Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Summary

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Abstract

Gen ekspresyonunu anlamak, hücresel fonksiyonları deşifre etmek için gereklidir. Bununla birlikte, belirli bir doku içinde in situ olarak çok sayıda genin ekspresyonunu analiz etme yöntemleri sınırlı kalmaktadır. Burada tarif edilen EASI-FISH protokolü, ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak bozulmamış yetişkin Drosophila merkezi sinir sistemindeki (CNS) düzinelerce genin ekspresyonunu tespit etmek için uyarlanmıştır. Bu protokol, jel sağlamlığını artıran, birden fazla hibridizasyon turunu mümkün kılan ve jel başına birden fazla beynin gömülmesine izin veren yeni bir jel formülasyonu içerir. Bu iyileştirme, verimi artırır, deneysel koşulların optimum şekilde karşılaştırılmasını kolaylaştırır ve reaktif maliyetlerini azaltır. Ek olarak, yeşil floresan proteinin (GFP) birlikte tespiti için GAL4-UAS sistemi kullanılarak, gen ekspresyonu belirli nöronal veya glial hücre tiplerinde görselleştirilebilir. Özellikle, genleşme mikroskobu ile elde edilen yüksek çözünürlük, yöntemin hassasiyeti ile birleştiğinde, tek RNA transkriptlerinin saptanmasına izin verir. Bu yaklaşım, yüksek görüntü kalitesini yüksek verimle etkili bir şekilde bütünleştirerek, bozulmamış sinek beyni boyunca gen ekspresyonunu incelemek için güçlü bir araç haline getirir.

Introduction

FISH ilk olarak 40 yılı aşkın bir süre önce Drosophila'da politen kromozomları üzerindeki genleri haritalamak için kullanıldı^1,2. Günümüzde, tek moleküllü FISH, sağlam doku^{3'te mRNA transkriptlerini uzamsal olarak lokalize etmek ve ölçmek için altın standarttır}. Bununla birlikte, numune bütünlüğü ve RNA kaybı sorunları nedeniyle, Drosophila'daki tam montajlı tek moleküllü FISH teknikleri, aynı örnekte analiz edilebilen yalnızca birkaç genle sınırlandırılmıştır^4,5,6,7. Barkodlamanın son zamanlardaki gelişimi (örn. ^8,9,10) kalın dokuda bile tespit edilebilen transkript sayısını artırırken^11,12), bu tür protokollerin oluşturulması, uygulamanın önünde bir engel olabilecek önemli bir kaynak yatırımı gerektirir. Gerçekten de, birçok yaratıcı uzamsal transkriptomik teknik, hiçbir zaman menşe kurumlarının ötesine yayılmadı¹³. Bu nedenle, aynı sağlam beyindeki düzinelerce genin ekspresyonunu tespit etmek için basit ve nispeten ucuz bir yöntem, çeşitli araştırma hedeflerini kolaylaştıracaktır: RNA dizilimi ve hücre atlası verilerinin doğrulanması, CNS boyunca moleküler hücre tiplerinin haritalanması, gen ekspresyonundaki gelişimsel, cinsiyete veya türe özgü farklılıkların ölçülmesi veya Drosophila'da mevcut olan çok çeşitli genetik veya çevresel bozulmaların neden olduğu gen ifadesindeki değişikliklerin ölçülmesi.

Genleşme mikroskobu, araştırmacıların dokuları şişebilir bir hidrojel^{14 içinde genişleterek daha yüksek çözünürlükte gözlemlemelerini sağlayan bir tekniktir}. EASI-FISH, genişleme mikroskobu ve oligo prob bağlanması^16'yı tespit etmek için enzimatik olmayan bir teknik olan hibridizasyon zincir reaksiyonunu (HCR) kullanan RNA FISH^{. EASI-FISH ilk olarak, fare lateral hipotalamusun17'nin kalın (300 μm) doku dilimlerindeki düzinelerce genin ekspresyon modellerini haritalamak için ince doku FISH'e alternatif bir yaklaşım olarak geliştirilmiştir. Bu yöntem, bu dokunun kalınlığının 300 μm'den az olduğu ve yakın zamanda bir prototip sinek EASI-FISH protokolü tanımlandığı göz önüne alındığında, yetişkin sinek beyinlerine uygulama için idealdir18. Burada, disseke edilmiş ve sabitlenmiş Drosophila beyinleri, mRNA ve proteinlerin sırasıyla alkilleyici ajanlar Melphalan-X ve Acryloyl-X (Ac-X) ile jel polimerine kovalent olarak bağlandığı şişirilebilir bir hidrojel içine gömülür. Beynin izotropik genişlemesine izin veren protein sindiriminden sonra, gene özgü DNA oligo probları, ilgilenilen transkriptleri bulmak için dokudaki mRNA'ya hibritlenir. Floresan etiketli DNA saç tokaları daha sonra ikinci bir hibridizasyon adımında eklenir. Çoklu firkete molekülleri, meta-kararlı DNA polimerleri oluşturmak için HCR reaksiyonunda polimerize olur. Bu, ışık tabakası veya konfokal mikroskopi ile parlak noktalar olarak tespit edilebilen bireysel transkriptler için sinyalin amplifikasyonuna yol açar.}

mRNA ve proteinin jel matrisine kovalent olarak sabitlenmesi ve jel oluşumundan sonra proteinlerin proteolitik sindirimi, mRNA transkriptlerinin nispeten stabil olduğu ve prob bağlanması için potansiyel olarak daha erişilebilir olduğu bir ortam yaratır. mRNA ve jelin stabilitesi, turlar arasında DNase1 enzimi ile inkübasyon yoluyla DNA problarının ve HCR ürününün sıyrılmasıyla^15,17. Ayrıca, numunenin genleşmesi, moleküler kalabalıklaşmayı azaltarak otofloresan ve ışık saçılımını azaltır ve görüntü çözünürlüğünü etkili bir şekilde artırır¹⁴. Bu nedenle, bireysel mRNA transkriptleri daha kolay çözülebilir.

GFP, floresan veya genleşme sonrası antikor bağlanması ile tespit edilebilir kalacak kadar prosedürü sürdürür. Bu nedenle, bu raporlayıcı, ilgilenilen hücre türlerini işaretlemek ve segmentlere ayırmak için kullanılabilir. Mevcut birçok nörona özgü bölünmüş GAL4 sürücü hattıyla bağlantılı olarak (örneğin, ^19,20), bu, bir nöronal tipin moleküler kimliği hakkında daha fazla bilgi edinme veya anatomileriyle kolayca ayırt edilemeyen moleküler alt tipleri tanımlama olasılığını açar.

Burada açıklanan, mükemmel mRNA tutma, teknik zorlukların giderilmesi ve jelin daha fazla sağlamlığına sahip prototip sinek EASI-FISH protokolü^{18'in güncellenmiş bir versiyonudur}. Modifikasyonlar, PFA konsantrasyonunun arttırılmasını, fiksasyon sıcaklığının düşürülmesini ve Melphalan-X ve Ac-X ile inkübasyondan önce beyinleri monte ederek numune hazırlamanın kolaylaştırılmasını içerir. Bu protokol aynı zamanda jel sağlamlığını artırmak için yeni bir jel tarifi içerir, bu da birçok FISH turu gerçekleştirirken ve görüntüleme yaparken jel hasarını etkili bir şekilde azaltır. Bu değişiklikler, protokolün gerçekleştirilmesini daha basit hale getirerek hem işlem süresini hem de reaktif kullanımını azaltır ve tutarlı sonuçlara olan güveni artırır. Daha da önemlisi, çoğullama yeteneği, aynı beyinde aylar boyunca düzinelerce genin araştırılabileceği şekilde artırılmıştır. Bu, yetişkin Drosophila beynindeki çeşitli ekspresyon seviyelerinde çeşitli nöronal genlerin ekspresyon modelleri ile gösterilmektedir.

Protocol

Bu protokol yetişkin (5-6 günlük) Drosophila melanogaster dişilerinde uygulanmıştır, ancak herhangi bir cinsiyet veya Drosophila türü uygulanabilir. Jel çapa tarifleri için Ek Tablo 1'e bakın; jel tarifi için, Ek Tablo 2; ve diğer EASI-FISH reaktifleri için Ek Tablo 3. Günlük malzemeler ve reaktifler kılavuzu için Ek Tablo 4'e bakın. Hafif tabaka mikroskobu jel tutucusu için Ek Dosya 1'e bakın. Şekil 1A-C, genişleme ve prob hibridizasyonundan önce beyinlerin jellere gömülmesinin şematik bir tasvirini göstermektedir (adım 2.1 ila 3.8). Şekil 1D, gömülü beyinlerin bir fotoğrafıdır, Şekil 1E, ışık tabakası mikroskobu için bir jel tutucuyu gösterir ve Şekil 1F, tipik bir deneyin zaman çizelgesini gösterir. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ticari detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Sinek beyin diseksiyonu ve fiksasyonu

1. Sinek beyinlerini veya CNS'yi soğuk S2 ortamında inceleyin (daha fazla diseksiyon detayı için bkz. reference²¹)
2. Beyinleri düzeltmek için, 20 beyin veya 10 CNS'ye kadar 2 mL soğuk% 4 PFA / PBS ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de bir nutatör üzerinde inkübe edin.
   DİKKAT: PFA yutulduğunda veya solunduğunda zararlıdır, cildi ve gözleri tahriş eder ve kanserojen olabilir.
3. Numuneyi (1x) 2 mL soğuk PBT (%0,5, Ek Tablo 4'e bakınız) ile durulayın, ardından numuneyi 2 mL soğuk PBT (4x) ile 4 °C'de bir nutatör üzerinde 15 dakika yıkayın.
4. Numuneyi (1x) 2 mL soğuk% 70 EtOH ile durulayın. Beyinleri 2 mL% 70 EtOH'de 4 ° C'de 6 aya kadar saklayın.

2. Beyinlerin monte edilmesi ve RNA ve protein bağlayıcılarının eklenmesi (1. Gün)

NOT: Her zaman eldiven giyin ve RNase Away ile ekipmanı ve çalışma alanını sürekli olarak silin. Eldivenler (1) RNazları numunelerden uzak tutmak ve (2) sağlık tehlikesi oluşturan çeşitli reaktiflerden korunmak için gereklidir.

1. Yüksüz bir slaytı bir RNase dekontaminasyon reaktifi ile silerek jel odalarını hazırlayın. Yapıştırıcıyı silikon contadan koruyan opak filmi çıkarın, contayı (en fazla 4 hazneli) kızağa yapıştırın ve her hazne yüzeyini bir P20 pipet ucu kullanarak 1 μL poli-lizin ile kaplayın. Havayla kurutun ve işlemi tekrarlayın.
   NOT: Adım 2.1 bir gün önce yapılabilir.
2. Beyinleri 0.2 mL'lik bir PCR tüpüne (tüp başına 4 beyne kadar) aktarın ve 150 μL PBT'de (% 0.1) (2x) 5 dakika ve PBS'de 5 dakika (2x) rehidre edin.
3. Beyinleri monte etmek için, hazne başına 40 μL PBS ekleyin, ardından beyinler arasında biraz boşluk bırakarak ince cımbızla beynin ortasına arka arkaya nazikçe yapıştırın (bkz. Şekil 1D). Oda başına 6 beyne veya 2 CNS'ye kadar montaj mümkündür.
4. PBS'yi çıkarın ve hemen 50 μL 20 mM MOPS tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.
5. Beyinler MOPS tamponunda dengelenirken, Melphalan-X ve Ac-X stok çözeltilerini çözün ve oda başına 75 μL Melphalan-X/Ac-X çözeltisi hazırlayın (Melphalan-X stoğunu MOPS tamponu ile 1:1 oranında seyreltin ve 1:100'de Ac-X ekleyin). Çözeltiyi toplamak için kısaca girdap yapın ve döndürün; Hazırlığı, çözelti 30 dakikalık inkübasyon süresinin sonunda hazır olacak şekilde zamanlayın, daha erken değil.
   DİKKAT: Melphalan-X yutulduğunda veya solunduğunda zararlıdır, cildi ve gözleri tahriş eder ve kanserojen olabilir.
6. Tüm MOPS tamponunu çıkarın ve 50 μL Melphalan-X/Ac-X çözeltisi ekleyin.
7. Üstüne bir lamel koyarak hazneyi örtün, ancak sızdırmaz hale getirmek için conta yapıştırıcısını kullanmayın. Odayı nemlendirilmiş bir kutuya yerleştirin ve gece boyunca RT'de ışıktan koruyarak inkübe edin.

3. Jelleşme ve Proteinaz K sindirimi (2. Gün)

1. Lameli ve Melphalan-X/Ac-X'i dikkatlice çıkarın ve monte edilmiş beyinleri (2x) 100 μL PBT (%0.1) ile 2 dakika ve (1x) 100 μL PBS ile 2 dakika yıkayın.
2. TREx-1000 solüsyonu, 4HT, TEMED ve APS'yi çözün ve buz üzerinde tutun.
   NOT: TREx-1000 -20 °C'de çökelebilir; çözüldükten sonra tamamen çözünmesi için iyice girdap.
   DİKKAT: Bu reaktifler yutulduğunda veya solunduğunda zararlı veya toksiktir, ayrıca cilt ve göz tahriş edicidir.
3. TREx-1000'i 4HT, TEMED ve APS ile 94:2:2:2 oranında karıştırarak jel çözeltisini hazırlayın. Girdap yapın ve buz üzerinde tutun. Her oda için 150 μL jel çözeltisi hazırlayın.
4. PBS'yi bir pipet ucuyla hazneden çıkarın ve kalan PBS'yi tüy bırakmayan bir mendille dikkatlice fitilleyin. Her oda için, hemen beynin üstüne 40 μL jel çözeltisi ekleyin. 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
5. Jel solüsyonunu çıkarın ve 40 μL taze jel solüsyonu ekleyin, 4 ° C'de 10 dakika daha inkübe edin.
   NOT: Jel atık çözeltisini bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve atmadan önce polimerize edin.
6. Jel solüsyonunu çıkarın ve contanın yüzey yapıştırıcısındaki şeffaf koruyucu filmi soyun. Son bir 45 μL taze jel solüsyonu ekleyin, haznenin üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin ve hava kabarcıklarının sıkışmasını önleyin. Hazneyi kapatmak için lamel bastırın ve 4 °C'de 10 dakika inkübe edin (30 °C'de toplam 4 dakika dengeleme için).
7. Jeli 37 °C'de 1,5 saat polimerize edin.
8. Jeller sertleştikten sonra tezgahta birkaç dakika soğumaya bırakın. Lameli dikkatlice çıkarın ve silikon contayı yeni bir tıraş bıçağıyla çıkarın. Ardından, jeli bir dikdörtgen şeklinde kesin ve numune yönünü izlemek için sağ üst köşeyi kesin.
9. Az miktarda ProK Tamponu ile ıslatılmış ince bir boya fırçası ile jelleri slayttan çıkarın ve bunları ayrı ayrı 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
10. Her jeli 500 μL ProK tamponu ve 5 μL ProK enzimi (1:100) ile gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

4. DNA sindirimi ve prob hibridizasyonu (3. Gün)

1. Jelleri (3x) RT.
   'de 1 mL PBS ile 10 dakika yıkayın NOT: Solüsyonları değiştirirken jele zarar vermemek için ince uçlu transfer pipetleri kullanın.
2. Jelleri 37 ° C'de 1 mL DNase1 tamponunda 30 dakika inkübe edin.
3. 450 μL DNaz tamponuna 50 μL DNaz1 enzimi ekleyin. Yavaşça karıştırın, ancak girdap yapmayın. Her bir jeli 500 μL DNase1 içinde 2 saat 37 °C'de inkübe edin. RT.
   'de 1 mL PBS ile (4x) 15 dakika yıkayın NOT: Jeller, DNaz sindirimi/yıkamasından önce veya sonra birkaç hafta boyunca 4 ° C'de 5x SSC'de saklanabilir.
4. Çözülme hibridizasyonu, (hyb) ve prob yıkama tamponu. Jelleri 500 μL hyb tamponunda prob olmadan 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   DİKKAT: Hyb ve prob yıkama tamponu, kansere neden olduğundan şüphelenilen formamid içerir.
5. Probları 1:100 oranında hyb tamponunda (10 nM) seyreltin ve jel başına 300 μL hazırlayın. Jelleri hyb tamponu ve problarla gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Prob yıkama tamponunu ve PBS'yi 37 °C'de tutun.

5. Prob yıkamaları (4. Gün)

1. Jelleri (3x) 37 ° C'de 750 μL prob yıkama tamponu ile 30 dakika yıkayın.
2. Jelleri (3x) 30 dakika, ardından (3x) 1 saat boyunca 1 mL PBS ile 37 ° C'de yıkayın.
3. Jelleri gece boyunca RT'de 2 mL PBS'de veya hafta sonu 4 ° C'de yıkayın.

6. Floresan saç tokaları ile hibridizasyon Zincir Reaksiyonu (HCR) (5. Gün)

NOT: HCR ilkesi için reference^{22'ye bakın}.

1. Jelleri RT'de 30 dakika boyunca 500 μL amplifikasyon (amp) tamponunda inkübe edin.
2. Floresan saç tokalarını bir PCR makinesinde 95°C'de 90 saniye ısıtın ve hızla 25°C'ye soğutun.
3. Her prob için, eşleşen firkete çiftlerini (h1 ve h2) amper tamponunda 1:50 oranında seyreltin, jel ve girdap başına 300 μL hazırlayın.
4. Jelleri saç tokası karışımı ile karanlıkta RT'de 3 saat inkübe edin.
5. Jelleri (2x) 750 μL 5x SSCT ile 15 dakika ve (2x) RT'de 1 mL 0.5x SSCT ile 30 dakika yıkayın.
6. Beyinler GFP eksprese ederse, 5 mg / mL ultra saf BSA içeren PBT'de (% 0.1) 500 μL anti-GFP-AF488 antikoru (1:500) ile boyayın ve gece boyunca (veya hafta sonu) 4 ° C'de inkübe edin.

7. Jellerin montajı ve görüntüleme (6. Gün)

1. Antikor inkübasyonundan sonra, jelleri bir kez durulayın ve (1x) 1 mL PBT (% 0.1) ile 30 dakika yıkayın, ardından (3x) 1 mL PBS ile 30 dakika yıkayın.
   NOT: PBS'de yıkama 2 kat genleşme ile sonuçlanacaktır; 3x genleşme için 0.05x SSC ile yıkayın.
2. Yıkarken, ışık tabakası mikroskop jel tutucusunun jel bağlantı yüzeyini iki kez 1 μL poli-lizin ile kaplayın ve katlar arasında 37 °C'de kurumasını bekleyin. Benzer şekilde, konfokal görüntüleme için, bir cam tabanlı tabağın jel bağlantı alanını tekrarlanan poli-lizin uygulamalarıyla kaplayın.
3. Jelleri RT'de 1 mL 5 μg/mL DAPI/PBS veya DAPI/0.05x SSC'de 30 dakika boyayın veya alternatif olarak gece boyunca 4 °C'de boyayın.
4. Jeli jel tutucuya (hafif tabaka mikroskobu) veya cam tabanlı tabağa (konfokal mikroskop) monte etmek için, jeli bir lamel üzerine yerleştirin ve kenarları tüy bırakmayan bir bezle dikkatlice kurulayın. Jelin, dokunun hedefe en yakın olacak şekilde yönlendirildiğinden emin olun. Bir boya fırçası kullanarak, jeli tek bir hareketle poli-lizin yüzeyine nazikçe yerleştirin. Görüntüleme için, jeli PBS'de yıkayın (veya 3x'e genişlerse 0,05x SSC).
   NOT: Görüntülemeden sonra, jeller ıslak bir boya fırçası ile poli-lizin yüzeyinden nazikçe çıkarılabilir ve 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılabilir.
5. Anında yeniden araştırma için 7. güne geçin. Daha uzun süreli depolama için (1 haftadan 6 aya kadar), jelleri 4 °C'de 1 mL 5x SSC'de saklayın. Kullanıma hazır olduğunda, devam etmeden önce jelleri (3x) 1 mL PBS ile 10 dakika boyunca yıkayın.
   NOT: Genişleme derecesi genellikle açıklanan arabelleklerde tutarlıdır (PBS'de ~2x ve 0,05x SSC'de ~3x). Genleşme faktörünü kontrol etmek için, bir floresan stereomikroskopta çekilen görüntülerde genişlemeden önce ve sonra beynin boyutunu ölçün. Genleşmeden sonra beyni görselleştirmek için, kısaca DAPI ile boyayın. Yaklaşık genişleme faktörü, genişleme sonrası boyutun genişleme öncesi boyuta bölünmesiyle elde edilir.

8. Çoğullama için sıyırma probları ve saç tokaları (7. Gün)

1. Jelleri 37 ° C'de 1 mL DNase1 tamponunda 30 dakika inkübe edin.
2. 450 μL DNaz tamponuna 50 μL DNase1 ekleyin. Yavaşça karıştırın, ancak girdap yapmayın. Jelleri 500 μL DNaz1 içinde 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
3. RT'de 1 mL PBS ile 15 dakika boyunca (4x) yıkayın. Jeller artık bir sonraki hibridizasyon turu için hazırdır (Gün 3, adım 6).

Results

Bu modifiye edilmiş EASI-FISH protokolünün performansı, yetişkin Drosophila beyninde birden fazla tur boyunca birkaç farklı nörotransmiter ilişkili ve nöropeptit geninin ekspresyonunun tespit edilmesiyle gösterilmiştir. Tipik olarak, jelleşmiş ve genişlemiş beyinler, tur başına iki veya üç prob ile hibritleştirildi, ardından Alexa Fluor (AF) 488 (GFP ifade edilmedikçe), AF546 ve AF647 veya Janelia Fluor (JF) 669 ile konjuge saç tokası çiftleri ile HCR izledi. Görüntüleme çoğunlukla bir ışık tabakası mikroskobu ü...

Discussion

Bozulmamış Drosophila sinir sistemi için açıklanan EASI-FISH protokolü, aynı beyinde veya CNS'de düzinelerce transkriptin saptanmasını sağlar. Sağlam, anlaşılır ve hassastır ve nöronların veya gliaların alt kümelerini tanımlamak için GFP tespiti ile birleştirilebilir. Bu yöntemin uygulanması kolay olduğundan, bozulmamış sinek beynindeki gen ekspresyonunun haritalanması ve ölçülmesiyle ilgilenen Drosophila laboratuvarları tarafından yapılan araştırmaları kolaylaştırmalıdır.

EA...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tüpleri	ABD Bilimsel	1402-4700
0.5 mL vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpleri, Amber	USA Scientific	1405-9707
0.5M EDTA, PH 8, RNaz içermeyen	İnvitrojen	AM9260G
10M NaOH	Sigma	72068
10x PBS	Fisher	BP 3994
20x SSC	ThermoFisher	9763
%40 Akrilamid	Bio-Rad	1610140
4-Hidroksi-TEMPO (4HT)	Sigma	176141
5 M NaCl RNaz içermez	Thermofisher	AM97060G
5 ml Transfer Pipeti - İnce uçlu	Global Scientific	134070-S20
6 Kuyulu Cam Alt Plaka	Cellvis	P06-1.5H-N
Asetonitril, susuz	ThermoFisher	042311-K7
Akrilik Asit	TCI	A0141
Akriloyl-X	ThermoFisher	A20770
Amonyum persülfat (APS)	Sigma	A3678
Amplifikasyon Tamponu	Moleküler Aletler	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Susuz DMSO	Invitrogen	D12345
AstA_B2	Moleküler Aletler	PRR477
ChAT_B1	Moleküler Aletler	PRG115
Crz_B5	Moleküler Aletler	PRR480
DAPI	Sigma	D9542
FIJI	Açık kaynak	https://imagej.net/software/fiji/
FMRFa_B2	Moleküler Aletler	PRR487
GAD1_B5	Moleküler Aletler	RTE581
GFP Poliklonal Antikor, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21311
Hibridizasyon Tamponu	Moleküler Aletler
Imaris Stitcher	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher
Imaris görüntüleyici	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer
JF-669, SE	Tocris	6420
Melphalan	Caymen Kimyasalları	16665
MOPS Tampon	Fisher	BP308-100
N, N Metilen-Bis-akrilamid ve nbsp;	Bio-Rad	1610142
N, N, N', N'-Tetrametiletilendiamin (TEMED)	Sigma	T22500
Nükleaz İçermeyen Su	Ambion	AM9932
Oligo Probları			Moleküler AletlerEMS
		15710
PBS	Fisher
Fotoflo-200	EMS	74257
Poli-L-lizin hidrobromür (polilizin)	Sigma	P1524
Prob Yıkama Tamponu	Moleküler Aletler	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
Proteinaz K	NEB	P8107S
QIAquick Nükleotid Temizleme Kiti	Qiagen	28306
RNase Uzakta	ThermoFisher	7003, dekontaminasyon reaktifi
RNase İçermeyen DNase1	Qiagen	79254
S2 Orta	ThermoFisher	21720024
Silikon Contalar	Invitrogen	P24743
Tdc2_B5	Moleküler Cihazlar	RTE880
Tk_B5	Moleküler Cihazlar	PRR484
UltaPure %10 SDS	Thermofisher	15553027
Ultra Saf BSA	ThermoFisher	AM2616
Konjuge Olmayan ve Alexa Flor Konjuge Saç Tokaları	Moleküler Aletler
VAChT_B1	Moleküler Cihazlar	RTA904
vGLUT_B2	Moleküler Aletler	RTB212
Zeis Z7 Jel Tutucu	Janelia	CAD dosyaları istek
Zeiss LSM 980 konfokal Ters mikroskop	Zeiss	https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980
Zeiss Z7 ışık tabakası mikroskobu	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html