Yöntem makalesi

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

DOI:

10.3791/67648

⸱

31 Ocak 2025

 , 
1Department of Immunology, Harvard Medical School, 2Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, canlı bağışıklık ve bağışıklık dışı popülasyonların fare akciğerinden kararlı bir durumda ve grip enfeksiyonunu takiben izolasyonunu detaylandırır. Ayrıca epitelyal ve miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejileri sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğerler sürekli olarak patojenlere ve diğer zararlı çevresel uyaranlara maruz kalır ve bu da onu hasara, işlev bozukluğuna ve hastalık gelişimine karşı savunmasız hale getirir. Solunum yolu enfeksiyonu, alerji, fibroz ve kanserin fare modellerini kullanan çalışmalar, hastalığın ilerleme mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve terapötik hedefleri belirlemek için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, fare akciğerine odaklanan çoğu çalışma, her iki popülasyonun aynı anda yerine bağışıklık hücrelerinin veya epitel hücrelerinin izolasyonuna öncelik verir. Burada, akış sitometrisi ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması için uygun olan hem bağışıklık hem de bağışıklık dışı popülasyonların kapsamlı bir tek hücreli süspansiyonunu hazırlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu popülasyonlar epitel hücreleri, endotel hücreleri, fibroblastlar ve çeşitli miyeloid hücre alt kümelerini içerir. Bu protokol bronkoalveoler lavaj ve ardından akciğerlerin dispas ile şişirilmesini gerektirir. Akciğerler daha sonra bir liberaz karışımı içinde sindirilir. Bu işleme yöntemi, çeşitli hücre tiplerini serbest bırakır ve bir filtreye karşı manuel ayrışma gerektirmeyen tek hücreli bir süspansiyon ile sonuçlanır, hücre sağkalımını teşvik eder ve aşağı akış analizleri için yüksek sayıda canlı hücre verir. Bu protokolde, hem naif hem de influenza ile enfekte akciğerlerde epitelyal ve miyeloid hücre alt kümeleri için geçit şemaları da tanımlıyoruz. Canlı immün ve immün olmayan hücrelerin eşzamanlı izolasyonu, hücreler arası karışmayı sorgulamak ve sağlık ve hastalıkta akciğer biyolojisi hakkında daha derin bir anlayış kazanmak için anahtardır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer, hava yolları, alveoller ve interstisyumdan oluşur. İmmün ve immün olmayan hücreler, hem homeostatik akciğer fonksiyonuna (gaz değişimi) hem de viral enfeksiyon gibi çevresel hakaretlere karşı konak savunmasına katkıda bulunmak için bu bölmelerde bulunur. Büyük ve küçük hava yolları veya bronşlar ve bronşiyoller, epitel hücreleri ile kaplıdır. Bu bölgelerdeki baskın epitel hücreleri, koruyucu moleküllerin salgılanmasından ve mukosiliyer klirensinkolaylaştırılmasından sorumlu olan kulüp ve siliyer hücrelerdir 1. Alveoller, akciğerdeki en distal yapılardır ve iki epitel hücre tipi, alveolar tip I hücreler (ATI'ler) ve alveolar tip II hücreler (ATII'ler) ile kaplıdır. ATI'ler gaz değişiminden sorumludur ve ATII'ler uygun yüzey gerilimini sağlamak için yüzey aktif maddeleri salgılar ve geri dönüştürür 2,3. ATII'ler kendi kendini yeniler ve ayrıca özellikle akciğer hasarından sonra önemli bir rol olan ATI'lere farklılaşabilir4. Ek olarak, ATII'ler, alveolar nişi dolduran ana bağışıklık hücresi tipi olan alveolar makrofajlar ('ler) için destekleyici bir niş sağlar5,6. Epitelin ötesinde, fibroblastlar, endotel hücreleri ve interstisyel makrofajlar (IM'ler) (hem sinir hem de damarla ilişkili olabilir) interstisyum 7,8,9,10'u içerir. Enfeksiyon ve yaralanmaya yanıt olarak, çok sayıda akciğer hücresi ölür ve monositler ve nötrofiller dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri dokuya sızar11,12. Akciğere sızan monositler makrofajlara farklılaşır ve makrofaj bölmesine uzun süreli katkıda bulunabilir13.

Fare akciğerinden tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için mevcut yöntemler genellikle kollajenaz bazlıdır ve dokunun fiziksel olarak ayrışmasını gerektirir14. Bu, düşük sayıda canlı bağışıklık dışı hücre popülasyonu ile sonuçlanabilir. Epitel hücrelerini izole etmek için bazı protokoller dispaz bazlıdır ve daha yüksek oranlarda canlı epitel hücresi verir; Bununla birlikte, bu protokoller genellikle bağışıklık hücresi verimlerini ve canlılığını araştırmaz 15,16,17. Akış sitometrisi, sindirilmiş bir doku içindeki hücre popülasyonlarını ayırt etmek için kullanılan yaygın bir yöntemdir. Başlangıçta,'ler, IM'ler, monositler ve nötrofiller için akış sitometrisi geçiti açıkça tanımlanmıştır. Bununla birlikte, iltihaplanma sırasında, makrofajlara farklılaşan sızan monositlerin yüzey işaretleyici ekspresyonundaki süreklilik nedeniyle geçit işlemi değişken ve yorumlanması zor hale gelir. Bu nedenle, burada sunulan protokol, enfeksiyonu takiben ilgilenilen miyeloid hücre popülasyonlarını tanımlamak için geçit stratejilerini de özetlemektedir.

Akciğer epitel ve miyeloid hücrelerinin sağlam bir şekilde ayrılması, homeostatik ve inflamatuar fonksiyonlarını ayırt etmek için gereklidir. Bu hücre bölmelerini paralel olarak izole etmek için bir yöntem, hem sağlığı koruyan hem de hastalığa neden olan anahtar hücre tiplerinin aşağı akış analizlerini mümkün kılacaktır. Bu protokolün iş akışına şematik bir genel bakış Şekil 1'de bulunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Harvard Tıp Okulu'ndaki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygundur (Hibe numaraları: R35GM150816 ve P30DK043351). Deneyler için 8-12 haftalık dişi C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Bu protokol aynı zamanda erkek fareler için de uygundur. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Malzemelerin hazırlanması

  1. Dispase, liberaz ve DNAse dahil olmak üzere gerekli enzimleri buz üzerinde çözün.
  2. Diğer gerekli reaktifleri hazırlayın. 10 mL'lik bir şırıngayı DPBS'de 5 mL 2 mM EDTA ile doldurun ve 27 G'lik bir iğne ile takın. 1 mL şırıngayı DPBS ile doldurun ve kateteri takın.

2. Akciğerlerin toplanması

  1. Fareyi 400-500 mg / kg ve 25-100 mg / kg ketamin / ksilazin karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Fare ayak pedi tutamına yanıt vermediğinde (~ 5 dakika) diseksiyona devam edin.
    NOT: Boğulmaya bağlı kanamayı ve sonuçları karıştırabilecek bağışıklık hücresi infiltrasyonunu önlemek için ötenazi için karbondioksit yerine bir ketamin / ksilazin karışımı kullanılır.
  2. Fareye% 70 etanol püskürtün. İnce cerrahi makas ve # 7 forseps kullanarak fareyi inceleyin. Makas kullanarak karın içine bir kesi yapın ve peritondan yanal olarak kesin.
    1. Vakumu serbest bırakmak için diyaframda küçük bir kesik yapın. Akciğerleri ve kalbi ortaya çıkarmak için diyaframı ve alt göğüs kafesini vücut boşluğundan kesin.
  3. 27 G iğne ile donatılmış 10 mL'lik bir şırıngada DPBS'de 5 mL 2 mM EDTA ile akciğerleri perfüze edin. Perfüzyon, sağdan sol ventriküle yönlendirilen iğne ile kalbin tabanına girilerek ve şırıngadan18 yavaşça sıvı verilerek gerçekleştirilir.
    NOT: Damar sisteminin yırtılmasını önlemek için perfüzyon yavaş yapılmalıdır.
  4. Göğüs kafesinin kenarlarını keserek göğüs kafesini sternumdan açın, ardından trakeayı ortaya çıkarmak için sternumdan dikey olarak kesin19. Trakea veya akciğerleri delmeden ince makas ve # 7 forseps kullanarak mümkün olduğunca fazla kas ve bağ dokusunu kesin.
  5. Soluk borusunu dikişle (2-0 numara) sanki bağlayacak gibi ama sıkmadan sarın. Trakeayı lateral olarak çiğneyin ve kateteri yerleştirin. Sütürü sıkıca çekerek dikişi kateterin etrafına sıkıca sabitleyin. Kateteri akciğere 1 cm'den fazla sokmayın.
  6. Akciğerleri 1 mL DPBS ile şişirin. Şırıngayı yavaşça geri çekerek DPBS'yi dışarı çekin. Akciğerleri aynı DPBS ile yeniden şişirin ve bronkoalveoler lavaj sıvısını (BALF) toplamak için şırıngayı bir kez daha geri çekin.
  7. Şırıngayı kateterden ayırın ve kateteri takılı bırakın. BALM'ı bir mikrosantrifüj tüpüne dağıtın.
  8. Aynı 1 mL şırıngayı 1 mL dispas ile doldurun ve katetere tekrar takın. Akciğerleri dispase ile şişirmek için şırınga dağıtın. Kateteri çıkarırken, dispas sızıntısını önlemek için trakea etrafındaki dikişi sıkın.
  9. Trakeayı yanal olarak kesin. Akciğerleri ve trakeayı yukarı doğru çekmek için forseps kullanırken göğüs kafesinin arkasındaki bağ dokusunu keserek akciğerleri vücut boşluğundan çıkarın.
  10. Kalbi akciğerlerden çıkarın. Akciğerleri buz üzerine 5 mL DPBS'ye yerleştirin.
  11. Bu adımda, ayrılmış BALIF'ı alın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Süpernatant, gerektiği gibi serbest bırakılabilir ve saklanabilir. 100 μL RPM'de yeniden süspanse edilebilen görünür bir hücre peleti olmalıdır.
    NOT: Sindirime devam etmek için 2 saate kadar beklenebilir, bu da aynı anda birden fazla farenin hasat edilmesine izin verir.

3. Akciğerleri sindirmek

  1. Özet karışımını hazırlayın. Akciğer başına 3 mL RPMI'de 83 μg/mL liberaz (50 μL stok solüsyonu) ve 100 μg/mL DNAse (15 μL stok solüsyonu) ekleyin.
  2. Akciğerlerin beş lobunu inceleyin ve herhangi bir bağ dokusunu atın19,20. Akciğeri bir cam slaytta 1 dakika makasla doğrayın.
  3. Doğranmış akciğeri diseksiyon makası kullanarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. BALV'den geri kazanılan ve RPMI'de yeniden süspanse edilen hücre peletini santrifüj tüpüne ekleyin. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak numuneyi içeren tüpe 3 mL sindirim karışımı ekleyin.
  4. Akciğer sindirim karışımını 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 37 ° C'de, 40 dakika boyunca 45 derecelik bir açıyla yerleştirilmiş sindirim tüpleri ile 140 rpm'de bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin.

4. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

  1. 50 mL'lik santrifüj tüplerini orbital çalkalayıcıdan çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Akciğer sindirim karışımını 5-6 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik yeni bir tüpe süzün. Kalan hücreleri filtreden yıkayın ve enzimleri RPMI'de 10 mL% 5 FBS ile nötralize edin.
  2. 5 dakika 4 °C'de 600 x g'da döndürün. Bir vakum aspiratörü veya pipet kullanarak süpernatanı aspire edin. 1 mL ACK lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve kırmızı kan hücrelerini (RBC'ler) parçalamak için oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. 9 mL PBS ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyin.
  3. 4 °C'de 600 x g'da 5 dakika döndürün. Bir vakum aspiratörü veya pipet kullanarak süpernatanı aspire edin. 1 mL FACS tamponunda (PBS'de %1 FBS) yeniden süspanse edin ve bir p1000 pipeti kullanarak 64 μm ağdan bir mikrosantrifüj tüpüne süzün.

5. Akış sitometrisi ve aşağı akış analizleri

  1. 96 oyuklu bir plakada akış sitometrisi veya floresanla aktive edilen hücre sıralaması yapılıyorsa, oyuk başına yaklaşık 1-2 milyon hücreyi veya akciğer süspansiyonunun% 8'lik bir kısmını boyayın.
  2. Hücreleri aşağı doğru döndürün. 96 oyuklu bir plakadaki tüm dönüşler, 600 x g'da 2,5 dakika (4 ° C) boyunca yapılmalıdır. Süpernatanı hafifçe vurun ve 200 μL DPBS'yi yeniden süspanse ederek hücreleri bir kez yıkayın. Döndürün ve hafifçe vurun.
  3. Hücreler akış sitometrisi analizi için boyanacaksa, aşağıdaki boyama prosedürüne devam edin.
    1. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 25 μL DPBS'de canlı/ölü Zombi lekesi (1:150) ve Fc bloğundaki (1:250) hücreleri yeniden askıya alın.
    2. Antikor boyama karışımını FACS tamponunda 2x konsantrasyonda hazırlayın.
      NOT: Bir boyama karışımı, miyeloid paneldeki (Tablo 1) veya epitel panelindeki (Tablo 2) tüm belirteçleri belirtilen konsantrasyonlarında içermelidir.
    3. Bir plakada 25 μL akciğer süspansiyonuna 25 μL boyama karışımı ekleyin ve karanlıkta 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Toplam boyama hacmi şimdi 50 μL olmalı ve birincil antikorlar son 1x boyama konsantrasyonlarında olmalıdır.
    4. 150 μL FACS tamponu ekleyin, 600 x g'da 4 ° C'de 2,5 dakika döndürün ve süpernatanı hafifçe vurun. 200 μL FACS tamponunda iki kez yıkayın.
    5. Hücre içi boyama gerekiyorsa, hücreleri hücre içi fiksasyon kiti ile sabitleyin. Hücre içi boyama gerekmiyorsa, DPBS'de% 4 PFA'da hücreler 20 dakika boyunca sabitlenebilir.
    6. Fiksatifi 200 μL FACS tamponu ile üç kez yıkayın. Numuneler 200 μL FACS tamponunda 4 °C'de karanlıkta 2-3 gün süreyle yeniden süspanse edilerek saklanabilir. Numuneleri çalıştırmadan önce, hücre sayılarını ölçmek için sayma boncukları eklenebilir.
  4. Hücreler sıralanacaksa, aşağıdaki boyama prosedürüne devam edin.
    1. Fc bloğu (1:250) ile 1x boyama antikoru karışımındaki hücreleri yeniden süspanse edin. Karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
    2. 150 μL FACS tamponu ekleyin, 600 x g'da 4 ° C'de 2,5 dakika döndürün ve süpernatanı hafifçe vurun. Ayırmadan önce 200 μL FACS tamponu ile üç kez yıkayın ve 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
      NOT: Sıralamadan önce hücrelere DAPI gibi bir canlılık boyası eklenmesi önerilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare başına yaklaşık 20-25 milyon hücreyi %90-95 canlılıkla izole eden bir fare akciğer sindirimini ana hatlarıyla belirtir. Ayrıca daha fazla analiz için BALB'nin toplanmasına izin verir. Elde edilen hücre süspansiyonu, hücreleri dizileme veya hücre kültürü için izole etmek için akış sitometrisi ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması dahil olmak üzere çoklu laboratuvar teknikleriyle uyumludur. Kısaca perfüzyondan sonra BALF toplanır ve akciğerler dispas ile şişir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R35GM150816 ve P30DK043351), Charles H. Hood Vakfı ve Harvard Kök Hücre Enstitüsü'nden alınan hibelerle desteklenmiştir. Alexander Mann'a ve Franklin laboratuvarının diğer tüm üyelerine, akış sitometrisi, geçit şemaları ve analizlerinin tasarlanması ve iyileştirilmesindeki yardımları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Harvard Tıp Okulu'ndaki İmmünoloji Akış Sitometrisi Çekirdeğine de teşekkür ederiz. Flow sitometri analizi FlowJo kullanılarak yapıldı. Şekil şemaları BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
VWR1 mL şırıngaBD309659
1.7 mL mikrosantrifüj tüpüDOT ScientificRN1700-GMT
10 mL pipetler (tek kullanımlık)Fisher Scientific12-567-603
BD Luer-Lok Uçlu 10 mL ŞırıngaVWR75846-756
123 sayım eBeads Boncuk SaymaThermo Scientific01-1234-42
12 kanallı pipet (30-300ul)USA Scientific 7112-3300
%16 paraformaldehitVWR100503-917
Normal konik 23 G iğneVWR305194
27 G normal konikiğne VWRBD305109
5 mL pipet (tek kullanımlık)Thermo Fisher Scientific170373
50 mL santrifüj tüpleriOlympus 28-108
96 kuyulu yuvarlak alt plakaCorning3797
ACK parçalama tamponuGibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 anti-fare CD11cBioLegend117311
Anti-F4/80 Sıçan Monoklonal Antikoru (PE (Phycoerythrin)/Cy7)BioLegend123114
APC anti-fare CD64 (Fc & gama; RI)BioLegend139306
APC/Cyanine7 anti-fare CD45BioLegend103115
BD Insyte Autoguard Korumalı IV KateterlerVWR381423
Brilliant Violet 421 anti-fare I-A/I-E (MHC-II)BioLegend107632
Brilliant Violet 421 anti-fare/insan CD11bBioLegend101235
Brilliant Violet 605 anti-fare Ly-6CBioLegend128036
Brilliant Violet 711 anti-fare CD45BioLegend103147
C57BL / 6J fareler Jackson Laboratuvarları
Cd140a (PDGFRA) Monoklonal Antikor (APA5), PE-Siyanin7, eBioscienceYaşam Teknolojileri25-1401-82
CD170 (Siglec F) Monoklonal Antikor (1RNM44N), PEYaşam Teknolojileri12170280
Hücre süzgeçleriCorning352350
SantrifüjEppenodorfSantrifüj 5910R
Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz I (DNaz)Millipore SigmaDN25-100MG-20 ° C'de saklanan stok çözeltisi olarak DPBS'de 20 mg / mL'de sulandırılmıştır; C
DispaseVWR76176-668Bir kez çözülür ve -20 &°C'de 1 mL alikot olarak saklanır; C
Diseksiyon forseps (Dumont #7)Güzel Bilim Araçları11297-00
Diseksiyon makasıGüzel Bilim Araçları14060-09
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
eBioscience fiksasyon kitiYaşam Teknolojileri00-5523-00
EDTAYaşam TeknolojileriAM9260G
EtanolVWRTX89125170HU
FBSGeminiBio100-106Bir kez çözülür ve -20 ° C'de alikotlar olarak uzun süreli depolamadan önce ısıyla inaktive edilir; C
FITC anti-fare CD31 AntikorBioLegend102406
Gibco RPMI 1640 OrtaFisher Scientific11-875-093
Cam slaytlarFisher Scientific12-552-3
dereceli rezervuarUSA Scientific 1930-2235
Buz kovasıCorning432128
Ketamin hidrokolorid enjeksiyonu (100 mg / mL)DechraKetamin ve ksyalazin ötenazi karışımı, steril DPBS'de bir aya kadar 30 mg / mL ketamin hidroklorür ve 4.5 mg / mL ksilazin altında tutulabilir.
LiferazMillipore Sigma5401119001-20 ° C'de depolanan stok çözeltisi olarak DPBS'de 5 mg / mL'de sulandırılır;
96 kuyulu plakalar için C KapaklarıFisher Scientific07-201-731
Orbital İnkübatör ÇalkalayıcıBarnstead Lab-LineSHKE4000
p1000 pipetEppenodorf3123000063
p1000 uçUSA Scientific 1122-1830
p200 pipetEppenodorf3123000055
p200 uçlarıUSA Scientific 1110-1700
PE anti-fare CD326 (Ep-CAM)BioLegend118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-fare CD104 AntikoruBioLegend123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-fare Ly-6GBioLegend127616
Pipet Yardımı Drummond4-000-101
Saflaştırılmış anti-fare CD16/32 BioLegend101302Metinde "Fc bloğu" olarak anılır
Sprey şişesiVWR23609-182
Sütür (Boyut 2-0)VWR100190-026
Alt PedlerVWR56617-014
Xysed (ksilazin 100mg/mL)PivetalYukarıdaki ketamin hidrokolorid notlarına bakınız.
Zombie Aqua Tamir Edilebilir Canlılık KitiBioLegend423102
Kayma Uçlu ile :

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanner, A., Salathé, M., O'Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 154 (6), 1868-1902 (1996).
  2. Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 81-91 (1977).
  3. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir Res. 2 (1), 33-46 (2001).
  4. Basil, M. C., Alysandratos, K. -D., Kotton, D. N., Morrisey, E. E. Lung repair and regeneration: Advanced models and insights into human disease. Cell Stem Cell. 31 (4), 439-454 (2024).
  5. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nat Rev Immunol. 14 (2), 81-93 (2014).
  6. Gschwend, J., et al. Alveolar macrophages rely on GM-CSF from alveolar epithelial type 2 cells before and after birth. J Exp Med. 218 (1), e20210745(2021).
  7. Gillich, A., et al. Capillary cell-type specialization in the alveolus. Nature. 586 (7831), 785-789 (2020).
  8. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nat Commun. 10 (1), 3964(2019).
  9. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaat3773(2019).
  10. Tsukui, T., et al. Collagen-producing lung cell atlas identifies multiple subsets with distinct localization and relevance to fibrosis. Nat Commun. 11 (1), 1920(1920).
  11. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nat Immunol. 21 (2), 145-157 (2020).
  12. Johansson, C., Kirsebom, F. C. M. Neutrophils in respiratory viral infections. Mucosal Immunol. 14 (4), 815-827 (2021).
  13. Li, F., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages autonomously determine severe outcome of respiratory viral infection. Sci Immunol. 7 (71), eabj5761(2022).
  14. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  15. Warshamana, G. S., Corti, M., Brody, A. R. TNF-α, PDGF, TGF-β1 expression by primary mouse bronchiolar-alveolar epithelial and mesenchymal cells: TNF-α induces TGF-β1. Exp Mol Pathol. 71 (1), 13-33 (2001).
  16. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 14 (3), 309-315 (1996).
  17. Quantius, J., et al. Influenza virus infects epithelial stem/progenitor cells of the distal lung: Impact on Fgfr2b-driven epithelial repair. PLoS Pathog. 12 (5), e1005544(2016).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. BIO Protoc. 11 (8), e3988(2021).
  19. Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).
  20. Bijgaart, R. J. E., van den Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741(2016).
  21. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. Int Immunopharmacol. 85, 106632(2020).
  22. Short, K. R., et al. Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions. Eur Respir J. 47 (3), 954-966 (2016).
  23. Laidlaw, B. J., et al. CD4+ T cell help guides formation of CD103+ lung-resident memory CD8+ T cells during influenza viral infection. Immunity. 41 (4), 633-645 (2014).
  24. D'Agostino, M. R., et al. Protocol for isolation and characterization of lung tissue-resident memory T cells and airway-trained innate immunity after intranasal vaccination in mice. STAR Protoc. 3 (2), 101652(2022).
  25. Waal, A. M., de Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  26. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Semin Immunopathol. 38 (4), 461-469 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Akci er H creleriMiyeloid H cre zolasyonuEpitel H cre zolasyonuTek H cre S spansiyonuAk SitometrisiH cre Ay klamaBronkoalveoler LavajAkci er Sindirimimm n H cre zolasyonuH cre Pop lasyonu Gating i lemleri

İlgili makaleler