Yöntem makalesi

İnsan Bağırsak Mikrobiyotasında C-Glikozit Metabolik Enzimlerinin Karakterizasyonu için Yapısal Biyoloji ve Analitik Kimya Yaklaşımları

1.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67629

⸱

23 Mayıs 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Son çalışmalar, insan bağırsak mikrobiyota enzimlerinin C-glikozitleri metabolize etmedeki rolünü vurgulamaktadır. Burada, bu C-glikozit metabolize edici enzimlerin yapısal ve enzimatik reaksiyon zincirlerini sistematik olarak karakterize etmek için analitik kimya tekniklerini (LC-MS/MS ve NMR) yapısal biyoloji yaklaşımlarıyla entegre eden kapsamlı bir metodoloji sunuyoruz.

Özet

Bağırsak mikrobiyotası, özellikle diyetteki glikozitleri metabolize etme kapasitesi nedeniyle, konak sağlığının önemli bir modülatörü olarak ortaya çıkmıştır. C-glikozitler, O-glikozitlere kıyasla üstün kimyasal stabilite ve enzimatik bölünmeye karşı direnç gösterirken, özel bağırsak bakterileri bunları seçici olarak metabolize ederek biyoyararlanımlarını artırabilir. Mikrobiyal C-glikozidaz enzimlerinin tanımlanmasından bu yana, kesin reaksiyon mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır ve bu süreçleri incelemek için standartlaştırılmış metodolojiler hala iyi bilinmemiştir. Bu boşluğu gidermek için, bu enzimatik aktiviteleri sistematik olarak karakterize etmek için sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) dahil olmak üzere yapısal biyoloji, enzimoloji ve analitik teknikleri birleştiren entegre bir multidisipliner yaklaşım getirdik. Bu kapsamlı yaklaşım, moleküler, enzimatik ve metabolik seviyelerde C-glikozit metabolizmasının hassas karakterizasyonunu sağlar.

Giriş

Son zamanlarda, insan bağırsak mikrobiyotası, konak sağlığını desteklemedeki kritik rolü nedeniyle büyük ilgi görmüştür 1,2. Bu mikrobiyal topluluklar, konak kaynaklı bileşikleri metabolize ederek biyolojik olarak aktif metabolitler 1,2,3 üretir. Örneğin, günlük diyetimizde en bol bulunan doğal bileşikler arasında yer alan flavonoidler, esas olarak insan bağırsağında zayıf bir şekilde emilen O- veya C-glikozitler olarak bulunur4. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyotası bu glikozitleri ikincil glikozitler veya aglikonlar gibi daha biyoaktif türevlere dönüştürebilir, çözünürlüklerini azaltabilir ve emilimlerini artırabilir, böylece doğal formlarına kıyasla biyoaktivitelerini iyileştirebilir 5,6.

Tarihsel olarak, O-glikozitlerin hidroliz mekanizmaları kapsamlı bir şekilde incelenmiştir 7,8. CC glikozidik bağları ile karakterize edilen C-glikozitler, daha fazla kimyasal stabilite ve bölünmeye karşı direnç sergiler 9,10. Buna rağmen, bazı bağırsak bakterileri C-glikozitleri deglikosile etme yeteneğini geliştirmiştir11,12. 1988'de Hattori ve ark. ilk olarak bazı bağırsak bakterilerinin C-glikozitlerden glikosil gruplarını çıkarabildiğini gösterdi 13. Daha sonraki çalışmalar, bu aktiviteyi yapabilen ilk bakteri türünü izole etti ve C-glikozit parçalama mekanizmalarının daha fazla araştırılmasını sağladı14. Bununla birlikte, bugüne kadar, sadece sınırlı sayıda bağırsak bakteri suşu ve C-glikozit metabolize edici enzimler tanımlanmış ve karakterize edilmiştir 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Son çalışmalar, PUE suşundaki deglikosilasyon puerarin (daidzein-8-C-glukozit) enzimlerinin (DgpA / B / C) iki aşamalı bir işlemle puerarin'i daidzein ve glikoza parçalayabildiğini göstermiştir: Bir Gfo / Idh / MocA ailesi oksidoredüktaz olan DgpA, puerarin'i 3 ''-okso-puerarin'e oksitler, bu daha sonra aglikon ve glikoz10'u elde etmek için DgpB / C kompleksinin aracılık ettiği bir β-eliminasyon reaksiyonuna girer, 26. Bununla birlikte, C-glikozit metabolize edici enzimlerin, özellikle DgpA/B/C sisteminin yapısal ve işlevsel özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır ve bu alandaki araştırmaları ilerletmek için daha ileri metodolojilere, özellikle biyolojik ve kimyasal stratejilerin entegrasyonuna ihtiyaç vardır24.

Bu boşluğu gidermek için, insan bağırsak mikrobiyotası DgpA/B/C katalizli C-glikozit metabolik reaksiyonunu araştırmak için entegre multidisipliner yaklaşımlar kullanıyoruz. Bu reaksiyonda, DgpA, C-glikozitlerin glikosil oksidasyonunu katalize eder, ardından DgpB ve DgpC, oksitlenmiş C-glikozit ürünlerini10,26,27 spesifik olarak parçalayan bir DgpB/C kompleksi oluşturur. Önce DgpA ve DgpB/C'nin rekombinant ekspresyonu ve saflaştırılmasını ayrı ayrı gerçekleştirdik. Saflaştırılmış DgpA ve DgpB/C proteinleri daha sonra kristalize edildi ve üç boyutlu yapıları X-ışını kristalografisi ile belirlendi. Son olarak, birleştirilmiş LC-MS/MS ve NMR spektroskopisi27 aracılığıyla gerçekleştirilen kapsamlı metabolik ürün analizi ile tam DgpA/B/C enzim sistemini kullanarak C-glikozit bölünme fonksiyonunu yeniden oluşturduk. Bu yaklaşımlara dayanarak, DgpA / B / C enzim sistemi tarafından katalize edilen C-glikozit metabolizmasını inceledik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Protein üretimi ve saflaştırılması

  1. İfade vektörünün inşası
    NOT: Bu çalışmada, insan bağırsak mikrobiyotasından DgpA, DgpB ve DgpC genleri, PUE suşu, model bir sistem olarak hizmet vermektedir. İlk adım, karşılık gelen rekombinant proteinleri üretmek için ekspresyon plazmitlerinin kullanılmasını içerir.
    1. NCBI'den DgpA/B/C gen kümesi dizisini (GenBank: LC422372.1) edinin. Daha sonra, DgpA/B/C DNA'sını ticari olarak sentezleyin ve DgpA, DgpB ve DgpC genlerini ayrı ayrı modifiye edilmiş bir pET-28a vektörüne klonlayın, bu da hedef proteini N-terminal SUMO ve 6×His etiketi (His-SUMO etiketi)28 ile üretecektir.
    2. DgpA, DgpB veya DgpC plazmitlerinin her birini E. coli BL21 (DE3) yetkin hücrelere dönüştürün. Daha sonra, 37 ° C'de 50 μg / mL kanamisin ile LB ortamında kültür bakterileri.
    3. Bakteri yoğunluğu (OD600) 0,6'ya ulaştığında ortama 0,2 mM IPTG ekleyin. Bakterileri 16 ° C'de 16 saat boyunca kültürleyin.
    4. Bakteri kültürünü ifade eden DgpA, DgpB ve DgpC'nin her birini 4.000 x g'da 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini her 1 L bakteri kültürü için 20 mL Tampon A'da (Tablo 1) yeniden süspanse edin.
  2. Proteinin saflaştırılması
    NOT: Yüksek saflıkta, yeterli miktarda rekombinant enzim, fonksiyonel karakterizasyon ve yapısal biyoloji çalışmaları için gereklidir. DgpB ve DgpC, işlevsellik için stabil bir protein kompleksi oluşturur (lizis prosedürü sırasında kendiliğinden DgpB/C kompleksi oluşturur)10,26. Daha sonra DgpA proteini ve DgpB/C kompleksinin saflaştırılması gerçekleştirilir.
    1. Bakteriyel resüspanse 1 mM PMSF ekleyin. Adım 1.1.4'teki DgpB ve DgpC bakteri süspansiyonunu karıştırın ve ardından bir ultrasonik hücre bozucu kullanarak DgpA bakteriyel süspansiyonunu veya DgpB ve DgpC karışımını (fonksiyonel DgpB / C kompleksi oluşturmak için) parçalayın.
    2. Bakteriyel lizatı 48.000 x g'da 4 ° C'de 40 dakika boyunca santrifüjleyin. Proteini içeren süpernatanı tutun ve bakteri peletini atın.
    3. Bir Nikel afinite kromatografisi (Ni-NTA) sütunu kullanarak süpernatanttan DgpA veya DgpB/C kompleksini saflaştırın. ÄKTA arıtıcıda Tampon A ve Tampon B (Tablo 1) ile %0 - 50 imidazol konsantrasyon gradyanı uygulayarak bağlı proteinleri elute edin.
    4. 10 μL ayrıştırılmış numune alın ve bunları 2 μL 5 × protein boyası ile karıştırın, ardından dikey bir elektroforez sistemi kullanarak 45 dakika boyunca 220 V'ta SDS-PAGE elektroforezi gerçekleştirin, ardından protein bantlarını görselleştirmek için Coomassie Blue boyama yapın. Gelecekte kullanmak üzere SDS-PAGE analizine dayalı olarak DgpA veya DgpB/C kompleksi içeren fraksiyonları toplayın.
      NOT: His-SUMO etiketli (17 kDa) bantlı DgpA (44 kDa) yaklaşık 61 kDa'da (Şekil 2D) göç ederken, His-SUMO etiketli (17 kDa) DgpC (33 kDa) yaklaşık 50 kDa'da ve His-SUMO etiketli (17 kDa) DgpB (15 kDa) yaklaşık 33 kDa'da göç eder (Şekil 2J)..
    5. Adım 1.2.3'ten DgpA veya DgpB/C kompleks numunelerini, imidazolün uzaklaştırılması için Tampon C'ye karşı 10 kDa moleküler ağırlıklı kesme diyaliz membranı kullanarak ve Ubikitin benzeri proteaz 1 (ULP1; Malzeme Tablosu) His-SUMO etiketini çıkarmak için enzim29.
    6. Diyaliz edilmiş protein örneğini iyon değişim kromatografisi sütunu (Q sütunu) aracılığıyla Tampon C'ye (Tablo 1) yükleyin. Daha sonra, ÄKTA arıtıcısında Tampon C ve Tampon D (Tablo 1) ile hazırlanan, 100 mM ila 600 mM arasında değişen bir sodyum klorür konsantrasyon gradyanı kullanarak bağlı proteini kolondan elüte edin.
    7. Adım 1.2.3 olarak Q sütunundan ayrıştırılan DgpA ve DgpB/C kompleksinin SDS-PAGE analizini gerçekleştirin ve moleküler ağırlıkları not edin: His-SUMO etiketi (17 kDa), DgpA (44 kDa), DgpA'nın oligomerik bantları (95 kDa'nın üzerinde) (Şekil 2E), DgpB (15 kDa), DgpC (33 kDa), DgpB ve DgpC'nin oligomerik bantları (53 kDa ile 95 kDa arasında) (Şekil 2K).
    8. Tampon E ile bir boyut dışlama sütunu (SEC) kullanarak proteini saflaştırın (Tablo 1). Elüsyon fraksiyonundaki proteinleri kullanarak SDS-PAGE analizi yapın ve ardından protein bantlarını görselleştirmek için Coomassie Blue boyaması yapın. SDS-PAGE ile analiz edildikten sonra hedef protein DgpA veya DgpB/C kompleksini içeren fraksiyonları toplayın.
      NOT: Oligomerize DgpA bandı 95 kDa'nın üzerinde iken (Şekil 2F), DgpC 33 kDa civarında, DgpB ve DgpC ise 15 kDa civarındadır ve oligomerize DgpB ve DgpC (53 kDa ile 95 kDa arasında) (Şekil 2L).
    9. 280 nm'de bir nanodamla kullanarak DgpA veya DgpB/C kompleksinin protein konsantrasyonunu ölçün. Daha sonra, DgpA veya DgpB/C kompleksini ultrafiltrasyon tüpleri ile yaklaşık 20 mg / mL'ye konsantre edin, ayırın ve sıvı nitrojen ile dondurun. DgpA veya DgpB/C kompleksini ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
  3. Dairesel dikroizm (CD) spektrum veri toplama
    NOT: DgpA tarafından katalize edilen glikosil oksidasyonu, metabolik yolda çok önemli bir başlatma adımı olarak hizmet ettiğinden, CD spektroskopisi, DgpA'nın hem uygun katlanma durumunu hem de ikincil yapısal bütünlüğünü doğrulamak için özel olarak kullanılmıştır. Bu yapısal parametreler hem enzimatik aktivite hem de başarılı protein kristalizasyonu için kritik öneme sahiptir.
    1. DgpA proteinini 1 x PBS tamponu (pH 7.4) ile 0.2 mg / mL'ye seyreltin (Tablo 1).
    2. 1x PBS tamponunu (pH 7.4) bir kuvars küvete yükleyin ve ikincil yapıyı ve katlanma durumu farklılıklarını hassas bir şekilde tespit etmek için bir CD spektrometresi kullanarak200 - 260 nm üzerindeki temel CD spektrumunu kaydedin 27.
    3. Tampon küvetini 1.3.1'den protein örnekleriyle değiştirin, CD spektrumunu 200 - 260 nm'nin üzerinde kaydedin ve protein örneği için CD spektrumunu elde etmek için tampon taban çizgisini çıkarın.
    4. Doğruluk için üç tarama toplayın ve ikincil yapı özellikleri ve protein katlanma durumu için verileri analiz edin (Şekil 3G, 3H).

2. Protein kristalografisi ve yapı tayini

NOT: DgpA'nın uygun katlanma ve yapısal bütünlüğü koruduğunu doğruladıktan sonra, her iki DgpA'nın üç boyutlu yapılarını belirlemek için yapısal biyoloji yaklaşımları kullanıldı. DgpB/C kompleksinin katalitik yeterliliğinin önceki fonksiyonel deneyler 10,26,27 ile biyokimyasal olarak doğrulandığı göz önüne alındığında, CD spektral doğrulama adımı atlanmıştır.

  1. Protein kristali büyümesi ve optimizasyonu
    1. 0.5 μL saflaştırılmış DgpA (20 mg / mL) veya DgpB / C kompleksini (20 mg / mL) eşit hacimde (0.5 μL) rezervuar çözeltisi ile 48 oyuklu kristal plakalar üzerindeki kristalizasyon kitlerinden oturma-bırakma yöntemindekarıştırın 30. Kristal büyümesi için kristal plakaları 16 °C'ye aktarın.
      NOT: DgpA veya DgpB/C kompleks kristal büyümesi için koşulları (protein konsantrasyonu ve PEG 3350, magnezyum format vb. gibi çökeltiler dahil) belirlemek için bu oturma damlalarını mikroskopla gözlemleyin.
    2. Asılı-damla buhar difüzyon yöntemini30 kullanarak hem DgpA hem de DgpB/C kompleksi için kristalleşme optimizasyonu gerçekleştirin.
    3. DgpA için, adım 2.1.1'de (20 mM magnezyum format, %20 PEG3350) tanımlanan durumla başlayın ve altı PEG3350 konsantrasyon gradyanını (%17, %18, %19, %20, %21 ve %22) dört magnezyum format konsantrasyon gradyanına (16 mM, 18 mM, 20 mM ve 22 mM) karşı test ederek ortogonal bir optimizasyon yaklaşımı uygulayın30.
    4. Sililanize cam lameller üzerinde 0.8 μL DgpA protein solüsyonunu (10 veya 20 mg / mL) 0.8 μL rezervuar solüsyonu ile karıştırarak kristalizasyon damlaları hazırlayın. Daha sonra lamelleri 24 oyuklu kristalizasyon plakaları üzerinde ters çevirin ve kristal büyümesi için 16 °C'de inkübe edin.
    5. DgpB/C kompleks optimizasyonu için aynı yaklaşımı izleyin: 0,8 μL protein kompleksini (10 veya 20 mg/mL) magnezyum asetat (16, 18, 20 veya 22 mM) ve PEG 8000 (%8, %9, %10, %11, %12 veya %13) içeren 0,8 μL rezervuar çözeltisi ile karıştırın. Benzer şekilde, 24 oyuklu plakalar üzerine silanize lameller üzerine asılı damlalar yerleştirin ve 16 ° C'de inkübe edin.
    6. DgpA ve DgpB/C kompleksinin protein kristallerinin, büyümeleri durana kadar tam boyuta ulaşmasına izin verin ve ardından kristalleri, rezervuar tamponu ve 5 mM substrat bileşikleri (glikoz ve puerarin) içeren bir ıslatma çözeltisine aktarın. DgpA ve DgpB/C kompleksinin 16 ° C'de 30 dakika.
    7. DgpA (glikozlu veya substrat içermeyen) ve DgpB/C kompleksi (substrat içermeyen) dahil olmak üzere kristalleri, %25 gliserol ile desteklenmiş ıslatma tamponu koşulunu içeren bir kriyoprotektan çözeltisine aktarın ve veri toplama için hemen sıvı nitrojen içinde saklayın.
      NOT: Hem DgpA hem de DgpB/C kompleks kristalleri substratlarla (glikoz ve puerarin) ıslatılmış olsa da, DgpA'nın katalitik merkezine yalnızca glikoz başarıyla dahil edildi. Sonuç olarak, yapısal analiz için üç farklı kristal formu elde edildi: glikozlu DgpA (Şekil 3E); substrat içermeyen DgpA (Şekil 3B-C); ve substrat içermeyen DgpB/C kompleksi (Şekil 3D). Kriyoprotektan çözeltisi, sıvı nitrojende hızlı soğutma sırasında buz oluşumunu önleyerek protein kristallerini korur, böylece yapısal bütünlüklerini korur ve radyasyonun neden olduğu hasarı en aza indirir. Tipik olarak baz olarak ana likör kullanılarak formüle edilen çözelti, optimize edilmiş kriyoprotektan konsantrasyonları (örneğin, gliserol veya etilen glikol) ile desteklenir.
  2. Veri toplama ve yapı belirleme
    1. Şanghay Ulusal Protein Bilimi Tesisi'nin (NFPS) Şanghay Sinkrotron Radyasyon Tesisi'nde (SSRF) glikozlu veya substrat içermeyen formlarda DgpA için kristalin X-ışını kırınım verilerini toplayın (NFPS) 0.978 Å'lik bir dalga boyu ile.
    2. Bir kristalografik veri işleme yazılımı31 kullanarak DgpA ve DgpB/C kompleksi dahil olmak üzere üç X-ışını kırınım verisi setini işleyin. Önce ham verileri yükleyin, ardından yazılımdaki ilgili düğmelere tıklayarak indeksleme, entegre etme ve ölçeklendirme işlevlerini sırayla yürütün. Sonraki yapı belirleme için uygun işlenmiş bir çıktı dosyası (output.sca) oluşturun.
    3. Moleküler replasman yöntemini kullanarak (Malzeme Tablosu) glikoz ile veya substrat içermeyen formlarda (Şekil 3B-C, 3E) ve substrat içermeyen (Şekil 3D) DgpB/C kompleksinin yapılarını belirleyin. Ardından, ilgili ligandları (glikoz, Mn2 +, H2O, vb.) dahil ederek yapıları ve elektron haritalarını iyileştirin31.

3. Reaksiyon aktivitesinin izlenmesi ve kinetik parametrelerin belirlenmesi

NOT: DgpA/B/C sistemi, tanımlanmış iki aşamalı bir kaskad yoluyla C-glikozit dönüşümlerine aracılık eder: DgpA, şeker kısmını oksitleyerek katalizi başlatır ve DgpB/C kompleksinin daha sonra parçaladığı veya izomerleştirdiği bir ara ürünüretir 10,26,27. Bu çalışmada, DgpA/B/C, bu reaksiyon kaskadından sorumlu enzimleri ifade ederken, DgpA ile DgpB/C kompleksi arasında doğrudan bir etkileşim meydana gelmediğine dikkat edilmelidir. Bu birleştirilmiş aktivite, üç tamamlayıcı yaklaşım kullanılarak titiz bir şekilde ölçülebilir: HPLC ürün analizi, elektron transferini izleyen DCPIP bağlantılı spektrofotometrik testler veya reaksiyon parametrelerinin ayrıntılı kinetik karakterizasyonu27,32. Spesifik olarak, DgpA / B / C katalizi ile üretilen C-glikozit bölünme ürünleri (daidzein) HPLC (265 nm'de UV tespiti) ile analiz edildi. Ürün oluşumu, standart bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak nicelleştirildi (Standart eğriyi oluşturma yöntemi, Adım 3.3.2. altındaki notta ayrıntılı olarak açıklanmıştır) ve kinetik parametreler, doğrusal olmayan regresyon analizi27,32 yoluyla ürün oluşum oranlarının Michaelis-Menten modeline uydurulmasıyla belirlendi. Glikozun puerarin C-glikozidik bağ bölünmesi üzerindeki etkisini ölçen inhibisyon testi, sakkaritlerin DgpA için substrat görevi görebileceğine dair doğrulayıcı kanıtlar sağlamıştır. Daha sonra, DCPIP testi, oksitlenmiş şekerlerden33 elektronları kabul ettiği için mavi renkli 2,6-diklorofenolindofenolün (DCPIP) renksiz löko-DCPIP'ye indirgenmesini ölçerek şeker oksidasyon reaksiyonlarını izler ve böylece DgpA'nın katalitik aktivitesini yansıtır.

  1. HPLC ile DgpA/B/C aktivitesinin izlenmesi
    1. 20 μM DgpA ve DgpB/C kompleksi (Adım 1.2.7'den) ve 0.1 mM içeren 500 μL Tampon F'de (Tablo 1) DgpA/B/C katalizli C-glikozit bölünmesi veya izomerizasyon reaksiyonunu gerçekleştirin: bölünme reaksiyonları için puerarin veya genistein-8-C-glukozit veya izomerizasyon reaksiyonları için daidzin veya genistin27. Reaksiyonları 37 °C'de 8 saat boyunca gerçekleştirin ve reaksiyon karışımına 1,5 mL metanol ekleyerek sonlandırın.
    2. Metanolün neden olduğu enzim denatürasyonu nedeniyle oluşan protein çökeltisini çıkarmak için reaksiyon çözeltisini 16.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 0.22 μm'lik bir filtre membranı kullanarak filtreleyin.
    3. 10 μL enjeksiyon hacmi ve UV 265 nm algılama dalga boyu ile 1 mL/dk akış hızında gradyan elüsyonlu HPLC analizi gerçekleştirin.
      NOT: Mobil fazlar, gradyan elüsiyonlu asetonitril (Mobil Faz A) ve% 0.1 sulu asetik asit (Mobil Faz B) idi. Mobil faz elüsyonunun gradyanı aşağıdaki gibidir: 0-5 dakikada% 5 -% 20 A,% 20 -% 45 A 5-15 dakikada,% 45 -% 52 A 15-18 dakikada,% 52 -% 55 A 18-19 dakikada,% 55 -% 5 A 19-21 dakikada% ve 21-23 dakikada% 5 A. DgpA/B/C enzim sistemi, daidzin ve genistin gibi substratlara karşı belirgin şekilde farklı katalitik verimlilikler sergiler ve bu da ilgili ürün oluşum hızlarında önemli farklılıklara neden olur. Substrat dönüşüm kinetiğini ve ürün biriktirme dinamiklerini kantitatif olarak değerlendirmek için, 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 ve 48 saatlik aralıklarla HPLC kullanılarak kapsamlı bir zaman seyri analizi gerçekleştirildi.
  2. 2,6 -diklorofenol indofenol (DCPIP) testi ile DgpA aktivitesinin izlenmesi
    NOT: DCPIP testi, oksitlenmiş şekerlerden33 elektronları kabul ederken mavi DCPIP'nin renksiz löko-DCPIP'ye indirgenmesini ölçerek şeker oksidasyonunu izler. Burada, farklı glikosile bileşiklere, monosakkaritlere, disakkaritlere veya polisakkaritlere karşı DgpA oksidasyon aktivitesini kaydetmek için DCIPIP raportör testi kullanıldı. Wildtype DgpA ve D182A, Δ(308-316) ve Δ(311-316) dahil olmak üzere şeker bağlayıcı kusurlu mutantları kullanıldı27.
    1. 0.8 mM DCPIP, vahşi tip DgpA ve üç şeker bağlayıcı kusurlu mutantı (DgpA D182A, DgpA Δ (308-316) veya DgpA Δ (311-316)) dahil olmak üzere 50 μM proteini inkübe edin), puerarin, vitexin, genistin, çözünür nişasta, maltotrioz, laktoz, sükroz, glikoz veya maltoz dahil olmak üzere 10 mM substrat ile 1x PBS tamponunda (pH 7.4).
    2. 20 saatlik reaksiyondan sonra, bir mikroplaka okuyucu33 kullanarak DCPIP'nin 600 nm'de absorbans değişimini kaydedin.
  3. Puerarin'in C-glikozidik bağ bölünme reaksiyonu üzerindeki glikozun inhibisyon hızının belirlenmesi
    NOT: DgpA, C-glikozitlerin şeker kısmını oksitleyebilen şeker oksidoredüktaz enzim ailesine aittir. Şekil 3E, glikozun DgpA katalitik merkezine bağlı olduğunu göstermektedir ve DgpA yapısını belirleme protokolü adım 2.2.3'te detaylandırılmıştır. DgpA'nın glikoz ve C-glikozit puerin arasındaki rekabetçi bağlanmasını incelemek için aşağıdaki deneyler yapılmıştır.
    1. Reaksiyonu 1 × PBS tamponunda (pH 7.4) gerçekleştirin. Adım 3.1'de açıklandığı gibi C-glikozit (puerarin) bölünme reaksiyon sistemine farklı konsantrasyonlarda glikoz (1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM ve 100 mM) ekleyin. Reaksiyonu 37 °C'de 12 saat boyunca gerçekleştirin.
    2. Referans bileşik (standart daidzein) için HPLC kalibrasyon eğrisini kullanarak ürünün (daidzein) kantitatif analizini gerçekleştirin. Önce değişen glikoz konsantrasyonları içeren reaksiyonlar ile inhibe edilmemiş C-glikozit bölünme reaksiyonları (glikoz olmadan) arasındaki ürün verimindeki farkı belirleyerek ve ardından bu farkı inhibe edilmemiş reaksiyondan elde edilen ürün verimine bölerek inhibisyon oranını hesaplayın.
      NOT: Kantitatif HPLC analizi için bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, bir konsantrasyon aralığında (örneğin, 0.1-1 mM, 0.1 mM'lik artışlarla) bir referans standardının (örneğin, puerarin veya daidzein) seri seyreltmesini hazırlayın. Her konsantrasyonu HPLC ile analiz edin, tepe alanlarını kaydedin ve bunları karşılık gelen standart konsantrasyonlara göre çizin. Standart eğriyi oluşturmak için doğrusal regresyon analizi yapın (y = mx + b, burada y = tepe alanı, x = konsantrasyon). Regresyon denklemi daha sonra bilinmeyen numune konsantrasyonlarını ölçülen tepe alanlarından enterpolasyon yapmak için kullanılabilir.
  4. Kinetik parametrelerin belirlenmesi
    NOT: Kinetik parametreler, enzimatik katalitik verimliliği kantitatif olarak değerlendirmek için kritik altın standartlar olarak yaygın olarak kabul edilmektedir. DgpA / B / C katalizli reaksiyonları kantitatif olarak değerlendirmek için, DgpA / B / C tarafından katalize edilen C-glikozit puerarin bölünme reaksiyonları için kinetik parametreler belirlendi.
    1. DgpA / B / C katalizli C-glikozit bölünme reaksiyonu için substrat C-glikozit (puerarin) konsantrasyon gradyanlarını (2 katlı artışlarla 0.01 ila 4 mM arasında değişen) hazırlayın.
    2. Reaksiyonu adım 3.1'de açıklanan yönteme göre 8 saat boyunca 37 °C'de gerçekleştirin. Standart daidzein'in HPLC kalibrasyon eğrisini kullanarak ürünün (daidzein) kantitatif analizini yapın. Ardından, niceliksel miktarı reaksiyon süresine bölerek reaksiyon hızını (ürün oluşum hızı) hesaplayın.
    3. Hesaplanan reaksiyon hızını ve substrat konsantrasyonunu istatistiksel yazılım (Malzeme Tablosu) kullanarak Michaelis-Menten modeline uydurarak K, m ve kkatetik kinetik parametrelerini belirleyin.

4. Reaksiyon ara ürününün hazırlanması ve tespiti

NOT: C-glikozit bölünme aktivitesinin ötesinde, DgpA/B/C ayrıca O-glikozitlerin C-glikozitlere izomerizasyonunu katalize eder. Bu nedenle, O-glikozitler DgpA/B/C için substrat olarak kullanıldığında, ara ürünler izomerize C-glikozitler olarak üretilecektir. Ara ürünü (puerarin) karakterize etmek için, ara bileşik saflaştırıldı ve daha sonra LC-MS/MS ve NMR spektroskopisi dahil olmak üzere analitik kimya araçları kullanılarak analiz edildi.

  1. DgpA/B/C katalizli C-glikozit izomerizasyon reaksiyonunda reaksiyon ara ürününün hazırlanması 27
    1. Substrat olarak 0.2 mM O-glikozit (daidzin) ve 90 mL'lik bir reaksiyon hacminde 20 μM DgpA ve DgpB/C kompleksi kullanarak DgpA/B/C katalizli O-ila C-glikozit izomerizasyon reaksiyonunu hazırlayın, yukarıdaki adım 3.1'de açıklanan protokolü izleyerek.
    2. Gradyan elüsyon stratejisinde (NOT) hazırlayıcı bir HPLC kullanarak ara ürün C-glikoziti (puerarin) saflaştırın.
      NOT: Mobil fazlar, gradyan elüsiyonlu asetonitril (Mobil Faz A) ve% 0.1 sulu asetik asit (Mobil Faz B) idi. Mobil faz elüsyonunun gradyanı aşağıdaki gibidir: 0-5 dakikada% 5 -% 20 A,% 20 -% 45 A 5-15 dakikada,% 45 -% 52 A 15-18 dakikada,% 52 -% 55 A 18-19 dakikada,% 55 -% 5 A 19-21 dakikada% ve 21-23 dakikada% 5 A.
    3. Adım 3.3.2'deki standart kalibrasyon HPLC eğrisini kullanarak saflaştırılmış ara ürünün konsantrasyonunu hesaplayın, adım 4.1.1'de 90 mL reaksiyon sisteminde yaklaşık 6 mg puerarin alın ve ardından saflaştırılmış ara ürünleri ileride kullanmak üzere bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı ile kurutun.
  2. LC-MS/MS ile reaksiyon ara ürününün karakterizasyonu
    1. Kurutulmuş ara ürünleri adım 4.1.3'ten toplayın. Daidzin türevi ara ürünlerin 100 μg'ını tartın, ardından 50 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 2 mL metanol içinde çözün. 10 dakika boyunca 13.500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı LC-MS/MS analizi için toplayın.
    2. 5 μL'lik bir enjeksiyon hacmine sahip LC-MS/MS analizi için adım 4.1.2'de aynı HPLC gradyan elüsyon programını kullanın.
  3. NMR ile reaksiyon ara ürününün karakterizasyonu
    1. Daidzin reaksiyonundan 4 mg saflaştırılmış ara ürünü, 1H ve 13C NMR spektroskopisi için 340 μL dimetil sülfoksit-d 6'da çözün. Cihaz parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: 298 K'da sıcaklık, 3 kez şim, darbe genişliği 18 μs, gevşeme gecikmesi 1,5 s, 48 tarama, diğer parametreler varsayılan ayarlarda27.
    2. 1 MHz NMR cihazı kullanarak NMR 13H ve 600 C spektrumlarını toplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Belirtilen prosedürleri takip ederek Şekil 1, ilk olarak DgpA, DgpB ve DgpC genlerini E. coli BL21 (DE3) hücreleri. DgpB ve DgpC kararlı bir enzim kompleksi oluşturduğundan (DgpB/C kompleksi)10,26,27,34, bu iki proteini eksprese eden hücreler, birlikte saflaştırma için birleştirildi. Hücre lizizinden sonra, süpernatant 48.0...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Şu anda, bu alandaki C-glikozit metabolizması enzimlerinin yapısal ve fonksiyonel özellikleri belirsizliğini korumaktadır ve uygun araştırma yöntemleri eksiktir 10,24,26. Çalışma, birleşik kimya ve biyoteknolojinin 40,41,42,43,44,45 önemli avantajlarından yararlanarak,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'nde (BUCM) (90011451310011) W.M.'ye Başlangıç fonu programı, BUCM'deki COVID-19'a karşı acil durum fonu (1000061223476) W.M.'ye, geleneksel Çin tıbbı ulusal idaresinin inovasyon ekibi ve yetenek yetiştirme programı (ZYYCXTD-C-202006) W.M.'ye ve BUCM(ZJKT2023012)'deki lisansüstü öğrenciler için bağımsız araştırma projesi ile H.P.'ye finanse edilmektedir. Wenfu Ma laboratuvarındaki tüm laboratuvar üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2,6-dikloroindofenol (DCPIP)Solarbio Bilim ve TeknolojiD6350
2-Merkaptoetanol(β-ME)Sigma-Aldrich08168
  5 & kez; Protein YüklemeBoyası Sangon BiotechC508320
Asetik asitShanghai MACKLINA111247
AsetonitrilThermo Fisher Scientific & ? InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz NMR SpektrometresiBrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 MHz
Santrifüj 5424REppendorf022620601
Chirascan & trade; artı CD spektrometresiUygulamalı FotofizikChirascan & ticaret;  
Daidzein ShanghaiYuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol (DTT)Solarbio Bilim ve TeknolojiD8220
E. coli BL21 (DE3) yetkin hücrelerThermo Fisher Scientific ™? InvitrogenEC0114
GenisteinShanghai Yuanye Biyo-TeknolojiS31565
Genistein-8-C-glukozitShanghai Yuanye Biyo-TeknolojiBP2095
GenistinShanghai Yuanye Biyo-TeknolojiS31591
GlikozSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9GraphPad YazılımıSürüm? Prizma 9Km ve kcat kinetik parametrelerini hesaplayın
HiLoad Superdex 200 pg hazırlayıcı SEC sütunlarıCytiva28989335
HisTrap HP Etiket protein saflaştırma kolonlarıCytiva17524802
HiTrap Q FF anyon değişim kromatografisi kolonCytiva17515601
HKL-3000HKL araştırma A.Ş.  sürüm 723
HPLC Sütunu TC-C18 (2), 170 & 1 & 3 mikro; m, 4.6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
İzopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit? IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
LaktozSigma-Aldrich17814
LC-20AT, yüksek performanslı sıvı kromatografisiShimadzuLC20AT
MaltozSigma-Aldrich47288
MaltotrioseSigma-Aldrich443713
Manganez klorürŞanghay Yuanye Biyo-TeknolojiS31112
MetanolThermo Fisher Bilim;? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Bilim ve TeknolojiN8110
Olympus SZX12 Stereo MikroskopOLYMPUS SZX7
fenilmetilsülfonil florür (PMSF)Sigma-AldrichP7626 ve nbsp;
PhoenixPhoenix geliştirme ekibi1.21.2Phoenix, Phaser yazılımı ile SAD (Tek dalga boylu Anormal Dağılım) ve MR (Moleküler Değiştirme) yöntemlerini içeren, protein kristal yapısı belirleme için kapsamlı bir yazılım paketidir.
Hazırlayıcı yüksek performanslı sıvı kromatografıSular2545/2998
Protein Kristal Tarama KitiHampton ResearchHR2-110 / HR2-112 / HR2-144 / HR2-126 / HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Biyo-TeknolojiB20446
Çalkalama inkübatörüShanghai Zhichu Instrument Co., Ltd  ZQZY-AF8
Yılan Derisi ve ticareti; Diyaliz Membranı, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific™? Invitrogen88245
Çözünür nişastaSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 Süper Hızlı SantrifüjThermo Fisher Scientific ™
SpectraMax i3x Çok Modlu Mikroplaka OkuyucuMOLEKÜLER CİHAZLARSpectraMax i3x 
SpectraMax QuickDrop Mikro Hacimli Spektrofotometre ÖzellikleriMOLEKÜLER CİHAZLARQuickDrop
SükrozSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Hazırlık KolonSuları186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific™? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Ubikitin benzeri proteaz 1Thermo Fisher Scientific™? Invitrogen12588018
Ultra Düşük Sıcaklık DondurucuThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcıPekin JM TeknolojisiCV600
VitexinSigma-Aldrich49513
75006590

Kaynaklar

  1. Gomaa, E. Z. Human gut microbiota/microbiome in health and diseases: a review. Antonie Van Leeuwenhoek. 113 (12), 2019-2040 (2020).
  2. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  3. Nie, Q., et al. Gut symbionts alleviate MASH through a secondary bile acid biosynthetic pathway. Cell. 187 (11), 2717-2734.e33 (2024).
  4. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), (2022).
  5. Zhang, S. -J., Guo, J. -R., Kang, A., Di, L. -Q. Advance in studies on gut microbiota in de-glycosylation of traditional Chinese medicine glycosides. Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo Zhongyao ZazhiChina Journal of Chinese Materia Medica. 38 (10), 1459-1466 (2013).
  6. Xie, G. -Z., Hui, H. -Y., Peng, M. -J., Tan, Z. -J. Biotransformation of glycosides in herbal medicine by gut microbiota. World Chinese Journal of Digestology. 26 (4), 221(2018).
  7. Vuong, T. V., Wilson, D. B. Glycoside hydrolases: catalytic base/nucleophile diversity. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 195-205 (2010).
  8. Davies, G., Henrissat, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3 (9), 853-859 (1995).
  9. Ito, T., Fujimoto, S., Shimosaka, M., Taguchi, G. Production of C-glucosides of flavonoids and related compounds by Escherichia coli expressing buckwheat C-glucosyltransferase. Plant Biotechnology. 31 (5), 519-524 (2014).
  10. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104, 1883-1890 (2020).
  11. Che, Q. M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Metabolism of aloesin and related compounds by human intestinal bacteria: a bacterial cleavage of the C-glucosyl bond and the subsequent reduction of the acetonyl side chain. Chem Pharm Bull (Tokyo). 39 (3), 704-708 (1991).
  12. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (5), 1883-1890 (2020).
  13. HATTORI, M., et al. Metabolism of barbaloin by intestinal bacteria. Chem Pharm Bull (Tokyo). 36 (11), 4462-4466 (1988).
  14. Che, Q. -M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Isolation of a human intestinal bacterium capable of transforming barbaloin to aloe-emodin anthrone1. Planta medica. 57 (01), 15-19 (1991).
  15. Braune, A., Blaut, M. Deglycosylation of puerarin and other aromatic C-glucosides by a newly isolated human intestinal bacterium. Environ Microbiol. 13 (2), 482-494 (2011).
  16. Braune, A., Blaut, M. Intestinal bacterium Eubacterium cellulosolvens deglycosylates flavonoid C-and O-glucosides. Appl Environ Microbiol. 78 (22), 8151-8153 (2012).
  17. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  18. Kim, D. -H., et al. Intestinal bacterial metabolism of flavonoids and its relation to some biological activities. Arch Pharm Res. 21, 17-23 (1998).
  19. Kim, M., Lee, J., Han, J. Deglycosylation of isoflavone C-glycosides by newly isolated human intestinal bacteria. J Sci Food Agric. 95 (9), 1925-1931 (2015).
  20. Tao, Z., et al. Isolation and identification of Enterococcus gallinarum P581a, a strain of intestinal bacteria deglycosylating flavone C-glycosides. J Gen Appl Microbiol. 68 (3), 125-133 (2022).
  21. Wang, S., et al. A newly isolated human intestinal strain deglycosylating flavonoid C-glycosides. Arch Microbiol. 204 (6), 310(2022).
  22. Xu, J., et al. Application of ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry to determine the metabolites of orientin produced by human intestinal bacteria. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 944, 123-127 (2014).
  23. Zheng, S., et al. A newly isolated human intestinal bacterium strain capable of deglycosylating flavone C-glycosides and its functional properties. Microb Cell Fact. 18, 1-10 (2019).
  24. Braune, A., Engst, W., Blaut, M. Identification and functional expression of genes encoding flavonoid O-and C-glycosidases in intestinal bacteria. Environ Microbiol. 18 (7), 2117-2129 (2016).
  25. Kumano, T., et al. FAD-dependent C-glycoside-metabolizing enzymes in microorganisms: Screening, characterization, and crystal structure analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 118 (40), e2106580118(2021).
  26. Nakamura, K., Zhu, S., Komatsu, K., Hattori, M., Iwashima, M. Deglycosylation of the isoflavone C-glucoside puerarin by a combination of two recombinant bacterial enzymes and 3-oxo-glucose. Appl Environ Microbiol. 86 (14), e00607-e00620 (2020).
  27. He, P., et al. Structural mechanism of a dual-functional enzyme DgpA/B/C as both a C-glycoside cleaving enzyme and an O- to C-glycoside isomerase. Acta Pharm Sin B. 13 (1), 246-255 (2023).
  28. Wang, Z., et al. Pro isomerization in MLL1 PHD3-bromo cassette connects H3K4me readout to CyP33 and HDAC-mediated repression. Cell. 141 (7), 1183-1194 (2010).
  29. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  30. Delucas, L. J., et al. Protein crystallization: virtual screening and optimization. Prog Biophys Mol Biol. 88 (3), 285-309 (2005).
  31. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  32. Li, M., et al. An efficient C-glycoside production platform enabled by rationally tuning the chemoselectivity of glycosyltransferases. Nat Commun. 15 (1), 8893(2024).
  33. Peters, B., et al. Characterization of membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter oxydans 621H via whole-cell activity assays using multideletion strains. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (14), 6397-6412 (2013).
  34. Nasseri, S. A., et al. An alternative broad-specificity pathway for glycan breakdown in bacteria. Nature. 631 (8019), 199-206 (2024).
  35. Rose, J. P., Wang, B. C. SAD phasing: History, current impact and future opportunities. Arch Biochem Biophys. 602, 80-94 (2016).
  36. Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
  37. Taberman, H., Parkkinen, T., Rouvinen, J. Structural and functional features of the NAD(P) dependent Gfo/Idh/MocA protein family oxidoreductases. Protein Sci. 25 (4), 778-786 (2016).
  38. Jahn, B., et al. Understanding the chemistry of the artificial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster's Blue in methanol dehydrogenase assays. J. Biol. Inorg. Chem. 25, 199-212 (2020).
  39. Yu, L., et al. Biotransformation of puerarin into puerarin-6 ″-O-phosphate by Bacillus cereus. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (2), 299-305 (2012).
  40. Lin, H., et al. Lysineless HiBiT and NanoLuc tagging systems as alternative tools for monitoring targeted protein degradation. ACS Med Chem Lett. 15 (8), 1367-1375 (2024).
  41. Ma, K., et al. A Widespread Radical-Mediated Glycolysis Pathway. J Am Chem Soc. 146 (38), 26187-26197 (2024).
  42. Yang, L., Lei, S., Xu, W. Rising above: exploring the therapeutic potential of natural product-based compounds in human cancer treatment. Tradit Med Res. 10 (3), 18(2025).
  43. Zhu, C., Cook, S. P. A concise synthesis of (+)-artemisinin. J Am Chem Soc. 134 (33), 13577-13579 (2012).
  44. Schade, A. E., et al. AKT and EZH2 inhibitors kill TNBCs by hijacking mechanisms of involution. Nature. , 1-9 (2024).
  45. Karpinska, K., et al. Selective degradation of MLK3 by a novel CEP1347-VHL-02 PROTAC compound limits the oncogenic potential of TNBC. J Med Chem. 67 (17), 15012-15028 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

C Glikozid MetabolizmasBa rsak Mikrobiyota EnzimleriProtein KristalografisiLC MS AnaliziNMR SpektroskopisiEnzim Kineti iKromatografik Safla t rmaFlavonoid Metabolizmas

İlgili makaleler