Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mycobacterium tuberculosis'te İlaç Duyarlılığının ve İlaç Etkileşimlerinin Resazurin Mikrotitre ve Dama Tahtası Testi Kullanılarak Saptanması

923 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67672

⸱

24 Ekim 2025

 ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2University of Madras, 3Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

Bu makalede

Özet

Burada, Mycobacterium tuberculosis'in ilaç duyarlılığını ve etkileşim profillerini değerlendirmek için resazurin mikrotitre testini (REMA) ve dama tahtası varyasyonunu görselleştirmek ve standartlaştırmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, tedavi rejimlerinde kullanılacak ilaç kombinasyonlarını optimize etmek ve çoklu ilaca dirençli tüberkülozla mücadele etmek için in vitro bilgiler sağlar.

Özet

Çoklu ilaca dirençli tüberkülozun (ÇİD-TB) ortaya çıkması, etkili tedaviyi yönlendirmek için hızlı ve doğru ilaç duyarlılık testi (DST) yöntemlerini gerektirmektedir. Bu çalışma, minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) belirlemek ve anti-tüberküloz ilaçların Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç-ilaç etkileşimlerini değerlendirmek için resazurin mikrotitre testi (REMA) ve dama tahtası testini birleştiren bir metodoloji sunmaktadır. 96 oyuklu bir formata uyarlanan REMA, ilaç duyarlılığının görsel bir göstergesi olarak metabolik olarak aktif M. tuberculosis tarafından resazurin boyasının indirgenmesinden yararlanır. Değişen konsantrasyonlarda anti-TB ilaçlar, M. tuberculosis izolatlarına karşı test edilir ve MIC'yi belirlemek için renk değişiklikleri gözlenir. Daha sonra, ilaç kombinasyonları arasındaki potansiyel sinerjistik, katkı maddesi veya antagonistik etkileri değerlendirmek için bir dama tahtası tahlili kullanılır. Bu basit ve ucuz yöntem, yedi gün içinde sonuç verir ve geleneksel DST yöntemlerine göre önemli bir avantaj sunar. Bu yöntem, M. tuberculosis izolatlarının DST'si hakkında değerli bilgiler sağlar ve ÇİD-TB'ye karşı daha iyi tedavi sonuçları için umut verici ilaç kombinasyonlarının tanımlanmasını kolaylaştırır.

Giriş

Mycobacterium tuberculosis'in neden olduğu tüberküloz (TB), ilaca dirençli suşların ortaya çıkmasıyla daha da kötüleşen zorlu bir küresel sağlık sorunu olmaya devam ediyor. Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, 2023 yılında tahmini 10,6 milyon yeni tüberküloz vakası ve 1,3 milyon ölüm meydana geldi ve bu da daha etkili teşhis ve tedavi stratejilerine olan acil ihtiyacın altını çiziyor1. Çoklu ilaca dirençli TB (MDR-TB) ve yaygın ilaca dirençli TB (XDR-TB), mevcut tedavi rejimlerinin karmaşıklığı, toksisitesi ve uzun süresi nedeniyle hastalık kontrolünde büyük zorluklar oluşturmaktadır 2,3.

M. tuberculosis'te benzersiz biyokimyasal yolları hedef alan bedaquilin ve delamanid gibi yeni anti-TB ajanlarının yakın zamanda piyasaya sürülmesi, TB yönetiminde bir atılımı temsil etmektedir 4,5. Bu ilaçlar, öncelikle DSÖ onaylı daha uzun ve daha kısa ÇİD-TB rejimlerininbir parçası olarak florokinolon ve rifampisine dirençli TB vakalarında kullanım için onaylanmıştır 6,7. Bununla birlikte, optimal ilaç kombinasyonlarının ve dozaj rejimlerinin belirlenmesi, özellikle bu ajanlar yerleşik tedavilerle birlikte kullanıldığında, kritik bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir 8,9. İlaç duyarlılık testi (DST) için mevcut yöntemler, güvenilir olmakla birlikte, genellikle zaman yoğun, kaynak yoğun ve klinik veya araştırma ortamında karmaşık ilaç kombinasyonlarını değerlendirmek için pratik değildir10. Bu, M. tuberculosis'te hem ilaç etkinliğini hem de etkileşim profillerini değerlendirebilen basit, ölçeklenebilir fenotipik testlere olan ihtiyacın altını çizmektedir.

Bu tür fenotipik yaklaşımlar arasında, resazurin mikrotitre testi (REMA), ilaç duyarlılığını değerlendirmek için yaygın olarak kabul edilen ve geleneksel bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Test, metabolik olarak aktif bakteriler tarafından mavi resazurin boyasının pembe resorufine indirgenmesine dayanır ve hücre canlılığının görsel bir göstergesi olarak hizmet eder. Palomino ve ark. 200211'de, bakteri üremesini değerlendirmek için resazurin kullanma ilkesi Pital ve ark.12'nin çalışmalarına kadar uzanmaktadır. Son yirmi yılda, REMA yöntemi kapsamlı bir şekilde doğrulanmış ve mikobakteriyel araştırma ve tanı testleri için standart çalışma prosedürlerine dahil edilmiştir 13,14,15.

REMA'yı tamamlayan Caleffi-Ferracioli ve arkadaşları tarafından tanıtılan dama tahtası tahlili, aynı resazurin bazlı okuma16'yı kullanarak bir mikroseyreltme formatında iki ilaç etkileşimi çalışmalarını mümkün kılarak REMA'nın faydasını genişletir. Prensipte umut verici olsa da, bu yöntem öncelikle rutin bir tanı testinden ziyade erken klinik öncesi değerlendirme sırasında potansiyel sinerjik veya antagonistik ilaç kombinasyonlarını taramak için yararlı bir araştırma aracı olmaya devam etmektedir.

Bu el yazması, REMA'yı veya dama tahtası varyantını yeni yöntemler olarak sunmamaktadır. Daha ziyade, bu çalışmanın amacı, daha önceki çalışmalarda tanımlanmış ve başarıyla uygulanmış olan MIC tayini ve ilaç etkileşim testi için yararlı ve doğrulanmış bir metodolojinin görsel bir temsilini sağlamaktır. Aşı hazırlama, ilaç titrasyonu, plaka düzeni, MIC yorumlaması ve dama tahtası etkileşim analizi hakkında ayrıntılı rehberlik içeren adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu makale, TB ilaç geliştirme ve deneysel farmakolojide REMA ve dama tahtası testlerinin daha geniş, daha tutarlı kullanımını desteklemeyi amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Örnek deneylerde kullanılan kimyasallar ve malzemeler Malzeme Tablosu dosyasında mevcuttur.

1. 7H9-S Ortamının Hazırlanması

  1. 100 mL 7H9-S ortamı için, 0,47 g 7H9 tozu ve 0,1 g kasiton tartın, ardından 90 mL damıtılmış suda çözün; Tamamen eriyene kadar karıştırın.
  2. Et suyunu 250 mL'lik bir şişede 121 °C'de 15 dakika boyunca bir otoklav kullanarak sterilize edin.
  3. Otoklavlanıp soğutulduktan sonra 10 mL Oleik Albümin Dekstroz Katalaz (OADC) takviyesi ve 0,5 mL gliserol ekleyin.
  4. Steriliteyi kontrol etmek için gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    NOT: Hazırlanan 7H9-S ortamının sterilitesi, gece boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek doğrulanır. Ortam ertesi gün bulanıklık gözlenmeden berrak kalmalıdır.
  5. 7H9-S ortamını 4 °C'de, doğrudan ışıktan uzakta saklayın.

2. M.tuberculosis Aşı hazırlığı

  1. Lowenstein Jensen (LJ) katı besiyerinde yetiştirilen M.tuberculosis kültüründen inokulum hazırlanması
    1. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, taze yetiştirilmiş (21-28 günlük) bir LJ ortamından tam bir M. tuberculosis kültürü döngüsü toplayın.
      NOT: Yaşlı kolonileri rahatsız edebilecek şekilde ortamın çok derinlerine kazımaktan dikkatlice kaçının.
    2. Toplanan bakterileri steril cam boncuklar ve 2,5 mL 7H9-S et suyu içeren steril bir bijou şişesine yerleştirin. Cam boncukların girdap sırasında kümelerin mekanik olarak bozulmasına yardımcı olduğundan emin olun.
      NOT: Güvenilir duyarlılık testi sonuçları sağlamak için 21-28 gün arasında taze kültürler gereklidir. Tutarsız sonuçlara yol açabileceğinden eski kültürleri kullanmaktan kaçının.
    3. Bijou şişesini sabitleyin ve en az 1 dakika kuvvetlice girdap yapın. Bakteri kümelerini parçalamak için sürekli karıştırmayı sağlayın, bu da nispeten bulanık bir süspansiyonla sonuçlanır. Amaç, ortam içinde homojen bir bakteri dağılımıdır.
    4. Kültür süspansiyonunu taze bir bijou şişesine aktarın ve 15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bekletin. Bu adım, daha büyük bakteri kümelerinin dibe yerleşmesini sağlar.
    5. McFarland 1.0 Standardını referans olarak kullanarak, kültür süspansiyonunun bulanıklığını kontrol edin ve istenen bulanıklık elde edilene kadar 7H9-S et suyu ile ayarlayın.
      NOT: Tipik olarak 1.0 olan bir McFarland Standardı, yaklaşık 1.97 × 106 CFU/mL17'ye eşdeğer bulanıklık için referans olarak kullanılır. Standart, 0,1 mL %1 baryum klorür ve 9,9 1 mL %1 sülfürik asidin birleştirilmesiyle hazırlanır ve bulanıklığı sağlayan ince bir baryum sülfat çökeltisi elde edilir. Bakteriyel süspansiyon, her iki tüpü de siyah çizgilerle beyaz bir arka plana karşı tutarak görsel olarak McFarland Standardı ile karşılaştırılır. Bakteriyel süspansiyonun bulanıklığı standarda uyacak şekilde ayarlanır.
  2. 7H9 sıvı besiyerinde büyütülen M.tuberculosis kültüründen inokulum hazırlanması
    1. Steril bir pipet kullanarak 2,5 mL M. tuberculosis kültürünü (2-3 haftalık) cam boncuklu taze bir bijou şişesine aktarın.
    2. Homojen bir süspansiyon sağlamak için karışımı en az 1 dakika vorteksleyin. Girdap eylemi, herhangi bir kümeyi kırmaya yardımcı olur.
    3. 2.5 mL kültür süspansiyonunu taze bir bijou şişesine aktarın ve kümelerin dibe çökmesine izin vermek için 15 dakika bekletin.
    4. Bulanıklığı McFarland 1.0 Standardı ile karşılaştırın ve gerekli konsantrasyonu elde etmek için 7H9-S et suyu kullanarak ayarlayın.
  3. İnokulumun seyreltilmesi
    1. 1:10 seyreltme hazırlayın: İnokulumu seyreltmek için, steril bir kapta 9 mL 7H9-S et suyuna 1 mL bakteri süspansiyonu ekleyin (Bu yaklaşık 1.97 × 105 CFU / mL verecektir).

3. Antibiyotiklerin hazırlanması ve saklanması

  1. Stok ve çalışma çözeltilerinin hazırlanması: Örnek deneyde kullanılan ilaçları, stok ve çalışma çözeltisi hazırlama yöntemleriyle birlikte Tablo 1'de özetlendiği gibi hazırlayın.
    1. İzoniazid (INH veya I): 1 mg/mL'lik bir izoniazid stok çözeltisi hazırlamak için, 2 mg izoniazid tozunu 2.0 mL damıtılmış suda çözün. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin.
    2. Moksifloksasin (MOX veya M): 1 mg/mL'lik bir Moksifloksasin stok çözeltisi hazırlamak için, 2 mg moksifloksasin tozunu 2,0 mL damıtılmış suda çözün. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin.
    3. Bedaquilin (BDQ veya J): Bedaquilin suda az çözünür. 1 mg/mL'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 2 mg bedaquilin tozunu 2.0 mL DMSO içinde çözün. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin.
    4. Delamanid (DEL veya D): Bedaquiline'e benzer şekilde, delamanid'in suda çözünürlüğü zayıftır. 1 mg/mL'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 2 mg delamanid tozunu 2,0 mL DMSO içinde çözün. Çözeltiyi 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin.
  2. Depolama: Her bir ilaç stok çözeltisinden 100 μL'yi steril dondurarak saklama şişelerine ayırın ve bunları -20 °C'de 3 aya kadar saklayın. Çözüldükten sonra kalan çözeltiyi atın. Tekrar dondurmayın.

4. Resazurin çözeltisinin hazırlanması ve saklanması

  1. Resazurin'i damıtılmış suda %0,01 veya %0,02'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözün. Sterilizasyon için çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden geçirin.
  2. Sterilize edilmiş resazurin solüsyonunu, bozulmayı önlemek için ışıktan koruyarak 4 °C'de 1-2 haftaya kadar saklayın.

5. REMA plakasının hazırlanması

NOT: REMA 96 oyuklu mikrotitre plakası kurulumuyla ilgili görsel bir kılavuz için Şekil 1'e bakın. 96 oyuklu plaka, altı adet iki katlı seyreltmede her ilaç için iki kopya halinde ilaç tahlillerini çalıştırmak için yeterli alan sağlar.

  1. 7H9-S et suyu ekleyin: Çok kanallı bir pipet kullanarak, sütun 2-11, B-G sıralarına 100 μL 7H9-S et suyu ekleyin. Dağıtımın tüm kuyularda eşit olduğundan emin olun.
  2. İlaç çözeltileri ekleyin: B2 ve B6 kuyucuklarına 100 μL çalışan INH çözeltisi ekleyin. Benzer şekilde, MOX, DEL ve BDQ çalışma çözümlerini ilgili kuyucuklara (B3 ve B7, B4 ve B8, B5 ve B9) ekleyin.
  3. İlaç konsantrasyonlarını seyreltin: Çok kanallı bir pipet kullanarak, B sıralarından G sıralarına (sütun 2-9) iki kat seri seyreltme gerçekleştirin ve G sırasını karıştırdıktan sonra son 100 μL'nin atıldığından emin olun.
  4. Büyüme kontrol kuyuları: Büyüme kontrolü için B10 ve C10 kuyucuklarına 100 μL 7H9-S et suyu ekleyin.
  5. Negatif ve sterilite kontrolleri: Negatif ve sterilite kontrolleri olarak hizmet etmek için B11 ve C11 kuyucuklarına 200 μL 7H9-S et suyu ekleyin.
  6. Buharlaşmayı önleyin: İnkübasyon sırasında buharlaşmayı en aza indirmek için tüm dış kuyucuklara 200 μL steril damıtılmış su ekleyin.
  7. Plakaları aşılayın: Negatif kontrol kuyucuğu hariç, her kuyucuğu 100 μL 1:10 seyreltilmiş kültür süspansiyonu ile aşılayın. Tüm kuyucuklarda eşit aşılama sağlayın.
  8. Kapatın ve inkübe edin: Steriliteyi korumak için plakaları plastik torbalara koyun ve 37 gün boyunca 7 °C'de inkübe edin.

6. REMA dama tahtası titrasyon testi

NOT: İlaç kombinasyonları (ör. BDQ ve DEL) için REMA dama tahtası titrasyon testi şablonuna ilişkin görsel kılavuz için Şekil 2A, B'ye bakın.

  1. İlaçları dikey ve yatay olarak seyreltin: Çeşitli iki ilaç kombinasyonları oluşturmak için birinci ilacı (BDQ) dikey olarak (BH satırları) ve ikinci ilacı (DEL) yatay olarak (sütun 2-8) seyreltin.
    NOT: Yatay olarak seyreltilmiş bir ilaç için seri olarak seyreltilmiş çalışma solüsyonunu steril bir şişede (4 μg / mL - 0.06 μg / mL'den) hazırlayın.
  2. Dikey seyreltme için BDQ çalışma solüsyonu ekleyin: B2 ve B8 kuyusuna 100 μL çalışma BDQ solüsyonu ekleyin.
  3. 7H9-S et suyu ekleyin: Çok kanallı bir pipet kullanarak, C2-H8 sütunlarına 50 μL 7H9-S et suyu ekleyin. Dağıtımın tüm kuyularda eşit olduğundan emin olun.
  4. İlaç konsantrasyonlarını seyreltin: Çok kanallı bir pipet kullanarak, B-H sıralarından (sütun 2-8) iki kat seyreltme gerçekleştirin ve H sırasını karıştırdıktan sonra son 50 μL'nin atıldığından emin olun.
  5. Yatay seyreltme için DEL çalışma solüsyonu ekleyin: İlaçların seri olarak seyreltilmiş çalışma solüsyonlarını 4 μg/mL'den 0,06 μg/mL'ye karşılık gelen kuyucuklara ekleyin.
  6. Büyüme kontrol kuyuları: Büyüme kontrolü için B9 ve C9 kuyucuklarına 100 μL 7H9-S et suyu ekleyin.
  7. Negatif ve sterilite kontrolleri: Negatif ve sterilite kontrolleri olarak hizmet etmek için B10 ve C10 kuyucuklarına 200 μL 7H9-S et suyu ekleyin.
  8. Plakaları aşılayın: Negatif kontrol kuyucuğu hariç, her kuyucuğu 100 μL 1:10 seyreltilmiş kültür süspansiyonu ile aşılayın. Tüm kuyucuklarda eşit aşılama sağlayın.
  9. Kapatın ve inkübe edin: Steriliteyi korumak için plakaları plastik torbalara koyun ve 37 gün boyunca 7 °C'de inkübe edin.

7. Sonuçların kuluçka ve yorumlanması

  1. Resazurin boyama: 7 günlük inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğa 30 μL resazurin (%0.01-%0.02) ekleyin. Renk gelişimi için plakayı gece boyunca kapatın ve inkübe edin.
  2. Renk değişimini yorumlar.
    1. Kuyuları tutarlı beyaz ışık veya gün ışığı dengeli aydınlatma altında görsel olarak inceleyin.
      NOT: Büyüme kontrolü (ilaçsız) aktif bakteri metabolizmasını gösterecek şekilde maviden pembeye dönmelidir. Mavi renk, büyümenin tamamen engellendiğini gösterir. Pembe aktif büyümeyi belirtirken, mor (karışık bir renk tonu) kısmi inhibisyonu temsil eder.
    2. Doğru yorumlama için rengin yoğunluğunu hem negatif kontrol (yalnızca ortam) hem de pozitif kontrol (ilaçsız bakteri üremesi) ile karşılaştırın. Gözlemci yanlılığını en aza indirmek için ikili bağımsız okumalar veya plaka fotoğrafçılığı kullanın.
      NOT: Görsel yargı, ortam aydınlatma koşullarına göre değişebilir, bu nedenle tutarlı aydınlatma şarttır.
  3. Minimal inhibitör konsantrasyon (MIC)
    1. MIC'yi, kuyunun tamamen mavi kaldığı ve metabolik aktivitenin %≥99 inhibisyonunu gösteren en düşük ilaç konsantrasyonu olarak tanımlayın. Kısmi veya tam büyümenin göstergesi olan mor veya pembe renk gösteren kuyuları düşünün.
      NOT: REMA ile MIC tayini, MIC'nin ilaçsız kontrole göre inokulumun% ≥99'unu inhibe eden en düşük konsantrasyon olarak kabul edildiği klasik orantı yönteminin ilkelerine yaklaşır. REMA, CFU sayımlarını kullanmazken, görsel son nokta, bu orana dayalı eşiğin fenotipik bir bağıntısını temsil eder. Bu yorum, önceden oluşturulmuş kolorimetrik protokoller11,14 ile uyumludur.

8. Fraksiyonel inhibitör konsantrasyon (FIC) İndeksinin hesaplanması

NOT: Fraksiyonel inhibitör konsantrasyon (FIC) indeksi, iki ilaç arasındaki etkileşimi (sinerji, antagonizma veya kayıtsızlık) belirlemeye yardımcı olur. Dama tahtası tahlilinden elde edilen MIC değerlerine göre hesaplanır.

  1. Yalnızca her ilaç için MIC'yi tanımlayın: REMA testinden, ayrı ayrı kullanıldığında her ilaç için MIC'yi belirleyin.
  2. Kombinasyon halindeki her ilaç için MIC'yi tanımlayın: Dama tahtası titrasyon testinden, ikinci ilaçla kombinasyon halinde kullanıldığında her ilacın MIC'sini tanımlayın.
  3. Her ilaç için FIC'yi hesaplayın.
    NOT: FIC ve FIC indeksini hesaplamak için kullanılan formüller için Tablo 2'ye bakın. Tablo 3 , REMA testine dayalı konsolide MIC'yi göstermektedir. Temsili MIC ve FIC indeks değerleri Tablo 4'te gösterilmektedir.
    1. FIC Endeksini şu şekilde yorumlayın:
      FIC ≤ 0.5: Sinerjiyi belirtin - ilaçlar, büyümeyi tek başına her iki ilaçtan daha etkili bir şekilde engellemek için birlikte çalışır.
      FIC > 0,5 ila < 4,0: Toplamsallığı belirtin - birleşik etki, bireysel etkilerin toplamına eşittir.
      FIC ≥ 4.0: Düşmanlığı belirtin - ilaçlar birbirlerinin faaliyetlerine müdahale eder.
  4. Örnek: H37Rv'de BDQ ve DEL için FIC Endeksini hesaplayın
    1. H37Rv için BDQ'nun MIC'sini belirleyin (örneğin, 0.125 μg/mL). DEL ile kombinasyon halinde, BDQ'nun MIC'sini 0.03 μg/mL olarak kaydedin.
    2. H37Rv için DEL'in MIC'sini belirleyin (örneğin, 0.063 μg/mL). BDQ ile kombinasyon halinde, DEL'in MIC'sini 0.125 μg/mL olarak kaydedin.
    3. BDQ için FIC'yi hesaplayın:
      FIC(BDQ) = Kombinasyon halinde BDQ'nun MIC'si/tek başına BDQ'nun MIC'si = 0,03 / 0,125 = 0,24
    4. DEL için FIC'yi hesaplayın: FIC(DEL) = kombinasyon halinde DEL'in MIC'si / tek başına DEL'in MIC'si = 0.125 / 0.063 = 1.98
    5. FIC Endeksini elde etmek için her iki FIC'yi de ekleyin: FIC Endeksi = FIC(BDQ) + FIC(DEL) = 0,24 + 1,98 = 2,26
    6. Sonucu yorumlayın.
      NOT: 2.26'lık bir FIC indeksi, BDQ ve DEL kombinasyonunun M. tuberculosis büyüme inhibisyonu üzerinde ilave bir etkiye sahip olduğunu gösteren ilave etkileşim aralığına (>0.5 ila <4.0) girer.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

REMA testi ile anti-TB ilaçlarının MIC'sinin belirlenmesi
Bedaquiline, Delamanid, Moksifloksasin ve İzoniazid'in aktiviteleri, ilaca duyarlı H37RV ve ilaca dirençli M. tuberculosis klinik izolatına karşı REMA kullanılarak değerlendirildi. Bedaquiline, Delamanid ve Isoniazid (1 μg/mL ila 0.03 μg/mL) konsantrasyon aralığında kullanıldı ve Moksifloksasin (2 μg/mL ila 0.06 μg/mL) aralığındaydı. M. tuberculosis ve H37Rv'nin ilaca dirençli klinik izolatlarının bakteriyel süspansiyonları da...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İlaca dirençli tüberkülozun (DR-TB) oluşturduğu küresel tehdit acil bir sorun haline gelmiştir 1,19. Bu durum, özellikle ikinci basamak ve daha yeni anti-TB ilaçları olmak üzere, uyuşturucuya duyarlılık testi (DST) için gelişmiş, hızlı yöntemlerin geliştirilmesine acil bir ihtiyaç yaratmıştır. Bu tür yöntemler, tedavi stratejilerini geliştirmek, anti-TB ilaçlarını etkili bir şekilde yönetmek ve hastalığın ilerlemesi ve daha fazla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
250 mL kapaklı kare şişeSchott Duran218203655Medya hazırlığı
7H9 et suyuBecton Dickinson271310M. tuberculosis için büyüme ortamı (Oda sıcaklığı)
96 oyuklu kapaklı tabakCorning359696-kuyucuklu Şeffaf Düz Tabanlı Polistiren TC-işlem görmüş Mikroplakalar, Tek Tek Sarılmış, Kapaklı, Steril (Oda sıcaklığı)
ART-Tips (1000 μ L)TARSONLAR528106Hidrofobik polietilen filtreler ile  Polipropilen Raflı Filtre Ucu-Steril (Oda sıcaklığı)
SANAT-İpuçları (200 μ L)TARSONLAR528104Hidrofobik polietilen filtreler ile  Polipropilen Raflı Filtre Ucu-Steril (Oda sıcaklığı)
Baryum klorür dihidratMerck217565McFarland Standart hazırlığı (Oda sıcaklığı)
Bedaquilin (BDQ)Jansen ve JansenJansen ve Jansen'den hediyeAnti-TB ilaç (4 ° C)
CasitoneBecton Dickinson225930Bakteri kültürü için takviye (Oda sıcaklığı)
Delamanid (DEL)Otsuka İlaçOtsuka İlaç'tan HediyeAnti-TB ilaç (4 ° C)
Dimetil sülfoksitSigma-Aldrich67-68-5İlaç stoğu hazırlama (Oda sıcaklığı)
Filtre 0.2 μ mKırlangıçSLGVR33RS0.22  μ m PVDF, tek kullanımlık, steril şırınga filtresi (Oda sıcaklığı)
GliserolMerck356350Kültür ortamına eklendi (Oda sıcaklığı)
Aşılama DöngüsüSigma-AldrichI8263Kültür süspansiyonu hazırlığı için (Oda sıcaklığı)
İzoniazid (INH)Sigma-AldrichI3377-5GAnti-TB ilaç (4 ° C)
LJ orta EğimBD Mikobaktosel221414M. tuberculosis için büyüme ortamı (4 &derece; C)
McCartney Bijou Dar Ağızlı şişe, 14 mLSüper Tek12.124.0014Kültür süspansiyonu hazırlığı için (Oda sıcaklığı)
McCartney Bijou Dar Ağızlı şişe, 7 mLSüper Tek12.124.0007Kültür süspansiyonu hazırlığı için (Oda sıcaklığı)
Mikropipetler (1000 μ L)Gilson'ınF144059MHassas sıvı kullanımı için (Oda sıcaklığı)
Mikropipetler (200 μ L)Gilson'ınFA10005MHassas sıvı kullanımı için (Oda sıcaklığı)
Moksifloksasin (MOX)Sigma-AldrichSML1581-50MGAnti-TB ilaç (4 ° C)
Çok kanallı pipet(20– 200 μ L)VWR849070024Kuyucuklar arasında eş zamanlı pipetleme için
OADCBecton Dickinson211886Bakteri kültürü için takviye (4 ° C)
Pipet doldurucularMerckZ333980Hassas sıvı kullanımı için (Oda sıcaklığı)
Resazurin sodyum tuzuSigma-Aldrich62758-13-8REMA testleri için redoks göstergesi (Oda sıcaklığı)
Serolojik pipetler, 10 mLCorningCLS4100Steril, polistiren tek kullanımlık pipetler kullanıldı (Oda sıcaklığı)
Masif cam boncuklar, çap 6 mmSigma-AldrichZ265950Kültür süspansiyonu hazırlığı için (Oda sıcaklığı)
Sülfürik asit 95– 97%Merck100731McFarland Standart hazırlığı (Oda sıcaklığı)
Filtre için şırıngalarDispo Van100032Şırınga filtreleriyle kullanım için
Vorteks KarıştırıcıREMICM-101 ARTIKültür süspansiyonu hazırlama için
Fermuarlı poli çantaSigma-AldrichZ162949

Kaynaklar

  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/9789240083851 (2023).
  2. Khawbung, J. L., Nath, D., Chakraborty, S. Drug-resistant tuberculosis: A review. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 74, 101574(2021).
  3. Alame Emane, A. K., Guo, X., Takiff, H. E., Liu, S. Highly transmitted M. tuberculosis strains are more likely to evolve MDR/XDR and cause outbreaks, but what makes them highly transmitted. Tuberculosis. 129, 102092(2021).
  4. Koul, A., et al. Delayed bactericidal response of Mycobacterium tuberculosis to bedaquiline involves remodelling of bacterial metabolism. Nat Commun. 5, 3369(2014).
  5. Matsumoto, M., et al. OPC-67683, a nitro-dihydro-imidazooxazole derivative with promising action against tuberculosis in vitro and in mice. PLoS Med. 3 (11), e466(2006).
  6. WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 4. treatment drug-resistant tuberculosis treatment. , World Health Organization. At https://www.who.int/publications/i/item/9789240063129 (2020).
  7. Conradie, F., et al. Treatment of highly drug-resistant pulmonary tuberculosis. N Engl J Med. 382 (10), 893-902 (2020).
  8. Lechartier, B., Hartkoorn, R. C., Cole, S. T. In vitro combination studies of benzothiazinone lead compound BTZ043 against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 56 (11), 5790-5793 (2012).
  9. Mallikaarjun, S., et al. Delamanid coadministered with antiretroviral drugs or anti-tuberculosis drugs shows no clinically relevant drug-drug interactions in healthy subjects. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5976-5985 (2016).
  10. Pai, M., Nicol, M. P., Boehme, C. C. Tuberculosis diagnostics: State of the art and future directions. Microbiol Spectr. 4 (5), (2016).
  11. Palomino, J. -C., et al. Resazurin microtiter assay plate: Simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  12. Pital, A., Pital, R. C., Leise, J. M. A rapid method for determining the drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Am Rev Tuberc. 78 (1), 111-116 (1958).
  13. Präbst, K., Engelhardt, H., Ringgeler, S., Hübner, H. Basic colorimetric proliferation assays: MTT, WST, and Resazurin. Methods Mol Biol. 1601, 1-17 (2017).
  14. Schön, T., et al. Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex isolates - the EUCAST broth microdilution reference method for MIC determination. Clin. Microbiol. Infect. 26 (11), 1488-1492 (2020).
  15. Singh, S., et al. Rapid identification and drug susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis: Standard operating procedure for non-commercial assays: Part 3: Colorimetric Redox Indicator Assay v1.3.12. J Lab Physicians. 4 (2), 120-126 (2012).
  16. Caleffi-Ferracioli, K. R., Maltempe, F. G., Siqueira, V. L. D., Cardoso, R. F. Fast detection of drug interaction in Mycobacterium tuberculosis by a checkerboard resazurin method. Tuberculosis. 93 (6), 660-663 (2013).
  17. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis growth: a correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44 (1), 287-290 (2013).
  18. Chandramohan, Y., et al. In vitro interaction profiles of the new antitubercular drugs bedaquiline and delamanid with Moxifloxacin against clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. J Glob Antimicrob Resist. 19, 348-353 (2019).
  19. Hameed, H. A., et al. Characterization of genetic variants associated with rifampicin resistance level in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates collected in Guangzhou Chest Hospital, China. Infect Drug Resist. 15, 5655-5666 (2022).
  20. Lienhardt, C., et al. New drugs for the treatment of tuberculosis: Needs, challenges, promise, and prospects for the future. J Infect Dis. 205, S241-S249 (2012).
  21. Anoopkumar-Dukie, S., et al. Resazurin assay of radiation response in cultured cells. Br J Radiol. 78 (934), 945-947 (2005).
  22. Baker, C. N., Thornsberry, C., Hawkinson, R. W. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J Clin Microbiol. 17 (3), 450-457 (1983).
  23. McFarland, J. The nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. J Am Med Assoc. XLIX (14), 1176(1907).
  24. Bellio, P., Fagnani, L., Nazzicone, L., Celenza, G. New and simplified method for drug combination studies by checkerboard assay. MethodsX. 8, 101543(2021).
  25. Martin, A., Camacho, M., Portaels, F., Palomino, J. C. Resazurin microtiter assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibilities to second-line drugs: Rapid, simple, and inexpensive method. Antimicrob Agents Chemother. 47 (11), 3616-3619 (2003).
  26. Zhao, L., et al. Evaluation of BACTEC MGIT 960 system for the second-line drugs susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in China. J Microbiol Methods. 91, 212-214 (2012).
  27. Said, H. M., et al. Comparison between the BACTEC MGIT 960 system and the agar proportion method for susceptibility testing of multidrug resistant tuberculosis strains in a high burden setting of South Africa. BMC Infect Dis. 12, 369(2012).
  28. Caviedes, L., Delgado, J., Gilman, R. H. Tetrazolium microplate assay as a rapid and inexpensive colorimetric method for determination of antibiotic susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 40 (5), 1873-1874 (2002).
  29. Mouton, J. W., Vinks, A. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic modelling of antibacterials in vitro and in vivo using bacterial growth and kill kinetics. Clin Pharmacokinet. 44 (2), 201-210 (2005).
  30. Sychev, A. V., Lavrova, A. I., Dogonadze, M. Z., Postnikov, E. B. Establishing compliance between spectral, colourimetric and photometric indicators in resazurin reduction test. Bioengineering. 10 (8), 962(2023).
  31. Postnikov, E. B., Sychev, A. V., Lavrova, A. I. Dose-response curve in REMA test: Determination from smartphone-based pictures. Analytica. 5 (4), 619-631 (2024).
  32. Mehlawat, N., Chakkumpulakkal Puthan Veettil, T., Sharpin, R., Wood, B. R., Alan, T. Ultrafast and ultrasensitive bacterial detection in biofluids: Leveraging resazurin as a visible and fluorescent spectroscopic marker. Anal Chem. 96 (45), 18002-18010 (2024).
  33. Grosset, J., Truffot-Pernot, C., Lacroix, C., Ji, B. Antagonism between isoniazid and the combination pyrazinamide-rifampin against tuberculosis infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 36 (3), 548-551 (1992).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Minimum nhibit r Konsantrasyonok la Diren li T berk lozla Duyarl l k TestiAntit berk loz la larSinerjik la Etkileri
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.