Method Article

Fare Kaynaklı Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Saflaştırılması, Genişletilmesi ve Akış Sitometrisi Tabanlı Fenotiplendirilmesi

DOI:

10.3791/67600

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Central Laboratory for Science and Technology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, farelerden yüksek oranda homojen kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini (BMSC'ler) saflaştırmak, genişletmek ve karakterize etmek için uygun maliyetli bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, yüksek proliferasyon ve farklılaşma potansiyeline sahip büyük miktarlarda BMSC'lerin elde edilmesini kolaylaştırır, fare modellerini destekler ve klinik öncesi araştırmaları ilerletir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), kendi kendini yenileyebilen ve birden fazla hücre soyuna farklılaşabilen bir kök hücre popülasyonudur. Bunlar arasında, kemik iliğinde bulunan ve kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC'ler) olarak bilinen MSC'ler, osteogenez, hematopoietik destek, hedef arama / göç ve immünosupresyonda çok önemli bir rol oynar. BMSC'ler, hücresel terapötik stratejiler için potansiyellerinin yanı sıra kolay bulunabilirlikleri, genetik stabiliteleri ve düşük immünojenisiteleri nedeniyle hücre biyolojisi ve doku mühendisliği araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Hematopoetik kök hücreler (HSC'ler) ve BMSC'ler kemik iliğinde bir arada bulunur, ancak farklı progenitör hücrelere sahiptir. Kemik iliğinden hücreler çıkarılırken, tipik olarak birden fazla hücre tipi elde edilir, bu da hücre popülasyonunda heterojenliğe yol açabilir, potansiyel olarak yanlılığa neden olabilir ve yüksek deneysel standartları karşılamaz. Bu nedenle, in vitro BMSC'lerin homojenliğini ve verimini iyileştirmek için etkili teknikler geliştirmek çok önemlidir. Bu çalışma, BALB/c farelerinden elde edilen BMSC'lerin saflaştırılması, genişletilmesi ve akış sitometrisine dayalı fenotiplemesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Üçüncü pasajlı BMSC'lerin homojenliği ve kök hücre fenotipi, CD29, CD44 ve Sca-1 için pozitiflik, CD45 ve CD31 için negatiflik gösteren ve osteojenik ve adipojenik farklılaşma yeteneklerini doğrulayan akış sitometrisi kullanılarak karakterize edildi. Bu uygun maliyetli protokol, fare modellerinde araştırmaları ve kapsamlı klinik öncesi çalışmaları ilerletmek için gerekli olan, yüksek çoğalma ve farklılaşma potansiyeline sahip yeterli sayıda homojen BMSC elde etmek için kolay ve verimli bir yöntem sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC'ler) multipotent özellikleri ile bilinir ve kendi kendini yenileyebilmeleri, farklılaşabilmeleri ve immünomodülatör özellikleri nedeniyle çeşitli hastalıkların tedavisinde yaygın olarak kullanılırlar 1,2. BMSC'ler kolayca elde edilebilir, kapsamlı genişleme yeteneğine sahiptir, immünosupresif özellikler sergiler ve anında bağışıklık reaksiyonlarını tetiklemez3, bu da onları doku mühendisliği uygulamaları ve hücre tedavisi için etkili taşıyıcılar için çekici kılar.

Kemik iliğinde, iki ana kök hücre popülasyonu ve bunların soyları, hematopoetik kök hücreler ve BMSC'ler birincil sakinlerdir4. Geleneksel olarak, BMSC'ler hedeflenen kemik iliği aspirasyonu yoluyla elde edilir ve in vitro olarak plastik yapışık hücreler olarak tanımlanır. Bununla birlikte, bu yöntem BMSC'leri endotel hücreleri, perisitler, lökositler ve hematopoietik kök hücreler dahil olmak üzere diğer kemik iliği alt popülasyonlarından ayırt etmek için yetersizdir5. Bu nedenle, BMSC'lerin izolasyonu için kolay ve etkili bir protokole ihtiyaç vardır.

Mevcut çalışma, plastik hücre kültürü plakalarına fiziksel yapışmaları yoluyla BMSC'lerin ayrılmasını ve saflaştırılmasını detaylandırıyor. Akış sitometrisi deneyleri, Uluslararası Hücre ve Gen Terapisi Derneği (ISCT) Mezenkimal Stromal Hücre (MSC) komitesi6 tarafından belirtildiği gibi, CD29, CD44 ve Sca-1 yüzey belirteçleri kullanılarak üçüncü geçiş BMSC'leri üzerinde gerçekleştirildi. ISCT kriterlerine göre, fare MSC'leri CD29, CD44 ve kök hücre antijeni 1 (Sca-1) için pozitiflik ve hematopoietik hücre belirteci CD45 ve endotel hücre belirteci CD31 için negatiflik ile karakterize edilir. Ek olarak, BMSC'ler multipotent olmalı ve osteoblastlara, kondrositlere ve adipositlere trisoy farklılaşması göstermelidir. Bu deneyde, ekstrakte edilen BMSC'lerde osteogenez indüklendi, 7. günde ALP boyaması ve farklılaşmayı değerlendirmek için 21. günde bir alizarin kırmızı S testi yapıldı. İzole edilmiş ve saflaştırılmış BMSC'lerin adipojenik farklılaşması da indüklendi ve adipogenezi değerlendirmek için 21. günde Yağ Kırmızısı O boyaması yapıldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanların işlenmesi, Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nden Laboratuvar Hayvanları Etik yönergelerine (Etik onay No.: PZSHUTCM2211070009) uygun olarak onaylanmıştır. Bu çalışmada sekiz haftalık dişi BALB / c fareleri (SPF derecesi, 20 ± 1 g vücut ağırlığı) kullanıldı. Bu protokol, fare kaynaklı BMSC'lerin saflaştırılmasını, pasajını, akış sitometrisine dayalı fenotiplemesini ve osteojenik ve adipojenik farklılaşmasını ana hatlarıyla belirtir. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvan taşıma

  1. Ev fareleri, belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında, kafes başına beş fare olacak şekilde, ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde. SPF dereceli yem ve steril su sağlayın. 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünü koruyun.
    NOT: Bu yöntem test edilmiş ve hem BALB/c hem de C57BL/6 fare türlerinde uygulanabilir bulunmuştur. Bu makale örnek olarak esas olarak BALB/c'yi kullanmaktadır.

2. Fare arka bacaklarından femur ve tibiaların toplanması

  1. Etik yönergeleri izleyerek CO2 boğulması ve ardından servikal çıkık7 yoluyla hayvanlara ötenazi yapın.
  2. Fareleri 5 dakika boyunca %75 etanolde bekletin (Şekil 1A).
    NOT: Kök hücreler ötenaziden 2 30 dakika sonratoplandı ve ilik yıkama, filtrasyon ve kültür plakalarına tohumlama dahil olmak üzere tüm süreç, optimum hücre canlılığını sağlamak için 2 saat içinde tamamlandı.
    NOT: Optimum BMSC verimi için yetişkin fareler (≥8 haftalık) kullanın; 8-12 haftalık fareler idealdir8.
  3. Steril diseksiyon makası ile Aşil tendonunun arka ayağında yaklaşık 1 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 1B).
  4. Distal tibiayı ortaya çıkarmak için steril makasla Aşil tendonunun arka ayağının etrafında dairesel bir kesi yapın (Şekil 1C).
  5. Her iki arka bacaktan çıkarmak için cildi kesiden kalçaya doğru soyun (Şekil 1D).
  6. Femur başını kalça kemiğinden ayırmak için iliak kemik boyunca kesin (Şekil 2A).
    NOT: Kemik iliği kaybını önlemek için diseksiyon sırasında uyluk kemiğinin iki taraflı eklemlerine zarar vermekten kaçının.
  7. Toplanan femurları ve tibiaları% 2 penisilin / streptomisin içeren steril soğuk öncesi PBS içeren 60 mm'lik bir tabağa yerleştirin (Şekil 2B).
  8. Daha sonra yıkamayı kolaylaştırmak için steril bir neşter kullanarak tibia ve fibuladan mümkün olduğunca fazla tendon ve kas kesin (Şekil 2C).
  9. İşlenmiş kemikleri %2 penisilin / streptomisin içeren PBS'ye geri koyun ve sonraki izolasyon adımları için steril davlumbaza aktarın.

3. Fare BMSC'lerinin saflaştırılması ve kültürü

  1. αMEM'i %10 Fetal sığır serumu ve %1 penisilin / streptomisin ile takviye ederek BMSC kültürü için tam MEM Alfa Modifikasyonu (αMEM) ortamı hazırlayın.
    NOT: Nispeten düşük bir konsantrasyon olan 1000 mg/L glikoz içerdiğinden αMEM ortamını seçin. Bu, yüksek glikozlu ortamlarda meydana gelebilecek hücre proliferasyonunun inhibisyonunu önlemeye yardımcı olur9
  2. 50 mL'lik bir şırınga alın ve şırınga ile birlikte gelen iğneyi takın.
  3. 50 mL'lik şırıngaya 20 mL αMEM ortamı çekin, ardından iğneyi 1 mL şırınga ile birlikte gelen iğneyle değiştirin.
    NOT: Kemik boyutuna uyum sağlamak ve hücre hasarını en aza indirmek için 1 mL'lik bir şırınga iğnesi kullanın. 50 mL'lik bir şırınga, tekrarlanan yerleştirmelerden kaynaklanan hücre kontaminasyonu riskini azaltarak kemik iliğinin verimli bir şekilde yıkanmasını sağlar.
  4. Steril bir başlıkta ayrılmış uyluk kemiği veya kaval kemiğinin her iki ucunu kesmek için makas kullanın.
  5. İğneyi kesik kenar boyunca kemiğe sokun ve kemik iliğini tam αMEM ortamı içeren 100 mm'lik bir kültür kabına yıkayın (Şekil 2D).
  6. Kemik iliğinin çoğunun çıkarıldığından emin olmak için kemik parçaları soluk görünene kadar kemik boşluklarını tekrar tekrar yıkayın (Şekil 2E).
  7. Toplanan hücreleri mümkün olduğunca dağıtmak için bir pipet ucuyla 40 kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
  8. Kalıntıları, doku parçalarını ve dağılmamış kümeleri çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün.
  9. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 100 mm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın ve tabak başına 15 mL'lik bir nihai hacme kadar tam αMEM ortamı ekleyin.
    NOT: Hücre büyümesini kolaylaştırmak için her farenin uyluk kemiğinden ve tibiaslarından toplanan tüm kemik iliği hücrelerini 100 mm'lik bir kültür kabında kültürleyin. Önceki deneylere dayanarak, 8 haftalık bir fareden (iki uyluk kemiği ve iki tibiadan) yaklaşık 1 ×10 7 BMC izole edilebilir. Bu hücreler, birincil kültür için 1.8 × 105 hücre/cm2 yoğunlukta 100 mm'lik bir kültür kabına ekilir.
  10. Tabağı iki elinizle tutun ve hücrelerin tabak boyunca eşit bir şekilde dağılmasını sağlamak için sekiz şeklinde 15 kez hafifçe döndürün.
  11. Kültür kabını 37 °C'de %5 CO2 inkübatöre koyun ve 5 gün boyunca kültüre alın (Şekil 3A).
    NOT: Düzgün hücre büyümesini sağlamak için bu süre zarfında kültür kabını hareket ettirmekten kaçının.

4. BMSC kültürü için αMEM ortamının değiştirilmesi

  1. % 80 birleşmeye ulaşıp ulaşmadıklarını belirlemek için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Değilse, 5. günde orta replasmana devam edin.
  2. Steril bir Pasteur pipeti ile 3 mL PBS çizin ve kültür kabının 1 cm yukarısından farklı pozisyonlarda dağıtın.
    NOT: Sıvıyı tabağın bir tarafına dağıtmaktan kaçının, çünkü bu, aşırı darbe kuvveti nedeniyle yapışan hücreleri çıkarabilir ve istenmeyen hücrelerin etkili bir şekilde çıkarılmasını önleyebilir.
  3. 3 mL PBS ekledikten sonra, hücreleri iyice yıkamak için kültür kabını hafifçe çalkalayın ve PBS'yi bir pipetle tabaktan çıkarın. Hücrelerin iyice yıkandığından emin olmak için yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın.
  4. Steril bir Pasteur pipeti ile 15 mL tam αMEM ortamı çizin ve kültür kabının 1 cm yukarısından farklı konumlarda dağıtın.
  5. Kültür kabını inkübatöre geri koyun ve alt kültürlemeden önce hücreler %80 birleşmeye ulaşana kadar izleyin (Şekil 3B).

5. BMSC'lerin Geçişi

  1. Birleşen hücrelerin %80'ini PBS ile iki kez yıkayın (Şekil 3C).
    NOT: Hücrelerin sindirimden önce PBS ile yıkanması, artık ortam ve hücre salgılarının giderilmesine yardımcı olur ve MSC'nin kültür kabına yapışmasını azaltır.
  2. Hücreleri 1 mL %0.25 tripsin-EDTA ile 37 ° C'de %5 CO2 inkübatörde 2-3 dakika inkübe ederek sindirin.
  3. Hücre süspansiyonuna 4 mL tam αMEM ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.
  4. 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak hücre süspansiyonunu kültür kabından aspire edin ve tüm yapışkan hücreleri ayırmak için kabın altını nazikçe yıkayın.
  5. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı atmak için bir pipet kullanın ve hücre peletini 2 mL tam αMEM ortamında yeniden süspanse edin.
    NOT: Alt kültürleme için, yaklaşık 4 × 104 hücre /cm2'lik bir tohumlama yoğunluğunun, sürekli büyüme ve çoğalma için optimal olduğu bulunmuştur.
  7. Hücreleri 1:1–1:2 oranında yeni 100 mm'lik hücre kültürü kaplarına bölün (bu, 1. pasajı , P1'i oluşturur) (Şekil 3D).
  8. Hücreleri yaklaşık olarak her üç günde bir, BMSC'lerin ikinci geçişini (P2) (Şekil 3E) ve üçüncü geçişini (P3) (Şekil 3F) oluşturmak için% 80 birleşmeye ulaştıklarında 1: 1.5 oranında bölün.

6. Fenotipik tanımlama ve osteojenik farklılaşma için P3 BMSC'lerin hazırlanması

  1. Hücre kültürü ortamını atın.
  2. P3 BMSC'leri 3 mL PBS ile iki kez yıkayın.
  3. P3 BMSC'leri, %80 birleşmeye ulaştıklarında %5'lik bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 2-3 dakika inkübe ederek 1 mL %0.25 tripsin-EDTA ile sindirin.
  4. Hücre süspansiyonuna 4 mL tam αMEM ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.
  5. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    NOT: Burada hazırlanan P3 BMSC peletleri, akış sitometrisi yoluyla fenotipik tanımlama ve osteojenik veya adipojenik farklılaşmayı değerlendirmek için kullanılacaktır.

7. Akış sitometresi ile BMSC'lerin fenotipik olarak tanımlanması

  1. P3 BMSC'lerin hücre peletlerini %2 FBS içeren 1.5 mL PBS çözeltisi ile yeniden süspanse edin ve konsantrasyonu 5 × 106 hücre / mL'ye ayarlayın.
  2. Tüp başına 5 ×ila 105 hücre elde etmek için 11 tüpün her birine 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Aşağıdaki grupları hazırlayın: boş etiket, CD29 izotip kontrolü, CD29, CD44 izotip kontrolü, CD44, Sca-1 izotip kontrolü, Sca-1, CD31 izotip kontrolü, CD31, CD45 izotip kontrolü ve CD45.
    NOT: Bu çalışmada aşağıdaki florokromlar kullanılmıştır: CD29-FITC, CD29 izotipi-FITC, CD44-APC, CD44 izotipi-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 izotipi-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 izotipi-PerCPcy5.5, CD31-PE ve CD31 izotipi-PE (malzeme tablosunda gösterildiği gibi). Bu florokromlar, farklı akış sitometrelerinin konfigürasyonlarına göre değiştirilebilir.
  3. Her grup için aşağıdaki reaktifleri ekleyin: Boş etiket grubuna 2 μL PBS, CD29 izotipi kontrol grubuna 2 μL CD29 izotipi (1:50 seyreltme), CD29 grubuna 2 μL CD29 (1:50 seyreltme), CD44 izotipi kontrol grubuna 0.5 μL CD44 izotipi (1:200 seyreltme), CD44 grubuna 0.5 μL CD44 (1:200 seyreltme), Sca-1 izotip kontrol grubuna 0,5 μL Sca-1 izotipi (1:200 seyreltme), Sca-1 grubuna 0,5 μL Sca-1 (1:200 seyreltme), CD31 izotip kontrol grubuna 2 μL CD31 izotipi (1:50 seyreltme), CD31 grubuna 2 μL CD31 (1:50 seyreltme), CD45 izotip kontrol grubuna 2 μL CD45 izotipi (1:50 seyreltme), ve CD45 grubuna 2 μL CD45 (1:50 seyreltme).
    NOT: Antikorlar, üreticinin akış sitometrisi için optimize edilmiş önerilerine göre kullanılmıştır. Ön deneyler, hedef hücreler için optimal boyamayı ve özgüllüğü doğruladı. Üreticinin dozaj yönergelerine bakın ve gerektiğinde titre ön testleri yapın.
  4. Yavaşça karıştırın, bir avuç içi santrifüjü kullanarak santrifüjleyin ve karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Her tüpe 900 μL PBS ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Fazla antikorları çıkarmak için süpernatanı atın.
  6. Her tüpteki hücre peletini 300 μL PBS ile yeniden süspanse edin ve bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.
    NOT: Akış sitometresi testi 1-2 saat içinde tamamlanabilirse, hücrelerin %2,5 nötr formaldehit ile sabitlenmesine gerek yoktur. Analiz 1-2 saat içinde gerçekleştirilemezse,% 2.5 nötr tamponlu formalin (% 10 nötr tamponlu formalinin PBS ile 1: 3 oranında karıştırılmasıyla hazırlanır) ile hücreleri sabitleyin ve daha sonraki akış sitometresi testi için gece boyunca karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
  7. Hücre otofloresansının koordinat ekseninin yaklaşık 1/4–1/3'ü içinde olduğundan emin olmak için boş etiket grubunu kullanarak akış sitometresi voltajını ayarlayın. Hücreleri CD29 izotipi, CD29, CD44 izotipi, CD44, Sca-1 izotipi, Sca-1, CD31 izotipi, CD31, CD45 izotipi ve CD45 gruplarından sırayla yükleyin. P1 kapısını (FSC/SSC çiziminde tanımlandığı gibi) orta hızda çalışan 10.000 hücreyi yakalayacak şekilde ayarlayın.
    NOT: Akış sitometresinin, deneylerde yaygın olarak kullanılanlar gibi uygun kanallarla donatıldığından emin olun: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 ve APC veya antikora bağlı floreseinlere karşılık gelen diğer kanallar.

8. BMSC'lerin osteojenik farklılaşması

  1. P3 BMSC peletlerini tam αMEM ortamında yeniden süspanse edin, konsantrasyonu 1 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın.
  2. Her bir oyuğa 1 × 105 hücre içeren 1 mL tam αMEM ortamı ekleyerek P3 BMSC'leri 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasına tohumlayın.
  3. P3 BMSC'leri 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörinde% 90'ın üzerine birleşene kadar 3-5 gün boyunca kültürleyin. Komple αMEM ortamını her 2 günde bir yeni ortamla değiştirin.
  4. Farklı kuyucukları eşit olarak iki gruba ayırın: negatif kontrol grubu (osteojenik farklılaşma indüksiyonu olmadan) ve osteojenik farklılaşma grubu
  5. Tam αMEM ortamını 10 mmol/L β-gliserofosfat, 50 mg/L L-askorbik asit ve 10-8 mol/L deksametazon ile destekleyerek osteojenik farklılaşma indüksiyon ortamını hazırlayın.
  6. Hücre kültürü ortamını atın ve P3 BMSC'leri 1 mL PBS ile yıkayın.
  7. Osteojenik farklılaşma indüksiyonu (1 mL / kuyu) için osteojenik farklılaşma indüksiyon ortamını osteojenik farklılaşma grubunun kuyularına ekleyin.
  8. Komple αMEM ortamını kontrol grubunun kuyucuklarına ekleyin (1 mL/oyuk).
  9. P3 BMSC'leri 37 °C'de %5 CO2 inkübatörde 7 veya 21 gün boyunca kültürleyin, osteojenik farklılaşma indüksiyon ortamını veya tam αMEM ortamını her 3 günde bir aynı taze ortamla değiştirin.
    NOT: Alkalin fosfataz (ALP) boyama için 7 günlük indüksiyonlu hücreler kullanılır. Alizarin kırmızısı S testi için 21 günlük indüksiyonlu hücreler kullanılır.

9. ALP boyaması ile farklılaşmış osteojenik hücrelerin tanımlanması

  1. 24 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücreleri bir kez 1 mL PBS ile yıkayın.
  2. 0.5 mL% 10 tamponlu formalin çözeltisi ekleyerek ve 20 dakika inkübe ederek hücreleri sabitleyin.
  3. Her bir kuyucuktaki hücreleri bir kez 1 mL PBS ile tekrar yıkayın.
  4. Her oyuğa 0,5 mL alkalin fosfataz boyama reaktifi 1 Adımlı NBT/BCIP ekleyin ve ışıktan korumak için alüminyum folyo sargı ile 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Çözeltiyi atın, her kuyucuktaki hücreleri bir kez 1 mL damıtılmış su ile yıkayın ve plakanın kurumasını bekleyin.
  6. Siyah-mor çökelti ile ALP pozitif hücreleri tanımlamak için bir kamera kullanarak lekeli kolonilerin görüntülerini gözlemleyin ve elde edin.
    NOT: Alkalin fosfataz (ALP) boyama reaktifi 1 Adımlı NBT/BCIP, ALP ile reaksiyona girdiğinde kolayca görselleştirilebilen güçlü, çözünmeyen siyah-mor bir çökelti üretir.

10. Alizarin kırmızısı S testi ile farklılaşmış osteojenik hücrelerin tanımlanması

  1. 24 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücreleri bir kez 1 mL PBS ile yıkayın.
  2. 0.5 mL% 10 tamponlu formalin çözeltisi ekleyerek ve 20 dakika inkübe ederek hücreleri sabitleyin.
  3. 24 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücreleri bir kez 1 mL PBS ile yıkayın.
  4. Her oyuğa 0.1 mol / L Tris-HCl (pH 8.3) içinde 0.5 mL% 0.1 alizarin kırmızı S ekleyin ve 37 ° C'de 30-60 dakika inkübe edin.
  5. Çözeltiyi atın, her kuyucuktaki hücreleri bir kez 1 mL damıtılmış su ile yıkayın ve plakanın kurumasını bekleyin.
  6. Alizarin kırmızısı S-pozitif hücreleri tanımlamak için bir kamera kullanarak lekeli kolonilerin görüntülerini gözlemleyin ve elde edin.
    NOT: Olgun mineralize kemik hücrelerine MSC farklılaşması için alizarin kırmızısı S testi, görsel olarak gözlemlenebilen parlak kırmızı bir leke üreten bir alizarin kırmızısı S-kalsiyum kompleksinin oluşumuna neden olur.

11. BMSC'ler için adipojenik indüksiyon farklılaşma ortamı A'nın hazırlanması

NOT: BMSC'lerin adiposit farklılaşması için, kılavuzlara göre sıklıkla bir Fare Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücreler Adipojenik Farklılaşma Kiti ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılır.

  1. Fetal Sığır Serumunu (Kitin serum olarak adlandırılan bir bileşeni) tam çözülmeden önce en az 6 saat boyunca 4 ° C buzdolabına koyun.
  2. Ek A-I'yi (Kitin bileşeni) hazırlamadan en az 4 dakika önce 30°C buzdolabına koyun; Ek A-II'yi (Kitin bileşeni) tamamen çözülene kadar oda sıcaklığına yerleştirin.
  3. İçeriği karıştırmak için reaktif tüpünü ters çevirin veya hafifçe vurun.
  4. Ek A-II reaktif tüpünü oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 300 × g'da santrifüjleyin, böylece reaktifin kolay geri alma için altta toplanmasını sağlayın.
  5. Tüm bileşenlerin dış ambalajını %75 medikal alkol ile iyice temizleyin ve bir biyogüvenlik kabininde açın.
  6. Ortama serum, Ek A-I ve Ek A-II ekleyin.
    NOT: Düzgün çözünmeyi sağlamak için, Bazal Ortamı (Kitin bir bileşeni) 37 °C'ye önceden ısıtın, aksi takdirde Ek A-II soğuğa maruz kalma nedeniyle çökelebilir.
  7. Her bir şişeyi ve tüpü durulamak için az miktarda Bazal Ortam kullanın ve tüm bileşenleri Bazal Ortama aktardığınızdan emin olun.
  8. Basal Medium şişenin kapağını kapatın ve iyice karıştırmak için hafifçe sallayın.
  9. Şişeyi parafin film ile kapatın, alüminyum folyoya sarın ve adı, hazırlanma tarihi ve diğer ayrıntılarla etiketleyin.

12. BMSC'ler için adipojenik indüksiyon farklılaşma ortamı B'nin hazırlanması

  1. Fetal Sığır Serumu tamamen çözülmeden önce en az 6 saat 4 °C buzdolabına koyun.
  2. Ek B'yi (Kitin bir bileşeni) hazırlamadan önce en az 4 dakika boyunca tamamen çözülene kadar 30 °C'lik bir buzdolabına koyun.
  3. İçeriği karıştırmak için reaktif tüpünü ters çevirin veya hafifçe vurun.
  4. Daha kolay toplama için reaktifi altta konsantre etmek için Ek B tüpünü santrifüjleyin.
  5. Tüm bileşenlerin dış ambalajını %75 medikal alkol ile iyice temizleyin ve bir biyogüvenlik kabininde açın.
  6. Bazal Ortama serum ve Ek B ekleyin.
  7. Her bir şişeyi ve tüpü yıkamak için Bazal Ortamın küçük bir kısmını kullanın ve tüm bileşenlerin ortama tamamen aktarıldığından emin olun.
  8. Basal Medium şişenin kapağını kapatın ve iyice karıştırmak için hafifçe sallayın.
  9. Şişeyi parafilm ile kapatın, alüminyum folyoya sarın ve adı, hazırlanma tarihi ve diğer ayrıntılarla etiketleyin.

13. BMSC'lerin adiposit farklılaşması

  1. Altı oyuklu bir plakaya 1 mL %0.1 jelatin ekleyin ve her bir oyuğun tabanını eşit şekilde kaplamak için sallayın.
  2. % 0.1 jelatin ile kaplanmış altı oyuklu plakayı steril bir davlumbaza veya CO2 inkübatöre en az 30 dakika yerleştirin.
  3. Jelatini aspire edin ve plaka hücre tohumlaması için hazırdır veya 30 dakika sonra tohumlamadan önce kuyuların kurumasını bekleyin.
  4. P3 BMSC'leri, altı oyuklu plakanın her bir oyuğunda 4 ×10 4 hücre /cm2 yoğunlukta tohumlayın ve her oyuğa 2 mL tam ortam ekleyin.
  5. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ve doymuş nem içeren bir CO2 inkübatörde inkübe edin.
  6. Ortamı dikkatlice aspire edin ve hücreler% 100 birleşime ulaştığında her bir oyuğa 2 mL adipojenik farklılaşma indüksiyon ortamı A ekleyin.
  7. 3 günlük indüksiyondan sonra kuyulardan ortam A'yı aspire edin ve 2 mL adipojenik farklılaşma ortamı B ekleyin.
  8. 1 gün sonra orta B'yi aspire edin ve daha fazla indüksiyon için orta A'ya geri dönün.
  9. Ortam A ve B arasında geçiş yapın ve hücreleri günlük olarak gözlemleyin. Ortam A ile indüksiyon sırasında hücre kasılması veya ölümü meydana gelirse, derhal ortam B'ye geçin.
  10. Uygun boyutta yeterli sayıda lipit damlacığı görünene kadar indüksiyon ve bakım işlemini tekrarlayın ve ardından boyamaya hazırlanın.

14. Yağ Kırmızısı O (ORO) boyama

NOT: Lipid damlacıklarının ayrılmasını önlemek için tüm prosedürleri mümkün olduğunca nazikçe gerçekleştirin.

  1. Adipojenik indüksiyon farklılaşması tamamlandıktan sonra adipojenik indüksiyon farklılaşma ortamını 6 oyuklu plakadan aspire edin ve 2-3 kez 1×PBS ile nazikçe yıkayın.
  2. Kuyucuk başına 2 mL% 10 nötr tamponlu formalin ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika sabitleyin.
  3. Oil Red O stoğunu 3:2 oranında damıtılmış su ile karıştırarak Oil Red O çalışma solüsyonunu hazırlayın. Karıştırdıktan sonra 250 × g'da 4 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı kullanın.
  4. Fiksatifi aspire edin ve PBS ile 2-3 kez nazikçe yıkayın, böylece fiksatifin tamamen çıkarılmasını sağlayın.
  5. Her kuyucuğa 0.8 mL kırmızı O leke çözeltisi ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
  6. Leke solüsyonunu aspire edin, 1 mL% 75 etanol ile iki kez yıkayın.
  7. Her oyuğa 2 dakika boyunca 1 mL hematoksilen karşı leke ekleyin, ardından aspire edin.
  8. Her oyuğa 2 mL PBS ekleyin ve adipojenik boyama sonuçlarını mikroskop altında gözlemleyin.
  9. Lekeli altı oyuklu plakayı parafilm ile kapatın ve 4 °C'de saklayın.
    NOT: 1 haftadan fazla saklamayınız. Lipid damlacıkları birleşerek lekelenme durumunu kaybedebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fareden türetilen BMSC'ler, üçüncü geçiş (P3) BMSC'lerini oluşturmak için yaklaşık 2 hafta boyunca izole edildi ve kültürlendi (Şekil 3). Şekil 3A'da gösterildiği gibi, kemik iliğinden taze ekstrakte edilen hücreler, görünür yağ damlacıkları ile mononükleer kaldı. Kültür kabında iğ şeklindeki hücreler ortaya çıktı ve 5. kültür gününde `-80'lik bir birleşmeye ulaştı (Şekil 3B,C).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kök hücre tedavisi, rejeneratif tıpta devrim yaratma potansiyeli nedeniyle büyük ilgi görmüştür. Klinik öncesi çalışmalar, kök hücrelerin, özellikle BMSC'lerin klinik uygulamasını destekleyen önemli kanıtlar sağlamıştır13. Bununla birlikte, düşük hücre verimi, kontaminasyon ve yavaş büyüme gibi zorluklar klinik uygulamalarını engellemiştir. Bu nedenle, hücre verimini ve işlevselliğini artırmak ve böylece klinik kullanımlarını genişletmek için BMSC hazırlama süreçl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışma ile ilgili olarak herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2020YFE0201600) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82174408 ve 82374477) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL şırınga (22G şırınga iğnesi)NAZIK GRUP(KDL)60017031
1-Adımlı NBT/BCIP Pierce Biyoteknoloji A.Ş.34042Alkalen fosfataz boyama
%10 nötr tamponlu formalinWexis5200250hücre fiksasyonu
6 oyuklu plakaLaboratuvar seçimi11110Hücre kültürü
24 oyuklu plakaLaboratuvar seçimi11310Hücre kültürü
40 μ m Hücre SüzgeciKornig352340Topakları gidermek için filtreleme
50 mL şırıngaNAZIK GRUP(KDL)60017040
%75 etanol Şangay NianYue Biyoteknoloji Co, Ltd31009001Farelerin cildini dezenfekte edin
Alizarin Kırmızı SSigma-Aldrich A5533 SerisiKalsiyum Birikintileri ve Kalsifiye Nodüllerin Tespiti
APC CD44 Monoklonal Antikor (klon:IM7)e-Biyobilim17-0441-82Akış sitometrisi 
APC Sıçan IgG2b kappa İzotip Kontrolü (Klon:eB149/10H5)e-Biyobilim17-4031-82Akış sitometrisi 
OtoklavJaponya Hiryama ŞirketiHVE-50 SerisiSterilizasyon cerrahi aletleri
CO2 inkübatörThermo Fisher Technology (Çin) Co., Ltd.300583057Hücre kültürü
Sitofleks akış ölçümüBeckman Coulter A00-1-1102Akış sitometrisi 
deksametazonSigma-Aldrich D4902BMSC'lerin osteojenik farklılaşması
Çanak (100mm)Corning430167Hücre kültürü
Çanak (60mm)Corning430166Transplantasyon sırasında örnek yerleştirme 
Dezenfektan pamuk toplarıŞangay Honglong Sanayi A.Ş.20230627Farelerin cildini dezenfekte edin
Tek kullanımlık steril eldivenlerŞangay Honglong Sanayi A.Ş., LtdYT21131Steril operasyon
Çift aslan Işınlanmış Kemirgen DiyetiSuzhou Shuangshi Deneysel Hayvan Yemi Technology Co., Ltd.Büyük Britanya 14924.3Hayvan yemi
Fetal Sığır Serumu Şanghay Biosun Bilim ve Şerif Teknoloji A.Ş., Ltd.BS-0002-500 SerisiHücre kültürü
FITC Hamster Anti-Sıçan CD29 (klon:Ha2/5)BD Biyolojik Bilimler555003Akış sitometrisi 
FITC Hamster IgM, λ 1 İzotip Kontrolü (klon: G235-1)BD Biyolojik Bilimler553960Akış sitometrisi 
jelatin (%0,1)OriCellGLT-11301 (İngilizce)hücrelerin yapışma yeteneğini geliştirmek
IVC'ler fare kafesiSuzhou Maymun Kral Hayvan Deney Ekipmanları Technology Co., Ltd.HH-MMB-2Hayvan bariyeri
L-askorbik asitSigma-Aldrich A8960 SerisiBMSC'lerin osteojenik farklılaşması
İşaret kalemiZebra Trading (Shenzhen) Co.,Ltd. YYST5Petri kabındaki hücresel bilgileri işaretleyin
MEM Alfa Modifikasyonu (1X)Şangay NianYue Biyoteknoloji Co, LtdSH30265Hücre kültürü
Fare Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücreler Adipojenik Farklılaşma KitiSiyagenMUXMX-90031 SerisiBMSC'nin adipojenik farklılaşması 
Nikon Eclipse Ti2 Ters Mikroskop SenteziJaponya Nikon CorporatinTi2-UHücreleri gözlemleyin ve fotoğraf çekin
Oftalmik makas Şangay NianYue Biyoteknoloji Co, LtdY00030 JZCildi kes
Oftalmik cımbızŞangay NianYue Biyoteknoloji Co, LtdBS-ZER-S-100 BiyokeskinFare kemik dokusu elde edin.
PASTEUR PIPETŞangay NianYue Biyoteknoloji Co, LtdBS-XG-03MKültür ortamını aspire edin
PE Sıçan Anti-Fare CD31 (klon:Ha2/5)BD Biyolojik Bilimler553373Akış sitometrisi 
PE Sıçan IgG2a, κ İzotip Kontrolü (klon:R35-95)BD Biyolojik Bilimler553930Akış sitometrisi 
PE-Siyanin7 Ly-6A/E (Sca-1) Monoklonal Antikor (klon:D7)e-Biyobilim25-5981-82Akış sitometrisi 
PE-Siyanin7 Sıçan IgG2a kappa İzotip Kontrolü (klon:eBR2a)e-Biyobilim25-4321-82Akış sitometrisi 
Penisilin-StreptomisinŞangay NianYue Biyoteknoloji Co, Ltd2585636Hücre kültürü
PerCP-Cy5.5 Sıçan Anti-Fare CD45 (klon:Ha2/5)BD Biyolojik Bilimler561869Akış sitometrisi 
PerCP-Cy5.5 Sıçan IgG2b, κ İzotip Kontrolü (klon:A95-1)BD Biyolojik Bilimler550764Akış sitometrisi 
NeşterCerrahi Alet Fabrikası oShanghai Tıbbi Cihazlar? Group?Co., Ltd. J11010-10# JZFarenin arka uzuvlarını ve gövdesini izole edin ve yabancı dokuları kemikten çıkarın
Steril başlıkThermo Fisher Technology (Çin) Co., Ltd.ECO0.9Cerrahi ameliyat masası
Steril cerrahi örtülerHenan Huayu Tıbbi Ekipman Co, Ltd20160900Steril cerrahi alanı sağlayın
Tüp (50 mL)Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd. BLD-BL2002500Filtrelenmiş hücre çözeltisini saklayın
tripsin-EDTA (%0,25)Gibco25200056Yapışık hücreleri sindirmek
β-gliserofosfatSigma-Aldrich G5422 SerisiBMSC'lerin osteojenik farklılaşması

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chu, D. -T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  2. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Transl. 3 (1), 26-33 (2015).
  3. Li, M., et al. Extracellular vesicles from apoptotic BMSCs ameliorate osteoporosis via transporting regenerative signals. Theranostics. 14 (9), 3583-3602 (2024).
  4. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice. J Vis Exp. (131), e56750(2018).
  5. Chu, D. -T., et al. Adipose tissue stem cells for therapy: An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application. J Clin Med. 8 (7), 917(2019).
  6. Qin, L., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic diseases—the two sides of the same coin. Acta Pharmacol Sin. 44 (2), 268-287 (2023).
  7. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  8. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586(2013).
  9. Grossner, T., Haberkorn, U., Hofmann, J., Gotterbarm, T. Effects of different basal cell culture media upon the osteogenic response of hMSCs evaluated by 99mTc-HDP labeling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6288(2022).
  10. Janda, C. Y., et al. Surrogate Wnt agonists that phenocopy canonical Wnt and β-catenin signalling. Nature. 545 (7653), 234-237 (2017).
  11. Bernar, A., Gebetsberger, J. V., Bauer, M., Streif, W., Schirmer, M. Optimization of the Alizarin Red S assay by enhancing mineralization of osteoblasts. Int J Mol Sci. 24 (1), 723(2022).
  12. Wang, C., et al. Restoration of osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in mice inhibited by cyclophosphamide with psoralen. Chin J Tissue Eng Res. 29 (1), 16-23 (2025).
  13. Papaccio, F., et al. Concise review: Cancer cells, cancer stem cells, and mesenchymal stem cells: Influence in cancer development. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2115-2125 (2017).
  14. Kolf, C. M., Cho, E., Tuan, R. S. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: Regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis Res Ther. 9 (1), 204(2007).
  15. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  16. Abdallah, B. M., et al. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal (mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biol Proced Online. 21 (1), 3(2019).
  17. Liu, S., et al. Single cell sequencing reveals gene expression signatures associated with bone marrow stromal cell subpopulations and time in culture. J Transl Med. 17 (1), 23(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bone Marrow Mesenchymal Stem CellsMesenchymal Stem CellsFlow CytometryCell PurificationCell ExpansionMouse Bone MarrowCell PhenotypingCD29 MarkerCD44 MarkerSca 1 Marker

Related Articles