Miyometrial ve Rahim Miyomları Üretimi İçin Üç Boyutlu Organoidlerin Kültür ve İşleme Teknikleri

Summary

Bu protokol, miyometrial ve rahim fibroid dokusundan kök hücrelerin 3D organoid kültürleriyle gömülü kollajen içeren hidrojeller oluşturmak için manuel olarak uygulanan bir tekniği ortaya koyar.

Abstract

Rahim miyomları, bir kadının rahmindeki en yaygın iyi huylu ve monoklonal, jinekolojik tümörlerdir. Bu patolojilerin incelenmesinde kullanılan yöntemlerle ilgili yaygın engelleri aşmak için, kolajen içeren hidrojelleri gömüleme iskelesi olarak kullanarak miyometrium ve rahim miyom kök hücrelerinin üç boyutlu organoid modelleri oluşturma stratejisi geliştirmeyi amaçladık. Özellikle, düşük bağlantılı V-bottom 96-kuyu plakalarında kolajen içeren hidrojeller kullanıldı. Bu yöntem, normal miyometrium ve rahim fibroid içeren miyometriumdan iki kök hücre tipinin 3D organoidlerinin, kollajen içeren hidrojellere gömmeleri ve uygun bir kök hücre çoğalma ortamında organoidler oluşturarak geliştirilmesini mümkün kıldı. Organoitler başarılı bir şekilde farklılaştı, çoğaldı ve karmaşık yapılara kendi kendini organize ederek sürdürülebilir bir sistem geliştirdi. Bu modelin önemi, patofizyoloji ve etiopatogenezi anlayışının yanı sıra rahim miyomlarını önlemek veya tedavi etmek için yeni ilaçların test edilmesinde de önemlidir.

Introduction

Rahim miyomları veya leiomyomalar, rahim 1'in en yaygın iyi huylu tümörleridir^. Üreme yıllarında kadınların önemli bir kısmını etkiler ve araştırmalar kadınların yaklaşık %77'sinin bir noktada bu hastalıkları yaşadığını gösteriyor. Birçok kadının belirtisi olmayan miyomları olsa da, %25'i anormal rahim kanaması, pelvik ağrı veya kısırlık gibi belirtiler^yaşar. Miyomların gelişimi ve büyümesi, cinsiyet hormonları, büyüme faktörleri, genetik değişiklikler ve diğer biyolojik mekanizmalar gibi çeşitli faktörlerden^etkilenir.

Patogenezi incelemek ve ilaç etkinliğini test etmek için in vitro ve hayvan modelleri geliştirilmiştir. 2D kültürlerdeki hücreler, düz bir yüzeyde büyümeye zorlanır, bu da şekillerini bozur ve davranışlarını 3D doku ortamında nasıl davranacaklarına kıyasla değiştirir. 2B kültürlemenin 3D kültüre kıyasla en büyük dezavantajı, bir doku içindeki doğal hücre ortamını kötü temsil etmesi, canlı bir organizmada meydana gelen karmaşık hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini doğru şekilde taklit edememesidir; bu da hücre davranışı ve uyaranlara yanıt incelerken potansiyel olarak yanlış sonuçlara yol^{açar 4}. Ayrıca, UF ve miyometrial hücreler 2B kültürde hormon yanıtını hızla^{kaybeder 5}. Genel olarak, farklı hayvan modelleri UF^{patofizyolojisi 6} hakkında ilgili bilgiler sağlamıştır. Hayvan modellerine kıyasla, 3D organoidler çeşitli avantajlar sunar: deneyleri basitleştirir, gerçek zamanlı görüntüleme ile uyumludur ve hayvan modellerinde iyi temsil edilmeyen insana özgü gelişimsel ve hastalık yönlerinin^{incelenmesini sağlar 7}. Öte yandan, primatlar gibi daha sofistike hayvanlarla yapılan deneyler etik olarak gerekçelendirilmesi çok zordur ve yüksek maliyetler^{vardır 8}. 3D organoid model, hayvan modellerine göre daha kontrollü, verimli ve maliyet etkin olan in vivo doku mimarisini daha yakından taklit ederek genellikle 2D hücre kültürlerinden üstündür. Bu nedenle, doğal hücre büyümesini ve hastalıklı dokunun karmaşıklıklarını doğru şekilde kopyalayan daha etkili alternatif modeller geliştirmek gereklidir.

Yöntemi, miyometrial ve rahim miyomlarının kök hücrelerinin 3D kültür organoidlerini, kollajen içeren hidrojeller kullanılarak manuel bir işlemle gerçekleştirmeyi amaçladık; bu yöntem ana avantaj ve sınırlamaları vurguladı.

Protocol

Protokol, Chicago Üniversitesi Etnik Komitesi tarafından IRB#20-1414 onay numarasıyla onaylandı. Chicago Üniversitesi'nin doku bankasına göre, doku toplanan tüm deneklerden bilgilendirilmiş onay alındı.

1. 3D organoid kültürü

1. Daha önce tarif edildiği gibi izole edilmiş ve saflaştırılmış miyometriyal ve UF Kök Hücrelerini (SC) kültürlen ve^{koruyun 9}.
2. Sıvı azottan SC elde edin ve çözülmelerine izin verin. Kültür sürecinin akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
3. Önceden kaplanmış şişeleri hazırlamak için 5 mL bağlanma faktörü proteini ekleyin. 37 °C'de en az 4 saat kuluçka yapın. Sonra fazla bağlanma faktörü proteinini at.
4. SC'leri, önceden kaplanmış 75^{cm 2} şişelerde, hem Dulbecco'nun modifiye Eagle's ortamı (DMEM) hem de %12 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş F12 içeren 10 mL ortam kullanılarak kültürlendirin. Termos, %90 birleşime ulaşana kadar %2 oksijen konsantrasyonu olan 37 °C hipoksi kuluçka makinesinde, Şekil 2A'da gösterildiği gibi inkübe yapın.
   NOT: Hipoksi, kök hücre büyümesinde önemli bir rol oynayabilir; çünkü kök hücre çoğalmasını ve hayatta kalmasını teşvik edebilir.
5. Birleşmeye ulaşıldığında, hücreler kalsiyum veya magnezyum olmadan HBSS'de %25 tripsin-%0,1 EDTA çözeltisi kullanılarak ayrılır.
   1. Bunu yapmak için hücre kültür ortamını çıkarın. Hücreleri 1x PBS ile yıkayın. 25 cm²'lik bir hücreye 1 mL tripsin ekleyin ve 2-3 dakika kuluçka yapın.
   2. Hücreler ayrılmaya başladığında, tripsin reaksiyonunu durdurmak için serumlu ortam ekleyin. Hücre çözeltisini 15 mL'lik bir tüpe aspire edin ve oda sıcaklığında 500 x g sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   3. Süpernatantı dikkatlice atın, pelleti sağlam bırakın.
6. Hücre pelletini daha sonra 1 mL serumsuz kök hücre üreme ortamında yeniden süzülür. Nazik pipetleme ile kümeleri bozun.
7. Hücre niceliklerini hemositometre kullanarak gerçekleştirin.
   1. 100 μL hücre süspansiyonu ile 10 μL %0,4 Trypan Blue çözeltisi karıştırın.
   2. Karışımı kısa bir süre girdablandırın ve 10 μL Trypan Mavi hücre süspansiyonunu hemositometre odasına pipet edin, oda çentiği ile cam kapak defteri arasındaki hemositometre odasına ( Şekil 2B).
   3. 1-4 kutularındaki hücreleri sayın, hücre sayısını hesaplamak için aşağıdaki denklemleri kullanın:
      Hücreler/mL = (toplam sayılan hücreler/toplam sayılan kutu sayısı) x seyreltme faktörü x 10.000
      Örnekteki toplam hücreler = hücreler/mL x toplam örnek hacmi
8. Yaklaşık 10.000 hücre, 2 μL kolajen içeren hidrojel ve 98 μL serumsuz kök hücre çoğalan ortamla karıştırın; böylece V-bottom 96 kuyu plakası için^{5 kuyu}başına 100 μL nihai hacim elde edilir.
9. Hücre karışımından 100 μL pipetle düşük bağlantılı V-bottom 96-kuyu plakasının her kuyusuna koyun. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 x g santrifüj yapın.
10. Plakayı %5_CO2 ile 37 °C inkübatöre 30 dakika boyunca yerleştirin.
11. Her kuyuyu, organların büyümesi için gerekli besin sağlaması amacıyla kolajen içeren hidrojel içermeyen serumsuz kök hücreler çoğaltıcı ortamdan ek olarak 100 μL hacmi ekleyin.
12. Ortamın buharlaşmasını telafi etmek için nadiren görülen aşırı buharlaşma durumunda her kuyuya 10-20 μL serumsuz kök hücre eklenerek çoğalabilir.
13. Organoidlerin tam büyümesi için hücreleri 7 gün kültüre yapın Şekil 2C-H. Serumsuz kök hücrelerin çoğaltıcı ortamını haftada 2 kez değiştirin (eski ortamı nazikçe aspire edip sonra taze ortam ekleyerek), böylece SC kaynaklı organoidlerin kültürü 21 güne kadar uzatılabilir.

2. Donmuş kesitleme

1. 96 kuyuyla levhadan hücreleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
2. Kriyoseksiyon için, organoidleri 2 kez fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS; 1x) yıkayın. Organoidlere 500 μL PBS ekleyin, ardından santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
3. Organoidleri 500 μL %4 paraformaldehit (PFA) ile 60 dakika boyunca 4 °C'de sabitleyin ve tekrar 1x PBS ile yıkayın.
4. Organoidleri %2 metilen mavisi olan 100 μL içinde tekrar 20 dakika boyunca boyaya bırakın. 1x PBS ile yıkayın ve 500 μL %30 sukroz içinde gece boyunca süspansiyon ile kriyoprotekti yapın.
5. Ertesi gün, sakaroz çözeltisi santrifüjle çıkarılır. Organoidleri Optimal Kesme Sıcaklığı bileşiğine (OCT) gömüp −80 °C'de ani dondurma işlemi yapılabilir.
6. OCT'ye gömülü organoidleri kriostat kullanarak kesitleyin, optimal kesit derinliği 10 μm olup, hemen slaytlara yerleştirilin, her slayt için bir kesit.
7. Slaytları 4 °C'de koruyun, ta ki immünoflüoresans boyama işlemi yapılana kadar, aşağıdaki yöntemle yapılın.
8. Sürgüyü 100 μL 1x PBS ile 3 kez yıkayın. Sonra, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS (1x) içinde 100 μL %0,1 Triton ekleyin.
9. Organoidleri %5 BSA ile 1x PBS'de 60 dakika bloke edin ve gece boyunca Sox-2 için primer antikorlarla (1:500) ve α-düz kas aktini (α-SMA) ile son konsantrasyon 1 μg/mL ile inkübe yapın.
10. Organoidleri 100 μL 1x PBS 3x ile yıkayın ve ardından Alexa Fluor etiketli floresan boya ikincil antikorlarıyla karanlıkta 1 saat kuluçka yapın (1:1000).
11. 100 μL 1x PBS 2x ile yıkayın ve ardından DAPI (1 ng/mL) ile desteklenen Antifade Montaj Ortamına monte edin.
12. 20x büyütme ile floresan mikroskop kullanarak görüntü alın. Şekil 3A'ya bakınız ve biyogörüntüleme analizi için yazılım ile görüntüleri analiz edin.

3. Tam montajlı organoidler immünoflüoresans boyama

1. Organoidleri ortamdan (adım 1.11) bir mikrosantrifüj tüpüne çıkarın ve 500 μL 1x PBS ile 2 kez yıkayın.
2. Organoidleri 500 μL %4 PFA ile oda sıcaklığında 60 dakika boyunca sabitleyin. Sonra PFA'yı atın ve 500 μL PBS ile 3x yıkayın.
3. Sabit organoidleri 4 °C'de gece boyunca 0,5 mL bloklama tamponu ile permeabilize edin.
4. Ertesi gün, bloklayıcı tamponu çıkarın, primer antikor (300-500 μL) Collagen III (COL3A1) ile seyreltme (1:500) ve AHR ile seyreltme (1:1000) ekleyin ve örnekleri gece boyunca 4 °C'de inkubka edin.
5. Organoidleri 500 μL 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve ardından gece boyunca 4 °C'de ikincil antikorlarla (594 keçi anti-tavşan IgG'si ve 488 keçi anti-fare IgG) kuluçka yapın.
6. Organoidleri 500 μL 1x PBS ile 3 kez yıkayın, ardından 5 μg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile 1x PBS (örnek başına 300-500 μL) ile oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın.
7. Organoidleri 500 μL 1x PBS ile üç kez yıkayın ve konfokal mikroskopta görüntü ile görüntüleyin (Şekil 3B).

4. Organoid dissosiyasyon

1. 100 mg papain'i filtreyle sterilize edilmiş aktivasyon çözeltisinde 250 U/mL stok konsantrasyonuna yeniden oluşturuyor, çözeltiyi 37 °C'de 30 dakika kuluçka ederek enzimi aktive ediyorum
   NOT: 2 - 8 °C sıcaklıkta 2 haftaya kadar saklanabilir.
2. Kullanımdan hemen önce 30 U/mL papain ve 125 U/mL DNaz I ile Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde bir dissosiyasyon çözeltisi hazırlayın.
3. Organoidleri (adım 1.11) 24 kuyruklu plakalara aktarın ve 500 μL dissosiyasyon çözeltisi ekleyin.
4. Örnekleri 37 °C'de, 90 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında 37 °C'de kuluçka edin.
5. Oda sıcaklığında 1 mL pipetör kullanarak aralıklı olarak 5x-6x tritürle yaparak esas olarak tek hücrelerden oluşan bir süspansiyon elde edilir.
6. Hücre süspansiyonu, içinde bir proteaz inhibitörü çözeltisi (1 mL 10 mg/mL) içeren 15 mL'lik santrifüj tüpüne ekleyin ve 300 x g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın, böylece pelet hücreleri ve süpernatantı atın.
7. Hücreleri uygun tamponda yeniden askıya alınır ve ortaya çıkan tek hücreli askılama Şekil 2I'de gösterilmiştir.

Results

Tohumlama sonrası ilk günden itibaren SC'ler kendiliğinden birleşmeye başladı ve organoidler oluşturdu, gösterildiği gibi. Optimal tohumlama yoğunluğunu 10.000 SC olarak belirledik; bu yoğunluk, tanımlanmış bir kültür sisteminde yetiştirildiğinde tutarlı şekilde organoidler oluşturdu. Bu sistem, kolajen içeren hidrojelleri ekstra düşük tutucu 96 kuyu plakasında 7 gün boyunca gömülü kök hücreler ve kök hücre proliferasyon ortamı için ECM iskeleti olarak

Discussion

Organoidler, küçüldüğü organlara benzeyen ve kök hücrelerden veya doku örneklerinden türetilen kendi kendini organize eden hücrelerden oluşan üç boyutlu^{yapılardır 11}. Hastaların doku kaynaklı kök hücre organoidleri, UF fizyolojisini ve hastalığı doğru şekilde kopyalama yetenekleri sayesinde biyomedikal araştırmaları ve klinik uygulamaları devrim niteliğinde değiştirebilir^. Burada, bu çalışma hem normal hem de UF hastalarından alınan insan S...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-foton konfokal  Mikroskop	Leica, ABD
Agarose I	VWR Şirketi, ABD	97062-248
Akura 96 Sferoid Mikroplakalar	InSphero	CS-09-004-03	düşük bağlantılı V-alt plakalar
Alexa Fluor 488 keçi fare karşıtı IgG	Life Technologies, CA, ABD	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 keçi anti tavşan IgG	Life Technologies, CA, ABD	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Tayvan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anti-alfa düz kas Aktin antikoru	Abcam, MA, ABD	(ab7817)	1 µ g/mL
Anti-Kolajen III antikor	Abcam, MA, ABD	(AB7778)	(1:500)
Anti-SOX1 antikor	Abcam, MA, ABD	ab242125	(1:500)
Bağlanma faktörü	Gibco, ABD	S-006-100
Buffer  bloklama;	Dako	X0909	%5  at serumu + %0,5  Triton X-100  1X 'de; PBS
Kriyostat	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Termo Bilim, Almanya	62248	1 mg/mL
DNase I	Termo-Bilim, Litvanya	EN0521
Dullbecco' ' modifiye edilmiş Eagle' s medium DMEM ve  F12	Gibco, ABD	21041-025
Fetal sığır serumu	Omega Scientific ,  Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (kolajen içeren hidrojeller)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (serumsuz kök hücreler Ortam  )	Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada	5446
OCT bileşiği (Optimal kesme sıcaklığı bileşiki)	Sakura, ABD	4583
Olympus BX41 mikroskobu	Olympus America, Center Valley, PA
Ovomucoid proteaz inhibitörü çözeltisi	Worthington Biyokimyasal Şirketi, ABD	LK003182
Papain	Worthington Biyokimyasal Şirketi, ABD	LK003176	aktivasyon çözeltisi (1.1 mM EDTA, 0.067 mM merkaptoetanol, 5.5 mM L-sistein HCl)
PBS (Fosfatla tamponlanmış tuzlu süm)	Gibco, ABD	70011	pH 7.4
PFA (paraformaldehit) %4	Invitrogen, ABD	FB002
Qupath	Bankhead, P. ve ark.  QuPath: Dijital patoloji görüntü analizi için açık kaynak yazılım.  Scientific Reports  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Biyogörüntüleme analizi için yazılım
Zaman Geçişli Mikroskobu
Doku kültürü şişeleri	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Tripsin	Gibco, ABD	A12859-01	KALSIYUM veya magnezyum olmadan HBSS'de %0,25 tripsin ve %0,1 EDTA;
DAPI ile desteklenen VECTASHIELD Antifade Montaj Ortamı	Vector Laboratuvarları, CA, ABD	#  UX-93952-24	1  ng/mL