Gelişmekte Olan Zebra Balığı Kalbindeki Mekanik Kuvvetlerin Manyetik Boncuklar Kullanılarak Manipüle Edilmesi

Summary

Bu protokol, mikrocerrahi yoluyla gelişmekte olan zebra balığı kalbine manyetik bir boncuk aşılamak, mekanik kuvvetlerin in vivo olarak manipüle edilmesini sağlamak ve endokardiyal hücrelerde mekanik uyarana bağlı kalsiyum akışını tetiklemek için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir.

Abstract

Mekanik kuvvetler sürekli olarak kalp kapakçığı morfogenetik programlarına geri bildirim sağlar. Zebra balıklarında kalp kapakçığı gelişimi, kalbin kasılmasına ve atan kalp tarafından üretilen fiziksel uyaranlara dayanır. Kan akışı tarafından yönlendirilen intrakardiyak hemodinamik, embriyonik kalbin gelişimini şekillendiren temel bilgiler olarak ortaya çıkar. Burada, kardiyak lümende 30 μm ila 60 μm çapında bir manyetik boncuk aşılayarak in vivo mekanik kuvvetleri manipüle etmek için etkili bir yöntemi açıklıyoruz. Boncuğun yerleştirilmesi, anestezi uygulanmış larvalarda kalp fonksiyonunu bozmadan mikrocerrahi yoluyla gerçekleştirilir ve sınır koşullarının yapay olarak değiştirilmesini sağlar, böylece sistemdeki akış kuvvetlerini değiştirir. Sonuç olarak, boncuğun varlığı, endokardiyal hücrelerin yaşadığı mekanik kuvvetleri arttırır ve mekanik uyarana bağlı kalsiyum akışını doğrudan tetikleyebilir. Bu yaklaşım, kalp gelişimini yöneten mekanotransdüksiyon yollarının araştırılmasını kolaylaştırır ve kalp kapakçığı morfogenezinde mekanik kuvvetlerin rolü hakkında bilgi sağlayabilir.

Introduction

1970'lerin sonlarında piyasaya sürülmesinden bu yana1, zebra balığı (Danio rerio), kardiyak gelişimin inceliklerini ve konjenital kalp bozukluklarını incelemek için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Fare ve civciv embriyoları da dahil olmak üzere, işlevsel bir kardiyovasküler sisteme dayanan ve erken kalp kusurlarından kurtulamayan çoğu omurgalının aksine, zebra balığı ciddi kalp fenotiplerinin araştırılmasını sağlayarak benzersiz bir avantaj sağlar. Bunun nedeni, pasif difüzyon yoluyla yeterli oksijen tedarikini kolaylaştıran, kalp kasılması ve aktif kan dolaşımı^{olmadığ....}

Protocol

Bu protokolde açıklanan zebra balığı embriyoları ile çalışma prosedürleri, proje lisansı PP6020928 kapsamındaki Avrupa direktifi 2010/63/EU ve İçişleri Bakanlığı yönergelerine uygundur.

1. Boncuk aşılama için zebra balığı embriyolarının elde edilmesi

1. İlgili zebra balığı çizgisini geçin ve embriyoları Danieau'nun ortamında 28,5 °C'de büyütün. Zebra balığı çizgilerini geçme hakkında daha ayrıntılı talimatlar için JoVE Bilim Eğitimi Veritabanına²⁷ bakın.
2. Danieau'nun ortamında% 0.003 PTU konsantrasyonu kullanarak, pigment oluşumunu engellemek için em....

Results

Başarılı boncuk aşılama örnekleri Şekil 3, Video 3 ve Video 4'te gösterilmiştir. Manyetik boncuk, zebra balığı kalbinin atriyumuna doğru bir şekilde yerleştirildi ve engelsiz kan akışına izin verdi ve kanama gözlenmedi. Ek olarak, kalp duvarları çökmeden yapısal bütünlüğünü korumuştur (Şekil 3 ve Video 3). 24 saat sonra, embriyo perikardiyal ödem belirtisi göstermedi ve bu da greftleme prosedürünün başarısını da.......

Discussion

Protokoldeki kritik adımlar ve sorun giderme

Zebra balığı embriyolarının montajı

Embriyoları monte etmek için kullanılan agaroz miktarı önemlidir. Oluşturulan kubbe aşırı büyük olmamalıdır, çünkü bu, boncuğun yüzeyden embriyolara manipülasyonunu engelleyebilir. Tersine, çok küçük olmamalıdır; Agarozun üzerinde, embriyolara ve yumurta sarısına yakın yerleştirilmiş birden fazla boncuk olması .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
< güçlü > Malzemeler< / güçlü >
Zebra balığı yetiştirme, yetiştirme ve embriyo toplama
Cam tabanlı çanak (35 mm x 15  mm)	VWR International	734-2905
Isı bloğu	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Kuyumcular forseps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 inç, Inox alaşımlı
Mikrosantrifüj tüpleri 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipeti
Petri kabı
Stereomikroskop
Reaktifler< / güçlü>
4 mg / mL trikat stok çözeltisi
Danieau'nun ortamı (60x stok çözeltisi)
PureCube Glutatyon MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-fenil-2-tiyoüre)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure düşük erime noktalı agaroz	Invitrogen	16520-050
Danieau'nun orta (60x stok çözeltisi)
34,8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1,6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5,8 g CaCl2 ve orta nokta; 2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2 ve orta nokta; 6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Malzemeleri H2O'da 2 L'lik bir nihai hacme kadar çözün. NaOH kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın, ardından otoklavlayın.
4 mg / mL trikain stok çözeltisi< / güçlü>
400 mg trikamid tozu (Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL çift damıtılmış H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
pH'ı 7'ye ayarlayın, ardından alikot yapın ve -20 ° C'de saklayın.