Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mycobacterium tuberculosis'ten Kültür Filtrat Proteinlerinin (CFP'ler) Ayrılması ve Fraksiyonlanması

880 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67679

⸱

11 Temmuz 2025

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis'in salgılanan proteinlerinin kültürlenmesini, toplanmasını ve konsantrasyonunu açıklar. Kültür filtrat proteinleri (CFP'ler) ölçülür, izoelektrik odaklama ile 20 fraksiyona ayrılır ve ayrıca bir hazırlayıcı SDS-PAGE ve bir elektroelüsyon sistemi kullanılarak 30 fraksiyona çözülür.

Özet

Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis)'in salgılanan proteinleri tüberküloz patogenezinde, immün modülasyonunda ve hastalığın ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar. Bileşimlerini ve işlevlerini anlamak, tüberküloz teşhisine, aşı geliştirmeye ve terapötik müdahalelere yardımcı olabilecek yeni biyobelirteçleri tanımlamak için çok önemlidir. Bu çalışma, kapsamlı immünolojik ve proteomik analizlere olanak sağlamak için kültür filtrat proteinlerinin (CFP'ler) sistematik izolasyonu, fraksiyonasyonu ve karakterizasyonuna odaklanmaktadır. CFP'ler, kontrollü protein ekspresyonunu sağlamak için kimyasal olarak tanımlanmış koşullarda yetiştirilen M. tuberculosis H37Rv kültürlerinden elde edildi. Kültür süpernatanı filtrasyon yoluyla saflaştırıldı ve proteinleri 10 kDa'nın üzerinde tutmak için içi boş bir lif sistemi kullanılarak konsantre edildi. Fraksiyonlama, proteinleri izoelektrik noktalarına göre 20 farklı fraksiyona ayıran sıvı faz izoelektrik odaklama yoluyla sağlandı. Hazırlayıcı sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılarak başka bir çözünürlük gerçekleştirildi, ardından 30 protein fraksiyonu elde edilen elektroelüsyon yapıldı. Bu yaklaşımla elde edilen fraksiyone proteinler, immünolojik profilleme ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizler için değerli bir kaynak sağlar. Bu çalışma, salgılanan proteinleri sistematik olarak izole ederek ve karakterize ederek, tanısal doğruluğu artırabilecek ve M. tuberculosis patogenezini anlamamızı ilerletebilecek tüberküloza özgü protein biyobelirteçlerinin tanımlanmasına katkıda bulunmaktadır.

Giriş

Kapsamlı araştırmalar, Mycobacterium tuberculosis1'in büyümesi ve bağışıklık etkileşimlerinde salgılanan proteinlerin önemli rolünü vurgulamıştır. M. tuberculosis'in kültür süzüntüsü, karmaşık bir protein ve protein olmayan bileşenler dizisi içerir, bu da onu biyolojisini ve immünojenik özelliklerini anlamak için değerli bir kaynak haline getirir. Erken proteomik çalışmalar, kültür filtratı2'de yaklaşık 450 protein tanımladı ve bunların çoğu tüberküloza karşı bağışıklık tepkilerinin ortaya çıkarılmasında kritik bir rol oynamaktadır. İmmünolojik olarak ilgili bu antijenlerin tanımlanması, tüberküloz için yenilikçi teşhis ve aşılar geliştirmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, bu alandaki ilerleme, M. tuberculosis enfeksiyonuna karşı immün yanıtın karmaşıklığı ve mikobakteriyel proteinleri izole etmek için kullanılan biyokimyasal saflaştırma yöntemlerinin teknik sınırlamaları nedeniyle zorlanmaktadır.

M. tuberculosis proteinlerini çözmek için çeşitli ayırma teknikleri kullanılmış, küçük ancak fonksiyonel olarak önemli proteinlerin saptanmasını kolaylaştırmış ve proteomik çalışmaların kapsamını genişletmiştir. İdeal bir ayırma yöntemi, karmaşık protein karışımlarını sınırlı sayıda farklı fraksiyona etkili bir şekilde çözer. Mikobakteriyel proteinleri ayırmak için yaygın olarak kullanılan iki yaklaşım, kromatografi tabanlı ve elektroforez tabanlı yöntemlerdir 1,2.

Afinite, iyon değişimi ve ters faz kromatografisi dahil olmak üzere kromatografik teknikler, on yıldan fazla bir süredir protein fraksiyonlamasının temel taşı olmuştur. Bu yöntemler, M. tuberculosis proteinlerini ayırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır3. Bununla birlikte, düşük protein verimleri ve protein olmayan bileşenlerden kaynaklanan girişim gibi faktörlerle sınırlıdırlar ve bu da sonraki immünolojik analizleri karmaşıklaştırabilir. Bu dezavantajlar, immünolojik olarak ilgili antijenleri tanımlamak için kromatografinin kullanımını kısıtlar.

Bu sınırlamaları ele almak için, iki boyutlu elektroforez tabanlı bir ayırma yöntemi benimsenmiştir. Birinci boyutta, proteinler, proteinleri izoelektrik noktalarına göre ayıran hazırlayıcı bir IEF sistemi kullanılarak izoelektrik odaklamalarına (IEF) dayalı olarak ayrılır. İkinci boyutta, proteinler hazırlayıcı SDS-PAGE kullanılarak moleküler ağırlık ile daha fazla çözülür, ardından tam jel eluter aleti ile elüsyon yapılır.

Bu iki boyutlu yaklaşım çeşitli avantajlar sunar. Kültür filtrat proteinlerinin (CFP) karmaşıklığını, onları 600 farklı fraksiyona bölerek önemli ölçüde azaltır. Ek olarak, fraksiyonlar doğrudan immünolojik analiz için uygundur, çünkü elüsyon işlemi hücresel immünolojik deneylere müdahale eden bileşenleri içermez 4,5,6.

Bu protokol, immünolojik analiz için kültür filtrat proteinlerinin hazırlanmasını ve ayrılmasını detaylandırır6.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Mycobacterium tuberculosis'in büyümesi ve kültür süzüntü proteinlerinin (CFP'ler) hazırlanması

  1. Sauton'un sıvı ortamının hazırlanması
    1. Aşağıdaki bileşenleri 950 mL damıtılmış suda birleştirin: Gliserol, 30.0 mL; Potasyum dihidrojen ortofosfat (KH2PO4), 0.5 g; Magnezyum sülfat, 0.5 g; Sitrik asit, 2.0 g; Kazein hidrolizat, 0.5 g; Ferrik amonyum sülfat, 0.05 g; Sodyum glutamat, 4.0 g.
    2. %40 potasyum hidroksit (yaklaşık 5 mL/L) kullanarak pH'ı 7,2'ye ayarlayın.
    3. Sesi 1 L'ye yükseltin ve 15 psi'de 20 dakika otoklavlayın.
  2. Mikobakteriyel süspansiyonun hazırlanması
    1. Lowenstein-Jensen (LJ) yamaçlarında yetişen Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) kolonilerini 2 mL Soton'un sıvı ortamına aktarın.
    2. Steril koşullar altında cam boncuklarla kuvvetlice çalkalayarak mikobakteri kümelerini parçalayın.
  3. Mikobakteri üremesinin başlatılması
    1. Bakteriyel süspansiyonu, 10 mL Sotron'un sıvı ortamını içeren bir McCartney şişesine aktarın.
    2. Şişeyi 37 °C'de 2 hafta inkübe edin.
  4. Kültürün ölçeğini büyütmek
    1. Yetiştirilen kültürü 1 L'lik bir şişede 200 mL Sotron'un ortamına aktarın.
    2. 37 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde 4 hafta boyunca inkübe edin.
    3. Log faz kültürünü, 2 L Soton'un ortamını içeren 4 L'lik bir şişeye aktarın.
    4. Kültürü 37 ° C'de sabit koşullar altında 4 hafta daha bir yüzey pelikülü oluşana kadar büyütün.
  5. Kültür filtrat proteinlerinin (CFP'ler) hasat edilmesi
    1. Kültürü, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1.000-1.500 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.
    2. Süpernatanı 0,45 μm'lik bir vakumlu filtrasyon sistemi ile filtreleyin.
    3. CFP içeren filtratı, 10 kDa'lık bir kesme ile teğetsel akışlı bir filtrasyon sistemi kullanarak konsantre edin.
  6. Hasat edilen CFP'nin saklanması
    1. Ticari olarak temin edilebilen BCA test kitini kullanarak protein içeriğini tahmin edin.
    2. Proteinleri ayırın,% 0.2'lik bir nihai konsantrasyona sodyum azid ekleyin ve -80 ° C'de saklayın.

2. Hazırlayıcı sıvı faz izoelektrik odaklama (IEF)

  1. Protein örneğinin hazırlanması
    1. Mycobacterium tuberculosis CFP'yi 8 M üre, 1 mM ditiyotreitol (DTT),% 5 gliserol,% 2 digitonin,% 2 amfolit (pH 3.0-10.0 ve pH 4.0-6.0 1: 4 oranında) içeren 60 mL IEF ayırma tamponunda çözün.
  2. IEF sisteminin kurulması
    1. Anot odasını 0.1 M fosforik asit ve katot odasını 0.1 M sodyum hidroksit ile doldurun.
    2. Hazırlayıcı IEF hücresini üreticinin talimatlarına göre monte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. IEF gerçekleştirme
    1. IEF sistemine 350 mg'a kadar protein yükleyin.
    2. Soğutma sirkülasyon suyu sistemi ile proteinleri 4 °C'de odaklayın.
    3. Voltaj yaklaşık 1400 V'ta stabilize olana kadar 12 W'lık sabit bir güç uygulayın, ardından 30 dakika daha devam edin.
  4. Kesirlerin toplanması ve analiz edilmesi
    1. IEF fraksiyonlarını hasat edin ve pH'larını belirleyin.
    2. Her bir alikotu SDS-PAGE ile analiz edin ve gümüş boyama kullanarak proteinleri görselleştirin.

3. Hazırlayıcı SDS-PAGE ve tam jel elüsyon

  1. SDS-PAGE için numune hazırlama
    1. IEF fraksiyonlarını piyasada bulunan 6x SDS-PAGE örnek arabelleği ile karıştırın.
    2. Karışımı 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
  2. Hazırlayıcı SDS-PAGE'in çalıştırılması
    1. %4 istifleme jeli ve %12,5 çözünen jel içeren 16 cm × 20 cm'lik bir poliakrilamid jele 10 mg'a kadar protein yükleyin.
    2. Boya cephesi alttan 2 cm uzakta olana kadar elektroforezi 50 mA'lık sabit bir akımda çalıştırın.
  3. Jelden proteinlerin ayrıştırılması
    1. Jeli elüsyon tamponunda (60 mM Tris, 40 mM CAPS, pH 9.4) 10 dakika dengeleyin.
    2. Jeli tam jel eluter aletine aktarın.
    3. 1 saat boyunca 250 mA'lık sabit bir akım uygulayarak proteinleri elute edin.
  4. Kesirlerin toplanması ve analiz edilmesi
    1. Ayrılan proteinleri, her biri 2,5 mL hacme sahip 30 ayrı fraksiyona dökün.
    2. Üreticinin talimatlarını izleyerek BCA protein tahmin yöntemini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
    3. SDS-PAGE ile her fraksiyondan 10 μg proteini analiz edin ve gümüş boyama kullanarak görselleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1, hazırlanan kültür süzüntü proteinlerinin (CFP) karmaşıklığını göstermektedir. Başlangıçta, 100 μg CFP, karmaşıklığını değerlendirmek için 2D-SDS PAGE analizine tabi tutuldu. Bu analiz, CFP'de yaklaşık 100 farklı protein noktasının varlığını ortaya koymuştur (Şekil 1).

Her çalışmadan toplanan 20 fraksiyon SDS-PAGE ile analiz edildi. Bunlardan, üç farklı çalışmadan üç temsili fraksiyon Şekil 2'de g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mycobacterium tuberculosis'in kültür süzüntü proteinleri (CFP'ler), değişen konsantrasyonlarda bulunan çeşitli protein bileşenlerinin karmaşık bir karışımını temsil eder. Proteomik çalışmalar, CFP 4,5 içinde 1.314'e kadar protein tanımlamıştır. Çok sayıda araştırma, CFP'lerin immün yanıtları modüle etmedeki kritik rolünü vurgulamıştır. Spesifik olarak, CFP'ler, T hücresi yanıtları 4,5,6,7

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ä KTA akı teğetsel akış filtrasyon sistemi CYTIVA29038437
Amfolitler (pH 3,0 ila 10,0)BIYO-RAD1632094
Amfolitler (pH 4,0 ila 6,0)BIYO-RAD1631143
BCA protein tahlili MERCK71285-M
CAPSMERCKC2632 (İngilizce)
Kazein hidrolizatıMERCK65072-00-6
Sitrik asitMERCKC0759 (İngilizce)
DigitoninMERCK300410
DTTMERCKD9779 Serisi
Ferrik amonyum sülfatHIMEDIAGRM10944
GliserolMERCKG5516 Serisi
Gliserol MERCK252859
Lowenstein-Jensen eğimleri HIMEDIASL001 Serisi
Magnezyum sülfatMERCKM7506 Serisi
Millipore Stericup Hızlı Bırakma Vakum Filtrasyon SistemiMERCKS2HVU11RE
Fosforik asit MERCK695017
Potasyum dihidrojen ortofosfatMERCKP0662
Potasyum hidroksit MERCK484016
Hazırlayıcı IEF Hücresi (Rotofor) BIYO-RAD170-2986 
Sodyum azid MERCKS2002
Sodyum glutamatMERCK49621
Sodyum hidroksitHIMEDIAMB095 Serisi
TrisMERCK252859
ÜreMERCKU5128
Tüm Jel Eluter aparatı BIYO-RAD1651250

Kaynaklar

  1. Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
  2. de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
  3. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  4. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
  5. Tucci, P., et al. Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).
  6. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  7. Yasuda, I., et al. Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines. Front Immunol. 15, 1330796(2024).
  8. Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins. Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).
  9. Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).
  10. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  11. Mustafa, A. S. Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma. Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).
  12. Rosenkrands, I., et al. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis. Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).
  13. Jungblut, P. R., et al. Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens. Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).
  14. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  15. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  16. Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Protein Fraksiyonlamasıİzoelektrik OdaklamaSDS-PAGEProtein Biyobelirteçleriİmmünolojik ProfillemeTanjansiyel Akış FiltrasyonuProteomik AnalizT-Hücre Antijenleri
Mycobacterium tuberculosis'ten Kültür Filtrat Proteinlerinin (CFP'ler) Ayrılması ve Fraksiyonlanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.