Yöntem makalesi

Hücre Duvarı ve Hücre Zarı Proteinlerinin Aşağı Akış Protein Analizi için Mycobacterium tuberculosis'ten Ayrılması ve Fraksiyonlanması

DOI:

10.3791/67680

⸱

26 Eylül 2025

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, çözünmeyen hücre duvarı ve zar proteinlerini, izoelektrik noktaya dayalı hazırlayıcı izoelektrik odaklama (IEF) kullanarak basit fraksiyonlara (1-5 protein) ayırır ve ardından moleküler ağırlığa göre ayırır. Elde edilen fraksiyonlar, daha fazla saflaştırma olmaksızın doğrudan immünolojik ve proteomik analiz için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüberküloz patogenezinde merkezi rol oynayan mikobakteri hücre duvarı ve membran proteinleri, hazırlayıcı İzoelektrik Odaklama (IEF) ve hazırlayıcı sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılarak başarılı bir şekilde ayrıştırıldı. Bunu, hidrofobik proteinlerin ayrılması için geleneksel yöntemlerdeki sınırlamaların üstesinden gelen jel elüsyonu takip eder. Bu prosedürde, M. tuberculosis kolonileri Lowenstein-Jensen eğimlerinden 2 mL 7H9 et suyuna aktarıldı, cam boncuklarla dağıtıldı ve 37 °C'de 2 hafta inkübe edildi. Daha sonra kültür 200 mL'ye ölçeklendirildi ve 4 hafta boyunca bir çalkalayıcıda büyütüldü. 500 mL 7H9 et suyu ile 1 L'ye yükseltildi ve 4 hafta daha büyütüldü. Yetiştirilen Mikobakteriler, 1741 × g'da 30 dakika santrifüjleme ile peletlenmiştir. Her 2 g pelet için 1 mL kırma tamponu eklendi ve numune sonikleştirildi. Lizat, kırılmamış hücreleri çıkarmak için 15 dakika boyunca 3436 × g'da santrifüjlendi ve süpernatan konsantre edildi. Bu süpernatan (tam hücre lizatı), hücre duvarı proteinlerini pelet etmek için 30 dakika boyunca 13751 × g'da santrifüjlendi. Kalan süpernatan, hücre zarını ve sitozolünü ayırmak için 4 saat boyunca 100.000 × g'da ultra santrifüjlendi. İzole edilmiş hücre duvarı ve membran proteinleri, 4 °C'de sıvı hazırlayıcı bir IEF sistemine yüklendi ve voltaj 20 fraksiyonu ayıran 1400 V'ta stabilize olana kadar 12 W'ta ayrıldı. Bu IEF fraksiyonları, hazırlayıcı SDS-PAGE ile daha da ayrıldı ve proteinler, 250 mA'da tam bir jel elüteri kullanılarak ayrıştırıldı ve bu da 30 fraksiyonla sonuçlandı. Bu protokol sayesinde, yeni M. tuberculosis hücre duvarlarını ve membrana özgü biyobelirteçleri tanımlayabildik ve ayrıca diğer patojenlerdeki benzer proteinleri karakterize etme potansiyeli gösteriyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünolojik çalışmalar, saflaştırılması kolay çözünür proteinlere ek olarak, M. tuberculosis gibi patojenlere karşı insan bağışıklık tepkisinin, Mycobacterium tuberculosis'in hücre duvarı1 ve hücre zarı proteinleri2'de bulunan hidrofobik proteine de yönlendirildiğini göstermiştir. Bu hücre duvarı ve zar proteinleri, tüberküloz da dahil olmak üzere birçok patojene karşı immünolojik kontrolde çok önemli bir rol oynar. Bu proteinlerden bazıları, T ve B hücre yanıtını oluşturan immünodominant antijenler olarak rapor edilmiştir. Buna karşılık, diğer proteinler, bağışıklık hücreleri tarafından patojenle ilişkili moleküler modeller (PAMP'ler) gibi doğuştan gelen bir bağışıklık tepkisini başlattığı ve böylece bir bağışıklık tepkisi başlattığı kabul edilen patojenlerin moleküler imzaları olarak tanımlanır. Örneğin, LprG, LpqH, LprA ve PhoS1 gibi Mikobakteriyel lipoproteinler, Toll benzeri reseptör 23 tarafından tanınır.

Hücre duvarı ve zar proteinlerinin hidrofobik doğası, bunların çözünmesi ve ayrılması açısından önemli teknik zorluklar sunar. Çalışmalar, membran proteinlerinin mikobakteriler 4,5 dahil olmak üzere tüm organizmaların kodlama bölgelerinin yaklaşık %20 ila %30'unu oluşturduğunu göstermiştir. İçsel yapıları ve teknik zorlukları nedeniyle, hücre duvarı ve zar proteinlerinin çözündürülmesi ve izole edilmesi, çözünür proteinlere kıyasla daha zordur. Sonuç olarak, membran protein yapılarının sadece %2'si rapor edilmiştir6. Bu proteinleri izole etmenin zorluğuna çeşitli faktörler katkıda bulunur. Birincil zorluk, hücre içindeki düşük bolluklarıdır, bu da daha ileri karakterizasyon7 için tek tek proteinlerin izolasyonunu zorlaştırır. Ek olarak, bu proteinler toplanma eğilimi göstererek çözünürlüklerini daha da karmaşık hale getirir. Bu sorun, çözünmeye yardımcı olmak için deterjanlar eklenerek çözülebilir. Bununla birlikte, bazı proteinler, deterjanların varlığında bile agregatlar oluşturabilir, bu durumda çözünürlüğü artırmak için kaotropik ajanlar ve indirgeyici ajanlar kullanılabilir.

Çözündürme için deterjanların kullanılması sonraki ayırma yöntemlerine müdahale edebilir. Örneğin, yüklü deterjanlar iyon değiştirme kromatografisi ile kullanılamaz ve tüm deterjanlar hidrofobik etkileşim kromatografisinibozabilir 8. Bu nedenle seçilen ayırma yöntemine uygun bir deterjan seçmek kritik öneme sahiptir. Hücre duvarı ve zar protein izolasyonundaki bir diğer önemli adım, çözündürme için kullanılan deterjanların uzaklaştırılmasıdır, çünkü bunlar proteinlerin sonraki fonksiyonel analizlerine müdahale edebilir.

Membran proteinlerinin, özellikle hücre duvarı ve hücre zarındaki hidrofobik proteinlerin analizi ile ilgili birçok zorluğun üstesinden gelen sağlam bir metodoloji geliştirdik. Bu proteinlerin incelenmesindeki en önemli zorluk, hidrofobik doğaları bunların çıkarılmasını ve analiz edilmesini zorlaştırdığından çözünmeleridir. Burada açıklanan metodoloji, hücre duvarı ve hücre zarı proteinlerini verimli bir şekilde çözündüren özel olarak formüle edilmiş bir izoelektrik odaklama (IEF) tamponu kullanır. Bu çözündürme adımı, bu hidrofobik proteinlerin daha sonra analiz edilmesini sağladığı için kritiktir.

Bu yöntemin ek bir avantajı, protein karışımının karmaşıklığını azaltma yeteneğidir. Proteinlerin izoelektrik noktasına (pI) ve moleküler ağırlığına dayanan iki tamamlayıcı ayırma tekniğini kullanan bu metodoloji, hücre duvarı ve hücre zarı proteinlerini verimli bir şekilde basitleştirilmiş fraksiyonlara ayırır. Her fraksiyon tipik olarak yalnızca bir ila üç protein içerir, bu da çözünürlüğü önemli ölçüde artırır ve aşağı akış karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Model sistem olarak Mycobacterium tuberculosis hücre duvarı ve hücre zarı proteinleri kullanılarak geliştirilen bu metodoloji, hidrofobik proteinlerin izole edilmesi ve analiz edilmesiyle ilgili zorlukları etkili bir şekilde ele almaktadır. Bu karmaşık protein fraksiyonlarının izolasyonu, ayrılması ve karakterizasyonu için güvenilir bir yaklaşım sağlayarak bunları ayrıntılı olarak inceleme yeteneğini geliştirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, ilgili hükümet yönergelerine uygun olup, Kurumsal Bilimsel Danışma Komitesi ve Etik Kurul tarafından onaylanmıştır. Örnekler alınmadan önce çalışma popülasyonundan bilgilendirilmiş onam alındı.

1. M. tuberculosis'in kültürlenmesi

  1. Yaklaşık 10 M. tuberculosis kolonisini Lowenstein-Jensen eğimlerinden 2 mL 7H9 et suyu ortamına aktarın (2.35 g Middlebrook 7H9 Broth Base'i 400 mL damıtılmış su, 50 mL Oleik Albümin Dekstroz Katalaz [OADC] takviyesi, 0.5 g Tween 80 ve 500 mL'ye kadar yapın)
    NOT: M. tuberculosis bir Risk Grubu 3 patojenidir; BSL3 tesisindeki biyolojik güvenlik kabininde (BSC) ele alınmalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanılmalıdır.
  2. Hücreleri steril koşullar altında cam boncuklar kullanarak bir şişe çalkalayıcıda 15 rpm'de 1 dakika dağıtın.
  3. Bakteri süspansiyonunu bir McCartney şişesinde 10 mL 7H9 et suyu ortamına aktarın ve 30 rpm'de bir çalkalayıcı inkübatörde 2 hafta boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  4. Log fazı kültürünü 200 mL 7H9 et suyu ortamına yükseltin ve 30 rpm'de 4 hafta boyunca bir çalkalayıcı kültüründe büyütün.
  5. Ayrıca, kültürü 500 mL 7H9 et suyu ortamı içeren 1 L'lik bir şişede ölçeklendirin ve 37 °C'de 4 hafta boyunca 30 rpm'de çalkalayıcı kültür olarak büyütün.
  6. Mikobakterileri 1741 g'da 30 dakika santrifüjleyerek hasat edin.

2. Tüm hücre lizat proteinlerinin hazırlanması

  1. İzole edilmiş bakteri peletini standart bir protokol izleyerek sonikasyona tabi tutun.
  2. Kırma tamponunu aşağıdaki bileşimle hazırlayın: %8,5 (100 mL başına 8,5 g) NaCl ile 20 mM Tris.
  3. Konsantre HCl ile son pH'ı 7,4'e ayarlayın.
  4. Taze hazırlanmış proteaz inhibitörlerini aşağıdaki konsantrasyonlarda kırma tamponuna ekleyin (eklenecek proteaz inhibitörlerinin detayları Ek Tablo 1'de listelenmiştir)
  5. Her 2 g bakteri hücresi peleti için M. tuberculosis basilini (100 mL paketlenmiş hacim ve tartılmış) tedavi edin, lizozim (1 mg / 5 mL hücre süspansiyonu) ile 1 mL kırma tamponu ekleyin ve hafifçe karıştırarak 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  6. Basilleri, kırılma tamponu hacminin iki katı kadar askıya alın.
  7. Tampona %0.04 (ağırlıkça/hacim) sodyum azid ve %0.05 Tween 80 ekleyin.
  8. Protein denatürasyonunu önlemek için süspansiyonu buz üzerinde tutarak, %40 genlikte 30 dakika boyunca 9 s açık ve 9 s kapalı döngüye sahip bir sonikatör kullanarak kırılma tamponundaki bakteri hücrelerini parçalayın.
  9. Kırılmamış hücreleri çıkarmak için hazırlanan lizatı 3438 g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
  10. Santrifüj yoğunlaştırıcılar (3 kDa kesme - 5 mL) kullanarak süpernatanı konsantre edin.
  11. Standart olarak BSA proteini kullanarak bisinkoninik asit (BCA) protein miktar tayini testini kullanarak süpernatanttaki protein konsantrasyonunu belirleyin.
    NOT: SDS-PAGE analizinde, analiz için 50 μg protein yükleyin.

3. Hücre duvarı ve hücre zarı proteinlerinin ultrasantrifüjleme ile izolasyonu

  1. Raja ve ark.9 tarafından protokolü izleyerek hücre duvarı, hücre zarı ve sitozolik proteinleri tüm hücre lizatından izole edin. aşağıda açıklandığı gibi.
  2. Tüm hücre lizatını 13751 × g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin ve hücre duvarı proteinlerini bir pelet olarak ayırın.
  3. Süpernatanı bir ultrasantrifüj kullanarak 4 °C'de 100.000 × g'da 4 saat boyunca ultrasantrifüjlemeye tabi tutun, hücre zarı proteinlerini bir pelet olarak ayırın ve sitozolik proteinleri süpernatanda bırakın.
  4. BCA protein tahlilini kullanarak hücre duvarı ve hücre zarı fraksiyonlarındaki protein konsantrasyonlarını tahmin edin.
    NOT: SDS-PAGE analizinde, analiz için 50 μg protein yükleyin. Ayrılan hücre duvarı ve hücre zarı, daha fazla analize kadar -80 °C'lik bir dondurucuda saklanır.

4. Hazırlayıcı sıvı faz izoelektrik odaklama (Rotofor [IEF aparatı])

  1. Ultrasantrifüjleme ile izole edilen hücre duvarı ve hücre zarı proteinlerini 8 M üre, 1 mM DTT, %5 gliserol, %2 digitonin içeren bir IEF tamponunda çözündürün.
  2. %2 amfolit ekleyin (1:4 oranında pH 3,0 ila 10,0 ve pH 4,0 ila 6,0)
  3. Çözündürülmüş proteinleri, bir soğutma suyu banyosu ile 4 °C'de tutulan sıvı bir IEF sistemi kullanarak parçalara ayırın.
  4. IEF ayrımını üreticinin talimatlarına göre, voltaj sabitlenene kadar (1300 V ile 1600 V arasında) 12 W'lık sabit bir güç uygulayarak gerçekleştirin.
  5. Voltaj stabilizasyonundan sonra IEF çalışmasına 30 dakika daha devam edin ve toplam çalışma süresi yaklaşık 5-6 saattir.
  6. Bir vakum pompası kullanarak tek tek IEF fraksiyonlarını toplayın ve pH değerlerini belirleyin.
  7. Ayrılan fraksiyonları (50 μg) SDS-PAGE'e tabi tutun ve Coomassie Brilliant Blue (CBB) veya gümüş boyama kullanarak proteinleri görselleştirin. Ayrılan IEF fraksiyonlarını daha fazla analize kadar -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.

5. Hazırlayıcı SDS-PAGE ve tüm jel elüsyonu

  1. IEF ile ayrılmış hücre duvarı ve hücre zarı fraksiyonlarını 6x SDS-PAGE numune tamponu ile karıştırın ve SDS-PAGE analizinden önce 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
  2. İkinci boyuttaki protein fraksiyonlarını %12,5 çözücü jel ve %4 istifleme jelinden oluşan 16 cm 20 cm poliakrilamid jeller kullanarak ayırın.
  3. Numuneyi yüklemek için 13 cm uzunluğunda tek bir numune kuyusu kullanın.
  4. Boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar 50 mA/jel sabit akımda elektroforez gerçekleştirin.
  5. Elektroforez çalışmasından sonra jeli elüsyon tamponunda (60 mM Tris, pH 9.4; 40 mM 3-(Sikloheksilamina)-1-propansülfonik asit [CAPS]) 10 dakika dengeleyin.
  6. Jeli, cihaz üreticisi tarafından tarif edildiği gibi bütün bir jel elüter aparatına aktarın.
  7. Eluteri 1 saat boyunca 250 mA'lık sabit bir akımda çalıştırarak proteinleri jelden ayrıştırın.
  8. Bir vakum pompası kullanarak her jelden her biri 3 mL hacimli yaklaşık 30 protein fraksiyonu toplayın.
  9. BCA protein tahlilini kullanarak ayrıştırılan fraksiyonlardaki protein konsantrasyonunu ölçün.
  10. Ayrıştırılan fraksiyonların 10 μg'sini SDS-PAGE analizine tabi tutun ve Coomassie parlak mavi (CBB) boyama ile görselleştirin.
    NOT: Ayrılmış bütün jel ayrıştırılmış fraksiyonlar, daha fazla analize kadar -80 ° C'lik dondurucuda saklandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre duvarı ve hücre zarı proteinlerinin yüksek hızlı ultrasantrifüjleme ile izolasyonu
Hücre duvarı ve membran proteinleri, protokolde belirtildiği gibi ultrasantrifüjleme yoluyla tüm hücre lizatlarından izole edildi. M. tuberculosis'in ayrılmış hücre altı fraksiyonları-hücre duvarı, hücre zarı ve sitozol protein profillerinin SDS-PAGE analizi Şekil 1'de gösterilmektedir.

Hazırlayıcı sıvı faz izoelektrik odaklama ile hücre du...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre duvarı ve zar proteinlerinin hidrofobik doğası, bunların çözündürülmesi ve ayrılmasında önemli deneysel zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Yukarıda bahsedilen protokolde, bu hidrofobik proteinleri etkili bir şekilde izole etmek için yeni bir iki boyutlu elektroforez tabanlı ayırma yöntemi tanımladık. Bu protokolde, başlangıçta sıvı IEF sistemini kullanarak zar ve hücre duvarı proteinlerini izoelektrik noktalarına göre ayırdık. Çözündürme problemini çözmek için, bu proteinlerin çözünme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Dr. KR Uma Devi'nin DST SERB hibesi ile tamamen desteklenmektedir. Dr. B. Ramalingam, DBT-Ramalingaswamy bursu tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
7H9 et suyu Himedia M198 Serisi
%40 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte BIYO-RAD1631113
BCA protein tahlili MERCKBCA1
Bio-Lyte 5/7 Ampholyte BIYO-RAD1631152
santrifüj yoğunlaştırıcılar 3 kDaMERCKZ629456
Digitonin.MERCKD141
DnaseMERCK11284932001
DTTMERCKD9779 Serisi
EDTAMERCKE9884 (İngilizce)
EGTAMERCKE3889
GliserolMERCKG5516 Serisi
LeupeptinMERCKE18
Pepstatin AMERCKP5318
PMSF HakkındaMERCK78830
RnaseMERCK10109134001
Rotofor BIYO-RAD170-2986  izoelektrik odaklama (IEF) aparatı
SonikatörVibra-Hücre, SonikVC 750 Serisi
ÖzetMERCKT7254 Serisi
TPCKMERCK4376
üreMERCKU5378 Serisi
Tüm Jel Eluter aparatı BIYO-RAD1651250

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seshadri, C., Turner, M. T., Lewinsohn, D. M., Moody, D. B., Van Rhijn, I. Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 190 (1), 278-284 (2013).
  2. Kunnath-Velayudhan, S., et al. Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14703-14708 (2010).
  3. Drage, M. G., et al. TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis. Cell Immunol. 258 (1), 29-37 (2009).
  4. Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7, 1029-1038 (1998).
  5. Almeida, J. G., Preto, A. J., Koukos, P. I., Bonvin, A. M. J. J., Moreira, I. S. Membrane proteins structures: A review on computational modeling tools. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1859 (10), 2021-2039 (2017).
  6. Finkelstein, J. Structures of membrane proteins. Nature. 511 ((Suppl 7509)), 21(2014).
  7. Smith, S. M. Strategies for the purification of membrane proteins. Methods Mol Biol. 1485, 389-400 (2017).
  8. Von Jagow, G., Link, T., Schager, H. Purification Strategies for Membrane Proteins. A Practical Guide to Membrane Protein Purification. , Academic Press. San Diego, CA. (1994).
  9. Raja, A., Uma Devi, K. R., Ramalingam, B., Brennan, P. J. Immunoglobulin G, A, and M responses in serum and circulating immune complexes elicited by the 16-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 308-312 (2002).
  10. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (4), 574-586 (2001).
  11. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  12. Sinha, S., et al. Immunogenic membrane-associated proteins of Mycobacterium tuberculosis revealed by proteomics. Microbiology. 151 (7), 2411-2419 (2005).
  13. Deenadayalan, A., et al. An Integrated approach for proteomic and immunological analysis of cell wall and cell membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis. Med Res Arch. 11 (11), (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre Duvar ProteinleriProtein Fraksiyonlamaszoelektrik OdaklamaSDS PAGEHidrofobik Protein Ayr mSubh cresel FraksiyonlamaProtein Biyobelirte leriJel El syonu

İlgili makaleler