Bu protokol, mikrocerrahi yoluyla gelişmekte olan zebra balığı kalbine manyetik bir boncuk aşılamak, mekanik kuvvetlerin in vivo olarak manipüle edilmesini sağlamak ve endokardiyal hücrelerde mekanik uyarana bağlı kalsiyum akışını tetiklemek için bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Gelişmekte Olan Zebra Balığı Kalbindeki Mekanik Kuvvetlerin Manyetik Boncuklar Kullanılarak Manipüle Edilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Mekanik kuvvetler sürekli olarak kalp kapakçığı morfogenetik programlarına geri bildirim sağlar. Zebra balıklarında kalp kapakçığı gelişimi, kalbin kasılmasına ve atan kalp tarafından üretilen fiziksel uyaranlara dayanır. Kan akışı tarafından yönlendirilen intrakardiyak hemodinamik, embriyonik kalbin gelişimini şekillendiren temel bilgiler olarak ortaya çıkar. Burada, kardiyak lümende 30 μm ila 60 μm çapında bir manyetik boncuk aşılayarak in vivo mekanik kuvvetleri manipüle etmek için etkili bir yöntemi açıklıyoruz. Boncuğun yerleştirilmesi, anestezi uygulanmış larvalarda kalp fonksiyonunu bozmadan mikrocerrahi yoluyla gerçekleştirilir ve sınır koşullarının yapay olarak değiştirilmesini sağlar, böylece sistemdeki akış kuvvetlerini değiştirir. Sonuç olarak, boncuğun varlığı, endokardiyal hücrelerin yaşadığı mekanik kuvvetleri arttırır ve mekanik uyarana bağlı kalsiyum akışını doğrudan tetikleyebilir. Bu yaklaşım, kalp gelişimini yöneten mekanotransdüksiyon yollarının araştırılmasını kolaylaştırır ve kalp kapakçığı morfogenezinde mekanik kuvvetlerin rolü hakkında bilgi sağlayabilir.
Giriş
1970'lerin sonlarında piyasaya sürülmesinden bu yana1, zebra balığı (Danio rerio), kardiyak gelişimin inceliklerini ve konjenital kalp bozukluklarını incelemek için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Fare ve civciv embriyoları da dahil olmak üzere, işlevsel bir kardiyovasküler sisteme dayanan ve erken kalp kusurlarından kurtulamayan çoğu omurgalının aksine, zebra balığı ciddi kalp fenotiplerinin araştırılmasını sağlayarak benzersiz bir avantaj sağlar. Bunun nedeni, pasif difüzyon yoluyla yeterli oksijen tedarikini kolaylaştıran, kalp kasılması ve aktif kan dolaşımıolmadığında bile hayatta kalmaya izin veren küçük boyutlarıdır 2,3,4. Ayrıca, zebra balığının birçok önemli özelliği arasında, gelişmekte olan kalbin non-invaziv olarak izlenmesini sağlayan embriyolarının optik şeffaflığı vardır 5,6,7,8.
Mekanik kuvvetler sürekli olarak kalp kapakçığı morfogenetik programlarına geri bildirim sağlar 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ve anormal kan akışı, çeşitli kardiyovasküler bozukluklarda ortak bir faktör olarak yaygın olarak kabul edilmektedir23,24. Zebra balığında kalp kapakçığı gelişimi, kalbin kasılmasına ve atan kalp tarafından üretilen mekanik kuvvetlere dayanır. Çoklu zebra balığı mutantları, valvülogenezde kalp tarafından oluşturulan mekanik uyaranların önemini göstermiştir. Dikkat çekici bir şekilde, sessiz kalp (sih) mutantlarında kardiyak troponin T (tnnt2) mutasyonlarına bağlı olarak kalp kasılmasının ve sonuç olarak kan akışının tamamen olmaması, erken morfogenetik aşamalar sırasında doku yakınsaması ve endokardiyal hücre (EdC) kümelenmesinin olmamasına neden olur25.
Kan akışı tarafından üretilen intrakardiyak hemodinamik ve mekanik kuvvetler, zebra balığı embriyonik kalbinin gelişimini şekillendiren temel epigenetik bileşenler olarak ortaya çıkar. Çok sayıda çalışma, zebra balıklarında uygun kardiyak morfogenezin farklı akış uyaranları gerektirdiğini ve bu fizyolojik modellerden sapmaların kalp kapakçığı kusurlarına yol açtığını göstermektedir 10,13,14,22,26. Burada, gelişmekte olan zebra balığı atan kalbi içinde 30 μm ila 60 μm çapında bir manyetik boncuk aşılayarak in vivo mekanik kuvvetleri manipüle etmek için Fukui ve ark.13'ten uyarlanan etkili bir yöntemi açıklıyoruz. Teknik, kalp fonksiyonunu bozmadan, anestezi uygulanmış larvaların kalp lümenine bir boncuğun mikrocerrahi olarak yerleştirilmesini içerir. Boncuğun varlığı, EdC'lerin deneyimlediği mekanik kuvvetlerin amplifikasyonuna yol açar ve mekanik uyarana bağlı kalsiyum akışını13 doğrudan tetikler. Bu yaklaşım, kalp morfogenezini düzenleyen mekanotransdüksiyon yollarının araştırılmasını sağlar ve mekanik kuvvetlerin kapak oluşumundaki rolüne ilişkin anlayışımızı derinleştirmek için bir araç sunar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolde açıklanan zebra balığı embriyoları ile çalışma prosedürleri, proje lisansı PP6020928 kapsamındaki Avrupa direktifi 2010/63/EU ve İçişleri Bakanlığı yönergelerine uygundur.
1. Boncuk aşılama için zebra balığı embriyolarının elde edilmesi
- İlgili zebra balığı çizgisini geçin ve embriyoları Danieau'nun ortamında 28,5 °C'de büyütün. Zebra balığı çizgilerini geçme hakkında daha ayrıntılı talimatlar için JoVE Bilim Eğitimi Veritabanına27 bakın.
- Danieau'nun ortamında% 0.003 PTU konsantrasyonu kullanarak, pigment oluşumunu engellemek için embriyoları döllenmeden 24 saat sonra (hpf) 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) ile tedavi edin.
- Floresan etiketli bir çizgi kullanıyorsanız, boncuk greftlemeye başlamadan önce embriyoları bir floresan stereoskop altında inceleyin ve parlak floresan sergileyen 10-20 sağlıklı embriyo seçin. Embriyoların zarar görmediğinden emin olmak için önceden seçilmiş embriyoları forseps kullanarak stereomikroskop altında nazikçe dekoryonlayın.
2. Zebra balığı embriyolarının montajı
- Danieau'nun %0.02 trikain içeren besiyerinden 20 mL hazırlayın.
- 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde %0.02 trikain içeren %1 düşük erime noktalı (LMP) agarozun 2 mL alikotunu hazırlayın. LMP agarozunu sıvı halde tutmak için tüpleri 38 °C'lik bir ısı bloğuna yerleştirin.
NOT: %1'lik LMP agaroz, montaj ve boncuk aşılama gününde kullanım için önceden hazırlanabilir. - 3-6 dekoryonlu embriyoyu, %0.02 trikatin ile desteklenmiş Danieau'nun besiyerini içeren bir Petri kabına aktarın.
- Embriyolar uyuşturulduğunda, onları minimum orta dereceli 35 mm x 15 mm cam tabanlı bir tabağa aktarın. Bir kubbe oluşturmak için hızlı bir şekilde 300-400 μL %1 LMP agaroz içeren trika ekleyin. Forseps kullanarak, embriyoları, Şekil 1'de gösterildiği gibi, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde, camla temas halinde, düz bir şekilde uzanacak şekilde konumlandırın. Agarozun katılaşması için ~ 4 dakika bekleyin.
NOT: Embriyoların birleştirilmesi için kullanılan agaroz miktarı çok önemlidir. Embriyoların üzerinde birkaç milimetre boşluk bırakırken yeterli kapsama alanı sağlaması gereken yaklaşık 350 μL'lik bir kubbe hedefleyin. Yeni başlayanlar için, bir seferde daha az sayıda embriyo monte etmek daha güvenli bir yaklaşım olabilir.
3. Boncuk aşılama
- Agaroz katılaştıktan sonra, üstüne yaklaşık 0,5 μL manyetik boncuk bırakın.
NOT: Manyetik boncukları aktarmak için 10 μL'lik bir pipet ucu kullanın. 0,5 μL'lik hassas ölçüm gerekli değildir, çünkü boncuklar süspansiyonda yüksek oranda konsantredir. Eğirme işleminden sonra ucu şişeye yerleştirmek, yeterli miktarda boncuk toplamak için yeterli olacaktır. - Agaroz ve boncukların üzerine% 0.02 tricaine içeren bir damla Danieau besiyeri ekleyin.
- Uygun boncuğu seçin.
NOT: Bu adım kritiktir. Boncukların boyutu, çapı 30 μm ila 60 μm arasında değişerek biraz değişebilir, bu nedenle numuneye ve kalp boyutuna göre uygun boncuğu gözle seçmek çok önemlidir. - Uygun boncuk seçildikten sonra, yumurta sarısının üzerine yerleştirmek için cımbız kullanın (Şekil 2A ve Video 1).
- Cımbızın bir kolunu kullanarak yumurta sarısının ortasında bir yumurta sarısı lezyonu veya 'delik' oluşturun (Şekil 2B ve Video 2).
NOT: Lezyonun derinliği yumurta sarısına çok derinden nüfuz etmemelidir; Kardinal ven ile yaklaşık olarak aynı seviyede olmalıdır. Oluşturulan deliğin çapı cımbız kolunun ucuna karşılık gelecektir. Lezyonun yumurta sarısında yapıldığından emin olun ve altlarını hedefleyerek kardinal damarlarla temastan kaçının. Delik oluşturulduğunda tipik olarak az miktarda yumurta sarısı çıkacaktır. - Boncuğu adım 3.5'te oluşturulan lezyonun içine yerleştirin ve venöz kutba ulaşana kadar hafifçe öne doğru itin. Orada, kalp kasılmaları emme oluşturacak ve boncuğu kalp lümenine çekecektir (Şekil 2 ve Video 2).
NOT: Boncuk yerleştirme sırasında venöz duvar kırılır ve yumurta sarısının yüksek yoğunluğu, geniş kanamayı en aza indirmeye yardımcı olur. Yumurta sarısı lezyonu tipik olarak boncuk yerleştirildikten sonra birkaç dakika içinde iyileşir. Bazı embriyolar boncuk greftlemeden 20-24 saat sonra perikardiyal ödem gösterebilir.
4. Zebra balığı embriyolarının sökülmesi
- Monte edilmiş tüm embriyolara manyetik boncuklar aşıladıktan sonra, cam tabanlı tabağa 1-2 mL Danieau'nun PTU içeren besiyerini ekleyin.
- Cımbız kullanarak LMP agarozu nazikçe kırın ve balıkları dikkatlice çıkarın, üzerlerinde agaroz kalmadığından emin olun.
- Bir Pasteur pipeti kullanarak, embriyoları Danieau'nun PTU'lu besiyerini içeren yeni bir Petri kabına aktarın ve 28.5 ° C'de iyileşmelerine ve gelişmelerine izin verin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Başarılı boncuk aşılama örnekleri Şekil 3, Video 3 ve Video 4'te gösterilmiştir. Manyetik boncuk, zebra balığı kalbinin atriyumuna doğru bir şekilde yerleştirildi ve engelsiz kan akışına izin verdi ve kanama gözlenmedi. Ek olarak, kalp duvarları çökmeden yapısal bütünlüğünü korumuştur (Şekil 3 ve Video 3). 24 saat sonra, embriyo perikardiyal ödem belirtisi göstermedi ve bu da greftleme prosedürünün başarısını da...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protokoldeki kritik adımlar ve sorun giderme
Zebra balığı embriyolarının montajı
Embriyoları monte etmek için kullanılan agaroz miktarı önemlidir. Oluşturulan kubbe aşırı büyük olmamalıdır, çünkü bu, boncuğun yüzeyden embriyolara manipülasyonunu engelleyebilir. Tersine, çok küçük olmamalıdır; Agarozun üzerinde, embriyolara ve yumurta sarısına yakın yerleştirilmiş birden fazla boncuk olması ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Protokol hakkındaki tartışma ve yorumları için Vermot lab üyelerine teşekkür ederiz. Imperial College London balık tesisinin tüm personeline minnettarız. Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC) fon almıştır: GA N°682939, Ek Girişimler (ödül numarası 1019496), MRC (MR/X019837/1) ve BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P, Biyomühendislik Bölüm Bursu (Imperial College London) tarafından desteklenmiştir. HF, JSPS KAKENHI (23H04726 ve 24K02207), JST FOREST programı (23719210), Uehara Memorial Vakfı, Hücre Bilimi Araştırma Vakfı, Takeda Tıbbi Araştırma Vakfı ve Novartis Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| < güçlü > Malzemeler< / güçlü > | |||
| Zebra balığı yetiştirme, yetiştirme ve embriyo toplama | |||
| Cam tabanlı çanak (35 mm x 15 mm) | VWR International | 734-2905 | |
| Isı bloğu | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Kuyumcular forseps | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont No. 5, L 4 1/4 inç, Inox alaşımlı |
| Mikrosantrifüj tüpleri 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| Pasteur pipeti | |||
| Petri kabı | |||
| Stereomikroskop | |||
| Reaktifler< / güçlü> | |||
| 4 mg / mL trikat stok çözeltisi | |||
| Danieau'nun ortamı (60x stok çözeltisi) | |||
| PureCube Glutatyon MagBeads | Cube Biotech | 32201 | |
| PTU (1-fenil-2-tiyoüre) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| UltraPure düşük erime noktalı agaroz | Invitrogen | 16520-050 | |
| Danieau'nun orta (60x stok çözeltisi) | |||
| 34,8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 1,6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 5,8 g CaCl2 ve orta nokta; 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 9.78 g MgCl2 ve orta nokta; 6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| Malzemeleri H2O'da 2 L'lik bir nihai hacme kadar çözün. NaOH kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın, ardından otoklavlayın. | |||
| 4 mg / mL trikain stok çözeltisi< / güçlü> | |||
| 400 mg trikamid tozu (Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 97.9 mL çift damıtılmış H2O | |||
| 2.1 mL 1 M Tris (pH 9) | |||
| pH'ı 7'ye ayarlayın, ardından alikot yapın ve -20 ° C'de saklayın. |
Kaynaklar
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84 (1), 4-16 (2012).
- Stainier, D. Y. Zebrafish genetics and vertebrate heart formation. Nat Rev Genet. 2 (1), 39-48 (2001).
- Brown, D. R., Samsa, L. A., Qian, L., Liu, J. Advances in the study of heart development and disease using zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 13(2016).
- Hoo, J. Y., Kumari, Y., Shaikh, M. F., Hue, S. M., Goh, B. H. Zebrafish: A versatile animal model for fertility research. Biomed Res Int. 2016 (2016), 9732780(2016).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (1), R3-R9 (2002).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J. Mechanically activated piezo channels modulate outflow tract valve development through the Yap1 and Klf2-Notch signaling axis. Elife. 8, e44706(2019).
- Vignes, H., et al. Extracellular mechanical forces drive endocardial cell volume decrease during zebrafish cardiac valve morphogenesis. Dev Cell. 57 (5), 598-609.e595 (2022).
- Steed, E., et al. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646(2016).
- Chow, R. W., et al. Cardiac forces regulate zebrafish heart valve delamination by modulating Nfat signaling. PLoS Biol. 20 (1), e3001505(2022).
- Fukui, H., et al. Bioelectric signaling and the control of cardiac cell identity in response to mechanical forces. Science. 374 (6565), 351-354 (2021).
- Vignes, H., Vagena-Pantoula, C., Vermot, J. Mechanical control of tissue shape: Cell-extrinsic and -intrinsic mechanisms join forces to regulate morphogenesis. Semin Cell Dev Biol. 130, 45-55 (2022).
- Juan, T., et al. Multiple pkd and piezo gene family members are required for atrioventricular valve formation. Nat Commun. 14 (1), 214(2023).
- Juan, T., et al. Control of cardiac contractions using Cre-lox and degron strategies in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (3), e2309842121(2024).
- Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J., Chow, R. Mechanotransduction in cardiovascular morphogenesis and tissue engineering. Curr Opin Genet Dev. 57, 106-116 (2019).
- Kalogirou, S., et al. Intracardiac flow dynamics regulate atrioventricular valve morphogenesis. Cardiovasc Res. 104 (1), 49-60 (2014).
- da Silva, A. R., et al. egr3 is a mechanosensitive transcription factor gene required for cardiac valve morphogenesis. Sci Adv. 10 (20), eadl0633(2024).
- Bartman, T., et al. Early myocardial function affects endocardial cushion development in zebrafish. PLoS Biol. 2 (5), E129(2004).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1760-1766 (2016).
- Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), e1000246(2009).
- Bäck, M., Gasser, T. C., Michel, J. B., Caligiuri, G. Biomechanical factors in the biology of aortic wall and aortic valve diseases. Cardiovasc Res. 99 (2), 232-241 (2013).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 53-62 (2009).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J. B., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. 144 (23), 4322-4327 (2017).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- JoVE Science Education database. Biology II: Mouse, zebrafish, and chick. Zebrafish breeding and embryo handling. JoVE. , (2023).
- Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
