Yöntem makalesi

İskemik İnmenin Sıçan Modelinde İmmünofloresan ile Hücre Ölümü Sinyalinin Değerlendirilmesi

1.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67606

⸱

3 Ocak 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Sıçan in vivo modelleri, iskemik inme için patolojik mekanizmaları ve terapötik hedefleri araştırmak için vazgeçilmez araçlardır. Bu çalışma, sıçanlarda orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO) takiben enfarktüslü beyin dilimlerinde immünofloresan boyama gerçekleştirmeyi açıklayacaktır.

Özet

İnme, dünya çapında önde gelen bir ölüm ve sakatlık nedenidir. İnme vakalarının çoğu iskemiktir ve orta serebral arterin (MCA) tıkanmasından kaynaklanır. İskemik inme tedavisi için mevcut farmakolojik yaklaşımlar sınırlıdır; Bu nedenle, inme sonrası iskemik hasara karşı etkili nöroproteksiyon sağlayan yeni tedavilere acilen ihtiyaç duyulmaktadır. İskemik inmeyi takiben beyin dokusunda, iskemik penumbra alanı kurtarılabilir ancak geri dönüşü olmayan hasara ilerleme riski vardır. Enfarktüslü çekirdeği çevreleyen penumbral alan, nöroproteksiyon için kavramsal bir hedeftir. Penumbral bölgede kan akımı kısmen sağlandığından, bu bölgedeki nöronal ve nöronal olmayan hücreler inme sonrası geçici olarak hayatta kalır ve hala canlı olan bu hücreler uygun tıbbi müdahaleler ile kurtarılabilir. Penumbranın patofizyolojisini anlamak, nöroprotektif tedavilerin geliştirilmesinde önemlidir, çünkü iskemik penumbrada aktive olan hücre ölüm yolları, RUNX1 ve katepsinler gibi terapötik hedefleri gösterebilir. Programlanmış hücre ölümünün aracıları olarak işlev gören bu protein hedefleri, translasyonel araştırmalarda daha fazla kullanılabilir. Orta büyüklükte ve insan beynine benzerlik gösteren, MCA oklüzyonunun (MCAO) in vivo sıçan modeli, insan iskemik inmesini taklit eder ve penumbral patolojiyi araştırmak, hücre ölümü sinyalini incelemek ve MCAO bağlamında potansiyel hedeflerin etkilerini değerlendirmek için uygulanabilir bir araç sunar. Burada, sıçanlarda MCAO'nun nasıl indükleneceğini ve MCAO'yu takiben sıçan beyninde hücre ölümü sinyalinin tespiti için immünofloresan boyamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklıyoruz.

Giriş

Serebral inme, dünya çapında önde gelen bir ölüm ve sakatlık nedenidir1. İnmenin yüksek mortalite ve morbiditesi, büyük kamu sağlık hizmeti yüküne ve ciddi sosyo-ekonomik sonuçlara neden olmaktadır. İnme insidansı ve mortalite oranı sabit kalmakla birlikte, inme hastalarının ve inmeye bağlı ölümlerin sayısı on yıllar boyunca artmaktadır 2,3. İnmeler iskemik veya hemorajik olarak kategorize edilebilir. İnme olgularının büyük çoğunluğu bir ana serebral arterin tıkanması sonucu oluşan iskemik inmelerdir4. Bugüne kadar, doku plazminojen aktivatörü (tPA), iskemik inme için FDA onaylı tek ilaçtır, ancak uygulaması dar terapötik pencere, komplikasyonlar ve kontrendikasyonlar ile oldukça sınırlıdır 5,6,7. Bu nedenle, inmenin etkilerini azaltmak için daha geniş bir terapötik pencere ile yeni tedavi seçeneklerinin geliştirilmesi acildir.

Deneysel hayvan modelleri, iskemik inmenin patofizyolojisini incelemek için yararlı araçlardır. Çoğu insan hastasında, iskemik inme orta serebral arterin (MCA) tıkanmasından kaynaklanır8. Bu nedenle, orta serebral arter tıkanıklığının (MCAO) kemirgen modelleri, insan serebral enfarktüsüne benzeyecek şekilde geliştirilmiştir. Küçük hayvan çalışmalarında kullanılan birkaç MCAO yaklaşımı olsa da, en yaygın olarak kullanılan yöntem, dış veya iç karotis arterlerden orta serebral artere bir naylon filament yerleştirilmesini içeren ve kan akışının geçici veya kalıcı olarak tıkanmasına neden olan intraluminal sütür modelidir 4,9. Bu model, büyük miktarda serebral enfarktüse yol açar ve enfarktüslü beyin dokusundaki hücre ölümü sinyallerinin immünofloresan tekniklerle incelenmesine izin verir.

Penumbra olarak adlandırılan enfarktüslü çekirdeği çevreleyen alan, potansiyel inme tedavileri için hedeftir10,11. Penumbradaki kan akışı kısmen korunduğundan, bu bölgedeki yaralı nöronlar ve nöronal olmayan hücreler, hücre ölümü sinyalinin aktivasyonunu inhibe ederek kurtarılabilir. Hücre ölüm yolaklarını hedeflemek, inme12 sonrası nöroproteksiyon için umut verici bir strateji olabilir. Bu nedenle, hücre ölümü sinyalinin değerlendirilmesi deneysel inme araştırmaları için çok önemlidir. Son zamanlarda, bir lizozomal proteaz olan katepsin-B'nin inme sonrası programlanmış hücre ölümüne aracılık etmede rol oynadığı gösterilmiştir ve nörolojik alanda önemli bir ilgi görmüştür13. Katepsin-B, daha fazla araştırmayı hak eden nöroproteksiyon için potansiyel bir hedefi temsil eder.

Bu makale, sıçanlarda intraluminal sütür yaklaşımı kullanılarak MCAO'nun nasıl indükleneceğini göstermektedir. Ayrıca, Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick-end etiketleme (TUNEL) boyaması kullanarak enfarktüs boyutunu belirlemek ve apoptotik hücreleri tespit etmek için 2,3,5-trifeniltetrazalyum klorür (TTC) boyamanın nasıl gerçekleştirileceğini de gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol ve burada bildirilen deneyler Sichuan Üniversitesi Tıp Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanların bakımı ve kullanımı yerel ve uluslararası etik kriterlere uygundu.

NOT: Bu çalışmada 250-280 g ağırlığındaki erişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları kullanıldı. Sıçanlar standart bir çevresel koşulda (20-22 ° C sıcaklık, 12 saat aydınlık / karanlık döngü) barındırıldı, standart bir sıçan formülü diyeti ve yüksek saflıkta su ile beslendi. Cerrahi işlem steril şartlarda yapıldı.

1. MCAO'nun sıçan modeli

  1. 1 L / dk'da oksijen ile% 4 izofluran kullanarak ilk anesteziyi indükleyin. Ayak tutamıyla anestezi derinliğini izleyin. Anestezi sağlanırken, kuruluğu önlemek için oküler bir merhem uygulayın. Sıçana hacim takviyesi olarak deri altına 1 mL salin ve preoperatif analjezi için 5 mg / kg karprofen ve 0.1 mg / kg buprenorfin enjekte edin. İzofluranı başlangıçta %3,5'e ve ardından ameliyat boyunca kademeli olarak %2'ye düşürün.
  2. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve vücut ısısını, rektal sıcaklık izleme probu ile düzenlenmiş bir ısı matı üzerinde 36,5 ± 0,1 ° C'de tutun. Boyundaki cildi iyodofor dezenfekte edici bir solüsyonla tıraş edin ve dezenfekte edin.
  3. Boyunda 2 cm'lik orta hat kesisi yapın ve şah damarlarını ortaya çıkarmak için yumuşak dokuları geri çekin. Sağ ortak karotis arteri (CCA), eksternal karotis arteri (ECA) ve internal karotis arteri (ICA) izole etmek için forseps kullanın.
  4. Proksimal sağ CCA'yı bağlamak için dikişler kullanın ve sağ ICA ve ECA'yı kökenlerinde bir mikro klips ile klempleyin.
  5. Küçük bir kesiden CCA'nın lümenine yuvarlak bir silikon uçla kaplanmış bir naylon monofilament yerleştirin ve naylon monofilamentin kanamasını ve yerinden çıkmasını önlemek için CCA'ya bir düğüm atın.
  6. Sağ ICA mikro klipsini açın ve naylon monofilamenti, silikon uç MCA'nın kökenini (~ 18-20 mm) tıkayana kadar ICA güdüğü boyunca sağ orta serebral artere (MCA) yerleştirin.
  7. Naylon monofilamentin açıkta kalan kısmını kesin ve boyun orta hattı kesisini kapatın.
  8. MCA'nın 2 saat tıkanmasından sonra, boyun kesisini açın ve CCA'daki düğümü çözün. Ardından, MCA'yı yeniden perfüze etmek için naylon monofilamenti geri çekin. Distal sağ CCA'yı bağlayın ve boyun insizyonunu sürekli veya kesintili dikişlerle kapatın.
  9. Ameliyat sonrası, her 8 saatte bir, 0.03 mg / kg'lık bir dozda deri altı enjeksiyonla buprenorfin verin. Anesteziden iyileşme boyunca fareleri, sıcaklık ayarlı bir ısıtma matı ile ısıtılmış bir kafeste gözlemleyin. Yemek yemeyi teşvik etmek için, kafese püre haline getirilmiş bir Petri kabı yerleştirin. Ameliyattan sonra kafes başına bir sıçan barındırın.
  10. Sahte fareleri monofilament yerleştirilmeden aynı prosedüre tabi tutun.
    NOT: Enfarktüs boyutu ölçümü (n = 3), immünofloresan analizi (n = 3) ve apoptoz tespiti (n = 3) için her grupta toplam 9 hayvan kullanılır.
  11. MCAO'dan 2 saat sonra ve reperfüzyondan 22 saat sonra nörolojik fonksiyonu 0-5 puanlık bir ölçek14 ile Zea-Longa davranışsal derecelendirme ölçeğini kullanarak değerlendirin. 0 veya 4 puan alan oranları hariç tutun.

2. Enfarktüs boyutunun ölçülmesi (Şekil 1)

  1. Fareleri derin anestezi altında (% 4 izofluran) giyotin ile kurban edin ve tüm beyni kafatasından dikkatlice izole edin.
  2. Beyni -20 °C'de 20 dakika dondurun ve donmuş beyni, dilimler arasında 2 mm mesafe olacak şekilde altı koronal dilime kesin. Beyin dilimlerini karanlıkta 37 °C'de 15 dakika boyunca %2 TTC ile boyayın.
  3. Beyin dilimlerini oda sıcaklığında (RT) 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Lekeli dilimleri, yakın çekim nesneler için otomatik mod ayarına sahip bir dijital fotoğraf makinesiyle fotoğraflayın.
  4. Resimleri bir bilgisayara aktarın ve ImageJ kullanarak enfarktüs boyutunu ölçün. Enfarktüs boyutunu, 6 dilimdeki enfarktüs alanının toplamının aynı dilimlerdeki tüm beyin alanının toplamına oranı olarak sunun. Verileri ortalamanın (SEM) standart hatası ± ortalama olarak ifade edin.

3. Beyin kriyoseksiyonunda immünofloresan analizi (Şekil 2)

  1. % 4 izofluran ve 1 L / dak oksijen ile anesteziyi indükleyin. Kalbi açığa çıkarmak için cildi ve deri altı dokuyu kesin.
  2. Perikardımı çıkarın ve sağ atriyumda küçük bir kesi yapın. Sol ventrikülden 200 mL salin ve ardından 200 mL %4 paraformaldehit perfüze edin.
  3. Kafatasını açın ve sağlam beyni çıkarın.
  4. Beyni 24 saatten fazla RT'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Daha sonra, doku batana kadar, her konsantrasyon için yaklaşık 6-8 saat, %10, %15 ve %30 konsantrasyonlarda bir dizi sükroz çözeltisi gradyanında kurutun.
  5. Beyni optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömün ve varsa hava kabarcıklarını çıkarın. Ardından, beyni sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 ° C dondurucuda saklayın.
  6. Beyni 5 μm kalınlığında bir kriyostat kullanarak bölümlere ayırın. Kesit boyunca kabin sıcaklığının -18 °C ile -20 °C arasında kaldığından emin olun. Kesit konumunu model alanına ve deney koşullarına göre etiketleyin. Bölümleri bir dondurucuda saklayın.
  7. İmmünofloresan boyama yapmak için donmuş bölümlerin ~ 30 dakika boyunca RT'de dengelenmesine izin verin. Ardından, bölümleri steril PBS 3x ile her biri 5 dakika bekletin.
  8. Dokuyu bir immünohistokimya kalemi ile çizin. RT'de 20 μg / mL Proteinaz K (RNaz içermeyen) ve% 0.3 Triton X-100 ile 10 dakika inkübe edin.
  9. Bölümleri steril PBS 3x ile her biri 5 dakika bekletin. Belirtilen dokuya% 3 BSA uygulayın ve bloke etmek için 1 saat RT'de inkübe edin.
  10. Bloke ettikten sonra çözeltiyi çıkarın, uygun birincil antikoru ekleyin (Tavşan rekombinant monoklonal katepsin-B antikoru, 1:200) ve bölümleri gece boyunca karanlıkta 4 ° C'de inkübe edin.
  11. Birincil antikoru çıkarın ve bölümleri her biri 5 dakika boyunca% 0.1 Tween-20 3x içeren steril PBS ile yıkayın.
  12. Gerekli florofor ile uygun ikincil antikoru (Keçi Anti-Sıçan IgG [H + L] [FITC konjuge], 1:200) ekleyin ve bölümleri ışıktan koruyarak RT'de nemlendirilmiş bir odada 1 saat inkübe edin.
  13. İkincil antikor inkübasyonundan sonra, bölümleri her biri 5 dakika boyunca% 0.1 Tween-20 3x içeren steril PBS ile yıkayın. Bölümleri DAPI içeren bir montaj ortamı ile boyayın ve bir lamel ile örtün.
  14. Aşağıdaki ayarlara sahip bir floresan mikroskobu kullanarak görüntü yakalayın: 488 nm uyarma dalga boyu, 520 nm emisyon dalga boyu ve 500 ms pozlama süresi. Uzun süreli koruma için bölümleri karanlıkta 4 °C'de saklayın.

4. TUNEL boyaması ile apoptozun saptanması (Şekil 3)

NOT: TUNEL boyama için ticari bir TUNEL test kiti kullanılır. Bu TUNEL kiti, bir DNaz I Tampon çalışma çözeltisi, deoksinükleotidil transferaz (TdT) dengeleme tamponu, etiketleme çalışma çözeltisi ve DAPI çalışma çözeltisi içerir.

  1. Yukarıdakiyle aynı prosedürü kullanarak beyni perfüze edin ve izole edin (adım 3.2-3.3). Fiksasyon için beyni 3-4 saat boyunca% 4 paraformaldehite daldırın.
  2. Beyni, rostral uçtan kaudal uca kadar yaklaşık 2 mm kalınlığında koronal dilimler halinde kesin ve 12 saat daha% 4 paraformaldehite daldırın. Fiksasyondan sonra beyin dilimlerini 1 saat akan suda yıkayın.
  3. Beyin dilimlerini dehidrasyon için her biri 35-50 dakika boyunca sırayla %50, %70, %80, %90, %95 ve %100 konsantrasyonlarda etanol çözeltilerine daldırın.
  4. Beyin dilimlerini 35-50 dakika boyunca TO tipi şeffaf biyolojik ajan I ile tedavi edin, ardından doku tamamen şeffaf olana kadar 35-50 dakika boyunca ajan II'yi temizleyin.
  5. Beyin dilimlerini sırayla 60 dakika boyunca ortam I'e, 60 dakika boyunca ortam II'ye, 60 dakika boyunca ortam III'e ve 60 dakika boyunca ortam IV'e daldırın.
  6. Beyin dilimlerini bir gömme kasetine yerleştirin. Kaseti kapatın, net bir şekilde etiketleyin ve katılaşması için soğuk bir hava deposuna koyun.
  7. Doku bloğunu kesmek için mikrotomu 10 μm'lik bir başlangıç kalınlığına ayarlayın. Ardından, dilimleme için kalınlığı 5 μm'ye ayarlayın.
  8. Su banyosunu 45 °C'ye ısıtın, doku bölümlerini su yüzeyinde yüzdürün ve slaytlara alın. Yaklaşık 30 saniye sonra slaytları çıkarın, RT'de kurutun ve bir kurutma kutusunda saklayın.
  9. Depolanan beyin bölümlerini, her biri 10 dakika olmak üzere 2 döngü boyunca bir temizleme maddesine batırarak deparafinize edin.
  10. Bölümleri yeniden sulandırmak için, 3 kez tekrarlayarak 5 dakika susuz etanolde bekletin. Bölümleri 3 dakika boyunca% 90 etanole aktarın. Ayrıca, bölümleri 3 dakika boyunca% 80 etanol içinde bekletin. Son olarak, bölümleri 3 dakika boyunca %70 etanole batırın.
  11. Numuneleri PBS 3x'te her biri 5 dakika durulayın. Filtre kağıdı kullanarak fazla nemi nazikçe alın.
  12. Her numuneye 100 μL 1x proteinaz K çalışma solüsyonu uygulayın ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin. Geçirgenleştirmeyi takiben, numuneleri PBS 3x'te her biri 5 dakika durulayın.
  13. Pozitif kontrol için numuneler hazırlayın.
    1. Geçirgen numuneye 100 μL 1x DNaz I Tampon çalışma solüsyonu (TUNEL tahlil kiti) ekleyin ve 5 dakika boyunca RT'de dengelenmesine izin verin. Emici kağıt kullanarak numunedeki fazla sıvıyı dikkatlice çıkarın.
    2. Numuneye 100 μL seyreltilmiş DNaz I çalışma çözeltisi (200 U/mL) ekleyin ve 37 °C'de 10-30 dakika inkübe edin. Numuneleri PBS 3x'te her biri 5 dakika durulayın.
  14. Negatif kontrol için numuneler hazırlayın.
    1. Geçirgen numuneye 100 μL 1x DNaz I Tampon çalışma solüsyonu uygulayın ve RT'de 5 dakika dengeleyin. Negatif kontrol numunesini DNaz I Tamponu ile 37 °C'de 10-30 dakika inkübe edin ve DNaz I enzimi eklenmediğinden emin olun. Numuneleri PBS 3x'te her biri 5 dakika durulayın.
  15. Her numuneye 100 μL terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) dengeleme tamponu (TUNEL test kiti) uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 10-30 dakika inkübe edin. Ardından, TdT Dengeleme Tamponunu emici kağıtla çıkarın.
  16. Her numuneye 50 μL etiketleme çalışma solüsyonu (TUNEL test kiti) ekleyin, ardından bunları 37 °C'de nemlendirilmiş, karanlık bir odada 60 dakika inkübe edin. Sinyal yoğunluğu düşükse, DNA etiketleme reaksiyon süresini uzatmayı düşünün. Ardından, numuneleri PBS 3x'te her biri 5 dakika durulayın.
  17. Fazla nemi lekeledikten sonra, DAPI çalışma solüsyonunu (TUNEL tahlil kiti) uygulayın ve çekirdekleri lekelemek için karanlıkta 5 dakika boyunca RT'de inkübe edin. Ardından, numuneleri PBS 4x'te her biri 5 dakika durulayın. Fazla sıvıyı emici kağıtla çıkarın ve solmaya karşı dayanıklı bir montaj ortamı kullanarak slaytları kapatın.
  18. Vectra Polaris multispektral görüntüleme sistemini kullanarak lekeli slaytları tarayın ve sistem yazılımı ile verileri analiz edin.

5. İstatistiksel analiz

  1. Deneysel sonuçları SEM ± bir araç olarak sunun ve GraphPad Prism 10 yazılımını (GraphPad Software, San Diego, CA) kullanarak iki grup karşılaştırması için bir Öğrenci t-testi ile verileri analiz edin.
  2. İstatistiksel fark olarak 0,05'ten küçük bir p değeri ayarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sıçanlar MCAO sırasında 120 dakika iskemiye ve ardından 22 saat reperfüzyona tabi tutulur. MCAO cerrahisi sırasında mortalite oranı minimaldi ve reperfüzyon süresi içinde % civarındaydı. MCAO grubunda önemli beyin hasarı gözlenirken, Sham grubunun beyninde enfarktüs gözlenmedi (24.87 ± %1.21'e karşı %0 enfarktüs alanı toplamı; MCAO [n = 3] vs. Sham [n = 3], P < 0.001; Şekil 1A,B). MCAO grubunda, katepsin-B'nin immünoreaktiviteleri iskemik çekirdekte belirgin artı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Serebral arterin tıkanması, oksijen ve beslenme yoksunluğuna, ardından reaktif oksijen türlerinin aktivasyonuna, hücre içi kalsiyum aşırı yüklenmesine, glutamat salınımına ve inflamatuar yanıtların indüksiyonuna yol açar15. Bu olaylar dizisi, enfarktüslü beyinde hücre ölümü ve geri dönüşü olmayan doku hasarı ile sonuçlanır. Penumbra, uygun bir terapötik pencere içinde tıbbi müdahale ile potansiyel olarak kurtarılabilir16. İskemik inme için ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Simiao Wu, Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı (2024YFHZ0330) ve Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi tarafından desteklendi. Weihong He, Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı (2023YFS0297) ve Sichuan Üniversitesi tarafından desteklendi. Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi Araştırma Çekirdek Tesisi'nden Yi Zhang ve Yue Li'ye TUNEL görüntüleme ve analizi konusundaki teknik destekleri için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/AVectra Polaris multispektral görüntüleme sistemi 
Susuz etanolChengdu Jinshan Kimyasal Reaktif Co.N/A
BuprenorfinBatı Çin HastanesiN/A
CarprofenBatı Çin HastanesiN/A
Katepsin-B antikoruAbcamAb214428
KriyostatLEICA LEICA CM 1950
Dijital fotoğraf makinesiOLYMPUSTG-7
Keçi Anti-Sıçan IgG (H + L) (FITC konjuge)Elabscience  E-AB-1021
Keçi serumuSolarbioSL038
GraphPad Prism 10 yazılımıN/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
İmmünohistokimya kalemiBiosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
InForm yazılımıAkoya BiosciencesSürüm 2.6.0multispektral görüntüleme sistemi için sistem yazılımı 
İyodofor dezenfeksiyon çözümüHuatian Technology Industry Co.Yok
İzofluranRWD Yaşam Bilimleri A.Ş.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
DAPISolarbioS2110
Naylon monofilamentRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/
Optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiEprediaN/A
ParaformaldehitBiosharpN/A
Fosfat tampon çözeltisi (PBS)SolarbioN/A
PrismGraphPad Sürüm 10
Proteinaz KTiangenRT403-02
TuzluKelun Co.Yok
Sprague-Dawley sıçanlarıHuafukang Co.N/A
SükrozBioFroxx1245GR500
Cerrahi aletlerRWD Life Science Co.N/A
TO-tipi şeffaf biyolojik ajan   Pekin Solarbio Bilim & Teknoloji A.Ş.http://www.solarbio.net/
Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) çözeltisiSolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
TUNEL kitiElabscience  E-CK-A321
içeren montaj ortamı Serisi

Kaynaklar

  1. Tsao, C. W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2023 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 147 (8), e93-e621 (2023).
  2. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  3. Hankey, G. J. Stroke. Lancet. 389 (10069), 641-654 (2017).
  4. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  5. Barthels, D., Das, H. Current advances in ischemic stroke research and therapies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (4), 165260(2020).
  6. Frank, D., Zlotnik, A., Boyko, M., Gruenbaum, B. F. The development of novel drug treatments for stroke patients: A review. Int J Mol Sci. 23 (10), 5796(2022).
  7. Wang, S. -N., et al. Humanized cerebral organoids-based ischemic stroke model for discovering of potential anti-stroke agents. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (3), 513-523 (2023).
  8. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol Biochem Behav. 87 (1), 179-197 (2007).
  9. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  10. Donnan, G. A., Baron, J. C., Ma, H., Davis, S. M. Penumbral selection of patients for trials of acute stroke therapy. Lancet Neurol. 8 (3), 261-269 (2009).
  11. Lo, E. H. A new penumbra: transitioning from injury into repair after stroke. Nat Med. 14 (5), 497-500 (2008).
  12. Datta, A., et al. Cell death pathways in ischemic stroke and targeted pharmacotherapy. Transl Stroke Res. 11 (6), 1185-1202 (2020).
  13. Gaire, B. P., Subedi, L., Teramoto, H., Hu, B. Cerebral Ischemia. , Exon Publications. Brisbane, Australia. (2021).
  14. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  15. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  16. Fisher, M. The ischemic penumbra: identification, evolution and treatment concepts. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 1-6 (2004).
  17. Adams, H. P. Jr, et al. Guidelines for the early management of adults with ischemic stroke: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, Clinical Cardiology Council, Cardiovascular Radiology and Intervention Council, and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Circulation. 115 (20), e478-e534 (2007).
  18. Fonarow, G. C., et al. Timeliness of tissue-type plasminogen activator therapy in acute ischemic stroke: patient characteristics, hospital factors, and outcomes associated with door-to-needle times within 60 minutes. Circulation. 123 (7), 750-758 (2011).
  19. Yamori, Y., Horie, R., Handa, H., Sato, M., Fukase, M. Pathogenetic similarity of strokes in stroke-prone spontaneously hypertensive rats and humans. Stroke. 7 (1), 46-53 (1976).
  20. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne stroke registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  21. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
  22. Garcia, J. H., Liu, K. F., Ho, K. L. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex. Stroke. 26 (4), discussion 643 636-642 (1995).
  23. Türeyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56 (1 Suppl), discussion 196-200 196-200 (2005).
  24. Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
  25. Naqvi, S. A. R., et al. Biochemistry of Drug Metabolizing Enzymes. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  26. Yadati, T., Houben, T., Bitorina, A., Shiri-Sverdlov, R. The ins and outs of cathepsins: Physiological function and role in disease management. Cells. 9 (7), 1679(2020).
  27. Liu, C. L., et al. Cysteine protease cathepsins in cardiovascular disease: from basic research to clinical trials. Nat Rev Cardiol. 15 (6), 351-370 (2018).
  28. O'Toole, D., et al. Signalling pathways linking cysteine cathepsins to adverse cardiac remodelling. Cell Signal. 76, 109770(2020).
  29. Luke, C. J., et al. Lysoptosis is an evolutionarily conserved cell death pathway moderated by intracellular serpins. Commun Biol. 5 (1), 47(2022).
  30. Xie, Z., et al. Cathepsin B in programmed cell death machinery: mechanisms of execution and regulatory pathways. Cell Death Dis. 14 (4), 255(2023).
  31. Nagakannan, P., Islam, M. I., Conrad, M., Eftekharpour, E. Cathepsin B is an executioner of ferroptosis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (3), 118928(2021).
  32. Conus, S., Simon, H. U. Cathepsins: key modulators of cell death and inflammatory responses. Biochem Pharmacol. 76 (11), 1374-1382 (2008).
  33. Bhoopathi, P., et al. Cathepsin B facilitates autophagy-mediated apoptosis in SPARC overexpressed primitive neuroectodermal tumor cells. Cell Death Differ. 17 (10), 1529-1539 (2010).
  34. Ding, X., Zhang, C., Chen, H., Ren, M., Liu, X. Cathepsins trigger cell death and regulate radioresistance in glioblastoma. Cells. 11 (24), 4108(2022).
  35. He, W., et al. Inhibition of myocardial cathepsin-L release during reperfusion following myocardial infarction improves cardiac function and reduces infarct size. Cardiovasc Res. 118 (6), 1535-1547 (2022).
  36. McCarroll, C. S., et al. Runx1 deficiency protects against adverse cardiac remodeling after myocardial infarction. Circulation. 137 (1), 57-70 (2018).
  37. Song, J., et al. Age-related promoter-switch regulates Runx1 expression in adult rat hearts. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 541(2023).
  38. Riddell, A., et al. RUNX1: an emerging therapeutic target for cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 116 (8), 1410-1423 (2020).
  39. Chen, H., et al. Pharmacological inhibition of RUNX1 reduces infarct size after acute myocardial infarction in rats and underlying mechanism revealed by proteomics implicates repressed cathepsin levels. Funct Integr Genomics. 24 (3), 113(2024).
  40. Petanceska, S., Burke, S., Watson, S. J., Devi, L. Differential distribution of messenger RNAs for cathepsins B, L and S in adult rat brain: an in situ hybridization study. Neuroscience. 59 (3), 729-738 (1994).
  41. Chaitanya, G. V., Babu, P. P. Activation of calpain, cathepsin-b and caspase-3 during transient focal cerebral ischemia in rat model. Neurochem Res. 33 (11), 2178-2186 (2008).
  42. Yuan, D., Liu, C., Wu, J., Hu, B. Inactivation of NSF ATPase leads to cathepsin b release after transient cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 9 (3), 201-213 (2018).
  43. Hill, I. E., Preston, E., Monette, R., MacManus, J. P. A comparison of cathepsin B processing and distribution during neuronal death in rats following global ischemia or decapitation necrosis. Brain Res. 751 (2), 206-216 (1997).
  44. Kilinc, M., et al. Lysosomal rupture, necroapoptotic interactions and potential crosstalk between cysteine proteases in neurons shortly after focal ischemia. Neurobiol Dis. 40 (1), 293-302 (2010).
  45. Seyfried, D., et al. Cathepsin B and middle cerebral artery occlusion in the rat. J Neurosurg. 87 (5), 716-723 (1997).
  46. Saido, T. C., Yokota, M. Neurodegenerative diseases as proteolytic disorders: brain ischemia and Alzheimer's disease. Tanpakushitsu Kakusan Koso. 42 (14 Suppl), 2408-2417 (1997).
  47. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsins b induces neuroprotection against secondary degeneration in ipsilateral substantia nigra after focal cortical infarction in adult male rats. Front Aging Neurosci. 10, 125(2018).
  48. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsin b alleviates secondary degeneration in ipsilateral thalamus after focal cerebral infarction in adult rats. J Neuropathol Exp Neurol. 75 (9), 816-826 (2016).
  49. Pluta, R., Salínska, E., Puka, M., Stafiej, A., Lazarewicz, J. W. Early changes in extracellular amino acids and calcium concentrations in rabbit hippocampus following complete 15-min cerebral ischemia. Resuscitation. 16 (3), 193-210 (1988).
  50. Hatsuta, H., et al. Tau and TDP-43 accumulation of the basal nucleus of Meynert in individuals with cerebral lobar infarcts or hemorrhage. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 49(2019).
  51. van Groen, T., Puurunen, K., Mäki, H. M., Sivenius, J., Jolkkonen, J. Transformation of diffuse beta-amyloid precursor protein and beta-amyloid deposits to plaques in the thalamus after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats. Stroke. 36 (7), 1551-1556 (2005).
  52. Gómez-Sintes, R., Ledesma, M. D., Boya, P. Lysosomal cell death mechanisms in aging. Ageing Res Rev. 32, 150-168 (2016).
  53. Heimer, S., Knoll, G., Schulze-Osthoff, K., Ehrenschwender, M. Raptinal bypasses BAX, BAK, and BOK for mitochondrial outer membrane permeabilization and intrinsic apoptosis. Cell Death Dis. 10 (8), 556(2019).
  54. Elena-Real, C. A., et al. Cytochrome c speeds up caspase cascade activation by blocking 14-3-3ε-dependent Apaf-1 inhibition. Cell Death Dis. 9 (3), 365(2018).
  55. Linfante, I., et al. Clinical and vascular outcome in internal carotid artery versus middle cerebral artery occlusions after intravenous tissue plasminogen activator. Stroke. 33 (8), 2066-2071 (2002).
  56. Farges, M. C., et al. Increased muscle proteolysis after local trauma mainly reflects macrophage-associated lysosomal proteolysis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 282 (2), E326-E335 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm nofloresan BoyamaS an nme ModeliOrta Serebral Arter Okl zyonuPenumbra N roproteksiyonuKatepsin B EkspresyonuTUNEL BoyamaApoptoz TespitiBeyin Dokusu Analizi

İlgili makaleler