Method Article

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

DOI:

10.3791/67610

⸱

January 17th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yaşlanma sırasında C. elegans'ın çoklu dokularında mitokondriyal morfolojiyi görüntülemek için standart bir yaklaşım sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğu ökaryotik hücrede bulunan önemli hücresel organeller olan mitokondri, aerobik solunum yoluyla enerji üretiminin ana bölgeleridir. 'Hücresel güç merkezi' olarak iyi bilinen bu rolün ötesinde, mitokondri, hücresel metabolizmanın düzenlenmesi, proliferasyon, bağışıklık sinyali ve hormonal sinyalizasyon dahil olmak üzere diğer birçok temel hücresel süreçte de yer alır. Yaşlanma sırasında veya mitokondriyal stres altında mitokondriyal fonksiyondaki bozulma genellikle mitokondriyal morfoloji ve hacimdeki belirgin değişikliklerle karakterize edilir. Nematod C. elegans , şeffaf gövdesi ve kısa ömrü nedeniyle bu değişiklikleri incelemek için ideal bir modeldir, bu da ömrü boyunca canlı mikroskopiyi kolaylaştırır. Bununla birlikte, C. elegans alanı içinde bile, mitokondriyal görüntüleme için her biri kendi sınırlamalarına sahip çok sayıda transgenik yapı ve yöntem mevcuttur. Burada, tek kopyalı, matris lokalize GFP yapıları, C. elegans'ta mitokondriyal morfolojiyi görüntülemek için sağlam ve güvenilir bir yöntem olarak sunulmuştur. Bu çalışma, yaşlanma sürecinde mitokondriyal görüntüleme gerçekleştirirken hataları en aza indirmek ve tekrarlar arasındaki ve çalışmalar arasındaki değişkenliği azaltmak için deneysel olarak kontrol edilebilir faktörlere özellikle odaklanmaktadır. Ek olarak, mitoMAPR, yaşlanma sırasında doku tipleri arasında mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri ölçmek için sağlam bir yöntem olarak önerilmektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, bir çift fosfolipid zarı ile çevrili hücresel organellerdir ve metabolizma ve enerji üretimi için anahtar bölge olarak hücresel biyoenerjetik değerlerin korunmasında önemli bir rol oynar1. Çok sayıda mitokondri, hücresel talepleri karşılamak için sürekli olarak ATP şeklinde enerji üretir2. Bu önemli rollere ek olarak, mitokondri ayrıca sinyal iletimi, otofaji, doğuştan gelen bağışıklık, hücre döngüsü ve hücre ölüm yolları gibi karmaşık hücresel süreçlere de katılır 2,3. Mitokondri, değişen enerji gereksinimlerine ve mitokondriyal sağlığa bağlı olarak, küçük bireysel organellerden geniş birbirine bağlı tübüler ağlara kadar çeşitli morfolojiler sergiler4.

Mitokondrinin önemli bir özelliği, sıkı bir şekilde koordine edilmiş ve sürekli bir fisyon ve füzyon olayları dizisi yoluyla bu çeşitli formlar arasında geçiş yapabildikleri dinamik doğalarıdır4. Bu karşıt süreçler arasındaki kesin denge, mitokondriyal morfolojiyi, sayıyı, boyutu ve sitoplazma5 içindeki konumlandırmayı düzenler. Ek olarak, bu füzyon ve fisyon işlemleri, mitokondri5'in kalite kontrolünü sürdürmek için önemlidir. Örneğin, mitokondriyal fisyon, hasarlı mitokondrinin mitofaji yoluyla uzaklaştırılmasının ve mitokondrinin otofaji2 yoluyla seçici olarak uzaklaştırılmasının önemli bir bileşenidir. Mitokondriyal dinamikler ayrıca hücre bölünmesi, gelişimi, çeşitli stres faktörlerine direnç ve hücresel metabolizmanın sürdürülmesinde önemli bir rol oynar6.

Mitokondriyal dinamiklerin bozulması, nörodejeneratif bozukluklar, metabolik hastalıklar, kardiyovasküler hastalıklar ve kanserler dahil olmak üzere çok sayıda hastalıkta rol oynar4. Ek olarak, yaşlanma, büyük ölçüde bu füzyon-fisyon dinamiklerindeki değişikliklere bağlı olarak mitokondrinin dramatik bir şekilde yeniden şekillenmesiyle ilişkilidir7. Bu nedenle, çeşitli stres veya hastalık koşulları altında ve yaşlanma süreci boyunca mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri görselleştirmek ve izlemek, hücresel işlevi, hastalık mekanizmasını ve potansiyel terapötik stratejileri anlamak için değerli bilgiler sunar.

Birçok moleküler yol gibi, mitokondriyal dinamikler ve işlev de nematod Caenorhabditis elegans gibi model organizmalar da dahil olmak üzere ökaryotlarda yüksek oranda korunur. İnsan hücrelerine benzer şekilde, C. elegans'taki mitokondriyal füzyon, sırasıyla dış mitokondriyal zarın (OMM) ve iç mitokondriyal zarın (IMM) füzyonunu kontrol eden FZO-1 (memeli Mfn1/2'nin ortoloğu) ve EAT-3 (memeli Opa1'in ortoloğu) dahil olmak üzere dinamin ile ilişkili guanin trifosfataz (GTPaz) proteinlerinin işlevi ile elde edilir8. Mitokondriyal fisyon, mitokondriyal dış zarın etrafında mitokondriyal zarları daraltan ve sonunda ayıran halka benzeri kompleksler oluşturarak mitokondriyal fisyonu destekleyen dinamin ile ilişkili protein (DRP-1, insan Drp1'in ortoloğu) tarafından düzenlenir9. Mitokondriyal füzyon, mitokondriyal DNA, proteinler ve lipitler dahil olmak üzere mitokondriyal içeriklerin karıştırılmasına izin vererek, kısmen hasar görmüş mitokondrinin sağlıklı mitokondri9'dan elde edilen içeriklerle tamamlanmasına izin vererek mitokondriyal kalite kontrolünde çok önemli bir rol oynar. Öte yandan, mitokondriyal fisyon, mitokondrinin bölünmesine izin verir, yeni mitokondri oluşturur ve bunların sadece sitoplazma içinde değil, aynı zamanda hücre bölünmesi sırasında yavru hücrelere de dağıtımını kolaylaştırarak uygun mitokondriyal kalıtım ve işlevsağlar 9. Bu olay aynı zamanda hasarlı veya işlevsiz mitokondriyal segmentleri ayırmak için de gereklidir, bu daha sonra mitofaji9 yoluyla bozunma için hedeflenebilir.

C. elegans, tam genom ve genetik modifikasyonları kolaylaştıran CRISPR/Cas9 dahil olmak üzere çeşitli genetik araçların mevcudiyetinedeniyle uzun zamandır en güçlü genetik model sistemlerinden biri olarak kabul edilmektedir.10, genlerin aşırı ekspresyonu için çok sayıda yöntem ve RNA girişimi (RNAi) için bakteriyel gıda bazlı bir yöntem11. Ek olarak, şeffaf anatomileri canlı organizmalarda mikroskobik görüntülemeye izin verir12. Son olarak, nispeten kısa ömürleri, düşük bakım maliyetleri ve çok sayıda yaşa uygun hayvan üretme kolaylığı, onları yaşlanma biyolojisi için mükemmel bir model sistem haline getirir13. Bu faydalar, ana mitokondriyal düzenleyici yolların bilinen korunumu ile birleştiğinde, C. elegans'ı yaşlanma sırasında mitokondriyal dinamikleri incelemek için oldukça çekici bir model sistem haline getirir.

Floresan belirteçler, mitokondri de dahil olmak üzere hücresel bileşenleri görselleştirmek ve incelemek için biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Yaygın olarak kullanılan MitoTracker ve tetrametilrodamin etil ester (TMRE) gibi hücre geçirgen spesifik boyalar vardır14. İlki, genel negatif yüklü mitokondriyal matrisi15 boyamak için kullanılırken, ikincisi, pozitif yüklü trifenilfosfonyum iyonu16 aracılığıyla nispi mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmek için kullanılır. Transgenik gerektirmemelerinden faydalanırken, solucanların yaşlanma sırasında yapı ve geçirgenlikte değişen kalın kütikülü ve farklı dokular arasında boya sızmasının değişkenliği, C. elegans17'de boya bazlı yaklaşımları zorlaştırmaktadır. Ayrıca, mitokondriyal morfolojinin değerlendirilmesi, boya agregasyonu17 gibi boyaların potansiyel hedef dışı etkileri ile karıştırılır. Bunun yerine, mitokondri lokalize floroforları eksprese etmek için genetik yöntemler solucan modelinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Burada, bu çalışma, hücre tipine özgü promotörler altında mitokondriyal matris lokalize GFP'yi (bundan böyle MLS::GFP olarak anılacaktır) eksprese eden suşları vurgulamaya odaklanmaktadır. Daha da önemlisi, bu transgenik hatlar, raportörün bilinen bir genomik lokusta tek kopya ekspresyonunu sağlamak için MosSCI yöntemi kullanılarak yapıldı ve bu da diğer mevcut suşlarla ilgili sorunları önledi. Örneğin, bazı mitokondri hedefli proteinlerin yüksek kopya ekspresyonu, ekstrakromozomal plazmit dizilerinin bilinmeyen bir kopya numarası18 olan rastgele bir lokusa entegrasyonu nedeniyle ekspresyon seviyelerinde değişkenliğe yol açar. Ek olarak, hücrelerin aşırı eksprese edilen mitokondriyal proteinleri düzgün bir şekilde lokalize etmesi yüksek bir yük olduğundan, daha önce mitokondriye zarar verdikleri gösterilmiştir19. Bu nedenle, hassas, stabil ve düşük gen ekspresyonu ve bilinen lokuslara geçiş kolaylığı, bu MosSCI transgeniklerini tercih edilen yöntem haline getirir. Bu suşları kullanarak, bu çalışma C. elegans'ın kas, bağırsak ve hipodermisindeki mitokondriyi görüntüleme yöntemlerini standartlaştırmaktadır. Ayrıca, C. elegans'ta yaşlanma sırasında mitokondrinin tekrarlanabilir deneysel analizini dikkate almak ve sağlamak için önemli olan önemli teknik uygulamaları ve sorun giderme yöntemlerini vurgular.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. C. elegans'ın büyümesi ve bakımı

  1. Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakalarının hazırlanması
    1. C . elegans kültürü için, 1 mM CaCl2, 12.93 μM (5 μg/mL) kolesterol, 25 mM KPO4 (pH 6.0), 1 mMMgM 4, 2.5 mM (% 0.25 w / v) Pepton ve 51.3 mM NaCl içeren NGM'li standart% 2 agar plakaları kullanın. Castro Torres ve ark.20'de açıklanan NGM plakalarının ayrıntılı dökme yöntemine bakın.
      NOT: RNA girişimi (RNAi) deneyleri için, 1 L NGM-agar plakaları için 1 mL 1 M IPTG ve 1 mL 100 mg / mL Karbenisilin ekleyin.
    2. NGM plakaları katılaştıktan sonra, oda sıcaklığında 24-48 saat boyunca lizojen et suyu (LB) içinde bir OP50 kültürü büyütün veya antibiyotiklerle (ampisilin / karbenisilin 100 μg / mL + tetrasiklin 5 μg / mL) LB'de bir pL4440 boş vektör plazmidi taşıyan bir HT115 kültürü büyütün ve 37 ° C'de 12-16 saat çalkalayın.
      NOT: Bu plazmit ticari kaynaklardan temin edilebilir (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. 200 μL OP50 veya HT115 kültürünü 60 mm'lik plakalara veya 100 mm'lik plakalara 1 mL ekin.
    4. Plakaları artık ıslanmayana kadar kurutun ve plakaları kapalı kaplarda 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
    5. İsteğe bağlı: L4 / yetişkin solucanları kimyasal olarak sterilize etmek ve genç solucanların gelişmesini önlemek için bakterilerle tohumlanmış NGM-agar plakalarına doğrudan 10 μL 10 mg / mL 5-floro-2'-deoksiüridin (FUDR) ekleyin.
      NOT: Bu çalışmada geliştirilen ve kullanılan suşlar şunlardır:
      (1) RHS191 - uthSi17[myo3p::MLS::GFP::unc-54 3'UTR::cb-unc-119(+)] I
      (2) RHS192 - uthSi83[col19p:: MLS::GFP::unc-54 3'UTR::cb-unc-119(+)]I
      (3) RHS193 - uthSi80[vha-6p:: MLS::GFP::unc-54 3'UTR::cb-unc-119(+)] IV
  2. Eşitleme C. elegans Beyazlatma ile
    1. Çok sayıda nematod gerektiren büyük ölçekli bir tahlil için, hayvanlarla dolu 60 mm'lik bir NGM-agar plakasını küçük parçalara ayırın ve bunları genişleme için bakteri ile tohumlanmış 100 mm'lik plakalara parçalayın. Parçalandıktan sonra 20 °C'de büyütüldüğünde 100 mm'lik plakaların solucanlarla dolması için 2-3 gün bekleyin. Hayvanların genişletilmesi için daha ayrıntılı öneriler için Castro Torres ve ark.20'ye bakın.
    2. Senkronizasyon için solucanları toplamak için, 5-10 mL M9 solüsyonunu (22 mM KH2PO4 monobazik, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4) 100 mm NGM-agar plakalarına dökün solucanlar ve solucanları bakteri çimlerinden gevşetmek için M9 solüsyonunu hafifçe döndürün.
    3. Solucanları serolojik bir pipetle çizin ve 15 mL'lik konik tüplere aktarın.
      NOT: Plastik serolojik pipetler, solucanların plastik pipetlerin iç duvarına yapışmasına neden olma eğiliminde olduğundan, cam serolojik pipetler önerilir.
    4. Solucanları topaklamak için oda sıcaklığında 1.100 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve süpernatanı bir vakum pompası kullanarak aspire edin.
    5. 1.5 mL% 6 sodyum hipoklorit, 0.75 mL 5 M NaOH veya KOH ve 2.75 mL dH2O içeren 5 mL ağartma çözeltisi hazırlayın. 5 mL ağartma çözeltisini solucan peletine dökün.
      DİKKAT: Sodyum hipoklorit ve hidroksit çözeltileri aşındırıcı olduğu için bu adımda eldiven ve laboratuvar önlüğü giyilmesi önerilir.
    6. Solucan + ağartma solüsyonu karışımını, hayvanların tüm vücutları tamamen eriyene ve sadece yumurtalar kalana kadar ~ 4-6 dakika kuluçkaya yatırın. Çözme işlemine yardımcı olmak için karışımı kuvvetlice çalkalayın.
      NOT: Solucanları her dakika diseksiyon mikroskobu altında kontrol edin. Yetişkin solucanların vücutlarının ne kadar çözüldüğüne bağlı olarak ağartma süresini kısaltın veya uzatın. Yumurtaları uzun süre ağartma solüsyonu içinde bırakmak, yumurtalara zarar verecek ve nematodların canlılığını etkileyecektir.
    7. Yumurtaları aspire etmek için yumurtaları/ağartma solüsyonu karışımını oda sıcaklığında 1.100 x g'da 30 saniye santrifüjleyin ve ardından yumurta peletini aspire etmemeye dikkat ederek süpernatanı bir vakum pompası kullanarak dikkatlice aspire edin.
      NOT: Yumurtaların ağartma solüsyonuna uzun süre maruz kalmasını önlemek için yıkamaların hızlı bir şekilde yapılması önerilir.
    8. Yumurtaları 5-10 mL M9 solüsyonu ile 4 kez yıkayın.
    9. Yumurtaları küçük bir hacimde M9 çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve 50 μL'ye kadar pipetleyerek bakteri tohumlanmış NGM plakalarına yerleştirin. 3-5 μL yumurta karışımını bir tabağa pipetleyerek ve bu hacimdeki yumurta sayısını sayarak yumurta sayısının kabaca bir tahminini hesaplayın. Yumurta karışımını bu hacimde sayılabilir sayıda yumurtaya seyreltmek için M9 ekleyin.
      NOT: Plaka başına 100'den az solucan kaplaması önerilir, çünkü solucanlar çok fazla hayvan kaplandığında yetişkinliğin 1. gününden önce açlıktan ölebilir. Hayvanların kaplama sayıları için daha ayrıntılı öneriler için Castro Torres ve ark.20'ye bakın.
    10. Alternatif olarak, daha sıkı yaş senkronizasyonu için nematodları L1-tutuklayın. L1 tutuklama için, 15 mL'lik konik bir tüpte yumurta peletine 10-12 mL'lik bir hacme uygun hacimde M9 çözeltisi ekleyin. Solucanların 20 ° C'de 16-24 saat döndürücüde dönmesine izin verin. Santrifüjleyin (adım 1.2.7'deki gibi) ve süpernatanı aspire edin. L1 hayvanlarının konsantrasyonunu hesaplayın ve bunları adım 1.2.9'da yumurtalar için tarif edildiği gibi NGM plakalarına koyun.
    11. C. elegans popülasyonunu istenen yaşa kadar yaşlandırın: Dölleri önlemek ve halihazırda üretilmiş yavruları ortadan kaldırmak için L4/yetişkin hayvanları, adım 1.1.6'da açıklandığı gibi 5-floro-2'-deoksiüridin (FUDR) içeren plakalara aktarın. FUDR olmadan solucanları yaşlandırmak için alternatif yöntemler için Castro Torres ve ark.20'ye bakın.
      NOT: Solucanları ilk larva evrelerinde senkronize etmek için bir yöntem olarak ağartmayı seçmeden önce bazı önemli faktörlerin göz önünde bulundurulması gerekir. Daha önce vurgulandığı gibi, ağartıcıya aşırı maruz kalmak embriyolara zarar verebilir, kuluçka oranlarını azaltabilir ve ağartıcıya dirençli suşlar için seçim baskısı oluşturarak popülasyonun genetiğini potansiyel olarak değiştirebilir. Ek olarak, embriyolar uzun süre beslenmeden bırakılırsa, besin tükenmesi metabolizmayı ve gelişimi bozabilir. Bu nedenle beyazlatma yöntemlerine alternatif olarak egg-lay veya NemaSync yöntemleri kullanılabilir. Yumurtlama prosedürü için yöntem, Castro Torres ve ark.20 tarafından atıfta bulunulan çalışmada adım adım açıklanmıştır. NemaSync, kimyasallar kullanılmadan solucanları senkronize etmek için manuel bir solucan senkronizörünün kullanıldığı daha yeni ve daha pahalı bir ticari yöntemdir21.

2. C. elegans'ta mitokondrinin görüntülenmesi

  1. C. elegans'ın görüntülenmesi için slaytların hazırlanması
    1. Cam slaytlar üzerine 10-20 μL M9 solüsyonu ilave ediniz ve belirli yaşlarda istenilen sayıda ergin solucanı lam üzerindeki solüsyona aktarınız. Yaklaşık 25 solucan önerilir.
      NOT: Solucanları felç etmek için geleneksel yöntemlerin kullanılması (örneğin, tetramisol veya sodyum azid) belirli koşullar altında mitokondriyal parçalanmaya neden olabilir (aşağıya bakınız). Bunun yerine, kalıcı bir pozitif yüzey yüküne sahip bir yüzeye sahip olan HistoBond slaytlarının kullanılması önerilir, bu da artefaktlara neden olabilecek ilaçlar kullanmadan solucanların hareketini azaltacaktır. Düşük hacimler hayvanların slayt ve lamel arasında ezilmesine neden olabileceğinden, yüksek hacimler ise görüntü elde etme sırasında hayvanların hareket etmesine neden olacağından, M9 çözeltisine uygun bir solucan oranı koymak önemlidir. Öneriler Tablo 1'de bulunabilir.
    2. Alternatif olarak, solucanları felç eden ilaçları kullanmak için, mitokondrinin sınırlı parçalanmasıyla kullanılabilecek bir dizi konsantrasyon ve zaman noktası için bu makalenin temsili sonuçlarına bakın.
      NOT: Sağlıklı, vahşi tip hayvanlarda büyük bir parçalanma olmamasına rağmen, bazı mutantların veya koşulların bu ilaçların aynı konsantrasyonuyla mitokondriyal parçalanma yaşayabileceğini hatırlamak önemlidir, bu nedenle bu ilaçları kullanırken bazı testler gereklidir.
    3. Sürgü üzerindeki M9 solüsyonundaki solucanları bir kapak camı ile örtün ve yanları kapatmak ve M9 solüsyonunun buharlaşmasını önlemek için oje kullanın.
    4. İsteğe bağlı: Kas görüntüleme için, kapak kızağını hafifçe iterek solucanları yuvarlayın. Bu, solucanların yanlarındaki vücut duvarı kaslarının, daha yüksek kaliteli görüntüler için odak düzlemi ile daha iyi hizalanmasını sağlar.
  2. Bileşik mikroskop kullanılarak mitokondrinin görüntülenmesi
    1. Kas ve hipodermal mitokondri için standart bir geniş alan mikroskobu kullanın (myo-3p::MLS::GFP ve col-19p::MLS::GFP).
      NOT: 63x/1.4 Plan Aprochromat objektif, GFP filtresi (11525314), DFC9000 GT kamera ve LED5 ışık kaynağı ile donatılmış ticari olarak temin edilebilen bir görüntüleyici ve uyumlu mikroskop yazılımı kullanılmıştır.
    2. Her mikroskop ve deney düzeneği için görüntüleme ayarlarını optimize edin.
      NOT: Bununla birlikte, bir başlangıç noktası olarak, bu yazıda kullanılan görüntüleyici ile görüntüleme parametreleri aşağıdaki gibidir: Boyutlar, hipodermal mitokondri için 0,50 μm'lik bir adım boyutunda 2048 (x) * 2048(y) pikseldir ve kas mitokondrisi için yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanan "Sistem Optimize Edilmiştir". Maruz kalma süresi kas mitokondrileri için 50 ms ve hipodermal mitokondri için 50 ms'dir. 475 nm LED %50 güce ayarlandı ve nötr yoğunluk filtresi kas için %30 ve hipodermal mitokondri için %17 olarak ayarlandı. Z aralığı, GFP sinyalinin göründüğü yerden başladığı yerden bittiği yere kadar başlar. Maksimum projeksiyondaki gürültüyü en aza indirmek için, maksimum projeksiyon için kullanılan z-düzlemlerinin sayısı azaltılabilir.
    3. Bağırsak mitokondrisinin görüntülenmesi için (vha-6p::MLS::GFP), konfokal mikroskop kullanın.
      NOT: Görüntüleme, 63x/1.4 Plan ApoChromat objektif, beyaz ışık lazeri (WLL), Acousto-Optik Işın Ayırıcı, HyD S dedektörleri ile donatılmış, piyasada bulunan bir konfokal mikroskopta gerçekleştirildi ve mikroskop yazılımı üzerinde çalıştırıldı. Daha önce de belirtildiği gibi, her bir deney düzeneği optimize edilmelidir, ancak bir başlangıç noktası olarak, bu çalışmada kullanılan Stellaris ile görüntüleme parametreleri aşağıdaki gibidir: WLL, %85.00 Maksimum Güç ve %3.00 yoğunlukta 485 nm lazer çizgisi ile ayarlanmıştır. HyD S dedektörü, analog ayarda 25'lik bir kazançla 490-590 nm'ye ayarlandı. 1024 (x) * 1024(y) veya 82.01 μm (x) * 82.01 μm (y) bir alanı 5 (z) piksel ile 0.495 μm adım boyutunda (z boyutu solucanların veya dokuların boyutuna bağlı olarak değişkendir) 1.000 Hz tarama hızı, 2.25 yakınlaştırma, 2 çizgi ortalaması ve 1 AU (95.5 μm) iğne deliği ile tek yönlü olarak taradık. Z aralığı, GFP sinyalinin göründüğü yerden başladığı yerden bittiği yere kadar devam eder. Maksimum projeksiyondaki gürültüyü en aza indirmek için, maksimum projeksiyon için kullanılan z-düzlemlerinin sayısı azaltılabilir.
  3. Mitokondriyal morfolojinin nicelleştirilmesi
    NOT: Ayrıntılar için Schindelin ve ark.22'ye bakın ve Ek Şekil 1A-D'ye bakın.
    1. FIJI (Fiji sadece ImageJ, https://fiji.sc/) yazılımını indirin ve yükleyin. Ardından FIJI'yi açın.
    2. MitoMAPR makrosunu indirmek ve kurmak için https://doi.org/10.7554/eLife.49158.033'dan kaynak kodu 1'i indirin. Ardından "A" altında belirtilen tüm kodu kopyalayın. MitoMAPR-1.0 için IJM kodu." Ardından, Fiji'yi açın, Eklentiler > Yeni > Makrosu'na gidin ve önceden kopyalanan kodu makro penceresine yapıştırın. Dosya > Farklı kaydet seçeneğine gidin ve Makroyu ileride kullanmak üzere kaydedin.
    3. Dosyaları Fiji araç çubuğuna sürükleyip bırakarak veya Dosya > Aç'a giderek FIJI'de Z-yığınları ile 3B mikroskobik bir görüntü açın.
    4. Görüntü > Yığınları > Z Projesi'ne gidip ardından odaktaki görüntülerin maksimum yansıtılacağı dilim aralığını seçip projeksiyon türü olarak Maksimum Yoğunluk'u seçerek görüntünün maksimum projeksiyonunu oluşturun.
    5. Dosya > > Farklı Kaydet'e giderek görüntüyü TIFF olarak kaydedin.
    6. "Dikdörtgen" aracını kullanarak, bir ROI çizerek ve ardından Görüntü > Kırpma'ya giderek tam görüntülerden ilgi alanlarını (ROI'ler) kırpın.
    7. Dosya > > Farklı Kaydet'e giderek görüntüyü TIFF olarak kaydedin.
    8. Makro dosyasını Fiji araç çubuğuna sürükleyip bırakarak daha önce kaydedilmiş MitoMAPR makrosunu çalıştırın ve ardından Çalıştır'a tıklayın. Yeni bir pencere, Tiff dosyasının 2.3.6'da kaydedildiği klasörü seçmenizi isteyecektir.
    9. Yeni bir pencere bir alan seçmenizi isteyecektir; daha önce adım 2.3.4'te belirtildiği gibi dikdörtgen aracını kullanarak görüntüde bir dikdörtgen oluşturun ve Tamam'a basın.
      NOT: Adım 2.3.6'da açıklandığı gibi daha önce kırpılmışsa görüntünün tamamı seçilebilir. Mitokondriyal morfoloji ile ilgili tüm değerleri içeren "Veri" penceresini Dosya > Farklı Kaydet > Kaydet'e giderek bir Excel dosyası olarak kaydedin.
  4. FIJI makrolarını kullanarak numunelerin toplu işlenmesi
    1. Analiz edilecek görüntü bölgesini belirtmek için bir makro oluşturun. Fiji'yi açın ve Yeni > Makro > Eklentiler'e gidin. Aşağıdaki kodu metin kutusuna yapıştırın ve makroyu 2.3.2'de (Ek Şekil 1E-H) açıklandığı gibi kaydedin.
      NOT: Dikdörtgen yapın (100, 100, 200, 200); run (Belirt..., genişlik = 100, yükseklik = 100, x = 100, y =100 ölçekli).
    2. Açılan tüm görüntüleri TIFF dosyaları olarak kaydetmek için bir makro oluşturun. Makro penceresinde Dosya > Yeni'ye gidin ve aşağıdaki kodu metin kutusuna yapıştırın. Makroyu 2.3.2'de anlatıldığı gibi kaydedin.
      NOT: dir = getDirectory(" Bir klasör seçin"); ids=newArray(nImages); için (i=0; i
    3. MitoMAPR toplu işlemi için bir makro oluşturun. https://doi.org/10.7554/eLife.49158.033 kaynak kodu 1'e gidin ve B. altında belirtilen tüm kodları kopyalayın). MitoMAPR-1.0_Batch" için IJM kodu. Makro penceresinde Dosya > Yeni'ye gidin, kaynak kodu 1'deki kodu metin kutusuna yapıştırın ve makroyu adım 2.3.2'de açıklandığı gibi kaydedin.
    4. Yinelemeli kırpma için bir makro oluşturun. https://doi.org/10.7554/eLife.49158.033 kaynak kodu 1'e gidin ve C.) CropR için IJM kodu altında belirtilen tüm kodları kopyalayın. Makro penceresinde Dosya > Yeni'ye gidin, kaynak kodu 1'deki kodu metin kutusuna yapıştırın ve makroyu adım 2.3.2'de açıklandığı gibi kaydedin.
    5. Toplu işlemeye başlamak için, önce tüm görüntüleri açarak ve adım 2.4.2'de kaydedilen makroyu çalıştırarak işlenecek tüm görüntüleri TIFF olarak kaydedin. Tüm resimler belirtilen klasöre TIFF olarak kaydedilecektir. Kaydedildikten sonra tüm görüntüleri kapatın.
    6. Adım 2.4.5'te kaydedilen görüntüler 3D görüntülerse (z yığınları içeren görüntüler), bunları Z-projeksiyonları yaparak 2D görüntülere dönüştürün. Görüntüleri toplu olarak Z'ye yansıtmak için, ana FIJI penceresinde Toplu > Makro İşleme'ye giderek toplu işleme penceresini > açın.
      1. "Giriş" için, 2.4.5'ten işlenecek tüm 3D görüntüleri içeren klasörün konumunu seçin. "Çıktı" için, işlendikten sonra kaydedilen görüntüler için istediğiniz konumu seçin. Çıktı formatını TIFF olarak seçin. Penceredeki büyük metin kutusuna aşağıdaki kodu yapıştırın ve işlem düğmesine basın: run("Z Project...", "projection=[Maksimum Yoğunluk]").
    7. Adım 2.4.4'teki yinelemeli kırpma makrosunu adım 2.4.3'teki belirtilen bölge makrosuyla birlikte kullanarak işlenecek tüm 2D görüntülerden aynı boyutlara sahip ROI'leri kırpın. Adım 2.4.4'ten yinelemeli kırpma makrosunu çalıştırın. Dizin isteyen bir pencere açılacaktır.
      1. Yalnızca 2.4.5 adımındaki 2D görüntüleri veya 2.4.6 adımındaki 2D Z ile yansıtılan görüntüleri içeren klasörü seçin ve Seç düğmesine basın. Makro, seçilen klasördeki görüntülerden birini açacak ve iki düğmeli "seçim yap" etiketli bir pencere açılacaktır.
    8. Adım 2.4.3'ten belirtilen seçim makrosunu çalıştırın. Seçim boyutunu değiştirmek için makro metin kutusundaki genişlik ve yükseklik değerlerini gerektiği gibi değiştirin ve yeni seçimi gözlemlemek için Çalıştır'a basın. Makrodaki X ve Y değerlerini değiştirmek, seçimin sol üst köşe konumunu değiştirir.
      1. Seçim boyutları tatmin edici olduğunda, dikdörtgeni istediğiniz alana sürükleyin ve ardından "seçim yap" penceresindeki OK düğmesine basın. Kırpılan bölge, adım 2.4.7'de seçilen klasöre kaydedilecektir.
    9. Makro, klasördeki diğer tüm görüntülerde yinelenir. Her görüntü için, tüm görüntülerde aynı boyutların kırpıldığından emin olmak için boyut değerlerini değiştirmeden 2.4.8 adımından itibaren makroyu çalıştırın. Her görüntü için, seçim dikdörtgenini istediğiniz konuma sürükleyin ve "seçim yap" penceresindeki Tamam düğmesine basın.
    10. 2.4.8-2.4.9 adımlarında kırpılan görüntüleri içeren klasörü açın ve kırpılan tüm görüntüleri yeni bir klasöre taşıyın.
    11. Adım 2.4.3'ten itibaren toplu MitoMAPR makrosunu çalıştırarak kırpılan tüm görüntüleri analiz edin. Yeni bir pencere sizden bir dizin seçmenizi isteyecektir. Adım 2.4.10'dan itibaren tüm kırpılan görüntülerin bulunduğu klasörü seçin. Tamamlandığında, mitokondriyal morfoloji ile ilgili tüm değerleri içeren "Veri" adlı bir pencere açılacaktır. Tüm verileri adım 2.3.9'da açıklandığı gibi bir Excel dosyası olarak kaydedin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans , aşırı numune hazırlama olmadan kolay bütün kurt, canlı hayvan görüntülemeye izin veren şeffaf gövdesi nedeniyle mitokondriyal görüntüleme için harika bir modeldir. Ek olarak, farklı dokulardaki mitokondriyal morfoloji, mitokondri hedefli floresan proteinleri eksprese etmek için dokuya özgü promotörler kullanılarak kolayca görselleştirilebilir. Burada, mitokondri hedefli bir GFP'nin (ATP-1 proteininin mitokondriyal lokalizasyon dizisi) ekspresyonunu sağlamak için myo-3p (kas mitokondri için), vha-6p (bağırsak mitokondri için) ve col-19p (hipodermal mitokondri için) kullanıldı. C. elegans'ın vücut duvarı kaslarının mitokondrisi, kas lifleri (miyofibriller) boyunca hizalanan tübüler morfoloji sergiler (Şekil 1A); bağırsak mitokondrisi, daha az düzgün hizalama ile yüksek derecede birbirine bağlı, ağ benzeri yapılar gösterdi (Şekil 1B); ve hipodermis, bağırsak veya kasa kıyasla daha yuvarlak veya oval şekilli görünen tübüler mitokondriye sahiptir (Şekil 1C). Mitokondriyal morfoloji genellikle kas ve bağırsaktaki solucanın uzunluğu boyunca tutarlıdır, ancak hipodermis, solucanın proksimal ve distal uçları arasındaki mitokondrinin birbirine bağlılığında bazı küçük farklılıklar gösterir. Bu nedenle, tekrarlanabilir deneysel sonuçlar elde etmek için vücutlarının belirli bir bölgesine odaklanılması önerilir. Burada, farenks ile farenksin ~100-200 μm altındaki vulva arasındaki alan tutarlı bir şekilde görüntülenir.

Kas ve hipodermal mitokondri için, bunları bir bileşik mikroskop altında görüntülemek, hücrelerin düzlüğü ve düşük odak dışı ışık seviyeleri nedeniyle yeterli çözünürlük sağlar. Bununla birlikte, bağırsak mitokondrisini bileşik mikroskopla gözlemlemek zordur, çünkü bağırsağın büyük hacmi, bağırsağın diğer bölümlerinden gelen büyük miktarda odak dışı ışık nedeniyle çözünürlüğü sınırlar (Şekil 2). Bu nedenle, odak dışı ışığı azaltmak ve uygun mitokondriyal morfolojiyi görselleştirmek için bağırsak mitokondrisinin konfokal mikroskop altında görüntülenmesi önerilir.

Mitokondrinin şekli oldukça dinamiktir ve hayvanlarınmetabolik ortamına 23 veya hatta değişken substrat sertliklerine24 maruz kalmaya bağlı olarak değişir. Bu nedenle, hayvanları bir besin kaynağının yokluğunda ve sert cam alt tabakası üzerinde uzun süre mikroskop slaytlarında bırakmak, mitokondriyal morfolojiyi potansiyel olarak etkileyebilir. Burada, bu çalışma, solucanların mitokondrilerinin M9 çözeltisindeki bir slayt üzerinde yaklaşık 30 dakika sonra parçalandığını ve hipodermal mitokondrinin en fazla parçalanmayı gösterdiğini buldu (Şekil 3). Bu nedenle, numune hazırlandıktan sonra mitokondrinin görüntülenmesi hızlı bir şekilde yapılmalıdır.

Sodyum azid ve tetramisol de dahil olmak üzere solucan hareketliliğini kısıtlayan kimyasallar, C. elegans'ın canlı görüntülenmesi için yaygın olarak kullanılır, çünkü sabit solucanların 3D görüntüleme için hayvanların birden fazla z-kesitini yakalaması gerekir. Önceki çalışmalar, sodyum azid veya tetramisole maruz kalmanın mitokondriyal parçalanmaya neden olabileceğini göstermiştir25. Şaşırtıcı bir şekilde, sodyum azidin - yüksek konsantrasyonlarda bile - kas veya bağırsaktaki mitokondriyal morfoloji üzerinde sınırlı bir etkiye sahip olduğu bulundu. Bununla birlikte, hipodermis, M9 kontrollerinden daha erken mitokondriyal parçalanma göstermiştir (Şekil 3). Daha da önemlisi, yüksek konsantrasyonlarda tetramizol (100 mM), tüm hücre tiplerinde maruziyetten hemen sonra önemli mitokondriyal parçalanmaya neden oldu. Karşılaştırıldığında, orta konsantrasyonlar (10 mM), bir M9 kontrolüne kıyasla daha hızlı parçalanma ile sonuçlandı. Düşük konsantrasyonların (1 mM) mitokondriyal morfoloji üzerinde sınırlı bir etkisi olmuştur. Bu veriler, sodyum azid kullanımının mitokondrinin hızlı görüntülenmesi için uygun bir seçenek olabileceğini, tetramisolden ise genellikle kaçınılması gerektiğini göstermektedir.

Beklendiği gibi, C. elegans'ın tüm dokularının mitokondrileri, doğal yaşlanma sürecinde parçalanma gösterir (Şekil 4A). Parçalanma, genç hayvanlarda görüntülenen doğrusal, tübüler mitokondriden önemli ölçüde farklı olan daha kesik ve küresel yapılar olarak ortaya çıkan mitokondri olarak görselleştirilebilir. Bağırsağın daha sonraki yaşlarda küresel otofloresan yapılarda arttığına dikkat etmek önemlidir, bu nedenle otofloresanı gerçek mitokondriyal yapılarla karıştırmamaya özen gösterilmelidir. Solucanlar arasında mitokondriyal yapıdaki değişikliklerin değişkenliği olabileceğinden, mitokondriyal morfolojinin nicelleştirilmesini sadece birkaç solucanı görüntülemek yerine önemli bir örneklem büyüklüğünde yapmak önemlidir. Burada, nesneler, ağlar, ağ başına bağlantılar, bağlantı noktaları, nesne uzunluğu, mitokondriyal ayak izi, mitokondriyal kapsama alanı ve nesne alanı dahil olmak üzere çeşitli metrikler kullanılarak mitokondriyal morfolojinin otomatik olarak ölçülmesine izin veren mitoMAPR kullanılmıştır (Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2). Otomasyon, kullanıcıdan öznel önyargıyı ortadan kaldırır. Burada, yaşlanma sırasında kas ve bağırsak mitokondriyal morfolojisindeki değişiklikleri kantitatif olarak ölçmek için nesne uzunluğu metriğinin ve yaşlanma sırasında hipodermal mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri ölçmek için bağlantı noktaları metriklerinin optimal olduğunu rapor ediyoruz (Şekil 4B).

figure-results-1
Şekil 1: C. elegans'ın tüm vücudu boyunca mitokondri görüntüleri. Mitokondriyal görüntüleme, kas (A), bağırsakta (B) ve hipodermiste (C) MLS::GFP ekspresyonu olan transgenik hayvanlarda L1 aşamasından EV üzerinde yetiştirilen 5. günün tamamı boyunca gerçekleştirildi. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Bileşik mikroskop ve konfokal mikroskop arasındaki mitokondriyal görüntülemenin karşılaştırılması. Mitokondriyal görüntüleme, kas (A), bağırsakta (B) ve hipodermiste (C) MLS::GFP ekspresyonu olan transgenik hayvanlarda L1 aşamasından EV üzerinde yetiştirilen 1. gün yetişkin hayvanlarda gerçekleştirildi. Ölçek çubuğu: 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: M9, sodyum azid ve tetramisol ile tedavi sonrası farklı dokuların mitokondriyal parçalanmasının değerlendirilmesi. Mitokondriyal görüntüleme, kas, bağırsak ve hipodermiste MLS::GFP ekspresyonu olan 1. gün yetişkin hayvanlarda gerçekleştirildi. Hayvanlar, L1 aşamasından itibaren EV'de yetiştirildi. Hayvanlar M9, sodyum azid (1 mM, 10 mM ve 100 mM) veya tetramizol (1 mM, 10 mM ve 100 mM) içeren slaytlara yerleştirildi ve görüntüleme slayt hazırlığından hemen sonra (0 dk) veya 15 dk veya slayt hazırlığından 30 dakika sonra yapıldı. Temsili görüntüler, 2 biyolojik kopya için suş başına n > 5 hayvan için gösterilmiştir. Ölçek çubukları: 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Farklı dokularda yaşlanma sırasında C. elegans'ın mitokondriyal görüntülenmesi ve MitoMAPR kullanılarak mitokondriyal morfolojinin nicelleştirilmesi. (A) Mitokondriyal görüntüleme, yetişkinliğin 1, 5, 9, 13 ve 15. günlerinde kas, bağırsak ve hipodermiste MLS::GFP ekspresyonu ile yetişkin hayvanlarda gerçekleştirildi. Hayvanlar, L1 aşamasından itibaren EV üzerinde büyütüldü ve 1. gün yetişkin aşamasından itibaren FUDR içeren EV plakalarına taşındı. Görüntüler, ≥ 3 biyolojik kopya için suş başına n ≥ 5 hayvanı temsil eder. Ölçek çubuğu: 5 μm. (B) 1, 5, 9, 13 ve 15. günlerde solucanların kas mitokondri ve bağırsak mitokondrilerinin nesne uzunluğunun ölçülmesi ve 1, 5, 9, 13 ve 15. günlerde solucanların hipodermal mitokondrilerinin birleşme noktalarının nicelemesi. ±Grafikler çizildi ve öğrenci t-testi kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi. ns = anlamlı değil, *p < 0.03; **p < 0.002; p < 0.0002; p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Solucan günleriSolucan sayısıTampon hacmi (mL)
12513
52514
92015
132015

Tablo 1: Slaytlar hazırlanırken önerilen solucan sayıları ve tampon hacimleri.

Ek Şekil 1: MitoMAPR kullanılarak tek bir görüntü nicelemesinin uygulanmasının iş akışları ve birden fazla görüntü için toplu işleme. (A) MitoMAPR makrosu kullanılarak tek bir görüntüden mitokondriyal morfolojiyi ölçme iş akışı. (B) Fiji kullanılarak ham 3D görüntü dosyasının Z projeksiyonu (Maks. projeksiyon). (C) Z'nin yansıttığı görüntüden ilgilenilen bölgeyi kırpma. (D) MitoMAPR makrosundan elde edilen iskelet görüntüleri. Ölçek çubukları: 5 μm. (E) MitoMAPR makrosunu kullanarak toplu işlem kullanarak birden fazla görüntüden mitokondriyal morfolojiyi ölçme iş akışı. (F) Kırpma makrosunun ekran görüntüsü. (G) Z projeksiyonu için bir toplu işlemin ekran görüntüsü. (H) Toplu kırpma makrosunun seçim onay penceresinin ekran görüntüsü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Mitokondriyal morfoloji metriklerinin kantitatif analizi C. elegans kas dokusu. Kaydedilen metrikler arasında nesneler, ağlar, ağ başına bağlantı noktaları, nesne uzunluğu, mitokondriyal ayak izi, nesne alanı ve farklı günlerde ölçülen mitokondriyal kapsama alanı yer alır. Veriler, yaşlanma ile birlikte mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri değerlendirmek için bir temel sağlar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: İmmobilize edici kimyasalların C. elegans'ta mitokondriyal morfoloji üzerindeki etkileri. Veriler, M9 tamponu veya farklı tetramisol ve sodyum azid konsantrasyonları ile numune hazırlandıktan sonra değişen konsantrasyonlar ve zaman noktalarında nesneler, ağlar, ağ başına bağlantı noktaları, nesne uzunluğu, mitokondriyal ayak izi, nesne alanı ve mitokondriyal kapsama alanı gibi ölçümleri içerir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal morfolojinin floresan görüntülemesi, mitokondrideki değişiklikleri belirlemenin en yaygın yoludur. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), atomik kuvvet mikroskobu ve kriyo-elektron mikroskobu gibi gelişmiş mikroskopi teknikleri daha yüksek çözünürlük sunarken, floresan mikroskobu çoğu araştırmacı için daha uygun fiyatlı ve erişilebilir olmaya devam etmektedir. Ek olarak, floresan mikroskobu canlı hücrelerde yapılabilir ve C. elegans gibi berrak model organizmalarda görüntüleme bütün hayvanlarda yapılabilir26,27. Transgenik C. elegans'ın görüntülenmesi oldukça basittir ve genetik olarak kodlanmış floresan belirteçler, mitokondrinin daha güvenilir ve sağlam bir şekilde görüntülenmesine olanak tanır, çünkü karmaşık numune işleme gerektirmez veya MitoTracker veya TMRE 28,29,30 gibi geleneksel mitokondriyal boyalardan hücre tipleri veya koşulları arasında değişken lekelenmeye maruz kalmaz. Genetik olarak kodlanmış floresan belirteçler genellikle mitokondriyal proteinlerin floroforlarla doğrudan etiketlenmesini veya floroforların minimal bir mitokondriyal lokalizasyon dizisi ile konjugasyonunu içerir. Bu yapılar genellikle dokuya özgü promotörler tarafından yönlendirilir ve kas, bağırsak veya hipodermis dokuları gibi farklı dokularda mitokondrinin görselleştirilmesini sağlar31. Genel olarak, bu floresan etiketli proteinler aşırı eksprese edilir, bu da tam uzunlukta mitokondriyal proteinler aşırı eksprese edilirse potansiyel olarak istenmeyen fizyolojik etkilere neden olabilir; bu nedenle, minimal MLS dizileri daha iyi bir seçenektir32. Bununla birlikte, minimal MLS-floresan protein füzyonlarının aşırı ekspresyonu ile bile, mitokondriye büyük miktarda protein ithal etmek mitokondriyal zarın potansiyelini çökertebileceğinden ve hayvan sağlığını etkileyebileceğinden, yüksek aşırı ekspresyondan kaçınılmalıdır33. Şu anda mevcut olan tüm C. elegans suşlarının kapsamlı bir karakterizasyonu bu makalenin kapsamı dışında olsa da, çok sayıda mitokondriyal raportörün ayrıntılı bir karşılaştırmalı analizi ve her birinin artıları ve eksileri burada bulunabilir31.

C. elegans'ta mitokondrinin canlı hücre görüntülemesi için, bu yöntemlerin konfokal mikroskopiye göre yüksek hızı ve kolaylığı nedeniyle standart bileşik veya geniş alan mikroskobu tercih edilen bir seçenek olabilir. Bu çalışmada, kas ve hipodermis gibi düz hücrelerin konfokal mikroskopiden minimal düzeyde fayda sağladığı ve bileşik mikroskopi, uygun mitokondriyal morfolojiyi görselleştirmek için yeterli çözünürlükte edinime izin verdiği gösterilmiştir. Bağırsak gibi daha büyük hücreler, odak dışı ışık nedeniyle bileşik mikroskobu zorlaştırır. Bu nedenle, bağırsak mitokondriyal morfolojisinin güvenilir bir şekilde görüntülenmesi için konfokal mikroskopi gereklidir.

Canlı hayvanlarda tüm doku kalınlığı boyunca 3D görüntüleme için önemli bir husus, görüntü elde etme sırasında solucanların hareketini önlemektir. Araştırmacılar genellikle tetramisol veya sodyum azid34 gibi solucanları felç etmek için yöntemler kullanırlar. Sodyum azid, mitokondrinin elektron taşıma zincirinde kritik bir enzim olan sitokrom c oksidazı (kompleks IV) inhibe eder ve kas kasılmaları ve diğer hücresel fonksiyonlar için gerekli ATP eksikliğine bağlı olarak genel felce yol açar34,35. Tetramisol, nöromüsküler kavşaklarda asetilkolini taklit ederek etki ederek kalıcı depolarizasyona ve kas kasılmasına neden olur36. Bununla birlikte, bu ilaçlara maruz kalma, oksidatif strese neden olarak mitokondriyal parçalanmaya neden olabilir23. Bu çalışmada, tetramisolün çok hızlı bir şekilde mitokondriyal parçalanmayı indüklediği, ancak sodyum azidin çok daha sınırlı bir etkiye sahip olduğu bulundu.

C. elegans, kısa ömrü ve hayvanları yaşlandırma kolaylığı nedeniyle yaşlanmanın mitokondriyal morfoloji üzerindeki etkisini incelemek için çok basit ve kolay bir yol sunar. Burada, DNA replikasyonunu önleyerek hayvanları kimyasal olarak sterilize etmek için sağlam bir yöntem olan FUDR'ye maruz kalmayı tercih ettik 20,37,38. Bununla birlikte, FUDR'nin belirli yaşlanma parametreleri üzerinde istenmeyen etkileri olabilir ve FUDR'nin hedef dışı etkilerinden endişe duyanlar için, dölleri ortadan kaldırmak için başka stratejiler kullanılabilir39. Örneğin, sıcaklığa duyarlı germ hattı mutantı glp-4 veya CF512 40,41,42 gibi sperm eksikliği olan mutantlar dahil olmak üzere steril mutantlar vardır. Alternatif olarak, hayvanlar günlük olarak döllerinden yetişkinleri manuel olarak seçerek doğal olarak yaşlandırılabilir.

Mitokondriyal morfolojideki değişikliklerin ölçülmesi de çok önemli bir husustur, çünkü hayvanlar arasında mitokondriyal morfolojide önemli farklılıklar olabilir. Bu nedenle, mitokondriyal morfolojideki değişiklikler hakkında önemli sonuçlar çıkarmak için yeterli bir örneklem büyüklüğünde nicel analiz ve istatistik yapmak çok önemlidir. Bununla birlikte, görüntü analizi ve niceleme, öznel önyargılardan ve birbirine bağlı mitokondri gibi oldukça karmaşık yapıların görüntülenmesinden kaynaklanan zorluklardan büyük ölçüde zarar görebilir. Bu amaçla, Mair laboratuvarı tarafından geliştirilen çok sayıda metrik kullanarak mitokondriyal morfolojiyi ölçmek için otomatik bir yöntemin bir özetini burada bulabilirsiniz. MitoMAPR, mitokondriyal ağ, nesne uzunluğu, dağılım, ağ kapsamı ve mitokondriyal ayak izi dahil olmak üzere mitokondrinin çeşitli yönlerini ölçerek mitokondriyal morfolojinin objektif, otomatik olarak ölçülmesine izin verir. MitoMAPR, ImageJ için ücretsiz bir makrodur ve bu nedenle işlevsel bir bilgisayarı olan tüm laboratuvarlar tarafından kullanılabilir. MitoMAPR kullanmanın önemli bir yönü, test edilen deney koşullarındaki değişiklikleri belirlemek için hangi mitokondriyal morfoloji metriğinin en sağlam olduğunu belirlemek için büyük bir örneklem boyutunda niceleme yapmaktır43,44. Burada, nesne uzunluğu ve birleşme noktalarının kas, bağırsak ve hipodermisteki yaşlanma sırasındaki değişiklikleri belirlemek için en iyi ölçümler olduğu bulunmuştur. Mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri analiz etmek için alternatif bir yaklaşım, z-yığını görüntülerinden mitokondrinin 3B temsillerinin oluşturulması ve ardından 3B analizin16,45 yapılmasıdır. Bu, SharpStack Total Deconvolution ve 3D Constructor modüllerine sahip Image-Pro Plus gibi ticari olarak mevcut yazılımlar kullanılarak elde edilebilir. 3B mitokondriyal temsillerin nicelleştirilmesinin, mitokondriyal şekil ve ağ özellikleri hakkında daha doğru bilgiler sağladığı gösterilmiştir46. Bununla birlikte, bu yöntem, geniş alanlı veya konfokal z yığınından birden fazla görüntü bölümünü tek bir 2D projeksiyona daraltmayı ve bunları mitoMAPR gibi araçlarla analiz etmeyi içeren yarı 3D yaklaşıma kıyasla teknik olarak daha karmaşık ve maliyetlidir. Bu çalışma, mitokondriyal matriks hedefli GFP'nin tek kopya ekspresyonunun kullanımını özetlemekte ve görüntüleme sırasında kaçınılması gereken birkaç tuzağı detaylandırmaktadır.

Sınırlamalar ve zamanla ilgili dikkat edilmesi gerekenler
Bağırsak dokusu gibi büyük ve kalın dokular için konfokal mikroskopi önerilse de, standart çizgi taramalı konfokal mikroskopi teknikleri mitokondrinin hızlı görüntülenmesini sağlamak için çok yavaş olabilir. Bu, solucanları uzun süre slaytlarda tutmanın mitokondrinin parçalanmasına neden olabileceğini gösteren verilerimiz göz önüne alındığında özellikle doğrudur. Konfokal mikroskopi teknolojisi önemli ölçüde ilerlemiş olsa da, eğirme diski, Airyscan veya bu çalışmada kullanılan gibi hızlı görüntüleme yapabilen mikroskoplar bazı laboratuvarlar için maliyet açısından engelleyici olabilir. Bu durumlarda, bileşik mikroskopi, dekonvolüsyon47 gibi odak dışı ışığı çıkarmak için hesaplamalı temizleme yöntemleriyle birleştirilebilir.

Ayrıca, açıklandığı gibi, MitoMAPR, mitokondrinin uzunluğunu ve mitokondriyal ağın ara bağlantısını kantitatif olarak ölçmek için güçlü bir otomatik makrodur. Ancak, burada listelenen sınırlamalar göz önünde bulundurularak dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. İlk olarak, matris hedefli bir GFP kullanmak, yalnızca iç zarın mitokondriyal parçalanmasını gözlemler, bu da dış zarın mitokondriyal morfolojisini tam olarak özetleyemeyebilir, çünkü dış zar fisyonunun yokluğunda iç zar fisyon olayları meydana gelebilir. Bu nedenle, her iki zarın daha rafine görüntülenmesi için hem matris hedefli hem de mitokondriyal dış zar hedefli florofor kullanılmalıdır. Dış mitokondriyal membran belirteçleri, yüksek derecede aşırı eksprese edildiklerinde matris lokalize proteinlerle aynı sonuçlara maruz kalabileceğinden, özellikle burada kullanılanlar gibi tam proteinler yerine minimal mitokondriyal lokalizasyon dizileri kullananlar olmak üzere, tek kopya belirteçlerin kullanılması önerilir31.

Şekil 3'te açıklandığı gibi, mitokondri mikroskop altında hızla parçalanabilir ve numune slaytlarını hazırlamak için farklı yöntemler, kullanılan tampona bağlı olarak morfolojiyi büyük ölçüde etkileyebilir. Bu el yazmasında açıklanan temsili veriler, solucanların mitokondrilerinin M9 ve düşük konsantrasyonlarda sodyum azid altında minimum parçalanmaya uğradığını göstermektedir. Solucanları felç etmek için yaygın olarak kullanılan bir başka kimyasal olan tetramisol, mitokondriali hızla parçalar ve bu da kullanımından genellikle kaçınılması gerektiğini gösterir. M9 ve sodyum azid, mitokondride önemli bir parçalanma göstermese de, farklı suşların burada gösterilen sonuçlardan farklı yanıt verebileceğini not etmek önemlidir. Diğer çalışmalar sodyum azidin mitokondriyi parçalayabildiğini göstermiş olsa da, yapılarımızın düşük ekspresyon seviyesi nedeniyle suşlarımızın sodyum azide maruz kaldığında önemli mitokondriyal parçalanma göstermemesi mümkündür. Mitokondri lokalize proteinlerin yüksek ekspresyonu, membran potansiyelini çökertebilir ve bu nedenle, diğer çalışmalarda kullanılan farklı suşlar, mitokondriyi bu çalışmada kullanılan aynı sodyum azid konsantrasyonlarından parçalanmaya karşı daha duyarlı hale getirebilir. Ne olursa olsun, solucanları felç eden kimyasalların, tüm çalışmalarda kullanılmadan önce test edilmesi gereken belirli koşullarda mitokondriyal parçalanmaya neden olmamasını sağlamak için özen gösterilmelidir, çünkü belirli mutantlar veya koşullar ilaca bağlı mitokondriyal parçalanmaya daha duyarlı olabilir. Ayrıca, solucanları M9'da tutmak bile doğal mitokondriyal morfolojilerinde ve aktivitelerinde değişikliklere neden olabilir, çünkü M9 tamponundaki yüzme aktivitelerinin daha önce mitokondriyal fisyon ve füzyon dinamiklerini etkilediği gösterilmiştir. Ek olarak, solucanları uzun süre M9'da bırakmak, mitokondriyal proteostaz bozulmalarına neden olarak mitokondriyi önemli ölçüde etkileyen hipoksi tepkilerini aktive edebilir48,49.

Son olarak, bir diğer önemli husus, mitokondriyal morfolojideki değişikliklerin genellikle mitokondriyal fonksiyondaki değişikliklerle ilişkili olmasına rağmen, ikisi arasında her zaman doğrudan bir korelasyon olmamasıdır. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonun daha kapsamlı bir analizi önerilir. Örneğin, oksijen tüketim oranı bir Denizatı aleti50 kullanılarak ölçülebilir, mitokondriyal membran potansiyeli, JC9 veya TMRE51 gibi membran potansiyel boyaları kullanılarak ölçülebilir, mitokondriyal oksidatif durum, roGFP52 gibi redoksa duyarlı boyalar kullanılarak ölçülebilir ve mitokondriyal stres direnci, rotenon53 gibi stres faktörlerine duyarlılık kullanılarak ölçülebilir. Mitokondrinin görüntülenmesi oldukça hızlı olabileceğinden, deneysel koşulların mitokondriyal morfolojiyi etkileyip etkilemediğini belirlemek için buradaki yöntemleri kolay bir ilk geçiş olarak sunuyoruz. Bu yöntemler, ilaçların veya genlerin büyük ölçekli taraması için bile uygundur ve ek ölçümler kullanılarak daha kapsamlı mitokondriyal analizlerin takibi önerilir. Toplamda, burada C. elegans'ta mitokondriyal morfolojiyi minimum deneysel hatalarla görüntülemenin en basit yöntemleri olduğuna inanılan şeyleri gözden geçiriyoruz.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.K., USC Provost Bursu tarafından desteklenmektedir; M.A. ve G.G. T32AG052374 tarafından desteklenmektedir; MV, 1R25AG076400 tarafından desteklenir; ve R.H.S. Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'nden R01AG079806 ve Larry L. Hillblom Vakfı'ndan 2022-A-010-SUP tarafından desteklenmektedir. Bazı suşlar, NIH Araştırma Altyapısı Programları Ofisi hibesi P40 OD010440 tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlandı. Bazı gen analizleri, bir U41 hibe HG002223 finanse edilen Wormbase kullanılarak gerçekleştirildi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Proliferasyon inhibisyonu için5-floro-2'-deoksiüridin (FUDR)Spektrum KimyasalıF2026-10GMBL
RNAi içinAPEX IPTGGenesee18-242
NGM plakaları içinBacto AgarVWR90000-764
NGM plakaları içinBacto PeptoneVWR97064-330
Kalsiyum klorür dihidratVWR97061-904NGM plakaları için
RNAi Kolesterol içinKarbenisilinVWR76345-522
NGM plakaları içinVWR80057-932
Konfokal mikroskop ve nbsp;İlaçlar için Stellaris 5
DMSOVWRBDH1115-1LPçözücü
HistoBond mikroskop slaytlarıVWR16005-110slayt hazırlama için
LB Et suyuVWR95020-778LB
için LEICA S7E Diseksiyon KapsamıLeica10450840Standart diseksiyon mikroskobu
LEICA STELLARIS 5Leica158101100Konfokal Mikroskop
LEICA THUNDERLeica11525679Bileşik Mikroskobu
NGM plakaları için magnezyumsülfat heptahidratVWR97062-132
pL4440 boş vektör plazmidvektör plazmidaddgeneplazmid # 1654
Potasyum KlorürVWR97061-566çamaşır suyu çözeltisi için
Potasyum NGMplakaları içinVWREM-PX1570-2
M9 içinpotasyum fosfat monobazikVWREM-PX1565-5
Felç edici solucanlar içinsodyum azidVWR97064-646
NGM plakaları içinSodyum KlorürVWREM-SX0420-5
çamaşır suyu çözeltisi
için M9 Sodyum hipoklorit VWR RC7495.7-32M9 TetrasiklinVWR71003-472
RNAiVWR97061-638
; Æ Kuru Vakum Pompaları, Standart Hizmet, Welch⫬ ÆAspirasyon içinVWR80077-612
, M9 için boş fosfat dibazik ,hidroklorür için sodyum fosfat dibazik WOB-L için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Protasoni, M., Zeviani, M. Mitochondrial structure and bioenergetics in normal and disease conditions. Int J Mol Sci. 22 (2), 586(2021).
  2. Wang, Y., et al. The role of mitochondrial dynamics in disease. MedComm. 4 (6), e462(2023).
  3. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
  4. Chen, W., Zhao, H., Li, Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 333(2023).
  5. Adebayo, M., Singh, S., Singh, A. P., Dasgupta, S. Mitochondrial fusion and fission: The fine-tune balance for cellular homeostasis. FASEB J. 35 (6), e21620(2021).
  6. Madan, S., Uttekar, B., Chowdhary, S., Rikhy, R. Mitochondria lead the way: mitochondrial dynamics and function in cellular movements in development and disease. Front Cell Dev Biol. 9, 781933(2021).
  7. Sharma, A., Smith, H. J., Yao, P., Mair, W. B. Causal roles of mitochondrial dynamics in longevity and healthy aging. EMBO Rep. 20 (12), e48395(2019).
  8. Rolland, S. G., Lu, Y., David, C. N., Conradt, B. The BCL-2-like protein CED-9 of C. elegans promotes FZO-1/Mfn1,2- and EAT-3/Opa1-dependent mitochondrial fusion. J Cell Biol. 186 (4), 525-540 (2009).
  9. Labrousse, A. M., Zappaterra, M. D., Rube, D. A., van der Bliek, A. M. C. elegans dynamin-related protein DRP-1 controls severing of the mitochondrial outer membrane. Mol Cell. 4 (5), 815-826 (1999).
  10. Dickinson, D. J., Pani, A. M., Heppert, J. K., Higgins, C. D., Goldstein, B. Streamlined genome engineering with a self-excising drug selection cassette. Genetics. 200 (4), 1035-1049 (2015).
  11. Bosher, J. M., Labouesse, M. RNA interference: Genetic wand and genetic watchdog. Nat Cell Biol. 2 (2), E31-E36 (2000).
  12. Yu, C. C. J., et al. Expansion microscopy of C. elegans. eLife. 9, e46249(2020).
  13. Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Front Endocrinol. 11, 554994(2020).
  14. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  15. Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 793 (1), 141-150 (2003).
  16. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.25.1-Unit 4.25.21 (2010).
  17. Valera-Alberni, M., Yao, P., Romero-Sanz, S., Lanjuin, A., Mair, W. B. Novel imaging tools to study mitochondrial morphology in Caenorhabditis elegans. Life Sci Alliance. 7 (11), e202402918(2024).
  18. Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response. Genetics. 174 (1), 229-239 (2006).
  19. Begelman, D. V., et al. An aco-2::gfp knock-in enables the monitoring of mitochondrial morphology throughout C. elegans lifespan. microPublication Biol. 2022, (2022).
  20. Castro Torres, T., et al. Surveying low-cost methods to measure lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. 183, e64091(2022).
  21. Rasmussen, N. R., Reiner, D. J. Nuclear translocation of the tagged endogenous MAPK MPK-1 denotes a subset of activation events in C. elegans development. J Cell Sci. 134 (17), jcs258456(2021).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Luz, A. L., et al. Mitochondrial morphology and fundamental parameters of the mitochondrial respiratory chain are altered in Caenorhabditis elegans strains deficient in mitochondrial dynamics and homeostasis processes. PLoS One. 10 (6), e0130940(2015).
  24. Oorloff, M., et al. Mechanical stress through growth on stiffer substrates impacts animal health and longevity in C. elegans. bioRxiv. , (2024).
  25. Chu, X., Wu, S., Raju, R. NLRX1 regulation following acute mitochondrial injury. Front Immunol. 10, 2431(2019).
  26. Shah, P., Bao, Z., Zaidel-Bar, R. Visualizing and quantifying molecular and cellular processes in Caenorhabditis elegans using light microscopy. Genetics. 221 (4), iyac068(2022).
  27. Wang, Y., Wang, P., Li, C. Fluorescence microscopic platforms imaging mitochondrial abnormalities in neurodegenerative diseases. Adv Drug Deliv Rev. 197, 114841(2023).
  28. Ding, J., et al. An expanded GCaMP reporter toolkit for functional imaging in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda, Md). 13 (10), jkad183(2023).
  29. Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of mitochondrial structure in the body wall muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 8 (7), e2801(2018).
  30. Chaweeborisuit, P., Suriyonplengsaeng, C., Suphamungmee, W., Sobhon, P., Meemon, K. Nematicidal effect of plumbagin on Caenorhabditis elegans: A model for testing a nematicidal drug. Z Naturforsch C J Biosci. 71 (5-6), 121-131 (2016).
  31. Valera-Alberni, M., Yao, P., Romero-Sanz, S., Lanjuin, A., Mair, W. B. Novel imaging tools to study mitochondrial dynamics in Caenorhabditis elegans. 7, 11(2024).
  32. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, e39804(2018).
  33. Jishi, A., Qi, X. Altered mitochondrial protein homeostasis and proteinopathies. Front Mol Neurosci. 15, 867935(2022).
  34. Morton, K. S., Wahl, A. K., Meyer, J. N. The effect of common paralytic agents used for fluorescence imaging on redox tone and ATP levels in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 19 (4), e0292415(2024).
  35. Noumi, T., Maeda, M., Futai, M. Mode of inhibition of sodium azide on H+-ATPase of Escherichia coli. FEBS Lett. 213 (2), 381-384 (1987).
  36. Siete, C., Xiong, R., Khalid, A., Hsieh, Y. -W., Chuang, C. -F. Immobilization of C. elegans with different concentrations of an anesthetic for time-lapse imaging of dynamic protein trafficking in neurons. microPublication Biology. 2024, (2024).
  37. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. J Gerontol. 34 (1), 28-36 (1979).
  38. Santi, D. V., McHenry, C. S. 5-Fluoro-2'-deoxyuridylate: covalent complex with thymidylate synthetase. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (7), 1855-1857 (1972).
  39. Wang, H., Zhao, Y., Zhang, Z. Age-dependent effects of floxuridine (FUdR) on senescent pathology and mortality in the nematode Caenorhabditis elegans. Biochem Biophys Res Commun. 509 (3), 694-699 (2019).
  40. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development (Cambridge, England). 116 (3), 755-766 (1992).
  41. Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
  42. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
  43. Zhang, Y., et al. Neuronal TORC1 modulates longevity via AMPK and cell nonautonomous regulation of mitochondrial dynamics in C. elegans. eLife. 8, e49158(2019).
  44. Dutta, N., et al. Investigating impacts of the mycothiazole chemotype as a chemical probe for the study of mitochondrial function and aging. GeroScience. 46 (6), 6009-6028 (2024).
  45. Tronstad, K., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Curr Pharm Des. 20 (35), 5634-5652 (2014).
  46. Nikolaisen, J., et al. Automated quantification and integrative analysis of 2D and 3D mitochondrial shape and network properties. PLoS One. 9 (7), e101365(2014).
  47. Lee, J. S., Wee, T. L. E., Brown, C. M. Calibration of wide-field deconvolution microscopy for quantitative fluorescence imaging. J Biomol Tech. 25 (1), 31-40 (2014).
  48. Hong, M., Kwon, J. Y., Shim, J., Lee, J. Differential hypoxia response of hsp-16 genes in the nematode. J Mol Biol. 344 (2), 369-381 (2004).
  49. Yan, J., Sun, C. L., Shin, S., Van Gilst, M., Crowder, C. M. Effect of the mitochondrial unfolded protein response on hypoxic death and mitochondrial protein aggregation. Cell Death Dis. 12 (7), 711(2021).
  50. Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 11 (10), 1798-1816 (2016).
  51. Shpilka, T., et al. UPRmt scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nat Comm. 12 (1), 479(2021).
  52. Braeckman, B. P., Smolders, A., Back, P., De Henau, S. In vivo detection of reactive oxygen species and redox status in Caenorhabditis elegans. antioxidants & redox signaling. 25 (10), 577-592 (2016).
  53. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. elegans. J Vis Exp. 159, e61001(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial MorphologyC Elegans AgingMitochondrial ImagingConfocal MicroscopyTissue Specific ImagingMitochondrial FragmentationGFP ConstructsMitoMAPR QuantificationMitochondrial HomeostasisFiji Software

Related Articles