Mevcut protokol, zorlanmış salınım tekniğini (FOT) kullanarak bir ex vivo murin modelinin solunum mekaniğini analiz etmek için aşamalı bir yöntemi açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ex vivo Murin Modelinde Akciğer Fonksiyonunun Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Solunum mekaniği, fonksiyonel akciğer kapasitesini değerlendirerek akciğer patolojilerinin tanımlanması ve tedavisinde önemli bir çalışma alanıdır. Akciğer mekaniği, farklı salınım dalga formlarını içeren çeşitli akciğer manevraları ile değerlendirilebilir. Akciğerlere uygulandığında, bu manevralar dalga formlarına verilen cevaba bağlı olarak basınç, hacim ve akış gibi çoklu değişkenleri ölçer. Bu sinyaller daha sonra histerizivite, direnç, uyum, doku sönümlemesi ve doku elastikansı gibi parametreleri belirlemek için hesaplanır ve analiz edilir ve genel akciğer fonksiyonunun ayrıntılı bir değerlendirmesini sağlar. Solunum mekaniğinin analizi, akciğer nakli için donör akciğerlerinin değerlendirilmesinde özellikle önemlidir. Bu protokol, türünün ilk örneğidir ve ex vivo bir fare modeli kullanarak solunum mekaniğini değerlendirmek için kapsamlı ve tekrarlanabilir aşamalı bir yöntem sunar. Seçilen hayvan modeli, akciğer geri kazanımı, depolama ve koruma ve zorlanmış salınım tekniği tabanlı bir sistem kullanılarak yapılan deneylerle ilgili ayrıntıları içerir. Ek olarak, bir ex vivo modelin incelenmesinde veri analizini, klinik önemi ve zorlanmış salınım tekniğinin uygulamalarını ana hatlarıyla belirtir.
Giriş
Akciğer nakli, son dönem akciğer hastalıkları için tek kalıcı tedaviyi temsil eder. Dünya çapında her yıl yaklaşık 4.600 kişiye akciğer nakli yapılmaktadır, ancak uygun donör akciğerlerinin yetersizliği nedeniyle bekleme listesinde yaklaşık 600 hasta ölmektedir 1,2. Mevcut akciğer havuzunu artırma çabalarında, donör tahsis sistemleri sürekli olarak ayarlanmaktadır, bu da cerrahların donör organlarını güvence altına almak için daha uzak mesafelere seyahat etmesine yol açmıştır3. Artan mesafeler her zaman soğuk iskemik zamanı arttırır ve ek organ koruma yöntemlerine ihtiyaç duyulur.
Akciğer naklinin donör organ koruması için mevcut standart, 4 ° C'de soğuk statik korumadır ve koruma süresini 6-8 saat ile sınırlar - transplantasyon için küçük bir canlılık penceresi4. Bununla birlikte, daha uzun seyahat mesafeleri ve buna bağlı olarak artan iskemik sürelerle, transplantasyon öncesi akciğer fonksiyonunun değerlendirilmesi kritik derecede önemlidir4. Akciğer nakli için gelişen politikalarla birlikte, bu ihtiyacı karşılamak için yeni araştırmalar yapılmıştır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, 10 °C'de soğuk statik korumanın, akciğer fonksiyonunda iyileşme, yaralanmaya direnç ve implante edildiğinde karşılaştırılabilir primer greft disfonksiyonu oranları ile akciğer koruması için daha optimal bir depolama sıcaklığı olduğunu göstermiştir 4,5,6,7,8. Ayrıca, ex vivo akciğer perfüzyonu (EVLP) üzerine odaklanan araştırmalar, donör akciğer kullanımında ve alıcılara zarar vermeden transplantasyonlarda önemli bir iyileşme göstermiştir9. Akciğer nakli için donör havuzunu genişletmek ve koruma süresini uzatmak için EVLP'nin kullanımı iyi belgelenmiş olsa da, bu teknoloji pahalıdır, zaman alıcıdır ve gerçekleştirmek için özel eğitim gerektirir10. Bu nedenle, ex vivo akciğer fonksiyonunu incelemek için kapsamlı, ucuz ve tekrarlanabilir ek yöntemlere ihtiyaç vardır.
Pulmoner mekaniğin geleneksel ölçümleri, örneğin uyum, direnç, elastikiyet ve basınç-hacim eğrileri, vücut pletismografisi kullanılarak veya tek bölmeli bir model kullanılarak ventilatör teknikleriyle güvenilir bir şekilde belirlenebilir. Hava yolu mekaniğini merkezi ve periferik bölmelere ayırabilen sabit faz modeline uyacak şekilde zorlanmış salınım modeli kullanılarak daha ayrıntılı mekanikler elde edilebilir (Newton direnci, doku sönümlemesi/elastikiyeti)11. Bu tekniklerin uygulanması tekrarlanabilir ve kapsamlı olsa da, şimdiye kadar bir sınırlama, muhtemelen kan kaybetmiş akciğerin alveolar giriş halkasındaki yapıyı kaybetmesi gibi, bu tür ölçümlerin in in vivo bir modelde gerçekleştirilmesi gerekliliği olmuştur12. Bu çalışmada, akciğer nakli uygulamaları için akciğer mekaniğini daha iyi karakterize etmek için ex vivo bir model geliştirmek amacıyla, ticari olarak temin edilebilen zorunlu salınım tekniğine dayalı küçük bir kemirgen ventilatörü kullanılmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanmıştır. Yaşları 6-8 hafta arasında ve ağırlıkları 18-28 g arasında olan C57Bl / 6 vahşi tip fareler kullanıldı. Reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.
1. Hazırlık
- Tüm cerrahi prosedürler için 20x'e kadar büyütme oranına sahip bir ameliyat mikroskobu kullanın.
- İşleme başlamadan önce tüm cerrahi aletleri temizleyin ve sterilize edin. Aseptik koşulları korumak için aletleri otoklavlayın veya uygun bir sterilizasyon solüsyonu kullanın.
2. Donör akciğerlerinin çıkarılması
- Tüm işlemleri steril koşullar altında gerçekleştirin.
NOT: Bu adım, özel bir cerrahi alanda ve steril koşullar altında gerçekleştirilir. - Fareyi anestezik bir indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijende% 5 izofluran ile anesteziyi indükleyin ve prosedür boyunca oksijende% 3.5 izofluran ile anesteziyi koruyun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
- İlk kesiden önce fare ağırlığını kaydedin.
- Fareyi ameliyat masasına sabitleyin ve ayak parmağına baskı uygulayarak uygun anestezi derinliğini sağlayın. Fare acı içinde geri çekilirse, anesteziyi gerektiği gibi artırın.
- Standart prosedür13'ü izleyerek akciğerleri donörden çıkarın.
NOT: Akciğerler ve kalp, akciğerleri ex vivo perfüze etmek için en blok olarak çıkarıldı ve daha sonra entübasyon için trakeanın bir kısmı çıkarıldı.
3. Akciğer depolama ve koruma
- Akciğerler donörden çıkarıldıktan sonra, kateteri dikkatlice ilerleterek trakeayı 18 G intravenöz anjiyo-kateter ile entübe edin ve trakeayı delmediğinden emin olun.
- 3-0 ipek sütür kullanarak trakeayı kanül üzerine sabitleyin ve sıkı bir sızdırmazlık sağlayın. 18 G intravenöz anjiyo-kateteri, pulmoner kapağın hemen yanından sağ ventrikül çıkış yolu (RVOT) içine gelene kadar ilerletin.
- Akciğerlerin vücuttan çıkarıldığı zamanı kaydedin.
- Akciğerleri, ticari olarak temin edilebilen koruma solüsyonunu içeren 50 mL'lik konik bir tüpte gece boyunca 4 ° C veya 10 ° C'de saklayın.
4. Kurulum ve kalibrasyon
- Sistemi ve/veya yazılımı açarak başlayın.
- Programı başlatın, Yeni bir çalışma oluştur düğmesine tıklayın ve protokolü tanımlamak ve konuları atamak için ekrandaki talimatları izleyin.
- Deneme Oturumu'na tıklayın ve kullanıcının adının ve soyadının baş harflerini kullanarak oturum açın.
- Konuları tutarlı bir adlandırma kuralına göre etiketlemeye başlayın.
- Her konunun cinsiyet, doğum tarihi ve kilo bilgilerini girin.
- Nesneleri seçin ve ölçüm alanına atayın ve ağırlıkları onaylayın.
- Ekrandaki talimatları izleyerek yazılımın kurulumuna ve kalibrasyonuna devam edin.
NOT: Borunun kalibrasyonu sırasında, donör akciğerlerinin entübasyonunda kullanılan aynı tip kanül, tutarlılığı sağlamak için sistemin Y-tüpüne bağlanmıştır. - Kalibrasyon değerleri kabul edilen aralıkların dışına çıkarsa kalibrasyonu tekrarlayın.
- Hazır olana kadar havalandırmaya başlamak için istemleri iptal edin. Ventilasyon ve veri kaydı ile ilgili deney oturumları daha sonra başlatılabilir.
5. Akciğer ventilasyonu ve veri toplama
- Akciğerleri 50 mL konik tüpten çıkarın. Akciğer kılcal damarlarını yıkamak için daha önce yerleştirilmiş 18 G intravenöz anjiyo-kateteri kullanarak 60 mL / kg'lık bir dozda ek koruma solüsyonu kullanarak sağ ventrikül çıkış yolunu (RVOT) yıkayın.
NOT: Donör akciğerlerinin dehidrasyonunu önlemek için büyük özen gösterilmelidir, çünkü bu, akciğer mekaniğinin incelenmesinde bilinen bir karışıklıktır. - Donör akciğerlerini ventilatör makinesine sabitleyin ve deneye başlayın.
- Havalandırmayı Başlat'a tıklayın ve hazır olduğunuzda deneysel oturumu başlatmak için Kaydı Başlat'a basın.
NOT: Bu çalışma için kullanılan ventilatör, solunum hızı 150 nefes/dk, tidal hacim 10 mL/kg ve PEEP 3 olacak şekilde ayarlanmıştır. - Sayfanın sağ tarafındaki görev listesinden akciğer mekaniği değerlendirmeleri görevine çift tıklayarak her görevi çalıştırın.
- Atelektik bölgelerin işe alındığından ve akciğer hacimlerinin standartlaştırıldığından daha fazla emin olmak için görev listesinde bulunan Derin Enflasyon görevini çalıştırın. Ayrıntılar için Sonuçlar bölümüne bakın.
- Görev dizisine devam edin.
NOT: Akciğer fonksiyonu, mekanik özellikleri değerlendiren birden fazla görevle değerlendirilebilir. Derin Şişirme akciğer hacmini standartlaştırırken, Prime-8 akciğer mekaniğini stabilize eder. PV-P ve PV-V , statik ve dinamik uyumu, hava yolu direncini ve iletkenliği ölçer. Snapshot 150 , direnç, uyumluluk ve elastikiyetin hızlı bir değerlendirmesini sağlarken, QuickPrime , akciğer viskoelastisitesi ile birlikte hava yolu ve doku direncini değerlendirir. Bu görevler toplu olarak akciğer fonksiyonunun kapsamlı bir analizini sağlar. Bu makalede, Deep Inflation, Snapshot 150 ve QuickPrime'da (ticari olarak mevcut ekipman kullanılarak) gerçekleştirilen görevlerin verileri temsili sonuçlar olarak verilmiştir. Verileri yorumlarken kafa karıştırıcı değişkenleri en aza indirmek için Derin Enflasyon görevi kullanılarak bozulmalar arasında akciğer hacimleri standartlaştırıldı. - Seçilen görev dizisini üç nüsha halinde çalıştırın.
- Kaydı Durdur'a ve ardından Havalandırmayı Durdur'a tıklayın.
- Verileri tek tek dışa aktarın veya bir sonraki konuya geçin ve 5.1-5.9 arasındaki adımları tekrarlayın.
NOT: Snapshot 150 ve QuickPrime bozulmalarından elde edilen veriler için, güvenilir analiz için >0.95'lik bir COD gereklidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Fare modeli için deneysel tasarımın grafiksel bir tasviri sağlanmıştır (Şekil 1). Akciğerler, çeşitli koşullar altında donör dokunun solunum mekaniğini değerlendirmek için ticari olarak temin edilebilen bir zorlanmış salınım tekniği tabanlı küçük kemirgen ventilatör sistemi kullanılarak şişirildi (Şekil 2). Korunmuş donör akciğer grupları arasındaki sonuçlar karşılaştırıldığında, 10 ° C'de depolanan donör akciğer gruplarının tüm parametrelerde 4 ° C'de depolanan...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Önemi ve potansiyel uygulamaları
Solunum mekaniği, akciğer patolojisini ve akciğer hasarını incelemek için çeşitli uygulamalarda rutin olarak kullanılmaktadır. Solunum mekaniği çalışması, ARDS gibi hastalıkların ilerlemesi ve yardımlı ventilasyon vakaları için birçok kez tanımlanmıştır, ancak organ nakli ile ilgili olduğu için literatürde çok daha az tanımlanmıştır 15,16,17,18,19.<...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, araştırmanın çıkar çatışması olarak yanlış yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmadan yürütüldüğünü beyan etmektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, ventilatör sisteminin kullanımı için Sophie Paczensy'ye ve yardımları için Colin Welsh'e teşekkür eder. Şekil 1 , biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Bu araştırma, Güney Carolina Klinik ve Translasyonel Enstitüsü'nden (NIH / Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi) UL1-TR001450 ödül numarası altında bir hibe ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 18 G anjiyo-kateter | B. Braun | 4251687-02 | Düz göbek |
| 24 G anjiyo-kateter | B. Braun | 4251601-02 | Düz göbek |
| 3 mL şırınga | Fisher Scientific | 14-823-41 | |
| 3-0 ipek sütür | Medex | ETH-A304H | |
| 50 mL konik tüpler | Thermo Fisher | 339652 | |
| %70 EtOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Anestezi indüksiyon odası | Harvard Aparatı | 75-2030 | Sıçanlar için hava geçirmez indüksiyon odası |
| Anestezi makinesi | Harvard Aparatı | 75-0238 | Pasif süpürücü ile mobil anestezi sistemi |
| Anestezi maskesi | Harvard Aparatı | 59-8255 | Sıçan anestezi maskesi |
| Künt mikro forseps | Dünya Hassas Aletler | 501217 | Pansuman forsepsleri, 12,5 cm, düz, tırtıklı |
| C57Bl/6 fareler | Charles Nehri | Gerinim Kodu 027 | Yabani tip, 6-8 hafta, 18-28g |
| Dijital ağırlık ölçeği | Fisher Scientific | S72422 | |
| FlexiVent sistemi | Scireq | NC2926059 | cebri salınım tekniği tabanlı küçük kemirgen ventilatörü |
| İnsülin şırıngası, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| İzofluran, USP | Piramal Yoğun Bakım | NDC 66794-017-25 | |
| Ameliyat mikroskobu veya cerrahi büyüteçler | AmScope | SM-3BZ-80S | 3.5x - 90x Stereo Mikroskop |
| Perfadex çözeltisi | Xvivo | 19811, 19850 | |
| Petri kapları | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Steril pamuklu çubuklar | Puritan | 25-806 1WC | |
| Steril gazlı bez süngerler | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Cerrahi makas | Dünya Hassas Aletler | 1962C | Metzenbaum makas |
Kaynaklar
- Erdman, J., et al. Lung transplant outcomes in adults in the United States: Retrospective cohort study using real-world evidence from the SRTR. Transplantation. 106 (6), 1233-1242 (2022).
- Valapour, M., Lehr, C. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. , Available at: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2022/Lung.aspx (2022).
- Benvenuto, L., Arcasoy, S. The new allocation era and policy. J Thorac Dis. 13 (11), 6504-6513 (2021).
- Ali, A., et al. Static lung storage at 10 °C maintains mitochondrial health and preserves donor organ function. Sci Transl Med. 13 (611), eabf7601(2021).
- Wang, L., et al. The effect of ischemic time and temperature on lung preservation in a simple ex vivo rabbit model used for functional assessment. J Thorac Cardiovasc Surg. 98 (3), 333-342 (1989).
- Date, H., et al. In a canine model, lung preservation at 10 °C is superior to that at 4 °C: A comparison of two preservation temperatures on lung function and on adenosine triphosphate level measured by phosphorus 31-nuclear magnetic resonance. J Thorac Cardiovasc Surg. 103 (4), 773-780 (1992).
- Hoetzenecker, K., et al. The advent of semi-elective lung transplantation-prolonged static cold storage at 10 °C. Transpl Int. 37 (1), 12310(2024).
- Abdelnour-Berchtold, E., et al. Evaluation of 10 °C as the optimal storage temperature for aspiration-injured donor lungs in a large animal transplant model. J Heart Lung Transplant. 41 (12), 1679-1688 (2022).
- Moreno Garijo, J., Roscoe, A. Ex vivo lung perfusion. Curr Opin Anaesthesiol. 33 (1), 50-54 (2020).
- Rajab, T., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Artif Organs. 44 (1), 12-15 (2020).
- Oostveen, E., et al. The forced oscillation technique in clinical practice: Methodology, recommendations, and future developments. Eur Respir J. 22 (6), 1026-1041 (2003).
- Gibney, B., et al. Structural and functional evidence for the scaffolding effect of alveolar blood vessels. Exp Lung Res. 43 (9-10), 337-346 (2017).
- Rajab, T. Techniques for lung transplantation in the rat. Exp Lung Res. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Evaluation of ventilation at 10 °C as the optimal storage condition for donor lungs in a murine transplant model. Hill, M., et al. The International Society for Heart and Lung Transplantation 44th Annual Meeting and Scientific Sessions, Prague, Czech Republic, , (2024).
- Hess, D. Respiratory mechanics in mechanically ventilated patients. Respir Care. 59 (11), 1773-1794 (2014).
- Henderson, W., et al. Fifty years of research in ARDS: Respiratory mechanics in acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 196 (7), 822-833 (2017).
- Mauri, T., et al. Respiratory mechanics to understand ARDS and guide mechanical ventilation. Physiol Meas. 38 (12), R280-R303 (2017).
- Bersten, A., et al. Respiratory mechanics and surfactant in the acute respiratory distress syndrome. Clin Exp Pharmacol Physiol. 25 (11), 955-963 (1998).
- Grinnan, D., Truwit, J. Clinical review: Respiratory mechanics in spontaneous and assisted ventilation. Crit Care. 9 (5), 472-484 (2005).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
