Miyometrial ve Rahim Miyomları Üretimi İçin Üç Boyutlu Organoidlerin Kültür ve İşleme Teknikleri

Summary

Bu protokol, miyometrial ve rahim fibroid dokusundan kök hücrelerin 3D organoid kültürleriyle gömülü kollajen içeren hidrojeller oluşturmak için manuel olarak uygulanan bir tekniği ortaya koyar.

Abstract

Rahim miyomları, bir kadının rahmindeki en yaygın iyi huylu ve monoklonal, jinekolojik tümörlerdir. Bu patolojilerin incelenmesinde kullanılan yöntemlerle ilgili yaygın engelleri aşmak için, kolajen içeren hidrojelleri gömüleme iskelesi olarak kullanarak miyometrium ve rahim miyom kök hücrelerinin üç boyutlu organoid modelleri oluşturma stratejisi geliştirmeyi amaçladık. Özellikle, düşük bağlantılı V-bottom 96-kuyu plakalarında kolajen içeren hidrojeller kullanıldı. Bu yöntem, normal miyometrium ve rahim fibroid içeren miyometriumdan iki kök hücre tipinin 3D organoidlerinin, kollajen içeren hidrojellere gömmeleri ve uygun bir kök hücre çoğalma ortamında organoidler oluşturarak geliştirilmesini mümkün kıldı. Organoitler başarılı bir şekilde farklılaştı, çoğaldı ve karmaşık yapılara kendi kendini organize ederek sürdürülebilir bir sistem geliştirdi. Bu modelin önemi, patofizyoloji ve etiopatogenezi anlayışının yanı sıra rahim miyomlarını önlemek veya tedavi etmek için yeni ilaçların test edilmesinde de önemlidir.

Introduction

Rahim miyomları veya leiomyomalar, rahim 1'in en yaygın iyi huylu tümörleridir^. Üreme yıllarında kadınların önemli bir kısmını etkiler ve araştırmalar kadınların yaklaşık %77'sinin bir noktada bu hastalıkları yaşadığını gösteriyor. Birçok kadının belirtisi olmayan miyomları olsa da, %25'i anormal rahim kanaması, pelvik ağrı veya kısırlık gibi belirtiler^yaşar. Miyomların gelişimi ve büyümesi, cinsiyet hormonları, büyüme faktörleri, genetik değişiklikler ve diğer biyolojik mekanizmalar gibi çeşitli faktörlerden^etkilenir.

Patogenezi incele....

Protocol

Protokol, Chicago Üniversitesi Etnik Komitesi tarafından IRB#20-1414 onay numarasıyla onaylandı. Chicago Üniversitesi'nin doku bankasına göre, doku toplanan tüm deneklerden bilgilendirilmiş onay alındı.

1. 3D organoid kültürü

1. Daha önce tarif edildiği gibi izole edilmiş ve saflaştırılmış miyometriyal ve UF Kök Hücrelerini (SC) kültürlen ve^{koruyun 9}.
2. Sıvı azottan SC elde edin ve çözülmelerine izin verin. Kültür sürecinin akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
3. Önceden kaplanmış şişeleri hazırlamak için 5 mL bağlanma faktörü prote....

Results

Tohumlama sonrası ilk günden itibaren SC'ler kendiliğinden birleşmeye başladı ve organoidler oluşturdu, gösterildiği gibi. Optimal tohumlama yoğunluğunu 10.000 SC olarak belirledik; bu yoğunluk, tanımlanmış bir kültür sisteminde yetiştirildiğinde tutarlı şekilde organoidler oluşturdu. Bu sistem, kolajen içeren hidrojelleri ekstra düşük tutucu 96 kuyu plakasında 7 gün boyunca gömülü kök hücreler ve kök hücre proliferasyon ortamı için ECM iskeleti olarak

Discussion

Organoidler, küçüldüğü organlara benzeyen ve kök hücrelerden veya doku örneklerinden türetilen kendi kendini organize eden hücrelerden oluşan üç boyutlu^{yapılardır 11}. Hastaların doku kaynaklı kök hücre organoidleri, UF fizyolojisini ve hastalığı doğru şekilde kopyalama yetenekleri sayesinde biyomedikal araştırmaları ve klinik uygulamaları devrim niteliğinde değiştirebilir^. Burada, bu çalışma hem normal hem de UF hastalarından alınan insan S.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-foton konfokal  Mikroskop	Leica, ABD
Agarose I	VWR Şirketi, ABD	97062-248
Akura 96 Sferoid Mikroplakalar	InSphero	CS-09-004-03	düşük bağlantılı V-alt plakalar
Alexa Fluor 488 keçi fare karşıtı IgG	Life Technologies, CA, ABD	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 keçi anti tavşan IgG	Life Technologies, CA, ABD	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Tayvan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anti-alfa düz kas Aktin antikoru	Abcam, MA, ABD	(ab7817)	1 µ g/mL
Anti-Kolajen III antikor	Abcam, MA, ABD	(AB7778)	(1:500)
Anti-SOX1 antikor	Abcam, MA, ABD	ab242125	(1:500)
Bağlanma faktörü	Gibco, ABD	S-006-100
Buffer  bloklama;	Dako	X0909	%5  at serumu + %0,5  Triton X-100  1X 'de; PBS
Kriyostat	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Termo Bilim, Almanya	62248	1 mg/mL
DNase I	Termo-Bilim, Litvanya	EN0521
Dullbecco' ' modifiye edilmiş Eagle' s medium DMEM ve  F12	Gibco, ABD	21041-025
Fetal sığır serumu	Omega Scientific ,  Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (kolajen içeren hidrojeller)	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (serumsuz kök hücreler Ortam  )	Stemcell Technologies, Vancouver, Kanada	5446
OCT bileşiği (Optimal kesme sıcaklığı bileşiki)	Sakura, ABD	4583
Olympus BX41 mikroskobu	Olympus America, Center Valley, PA
Ovomucoid proteaz inhibitörü çözeltisi	Worthington Biyokimyasal Şirketi, ABD	LK003182
Papain	Worthington Biyokimyasal Şirketi, ABD	LK003176	aktivasyon çözeltisi (1.1 mM EDTA, 0.067 mM merkaptoetanol, 5.5 mM L-sistein HCl)
PBS (Fosfatla tamponlanmış tuzlu süm)	Gibco, ABD	70011	pH 7.4
PFA (paraformaldehit) %4	Invitrogen, ABD	FB002
Qupath	Bankhead, P. ve ark.  QuPath: Dijital patoloji görüntü analizi için açık kaynak yazılım.  Scientific Reports  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Biyogörüntüleme analizi için yazılım
Zaman Geçişli Mikroskobu
Doku kültürü şişeleri	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Tripsin	Gibco, ABD	A12859-01	KALSIYUM veya magnezyum olmadan HBSS'de %0,25 tripsin ve %0,1 EDTA;
DAPI ile desteklenen VECTASHIELD Antifade Montaj Ortamı	Vector Laboratuvarları, CA, ABD	#  UX-93952-24	1  ng/mL