Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Epikütan İndüklenen İmmünomodülasyonun Murin Modeli

836 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67578

⸱

24 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Çalışma, epikütan (EC) bağışıklama yoluyla farelerde bağışıklık tepkilerini modüle etmede cildin rolünü göstermektedir. Bir protein antijeni ile EC bağışıklaması, patojenle ilişkili moleküler paternlerle birleştirildiğinde temas aşırı duyarlılığında veya ters cilt kaynaklı baskılamada bağışıklık tepkilerini baskılayabilir. EC bağışıklaması, immünoterapiye etkili, iğnesiz bir yaklaşım olarak umut vaat etmektedir.

Özet

İnsan vücudunun dış çevre ile etkileşime giren en büyük organı olan deri, (1) organizmayı ksenobiyotiklerden ve mikroorganizmalardan korumak, (2) termoregülasyonu kolaylaştırmak, (3) su ve elektrolit dengesini korumak, (4) D vitamini sentezlemek ve (5) bağışıklığa katılmak gibi önemli fizyolojik roller oynar. Bu makale, cildin immünolojik mekanizmalardaki önemli katılımını vurgulayarak, bağışıklık tepkisini baskılayarak veya güçlendirerek immünomodüle etme kapasitesini sergilemektedir. Önceki bulgular, farelerde, tek başına veya patojenle ilişkili moleküler paternlerle (PAMP'ler) birlikte bir antijenle epikütan (EC) bağışıklamanın, sırasıyla bağışıklık tepkilerini baskılayabildiğini veya güçlendirebildiğini ortaya koymaktadır. Spesifik olarak, bir antijen ile EC bağışıklamasının, otoimmün hastalıkların veya alerjik kontakt dermatitin çeşitli murin modellerinde bağışıklık tepkilerini baskılayabildiği gözlenmiştir. Sonuçlar, PAMP'lerle kombine edilmiş bir antijen ile EC bağışıklamasının, patojenlere karşı bağışıklığı artırmak veya T yardımcı tip 2 lenfosit (Th2) bağımlı alerjileri hafifletmek için etkili bir strateji olarak hizmet edebileceğini göstermektedir. Bu protokol, Th1 hücrelerinin aracılık ettiği insan alerjik kontakt dermatit (ACD)-kontakt aşırı duyarlılığın (CHS) bir fare modelinde bir antijenin epikütan uygulaması yoluyla cilt baskılanmasını indüklemek için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir. Bununla birlikte, çeşitli murin bozukluğu modellerine de uygulanabilir. Makale, EC ile indüklenen immünomodülasyonu, çeşitli bozukluklarda iğnesiz immünoterapi için çekici bir murin modeli olarak sunmaktadır.

Giriş

Bu makale, bir fare temas aşırı duyarlılığı (CHS) modelinde toleransı indüklemek (bu metin boyunca 'bastırma' olarak anılacaktır) ve bu toleransı tersine çevirmek için bir yöntem (bu metin boyunca 'kontrasupresyon' olarak anılacaktır) için bir antijenin tek başına veya patojen tanıma reseptörleri (PRR'ler) için ligandlarla kombinasyon halinde epikütan (EC) uygulanması yoluyla 1. Açıklanan protokolde (a) haptenize fare immünoglobulinleri (TNP-Ig), temas aşırı duyarlılığını baskılamak için antijen olarak kullanılır veya (b) patojenle ilişkili moleküler modellere (PAMP'ler) sahip antijen, Toll benzeri reseptörler için ligandlar (TLR) ve nükleotid bağlayıcı oligomerizasyon alanı içeren protein (NOD) benzeri reseptörler (NLR'ler), cilt kaynaklı baskılamayı tersine çevirmek için 2,3,4. Bulgular, EC ile indüklenen immünomodülasyona antijen-spesifik olmayan T baskılayıcı (Ts) hücreleri ve antijene özgü T kontrasupresör (Tcs) hücrelerin aracılık ettiğini göstermektedir. Bu hücreler, test edilen reaksiyonların mekanizmasını belirlemek için bir fare evlat edinici hücre transferi modelinde incelenebilir. Mevcut protokol, "evlat edinen transfer GİRİŞ" ve "evlat edinen transfer ÇIKIŞ" olmak üzere iki hücre transferi modelini tanımlamaktadır. Adoptif transfer IN, CHS'nin afferent ve efferent fazlarında immünomodülasyonu test etmek için yararlıdır. Öte yandan, "adoptive transfer OUT", immünomodülasyonun etkisini sadece CHS'nin efferent fazında yansıtır.

Makale, T yardımcı tip 1 lenfositlerin (Th1) aracılık ettiği insan alerjik kontakt dermatit (ACD) - kontakt aşırı duyarlılık (CHS) bir fare modelinde bir antijenin epikütan uygulaması yoluyla cilt kaynaklı bir baskılama yöntemini açıklamaktadır5. Bununla birlikte, bu yaklaşım aynı zamanda T sitotoksik lenfosit tip 1 (Tc1) aracılı CHS 6,7, kollajen kaynaklı artrit (CIA)8,9 gibi otoimmün hastalıkların deneysel modellerinin düzenlenmesinde (baskılayıcı, toleranslı) etkinliği açısından da test edilmiştir , deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE)10,11 ve ülseratif kolit12. Ayrıca, protokol, CHS 13,14,15,16'nın bir murin modelinde PRR ligandları ile birlikte bir antijenin EC uygulaması yoluyla cilt kaynaklı kontrasupresyon (ters bastırma) yöntemini açıklar. Sunulan sonuçlar, EC ile indüklenen antijen spesifik olmayan baskılamanın TLR2, TLR3, TLR4, TLR9 ve NOD2 ligandlarının saflaştırılmasıyla tersine çevrilebileceğini göstermektedir. Deri kaynaklı kontrasupresyon yöntemi, atopik dermatitin (AD) bir hayvan modelinde de kullanılmış olup, metillenmemiş oligodeoksinükleotidler (CpG) içeren sentetik tek sarmallı DNA moleküllerinin varlığında bir antijen ile EC tedavisinin - TLR9 için ligand, Th2 aracılı yanıtları antijene özgü bir şekilde baskılayabilir (bağışıklık tepkisini bir Th1 / Th17 fenotipine doğru kaydırır)17. Tarif edilen yöntem ayrıca pnömokok pnömonisinde de test edildi ve CpG ile birlikte sığır serum albüminine (PC-BSA) konjuge pnömokok polisakkarit ile EC bağışıklamasının Streptococcus pneumoniae18'e karşı bağışıklığı potansiyel olarak artırabileceğini gösterdi.

EC ile indüklenen immünomodülasyonun önemli bir yönü, modelin seçimi ve antijenin doğasıdır. Makale, kullanılan antijenleri, antijene maruz kalma süresini ve test edilen modellerin T hücresi özgüllüğünü detaylandıran bir tablo içerir (bakınız Tablo 1). İmmünomodülasyon için tarif edilen yöntem, antijene özgü T lenfositlerini içeren hastalıklara yöneliktir. Bu yöntemin etkinliği, proseste EC tarafından uygulanan uyumlu bir antijen kullanılarak değerlendirildi. Antijenin uyumluluğu, hastalık sürecinde yer alan T lenfositleri ile etkili bir şekilde etkileşime girmesini sağlamak için çok önemlidir. Sağlam cilde bir protein veya peptit yamasının uygulanması, epidermistenantijen penetrasyonunu kolaylaştırır 19,20. Bu artan antijen penetrasyonu, pansumanın altındaki terlemenin artmasına bağlanır. Epidermal geçirgenlikteki değişiklikler yama uygulamasından sonraki 4-10 saat içinde meydana gelirken, EC kaynaklı immünomodülasyon iki haftaya kadar etkili kalabilir 5,14.

AK tedavisi yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu yöntemin birçok varyasyonunun varlığı soru işaretlerine yol açabilmektedir. Mevcut anlayış, antijen uygulamasından önceki epidermal hasarın derecesinin, ortaya çıkan bağışıklık tepkisinin doğasını etkileyebileceğini düşündürmektedir21. Yüzeysel epidermal hasar, Langerhans hücreleri tarafından anti-enflamatuar sitokinlerin salınımını tetikler ve Th2 yanıtının22 başlamasını destekler. Buna karşılık, daha kapsamlı epidermal hasar, proinflamatuar sitokinlerin salınımını teşvik eder ve dermal dendritik hücrelere antijen iletimini kolaylaştırır23. Sunulan protokol şunları vurgulamaktadır: (a) bu yöntemin küçük ve aktif hayvanlarda, özellikle farelerde uygulanmasındaki zorlukların tanınması; (b) Jiletli tıraş sonrası cilt durumu, maddelerin cilt ile uygun teması, maruz kalma süresi ve EC tedavisi sırasında cildin hijyenik koşulları gibi tedavinin etkinliğini belirleyebilecek faktörleri göz önünde bulundurmak. Farklı cilt preparatları cildin durumunu çeşitli şekillerde etkileyebileceğinden, antijen uygulamasından önce fiziksel veya kimyasal cilt epilasyon yöntemini dikkate almak çok önemlidir. Tüm bu prosedürlerin cilt bağışıklık hücrelerini aktive edebileceği, potansiyel olarak cilt enfeksiyonlarına yol açabileceği veya hastalığın ilerlemesini etkileyebileceği kabul edilmektedir. Epilasyondan sonra cilt koşulları üzerindeki potansiyel yan etkiler, epilasyon yöntemini seçerken birincil husus olmalıdır. Araştırmacılar, jilet ile traş edilmiş dorsal cilt üzerinde bir antijenin EC uygulaması yoluyla indüklenen bir T hücresi aracılı bağışıklık baskılama yöntemini tanımladılar ve bunun çeşitli fare bağışıklık tepkileri modelleri üzerindeki etkisini gösterdiler. Antijenin EC uygulaması, PAMP'larla birlikte, antijene özgü T kontrabaskılayıcı hücreleri indükler. Ayrıca, sunulan EC uygulama yöntemi, özellikle antijenlere veya PAMP'lara tekrar tekrar maruz kalma durumunda, ilgili yan etkilere neden olmaz.

Açıklanan protokol, özellikle fareler gibi küçük hayvanlarda, bu yöntemle güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmede çeşitli faktörlerin öneminin altını çizmektedir. Bu yaklaşımın non-invaziv doğası, tipik olarak, intradermal veya enjekte edilebilir bağışıklama tekniklerine kıyasla daha düşük advers reaksiyon riski (ağrı, enfeksiyon veya yara izi gibi) ile sonuçlanır. Epikütan bağışıklama kullanıcı dostudur ve klinik olmayan ortamlarda kolayca uygulanır, daha invaziv yöntemlere kıyasla erişilebilirliği ve uyumluluğu artırır.

Tablo 1: Farklı fare hastalığı modellerinde EC kaynaklı immün yanıt modülasyonu. Kısaltmalar: ACD = alerjik kontakt dermatit; AD = atopik dermatit; Ag = antijen; CIA = kollajen kaynaklı artrit; CHS = temas aşırı duyarlılığı; CFA = Freund'un adjuvanını tamamlayın; COLL II = tip II kollajen; DNFB = 2,4-dinitroflorobenzen; DNP-BSA = sığır serum albüminine konjuge dinitrofenil; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit; EC = epikutanöz; LPS = lipopolisakkarit; OVA = ovalbümin; PAMP = patojenle ilişkili moleküler model; PC-BSA = sığır serum albüminine konjuge pnömokok polisakkarit; Th1 = T yardımcı tip 1 lenfosit; Tc1 = T sitotoksik tip 1 lenfosit; TNCB = 2,4,6-trinitroklorobenzen; TNP-Ig = 2,4,6-trinitrofenil konjuge fare immünoglobulinleri; Ts = T baskılayıcı hücreler; Tcs = T kontrasupresör hücreler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu makalede sunulan tüm deneyler, Polonya'nın Krakow kentindeki 1. ve 2. Hayvan Deneyleri Yerel Etik Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak onaylanmış ve yürütülmüştür. Prosedürler, özellikle anestezik olarak ketamin / ksilazin veya izofluran uygulaması, fare derisinin tıraş bıçağı kullanılarak tıraş edilmesi, traş edilmiş cilde ve her iki kulak tarafına madde / hapten uygulanması ve periferik bağışıklık organlarının toplanması ile ilgili yerel tavsiyelere uygundur. Çalışmada, vücut ağırlıkları 20-25 g arasında değişen, 6-12 haftalık CBA/J (H-2k) erkek ve dişi fareler kullanıldı. Kullanılan reaktifler ve ekipmanla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvan hazırlama

  1. Ev fareleri birlikte; İzolasyonun ruh halleri üzerindeki olumsuz etkilerini önlemek önemlidir. İstatistiksel anlamlılık için, grup başına 10-12 hayvan kullanın.

2. Ameliyat alanının hazırlanması

  1. Tüm işlemlerden önce ve sonra ameliyat masasını %70 etanol solüsyonu ile temizleyin. Fare kullanımı steril koşullar gerektiriyorsa, tüm işlemleri bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirin.

3. Th1 aracılı CHS reaksiyonu için baskılayıcı hücrelerin (Ts) indüksiyonu

NOT: Bu prosedür Şekil 1A'da gösterilmiştir.

  1. "0" gününde, fareleri propilen glikol içinde% 30 izofluran ile uyuşturun. Fareyi sol elinizle tutun ve vücudunun sırt tarafını açığa çıkarın. Sağ elinizle gri sabunu bol su ile köpürtün ve cilde uygulayın.
    1. Steril bir tıraş bıçağı kullanarak 2 cm²'lik bir cilt bölgesini nazikçe tıraş edin. Cilde zarar vermekten kaçının. Herhangi bir cilt lezyonu, fareleri daha sonraki prosedürlerden diskalifiye edecektir.
      NOT: Gri sabun, yumuşak bir bitkisel bazdan yapılan doğal ve hipoalerjenik bir üründür. Kuru ve hassas cildi etkili bir şekilde yeniler ve nemlendirir. Bu sabun herhangi bir yapay renk, sentetik koku veya hayvansal kaynaklı içerik içermez. İçindekiler arasında Sodyum Palmat, Sodyum Palmiye Çekirdeği, Aqua (Su), Gliserin, Taraxacum Officinale (Karahindiba) Çiçek / Yaprak / Gövde Özü, Palmiye Asidi, Hurma Çekirdeği Asidi, Sodyum Klorür, Propilen Glikol, Tetrasodyum EDTA, Etidronik Asit bulunur. Gri sabun, tahrişe ve sedef hastalığına eğilimli hassas ve narin ciltler için tasarlanmıştır. Aşırı kuruluğu ve sıkılık hissini önlerken sorunlu cildi etkili bir şekilde temizler. Bu sabun ayrıca tahrişleri yatıştırır, nemlendirir ve daha hızlı cilt yenilenmesini destekler. Daha da önemlisi, cildin koruyucu bariyerinden ödün vermez.
  2. Fareleri kafese yerleştirin. Tıraştan sonra, cildin kurumasını ve hayvan tarafından temizlenmesini sağlamak için antijeni uygulamadan önce en az altı saat bekleyin.
  3. "+1" gününde, steril Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) 1 mg / mL antijen 2,4,6-trinitrofenil konjuge fare immünoglobulini (TNP-Ig) çözeltisi hazırlayın. On fare için 1200 μL'lik bir antijen hacmini hazırlayın. Çözeltileri kullanmadan hemen önce 2 mL'lik bir şişede karıştırın. Şişeyi alüminyum folyo ile kaplayarak TNP-Ig'yi ışıktan koruyun.
    NOT: Tıraş edilmesi ve çözücünün traş edilen yere uygulanmasının neden olduğu spesifik olmayan enflamatuar reaksiyonları değerlendirmek için yalnızca araçla (DPBS) tedavi edilen farelerden oluşan bir CHS kontrol grubunu dahil edin. Antijen özgüllüklerini test etmek için Ts indüksiyonu için farklı bir antijen türü kullanılmalıdır. Fare immünoglobulinleri (Ig) fare serumlarından hazırlandı ve TNP hapten ile konjuge edildi (Ek Dosya 1). 24,25 boyunca Ig molekülü başına 40 TNP (TNP40-Ig) ikame seviyesine sahip tek bir preparat kullanıldı.
  4. Aynı gün, fareleri propilen glikol içinde% 30 izofluran ile uyuşturun. Antijenin 100 μL'sine batırılmış 1cm2'lik bir gazlı bez yaması yerleştirerek antijeni daha önce traş edilmiş yere uygulayın (adım 3.3'te hazırlanmıştır). Bunu ince bir plastik yama (2 cm²) ile örtün ve kumaş yapışkan bantla sabitleyin. CHS denetim grubunda yalnızca DPBS'yi uygulayın.
    NOT: Plastik yama için 30 μm şeffaf belge kılıfları kullanılabilir. Kumaş yapışkan bant kolayca çıkarılabilir, esnek olmalı, vücut şekillerine uygun olmalı ve hava ve su buharı geçirgenliğine izin vermelidir.
  5. "+5" gününde, fareleri propilen glikol içinde% 30 izofluran ile uyuşturun. Yamayı yuvarlatılmış köşelere sahip güvenlik makasıyla dikkatlice kesin, ardından yapışkan bandı nazikçe çıkarın. Farelerin serbestçe hareket etmesine ve derilerini en az 4 saat boyunca doğal olarak temizlemesine izin verin. Gerekirse, antijen uygulama bölgesinde yeniden büyümüş saçları tıraş edin, ancak bu genellikle gerekli değildir.
    NOT: Yapışkan bandı yalnızca antijen uygulama alanında (gazlı bez ve plastik alan), yalnızca bandajın kenarlarına sıkıca yapıştığı yerde kesin. Cildin kurumasını ve hayvan tarafından temizlenmesini sağlamak için antijeni uygulamadan önce en az 4 saat bekleyin.
  6. "+5" gününde, adım 3.3 ve adım 3.4'ü tekrarlayın.
  7. "+8" gününde 3.5 adımını tekrarlayın. Bu, antijene bir haftalık cilt maruziyetinin tamamlandığını gösterir. Bu süreyi takiben, CHS reaksiyonunun baskılanmasını test etmek için fareleri kullanın -in vivo aktif modeller (adım 6) veya "evlat edinen transfer GİRİŞİ" (adım 8) veya "evlat edinen transfer DIŞARI" (adım 9) içinde Ts hücrelerinin donörleri olarak hizmet etmek üzere ötenazi yapın.

4. Th1 aracılı CHS reaksiyonu için kontrasüpresör T hücrelerinin (Tcs) indüksiyonu

NOT: Bu prosedür Şekil 1B'de gösterilmiştir.

  1. "0" gününde 3.1-3.2 adımlarını uygulayın.
  2. "+1" gününde, 100 μL DPBS'de 100 μg antijen TNP-Ig ve 100 μg LPS (PAMP örneği) karışımı hazırlayın. Solüsyonu kullanmadan hemen önce 2 mL'lik bir şişede hazırlayın ve antijen ışığa duyarlı ise şişeyi alüminyum folyoya sararak ışıktan koruyun.
    NOT: Kontrasüpresyonunu değerlendirmek için (cilt kaynaklı supresyonun tersine çevrilmesi), farelerin sadece antijen TNP-Ig ile tedavi edildiği bir supresyon kontrolü (Ts kontrol grubu) dahil edilmelidir. Ayrıca, immün yanıtların spesifik olmayan modülasyonunun derecesini belirlemek için yalnızca DPBS (CHS kontrolü) ve tek başına LPS (PAMP kontrolü) ile tedavi edilen fareler dahil edilmelidir. LPS, bağışıklık uyarıcı parçacık26'nın bir örneğidir. Herhangi bir bağışıklık stimülatörünün spesifik özellikleri, kullanılan fare modeline, incelenen bağışıklık tepkisinde yer alan bağışıklık hücrelerinin tiplerine ve incelenen maddelerin farmakokinetiğine bağlıdır.
  3. Aynı gün, fareleri propilen glikol içinde% 30 izofluran ile uyuşturun. Önceki traş edilmiş cilde 1cm2'lik bir gazlı bez yaması yerleştirin, 100 μL karışım içeren bir çözelti ile doyurun (adım 4.2'de hazırlanmıştır). Gazlı bezi ince bir plastik yama (2 cm²) ile sabitleyin ve kumaş yapışkan sıva kullanarak yerine yapıştırın. Kontrol gruplarında, DPBS (CHS kontrolü) veya LPS (PAMP kontrolü) veya tek başına TNP-Ig (Ts kontrol grubu) uygulayın.
    NOT: Plastik yama için 30 μm şeffaf belge kılıfları kullanılabilir. Kumaş yapışkan bant kolayca çıkarılabilir, esnek olmalı, vücut şekillerine uygun olmalı ve hava ve su buharı geçirgenliğine izin vermelidir.
  4. "+5" gününde, 3.5 adımını uygulayın.
  5. "+5" gününde 4.2-4.3 adımlarını tekrarlayın.
  6. "+8" gününde 3.5 adımını tekrarlayın. LPS ile karıştırılmış antijene bir haftalık cilt maruziyeti sona erer. Bu süreyi takiben, fareleri CHS reaksiyonunda test edin - in vivo aktif modeller (adım 6) veya "evlat edinen transfer OUT" da (adım 10) Tcs hücrelerinin donörleri olarak hizmet etmek için ötenazi yapın.

5. Th1 aracılı CHS reaksiyonu için T efektör hücrelerinin (Teff) indüksiyonu (CHS'nin duyarlılaştırma fazı)

  1. "0" gününde, farelerin göğsünü ve karnını (2 × 2 cm'lik alan) gri sabun ve ardından bir tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin. Tahriş olmamasını sağlamak için hapteni uygulamadan önce cildin 6 saat dinlenmesine izin verin.
  2. Aynı gün, kullanımdan hemen önce, hapten çözeltisini (% 5) bir cam şişede hazırlayın ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün: bir aseton-etanol karışımında 2,4,6-trinitroklorobenzen (TNCB) (oran 1: 3).
  3. Aynı gün, daha önce traş edilmiş bölgeye 150 μL hapten uygulayarak fareleri hassaslaştırın. Spesifik olmayan enflamatuar reaksiyonu değerlendirmek için negatif kontrol grubunda aracı tek başına (aseton-etanol karışımı) uygulayın. Hayvanı kafese geri koymadan önce, derinin kuruması için 30 saniye bekleyin.
    DİKKAT: Eldiven kullanın; TNCB çoğu insanda ciddi alerjik reaksiyonlara neden olur.

6. Aktif model: Th1 aracılı CHS'de Ts veya Tcs hücrelerinin test edilmesi

NOT: Bu prosedür Şekil 2'de gösterilmiştir.

  1. Adım 3 ve adım 4'ü izleyerek Ts veya Tcs hücresini indükleyin. Bu prosedür "0" gününden "+8" gününe kadar sürecektir.
  2. "+8" gününde, 5. adımı izleyerek Teff hücrelerini indüklemeye başlayın.
  3. Dört gün sonra, ortaya çıkarma aşamasını (meydan okuma) gerçekleştirerek CHS yanıtını değerlendirin. Kısacası, TNCB'yi kulakların her iki tarafına da uygulayın. Ardından, kulakların kalınlığını bir mikrometre ile ölçerek ölçün. Bu testin ve diğer olası uç noktaların ayrıntılı bir açıklaması başka bir yerde rapor edilmiştir (Zemelka-Wiacek M. ve ark.27).

7. Donör farelerden Teff, Ts veya Tcs hücrelerinin izolasyonu

  1. Ameliyat masasını her işlemden önce ve sonra %70 etanol solüsyonu ile sterilize edin. Steriliteyi korumak için tüm prosedürleri bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirin ve sterilize edilmiş aletler kullanın. "+8" gününde Ts, Tcs ve Teff hücrelerini izole etmek için, sırasıyla adım 3, 4 ve 5'te açıklanan EC ile aşılanmış fareleri kullanın.
    NOT: 1:1'lik bir bağışçı-alıcı oranına bağlı kalın.
  2. Donörleri ketamin (90-120 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg) karışımının intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile uyuşturun. Farenin en az 5 dakika boyunca tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
  3. Anestezi uygulanmış farenin tüm karın bölgesini% 70 etanol ile dezenfekte edin, ardından periton boşluğunu ortaya çıkarmak için karın tabakasını (3-4 cm) kesin. Yardımcı ve kasık lenf düğümlerini (ALN'ler) ve dalağı (SPL) steril forseps ile %1 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş steril DPBS ile doldurulmuş tüplere izole edin. Tüm donörlerden gelen ALN'leri bir şişede ve SPL'leri başka bir şişede toplayın ve şişeleri buz üzerinde tutun. Her aksillada iki aksiller lenf nodu bulunurken, tek bir kasık lenf nodu üç kan damarına bitişik kalça bölgesinde yer alır. SPL'ler vücudun sol tarafında, bağırsak ve midenin arkasında yer alır.
    NOT: Steril koşulları korumak için biyogüvenlik kabini altında steril aletlerle çalışın. Bu işlemden sonra, farelere kurumsal olarak onaylanmış protokollere göre ötenazi yapılmalıdır.
    1. İki mikroskop lamının buzlu uçları arasındaki dokuyu ezin. Hücre süspansiyonunu 70 μm gözenek boyutuna sahip bir hücre süzgecinden süzün.
  4. Hücreleri% 1 FBS ile desteklenmiş 30 mL DPBS ile durulayın. 300 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 1-5 mL DPBS'de yeniden süspanse edin.
  5. Bir hemositometre ve Tripan Mavisi kullanarak hücrenin canlılığını sayın. 10 μL hücre süspansiyonunu 90-990 μL Tripan Mavisi ile karıştırın ve hacmi hücre sayısına göre ayarlayın. Bu seyreltme faktörünü canlılık hesaplamasına dahil edin.
  6. ALN'ler ve SPL'lerin bir karışımını hazırlayın (oran 1: 1). Hücre sayısına uyun:% 1 FBS ve 1 mL DPBS'de 7 x 107 Teff hücresi / alıcı ile desteklenmiş 1 mL DPBS'de alıcı başına 1 ila 5 x 107 Ts veya Tcs hücresi kullanın. Tüm hücre popülasyonları için verici-alıcı oranını 1:1 ve ayrıca verici-DPBS oranını 1:1 tutun. Hücreleri olan şişeleri buzun üzerinde tutun.
    NOT: Daha fazla in vitro deneyin yürütülmesi, hücre donörlerinin sayısında orantılı bir artış gerektirir.
    NOT: Ek olarak, izole edilmiş Teff, Ts ve Tcs hücreleri, fenotipleme veya sitokin sekresyon değerlendirmesi gibi akış sitometrisi kullanılarak ek saflaştırma veya analizlere tabi tutulabilir. Hücre proliferasyon kapasitesini keşfetmek veya kültür süpernatantlarındaki sitokin seviyelerini ölçmek için hücre kültürlerini başlatmak da mümkündür. Daha fazla deney yapmak, hücre donörlerinin sayısında orantılı bir artış gerektirir.

8. Evlat edinen transfer IN: Th1 aracılı CHS'de Ts'nin test edilmesi

NOT: Bu prosedür Şekil 3'te gösterilmiştir. Steril çalışın ve her işlemden önce ve sonra %70 etanol çözeltisi kullanın. Steriliteyi korumak ve sterilize edilmiş aletler kullanmak için tüm hücre işlemlerinin bir biyogüvenlik kabini içinde yürütüldüğünden emin olun.

  1. Adım 3 ve adım 7'yi izleyerek Ts hücrelerini (donörler) indükleyin ve izole edin. Hücreleri 30 mL DPBS ile durulayın. 300 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini alıcı başına 200 μL DPBS'de yeniden süspanse edin (donör-alıcı oranı 1: 1).
  2. Alıcılar (saf sinjeneik fareler): alıcıları intraperitoneal (IP) ketamin (90-120 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg) karışımı enjeksiyonu ile uyuşturun. Farenin en az 5 dakika boyunca tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
  3. Anestezi uygulanmış alıcıya 200 μL'de 1-5 x 107 Ts hücreli (adım 8.2) hazırlanmış bir karışımın intravenöz (i.v.) enjeksiyonunu uygulayın.
  4. Aynı gün, Th1 aracılı CHS reaksiyonunu indükleyin. Kısaca, adım 5.1-5.3'te açıklanan Teff hücresini (duyarlılaştırma fazı) indükleyin. Dört gün sonra, adım 6.3'te açıklanan ortaya çıkarma aşamasını (meydan okuma) gerçekleştirerek CHS yanıtını değerlendirin.

9. Evlat edinen transfer OUT: Th1 aracılı CHS'de T'lerin test edilmesi

  1. 3, 5 ve 7. adımları izleyerek Ts ve Teff hücrelerini (donörler) indükleyin ve izole edin. İzole edilmiş Ts ve Teff'i iki ayrı şişede saklayın. Teff hücrelerini iki şişeye bölün: biri "Ts test grubu" ve diğeri "CHS kontrolü" için.
    NOT: Steril çalışın ve her işlemden önce ve sonra %70 etanol solüsyonu kullanın. Steriliteyi korumak ve sterilize edilmiş aletler kullanmak için tüm hücre işlemlerinin bir biyogüvenlik kabini içinde yürütüldüğünden emin olun. Yalnızca Teff hücrelerinin uygulanacağı alıcılardan oluşan bir kontrol grubunu dahil edin ("CHS kontrolü"). Bu grup için, 1: 1 olan donör-alıcı oranına uymak için ekstra donörler kullanılmalıdır. Sonuçların kalitesini arttırmak için, bir çözücü çözeltisi ile EC ile muamele edilmiş donörlerden transfer edilen kontrol hücrelerini alan alıcılar eklenmelidir. Herhangi bir ek alıcı ve bağışçı grubu ekleme kararının dikkatli bir şekilde planlanması gerekir, çünkü bu yaklaşım 3R ilkesine (Azalt, İyileştir, Değiştir) uymayan birçok fare gerektirir.
  2. "Ts test grubu" için Teff hücrelerine Ts hücreleri ekleyin. "CHS kontrol" şişesindeki Teff hücrelerine yeterli DPBS ekleyin.
    NOT: Alıcı başına 1-5 x 107 Ts hücre ve 7 x 107 Teff hücre sayısını koruyun.
  3. Tüm şişeleri yavaşça karıştırın. Şişeleri su banyosunda (37 °C) 30 dakika tutun ve her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.
  4. Her bir hücre şişesini% 1 FBS ile desteklenmiş 30 mL DPBS ile durulayın. 300 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve hücre peletini 200 μL DPBS / alıcıda yeniden süspanse edin.
  5. Her hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir gözenek hücre süzgecinden geçirin. Gerekirse, 200 μL DPBS/alıcının hacmini ayarlayın.
  6. Alıcılar (saf sinjeneik fareler): alıcıları intraperitoneal (IP) ketamin (90-120 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg) karışımı enjeksiyonu ile uyuşturun. Farenin en az 5 dakika boyunca tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
  7. Hazırlanan hücrelerin intravenöz (i.v.) enjeksiyonunu uygulayın.
  8. Aynı gün, adım 6.3'te açıklanan CHS'nin (meydan okuma) ortaya çıkarma aşamasını indükleyin. Davranışın yalnızca CHS'nin meydan okuduğu "negatif kontrolü" dahil edin.

10. Evlat edinen transfer OUT: Th1 aracılı CHS'de Tcs'nin test edilmesi

  1. Adım 3-5 ve adım 7'yi izleyerek Ts, Tcs ve Teff hücrelerini (donörler) indükleyin ve izole edin.
    NOT: Steril çalışın ve her işlemden önce ve sonra %70 etanol solüsyonu kullanın. Steriliteyi korumak ve sterilize edilmiş aletler kullanmak için tüm hücre işlemlerinin bir biyogüvenlik kabini içinde yürütüldüğünden emin olun. İki alıcı kontrol grubu ekleyin: sadece Teff hücrelerinin uygulanacağı bir "CHS kontrolü" ve Teff hücrelerinin sadece Ts hücreleri ile inkübe edileceği bir "Ts kontrolü". Bu gruplar için, 1:1 olan bağışçı-alıcı oranına uymak için ekstra bağışçılar kullanın.
  2. İzole edilmiş Ts ve Tcs hücrelerini ayrı şişelerde saklayın. Teff hücrelerini üç şişeye bölün: biri "Tcs test grubu" için, biri "Ts kontrolü" için ve diğeri "CHS kontrolü" için.
  3. İlk inkübasyon: (a) "Tcs test grubu" için Teff hücrelerine Tcs hücreleri ekleyin. (b) "Ts kontrolü" ve (c) "CHS kontrolü" için, Teff hücrelerine yeterli miktarda DPBS ekleyin (bakınız Tablo 2).
    NOT: Alıcı başına 1-5 x 107 Tcs hücre ve 7 x 107 Teff hücre sayısını koruyun.
  4. Tüm şişeleri yavaşça karıştırın. Su banyosunda (37 °C) 30 dakika bekletin, her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.
  5. Her bir hücre şişesini% 1 FBS ile desteklenmiş 30 mL DPBS ile durulayın. 300 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve alıcı başına% 1 FBS ile desteklenmiş 1 mL DPBS'de hücre peletini yeniden süspanse edin. Bir hücre karışımı-DPBS oranını 1: 1 koruyun.
  6. İkinci inkübasyon: (a) "Tcs test grubu" için, önceden inkübe edilmiş Teff ve Tcs hücrelerinin karışımına Ts hücreleri ekleyin. (b) "Ts kontrolü" için, DPBS ile önceden inkübe edilmiş Teff hücrelerinin karışımına Ts hücreleri ekleyin. (c) "CHS kontrolü" için, önceden inkübe edilmiş Teff hücrelerine yeterli DPBS ekleyin.
    NOT: Alıcı başına 1-5 x 107 Ts hücre sayısını koruyun. Yıkama ve santrifüjleme prosedürleri sırasında hücre kaybında homojenliği sağlamak için tüm deney gruplarında (a, b ve c) inkübasyonlar yapın.
  7. Tüm şişeleri yavaşça karıştırın. Su banyosunda (37 °C) 30 dakika bekletin, her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.
  8. Her bir hücre şişesini 30 mL DPBS ile durulayın. 300 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve hücre peletini 200 μL DPBS / alıcıda yeniden süspanse edin.
  9. Her hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir gözenek hücre süzgecinden geçirin. Gerekirse, 200 μL DPBS/alıcının hacmini ayarlayın.
  10. Alıcılar (saf sinjeneik fareler): alıcıları intraperitoneal (IP) ketamin (90-120 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg) karışımı enjeksiyonu ile uyuşturun. Farenin en az 5 dakika boyunca tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
  11. Hazırlanan hücrelerin intravenöz (i.v.) enjeksiyonunu uygulayın.
  12. Aynı gün, adım 6.3'te açıklanan CHS'nin (meydan okuma) ortaya çıkarma aşamasını indükleyin. Davranışın yalnızca CHS'nin meydan okuduğu "negatif kontrolü" dahil edin.

Tablo 2: Tcs "transfer OUT" sırasında hücre inkübasyonlarının programı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışma, tek başına deri yoluyla uygulanan veya PAMP ile kombine edilen antijenlerin, CHS reaksiyonunu modüle eden sırasıyla Ts veya Tcs hücrelerini indükleyip indükleyemeyeceğini incelemektedir. CBA/J farelerinin EC yoluyla 100 μg TNP-Ig veya TNP-Ig artı 100 μg LPS ile aşılanması, sırasıyla Ts veya Tcs hücrelerini indükler. Fareler daha sonra% 5 TNCB ile duyarlı hale getirildi ve 4 gün sonra aynı hapten ile zorlandı. Reaksiyon, meydan okumadan önce ve sonra kulak şi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Araştırmalar birçok farklı hayvan modeli üzerinde gerçekleştirildi ve BALB/c, C57BL/6, HLADR4-Tg, DBA 1 ve B10.PL gibi birçok fare suşu kullanılarak yapıldı ve SJL, atanmış bir antijen ile EC bağışıklamasının, tolerans oluşturmak ve istenmeyen bağışıklık tepkilerini kontrol etmek için çok yönlü ve potansiyel olarak sınırsız bir araç olarak hizmet edebileceğini göstermektedir. Mevcut protokol iki hücre transfer modelini özetlemektedir: (1) CHS'nin hem afferent hem de efferent fazları sıra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Polonya Bilimsel Araştırma Komitesi Hibeleri 3 PO5B 091 25, 2PO5A 204 29 ve Ulusal Bilim Merkezi N N401 3554 33'ten M.S.'ye hibe ile desteklenmiştir. Grafikler GraphPad Prism yazılımı 10.2.3 kullanılarak çizildi ve 1-3 rakamları BioRender'da oluşturuldu. Zemelka-Wiacek, M. (2025): (1) https://BioRender.com/3ux2px ; (2) https://BioRender.com/s0y8zs7; (3) https://BioRender.com/0qziglw. Yazarlar, fare kolonilerine baktığı için Dorota Woźniak'a teşekkür ediyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2,4,6-trinitroklorobenzen (TNCB)Tokyo Kimya Endüstrisi CO., Ltd, JaponyaC0307
2,4,6-trinitrofenil ile konjuge fare immünoglobulini (TNP-Ig)Biyomedikal Bilimler Kürsüsü, Sağlık Bilimleri Fakültesi, Jagiellonian Üniversitesi Tıp Fakültesi, Krakow, Polonya
aseton (ACS reaktifi, ≥ 99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Almanya179124
Alüminyum folyoMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaZ185140   
analitik denge Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, AlmanyaPRACTUM224-1, 29105177
Sığır serumu albümini (BSA)Merck KGaA, Darmstadt, AlmanyaA9418
CBA/J (H-2k) Jagiellonian Üniversitesi Tıp Fakültesi, Krakow, Polonya Sağlık Bilimleri Fakültesi Biyomedikal Bilimler Kürsüsü yetiştirme birimi
hücre süzgeci, gözenek boyutu 70 & mu; mBIOLOGIX, Çin15-1070
tek kullanımlık pipetlerin kapasitesi: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaZ740301, Z740302, Z740303
Dulbecco′ s fosfat tamponlu tuzlu (DPBS)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, ABD14190144
eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler 1.5mlEppenforf, Almanya30120086
eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler, 2.0 mlEppenforf, Almanya30120094
Etanol %100 (mutlak alkol)Merck KGaA, Darmstadt, Almanya1.07017
etanol %96Merck KGaA, Darmstadt, Almanya1.59010
fetal sığır serumu (FBS)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, ABDA3160802
Cam mikroskop slaytları (kumla püskürtülmüş, tek buzlu kaplama)ThermoScientific, Portsmouth, NH, ABD421-004T
Grafik Pad PrizmasıGraphPad Software Inc.v. 10.2.3
gri sabun (Bialy jelen sabun barı)Pollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o., Sp. K., Polonya163057
hemositometreVWR, Avantor, ABD612-5719
kuluçka makinesi Heracell 150iTermo Elektron  LED Gmbh, Almanya41071068
izofluran (Aerrane)Baxter, Deerfield, IL, ABD8AGG9623
ketamin 100 mg/mL, enjeksiyon için çözeltiBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polonyacat.# mevcut değil
laboratuvar santrifüji (Heraeus Fresco 21)Termo Bilim, Almanya75002425
laboratuvar santrifüji (Heraeus Megafuge 1.0R)  Termo Bilim, AlmanyaB00013899
Lipopolisakkarit (LPS)Merck KGaA, Darmstadt, AlmanyaL-8274
maske (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, Amerika Birleşik Devletleri111-0917
mikrometreMitutoyo, Tokyo, Japonya193-111
Amaçlarla mikroskopLeica Microsystems CMS GmbH, AlmanyaDM1000, 294011-082007
propilen glikol Chempur, Piekary figure-materials-1 Polonya114489005
jilet bıçağıVWR, Radnor, Pennsylvania, Amerika Birleşik DevletleriPERS94-0462
şeffaf belge kılıfları 30 & Micro; mSCHEMAT5906961126542
Trypan BlueMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaT8154
15 mL steril tüplerMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaCLS430055 (Corninig)
50 mL, steril tüplerMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaCLS430290 (Korning)
şişeler, vida kapak, şeffaf cam (sadece şişe) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Almanya27173
Viscoplast Polovis, İpek yapıştırıcı, 5x0.0125m3M Polonya, Nadarzyn, Polonya7100231620
su banyosu AJL Electronic, PolonyaLW102
Enjeksiyon için ksilazin (ksilapan 20 mg/mL) çözeltisiVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polonyacat.# mevcut değil

Kaynaklar

  1. Szczepanik, M., Majewska-Szczepanik, M. Transdermal immunotherapy: Past, present and future. Pharmacol Rep. 68 (4), 773-781 (2016).
  2. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with hapten-conjugated protein antigen alleviates contact sensitivity mediated by three different types of effector cells. Pharmacol Rep. 64 (4), 919-926 (2012).
  3. Majewska, M., et al. Role of TLR ligands in epicutaneously induced contrasuppression. Pharmacol Rep. 61 (3), 539-549 (2009).
  4. Ptak, W., et al. Toll-like receptor ligands reverse suppression of contact hypersensitivity reactions induced by epicutaneous immunization with protein antigen. Int Arch Allergy Immunol. 139 (3), 188-200 (2006).
  5. Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization induces alphabeta T-cell receptor CD4 CD8 double-positive non-specific suppressor T cells that inhibit contact sensitivity via transforming growth factor-beta. Immunology. 115 (1), 42-54 (2005).
  6. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunol Cell Biol. 90 (8), 784-795 (2012).
  7. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacol Rep. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  8. Marcińska, K., Majewska-Szczepanik, M., Maresz, K. Z., Szczepanik, M. Epicutaneous Immunization with Collagen Induces TCRαβ Suppressor T Cells That Inhibit Collagen-Induced Arthritis. Int Arch Allergy Immunol. 166 (2), 121-134 (2015).
  9. Marcińska, K., et al. Epicutaneous (EC) immunization with type II collagen (COLL II) induces CD4(+) CD8(+) T suppressor cells that protect from collagen-induced arthritis (CIA). Pharmacol Rep. 68 (2), 483-489 (2016).
  10. Majewska, M., et al. Epicutaneous immunization with myelin basic protein protects from the experimental autoimmune encephalomyelitis. Pharmacol Rep. 59 (1), 74-149 (2007).
  11. Tutaj, M., Szczepanik, M. Epicutaneous (EC) immunization with myelin basic protein (MBP) induces TCRalphabeta+ CD4+ CD8+ double positive suppressor cells that protect from experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J Autoimmun. 28 (4), 208-215 (2007).
  12. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig alleviates TNBS-induced colitis in mice. Pharmacol Rep. 64 (6), 1497-1504 (2012).
  13. Majewska, M., et al. TCRalphabeta + CD8+ and TCRgammadelta+ lymphocytes inhibit the capability of peritoneal macrophages to induce contact hypersensitivity. Folia Biol (Krakow). 57 (1-2), 23-27 (2009).
  14. Ptak, W., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen in the presence of TLR4 ligand induces TCR alpha beta+CD4+ T contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression of Th1-mediated contact sensitivity. J Immunol. 182 (2), 837-850 (2009).
  15. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. Int Arch Allergy Immunol. 164 (2), 122-136 (2014).
  16. Majewska-Szczepanik, M., Dorożyńska, I., Strzępa, A., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig and NOD2 ligand muramyl dipeptide (MDP) reverses skin-induced suppression of contact hypersensitivity. Pharm Rep. 66 (1), 137-142 (2014).
  17. Majewska-Szczepanik, M., Askenase, P. W., Lobo, F. M., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with ovalbumin and CpG induces TH1/TH17 cytokines, which regulate IgE and IgG2a production. J Allergy Clin Immunol. 138 (1), 262-273 (2016).
  18. Majewska-Szczepanik, M., Yamamoto, N., Askenase, P. W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with phosphorylcholine conjugated to bovine serum albumin (PC-BSA) and TLR9 ligand CpG alleviates pneumococcal pneumonia in mice. Pharmacol Rep. 66 (4), 570-575 (2014).
  19. Tan, G., et al. Hydration effects on skin microstructure as probed by high-resolution cryo-scanning electron microscopy and mechanistic implications to enhanced transcutaneous delivery of biomacromolecules. J Pharm Sci. 99 (2), 730-740 (2010).
  20. Mondoulet, L., et al. Epicutaneous immunotherapy on intact skin using a new delivery system in a murine model of allergy. Clin Exp Allergy. 40 (4), 659-667 (2010).
  21. Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. Eur J Immunol. 34 (8), 2100-2109 (2004).
  22. Callard, R. E., Harper, J. I. The skin barrier, atopic dermatitis and allergy: a role for Langerhans cells. TRENDS Immunol. 28 (7), 294-298 (2007).
  23. Eidsmo, L., Martini, E. Human Langerhans Cells with Pro-inflammatory Features Relocate within Psoriasis Lesions. Front Immunol. 22 (9), 300(2018).
  24. McKinney, M. M., Parkinson, A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. J Immunol Methods. 96 (2), 271-278 (1987).
  25. Methods in Immunology and Immunochemistry by: Curtis A Williams Merrill W. Chase vol. 2 Physical and chemical methods. , Academic Press. Now York. 359(1968).
  26. Wang, G., Wang, Y., Ma, F. Exploiting bacterial-origin immunostimulants for improved vaccination and immunotherapy: current insights and future directions. Cell Biosci. 14 (1), 24(2024).
  27. Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a murine model of allergic contact dermatitis. J Vis Exp. 26 (187), e64329(2022).
  28. Thomas, W. R., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Differences in the ability of T cells to suppress the induction and expression of contact sensitivity. Immunology. 42 (1), 53-59 (1981).
  29. Walczak, A., Siger, M., Ciach, A., Szczepanik, M., Selmaj, K. Transdermal application of myelin peptides in multiple sclerosis treatment. JAMA Neurol. 70 (9), 1105-1109 (2013).
  30. Juryńczyk, M., et al. Immune regulation of multiple sclerosis by transdermally applied myelin peptides. Ann Neurol. 68 (5), 593-601 (2010).
  31. Beaujean, M., et al. The immunological effects of intradermal particle-based vaccine delivery using a novel microinjection needle studied in a human skin explant model. Vaccine. 41 (13), 2270-2279 (2023).
  32. Prins, M. L. M., Prins, C., de Vries, J. J. C., Visser, L. G., Roukens, A. H. E. Establishing immunogenicity and safety of needle-free intradermal delivery by nanoporous ceramic skin patch of mRNA SARS-CoV-2 vaccine as a revaccination strategy in healthy volunteers. Virus Res. 334, 199175(2023).
  33. Brough, H. A., et al. Epicutaneous sensitization in the development of food allergy: What is the evidence and how can this be prevented. Allergy. 75 (9), 2185-2205 (2020).
  34. Paris, J. L., Vora, L. K., Torres, M. J., Mayorga, C., Donnelly, R. F. Microneedle array patches for allergen-specific immunotherapy. Drug Discov Today. 28 (5), 103556(2023).
  35. Bartnikas, L. M., et al. Epicutaneous sensitization results in IgE-dependent intestinal mast cell expansion and food-induced anaphylaxis. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 451-460 (2013).
  36. Leyva-Castillo, J. M., et al. Mechanical skin injury promotes food anaphylaxis by driving intestinal mast cell expansion. Immunity. 50 (5), 1262-1275 (2019).
  37. Amberg, N., Holcman, M., Stulnig, G., Glitzner, E., Sibilia, M. Effects of depilation methods on imiquimod-induced skin inflammation in mice. J Invest Dermatol. 137 (2), 528-531 (2017).
  38. He, X., Jia, L., Zhang, X. The effect of different preoperative depilation ways on the healing of wounded skin in mice. MDPI Animals. 12 (5), 581(2022).
  39. Liu, I. -L., Wang, L. -F. Epicutaneous sensitization with protein antigen. Dermatol Sinica. 30, 154-159 (2012).
  40. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Pyrczak, W., Szczepanik, M. Complementary methods for contact hypersensitivity (CHS) evaluation in mice. J Immunol Methods. 387 (1-2), 270-275 (2013).
  41. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  42. SanMiguel, A. J., Meisel, J. S., Horwinski, J., Zheng, Q., Grice, E. A. Topical antimicrobial treatments can elicit shifts to resident skin bacterial communities and reduce colonization by Staphylococcus aureus competitors. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), e00774-e00817 (2017).
  43. Strzępa, A., Majewska-Szczepanik, M., Lobo, F. M., Wen, L., Szczepanik, M. Broad spectrum antibiotic enrofloxacin modulates contact sensitivity through gut microbiota in a murine model. JACI. 140 (1), 121-133.e3 (2017).
  44. Meisel, J. S., et al. Commensal microbiota modulate gene expression in the skin. Microbiome. 6 (1), 20(2018).
  45. Arildsen, A. W., Zachariassen, L. F., Krych, L., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Delayed gut colonization shapes future allergic responses in a murine model of atopic dermatitis. Front Immunol. 12, 650621(2021).
  46. Griffin, M. F., desJardins-Park, H. E., Mascharak, S., Borrelli, M. R., Longaker, M. T. Understanding the impact of fibroblast heterogeneity on skin fibrosis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), dmm044164(2020).
  47. Majewska-Szczepanik, M., Strzępa, A., Marcińska, K., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig antigen induces CD11c+IL-10+ dendritic cells that promote suppression of Th1-mediated contact hypersensitivity in humanized HLA-DR4 transgenic mice. Int Immunopharmacol. 119, 110281(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Epikutan İmmünizasyonİmmünomodülasyon ProtokolüKontak HipersensitiviteBaskılayıcı T HücreleriEfektör T HücreleriAdaptif TransferCilt İmmünitesiAlerjik Kontak DermatitPatojenle İlişkili Moleküler Kalıplar
Epikütan İndüklenen İmmünomodülasyonun Murin Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.