Kas-İskelet Dokusundaki Primer Kirpiklerin ARL13B-CENTRIN-2 Fare Modeli Kullanılarak Hacimsel Görüntülenmesi ve Analizi

Özet

Bu yöntem, bir ARL13B-CENTRIN-2 transgenik fare modelindeki endojen sinyalin, doku toplamadan kirpik organizasyonunun analizine kadar, mineralize dokunun geniş alanlarında üç boyutlu olarak primer kirpikleri yerinde görüntülemek için kullanılmasını tanımlar. Bu protokol diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Özet

Birincil silyum, çoğu hücre tipi tarafından bir araya getirilen, hareketsiz, yalnız bir organeldir. İskeletin gelişimi ve homeostazı için ve çevrelerindeki ortamdan gelen biyokimyasal ve mekanik ipuçlarına hücre tepkilerini koordine etmek için gereklidir. Mikrometre ölçeğindeki boyutu nedeniyle, birincil silyumun dokularda yüksek verimli bir şekilde ve optik önyargılar olmadan karakterize edilmesi için yerinde görüntülenmesi zordur. Organizasyonunun in vivo olarak 3D ortamında anlaşılması, fizyoloji ve hastalıktaki siliyer rolleri anlamanın anahtarı olacaktır. ARL13B-CENTRIN-2 fare serisi, siliyer aksonem proteini ARL13B üzerinde bir mCherry etiketi ve siliumun tabanına lokalize edilmiş sentriol proteini CENTRIN-2 üzerinde bir yeşil floresan protein (GFP) etiketi sunar. Bu fare serisi, boyamaya gerek kalmadan birincil silyumun görüntülenmesine olanak tanır, bu da görüntü toplamadaki adım sayısını azaltır ve sinyal-gürültü ile ilgili sorunları ortadan kaldırır. Bu yayın, floresan sinyalini korurken kas-iskelet dokularındaki primer kirpikleri görüntülemek için adım adım bir protokolü açıklamaktadır. Ayrıca, uzunluk ve 3D yönlendirme gibi kirpik özelliklerinin tarafsız bir şekilde ölçülmesini sağlayan, evrensel olarak uygulanabilir bir görüntü analizi hattını tanımlar.

Giriş

Birincil silyum, iskelet de dahil olmak üzere birçok doku ve organın gelişiminde ve homeostazında önemli bir organeldir. Doğum sonrası büyüme sırasında, endokondral ossifikasyon sırasında kıkırdak mineralizasyonunu düzenler¹. İnsanlarda, kirpiklerle ilgili proteinleri etkileyen genetik mutasyonlar, siliopatiler olarak bilinen bir dizi hastalığa ve gelişimsel bozukluğa neden olur. Dokular içindeki primer kirpiklerin organizasyonunun anlaşılması, organ düzeyinde hücresel davranışı nasıl düzenlediklerini anlamak için önemlidir. Primer kirpiklerin insidansı, uzunluğu ve oryantasyonunun dokular içinde ve dokular arasında değiştiği gösterilmiştir, bu da doku organizasyonunun işlevlerine göre bir rol oynadığını düşündürmektedir ^2,3,4. Doğum sonrası kemik büyümesinin çoğunun erken yaşamdan itibaren ve ergenlik döneminde meydana geldiği uzun kemiklerin sonundaki kıkırdak tabakası olan büyüme plakası, sütunlar halinde düzenlenmiş kondrosit hücrelerine sahip oldukça organize bir dokudur. Büyüme plakasında, kondrositler dinlenmeden çoğalmaya ve hipertrofik olmaya kadar farklılaşma aşamalarından geçer.

Bu hücresel organizasyon bazı siliyopatilerde kaybolur, bu da primer kirpiklerin bu hücresel organizasyonu koordine etmede rol oynayabileceğini ve / veya en azından hücresel polarizasyon ile ilişkili olabileceğini düşündürür. Ek olarak, primer kirpik oryantasyonu, eklem kıkırdağında yük taşıyan ve taşımayan bölgeler arasında gözlenen farklılıklarla birlikte mekanosensoriyel işlevlerinde bir rol oynuyor gibi görünmektedir⁴. Son zamanlarda yaptığımız çalışmalar, eklem kıkırdağının farklı bölgelerinde ve büyüme plakasında farklı roller olduğunu ima etmiştir ^5,6. Büyüme plakasındaki primer kirpikleri görüntüleyen önceki çalışmalar, dokudaki kirpik organizasyonu ile ilgili bilgileri kaybeden veya 3D'de az sayıda hücre ile sınırlı olan 2D ile sınırlıydı, bu da analizin ölçeğini ve gücünü azaltıyordu ^7,8.

Primer siliumun görüntülenmesindeki zorluklar arasında mikrometre ölçeğinde boyutu ve immünohistokimya antikorlarının özgüllüğü yer almaktadır. Yerel bir floresan sinyalin kullanılması, güçlü lokalizasyon ve özgüllük sağlar. Bununla birlikte, doğal floresan sinyallerin mineralize dokularda görüntülenmesi zor olabilir, çünkü dokuları parafine gömmek için uzun dekalsifikasyon işlemi sinyal kaybına neden olabilir. Doğal durumda donmuş numunelerin kriyoseksiyonu, gömme ve kesit alma sürecini hızlandırarak bu kaybı önler.

Primer kirpikleri yerinde görüntülemek için, mCherry'ye kaynaşmış ADP-ribosilasyon faktörü benzeri proteini (ARL13B) ve GFP 9'a kaynaşmış CENTRIN-2'yi eksprese eden Bangs ve ark. tarafından bir çift transgenik fare hattı oluşturuldu. ARL13B, birincil silyum zarına lokalize küçük bir GTPazdır ve CENTRIN-2, cilium^10,11'in tabanındaki iki sentrozoma lokalize edilmiş bir sentrometre proteindir. Bu nedenle bu fare serisi, floresan etiketli primer kirpiklerin immünohistokimyaya ihtiyaç duymadan görüntülenmesine izin verir.

Burada tarif edilen protokol, konfokal mikroskopi ile murin postnatal büyüme plakalarında primer kirpikleri 3D olarak görüntülemek için bu transgenik çizgiyi kullanır, sadece ek 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama gerektirir. Yüzlerce hücredeki yüzlerce primer kirpik, doku bağlamında toplu olarak görüntülenebilir ve analiz edilebilir. Bir görüntü analiz hattı daha sonra büyüme plakasının farklı bölgelerindeki birincil kirpik insidansını, uzunluğunu ve oryantasyonunu ölçer. Boru hattı ayrıca sentrioller için bu özellikleri ölçebilir. Protokoldeki adımların bir taslağı Şekil 1'de sunulmuştur.

Protokol

Hayvancılık ve deneyler, Oxford Üniversitesi etik çerçevelerine uygun olarak ve Birleşik Krallık İçişleri Bakanlığı tarafından verilen bir Proje lisansı altında yürütülmüştür. Bu protokol 2 ila 10 haftalık fareler üzerinde gerçekleştirildi, ancak bu yaşın ötesinde farelerin kıkırdağında çalışacaktı.

1. Doku toplama

1. Fareleri içeren bir kutuyu hacimce% 80'e kadar karbondioksit ile doldurarak ve konsantrasyonunu 5 dakika koruyarak farelere ötenazi yapın. Servikal çıkık gerçekleştirin.
2. İlgilenilen dokuyu inceleyin.
   NOT: Aşağıda, tibial ve femoral büyüme plakaları ve eklem kıkırdağı dahil olmak üzere arka bacak dizlerinin diseksiyonu için bir protokol bulunmaktadır.
   1. Cildi ayaktan kesin ve uyluğun üst kısmına kadar kesin. Forseps ile insizyon hattından cildi çıkarın.
   2. Bacaklardaki kas ve yağ dokusunu kesin.
   3. Bacağı vücuttan ayırmak için, kalçanın üst kısmındaki uyluk kemiğinden temiz bir şekilde kesin. Ayağı kaval kemiğinin altından kesin.
   4. Bacakta kalan fazla kas ve yağ dokusunu alın.

2. Doku fiksasyonu ve gömme

NOT: Protokol boyunca, floresan sinyal kaybını önlemek için dokuyu karanlıkta tutmaya özen gösterin.

1. Dokuyu 4 saat boyunca oda sıcaklığında% 10 formalin içinde sabitleyin.
2. Dokuları gece boyunca 4 ° C'de% 2.5 formaline aktarın.
3. Dokuları damıtılmış suda (dH₂O) %30 sükroza aktarın ve gece boyunca veya 3 gün boyunca 4 ° C'de oda sıcaklığında hafifçe döndürün. Rotasyon sırasında dokunun tamamen daldırılmasını sağlamak için tüpleri üste kadar doldurun. Bu inkübasyonu takiben, doku tüpün dibine çökecektir.
4. Ayrı bir kutuya az miktarda kuru buz koyun ve kriyokalıbı üstüne yerleştirin. Bir dizi süper kriyogömme ortamı (SCEM) izleyin ve bacak kapağının mümkün olduğunca düz olması için bacak kapağı aşağı bakacak ve tibia ve uyluk kemiğini birbirinden ayıracak şekilde uzvu bunun üzerine yerleştirin. SCEM katılaşmaya başlayana ve uzuv tutulmadığında artık hareket etmeyene kadar forseps ile yerinde tutun.
5. Kalıbı üstüne kadar doldurarak tamamen SCEM ile örtün. SCEM tamamen katılaşana kadar dokunun hareket etmesini önlemek için numuneyi düz tutarak numuneyi kuru buz kutusuna yerleştirin.
6. -20 °C'ye aktarın.

3. Bölümlendirme

1. Bloğu kalıptan çıkarın ve bir kriyostatın aynasına uyan bir boyuta kadar kesin. Mandrene SCEM uygulayarak ve bloğu üstüne yerleştirerek bloğu aynaya takın.
2. Kriyostatta -5 °C'de en az 20 dakika katılaşmasına izin verin.
3. Mandreni numune tutucuya ve bıçağı bıçak tutucusuna takın.
4. Tibial büyüme plakasına ulaşılana kadar bloğu kesin. İdeal olarak, kaval kemiği yukarı bakacak şekilde bölüm.
5. Kriyofilm bandı, çevresinde yeterli boşluk olacak şekilde numuneye uyan bir boyutta kesin. Kriyofilmi kesilen yüzeye monte edin ve kriyofilmin uygun bir aletle sıkıca yapışmasını sağlayın. İki hücreli kalın kesitler elde etmek için 40-60 μm kalınlığında kesitler kesin. Bandı forseps kullanarak toplayın ve bir slayta, numune tarafı yukarı bakacak şekilde ve tibial büyüme plakasını slaydın kısa slaytı ile aynı hizada yerleştirin.
6. Örnek slaytları -20 °C'de saklayın.

4. Slayt hazırlama ve montaj

1. Slaytı oda sıcaklığında yatay olarak çözdürün.
2. SCEM'i çıkarmak için slaytı bir damla PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
3. 10 μM DAPI ile 1 dakika boyayın.
4. Slaytı bir damla PBS ile 2 x 5 dakika yıkayın.
5. Monte edin, bir lamel ile örtün ve gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. Lamelin kenarlarını lamel sızdırmazlık maddesi ile kapatın.
6. Ertesi gün görüntü.

5. Konfokal mikroskopi ile görüntüleme

NOT: Kullanılan konfokal mikroskopta 40x/1.4 objektifin çözünürlüğü 240 nm'dir.

1. Mikroskobu kurun.
   1. Mikroskobu açın ve yazılımı açın. Sistem düğmesine tıklayın.
   2. Edinme sekmesi altında, kanalları ayarlamak için Akıllı Kurulum'a tıklayın. GFP, mCherry ve DAPI kanallarını seçin ve ekleyin. Airyscan üçgeninde Airyscan seçeneğini ve SR8Y işlevini seçin (çözünürlük ve hız katlama 8Y arasında). En İyi Sinyale Tıklayın | Tamam (Ek Şekil S1A).
   3. Bul sekmesinde, Mikroskop Kontrolü altında, yağa daldırmalı 40x/1.4 objektifi seçin.
2. İlgilendiğiniz bölgeyi bulun.
   1. Sürgüyü sürgü tutucusuna yerleştirin ve yağ lamel ile temas edene kadar objektifi yukarı kaldırın.
   2. Büyüme plakasını veya ilgilenilen diğer bölgeyi ışık yolunun altına yerleştirin.
   3. Bul sekmesinde, Floresan'a tıklayın, DAPI'yi seçin ve göz merceğini kullanarak, büyüme plakasını veya ilgilenilen bölgeyi görüş alanı altına yerleştirmek için kaydırma tutucuyu joystick ile hareket ettirin.
   4. Edinme sekmesinde, yalnızca DAPI kanalını seçerek başlayın.
   5. Bu kanalın görüntüsünü ekranda görüntülemek için Sürekli'ye tıklayın ve büyüme plakasının görünümde olduğundan emin olun.
   6. Kutucuklar sekmesinde Görüntüleyiciyi göster'e tıklayarak Döşeme görüntüleyiciyi açın. Gerekli karo sayısını ekleyin (genellikle x yönünde 1 karo ve y yönünde 3-5) ve Önizleme ve Başlat'a tıklayın (Ek Şekil S1B).
   7. Fayansların büyüme plakasının dinlenme, proliferasyon ve hipertrofik olmak üzere üç bölgesini kapladığını kontrol edin. Döşeme konumunu ve numarasını gerektiği gibi ayarlayın.
3. Görüntüleme parametrelerini ayarlayın.
   1. Edinme sekmesinde Sürekli'ye tıklayın. Kanallar sekmesinde, çekirdekleri ekranda net bir şekilde görüntülemek için Kazanç (Ana) ve Lazer gücünü ayarlayın. Airyscan Dedektörünün hizalanmasına izin verin. Pencerenin altındaki döşemeli rozet sembolüne tıklayarak Airyscan Dedektör Ayarı penceresini açın; hizalandıktan sonra, tüm karolar yeşile dönecektir (Ek Şekil S1C).
   2. GFP ve mCherry kanallarını ayrı ayrı seçin ve Kazanç (Ana), Lazer gücünü ayarlayarak bu adımları tekrarlayın ve Airyscan Dedektörünü hizalayın.
   3. Üç kanalı da seçin ve Sürekli'ye tıklayın. Airyscan Dedektörünün hizalanmasına izin verin.
   4. Edinme Modu sekmesinde Görüntü Boyutu, Piksel, Boyut, Çerçeve Boyutu, Hız ve Ortalama değerlerini tanımlayın. Kullanılan kanallar için Alım Modu ayarları, Kazanç (Ana) ve Lazer gücü değerleri için Ek Şekil S1D,E'ye bakın.
4. Görüntüleri elde edin.
   1. Edinme sekmesinde, Z-Stack onay kutusuna tıklayın.
   2. Yalnızca DAPI kanalı seçiliyken, görüntüyü ekranda görüntülemek için Sürekli'ye tıklayın. Hedefi, görüntülenecek en yakın düzleme taşıyın. Z-Stack sekmesinde, İlk Düzlemi Ayarla'ya tıklayın, görüntülenecek son düzleme odaklanın ve Son Düzlemi Ayarla'ya tıklayın. Görüntü 30-40 μm z-yığınları.
   3. Aralığı 0,15 μm olarak ayarlayın.
   4. Z yığınının merkezine gidin. Döşemeler sekmesinde, Döşeme Bölgeleri altında, Doğrula'ya tıklayın ve Z Ayarla ve sonrakine geç'e tıklayın.
   5. Odak Stratejisi sekmesi altında, odak stratejisinin Kutucuk Kurulumu'nda tanımlanan Z Değerlerini/Odak Yüzeyini Kullan olarak ayarlandığından emin olun.
   6. Görüntü alımını başlatmak için Denemeyi Başlat'a tıklayın.
5. Görüntü işleme
   1. İşleme sekmesinde Tek veya Toplu mod'u seçin. Airyscan işleme'yi seçin. 3D işleme'yi işaretleyin ve Standart Otomatik Filtre'yi seçin. Alınan ham görüntüyü seçin ve işlemeye başlayın (Ek Şekil S2A).
   2. Airyscan İşleme tamamlandıktan sonra, işleme yöntemlerinde Dikiş'i seçin. Yeni Çıktı, Sigorta Döşemeleri, Gölgelendirmeyi Düzelt ve Referansa göre Tümü'nü seçin, referansı DAPI olarak. Airyscan işlenmiş görüntüyü seçin ve işlemeye başlayın (Ek Şekil S2B).
   3. Ham ve çift işlenmiş görüntüleri kaydedin. İkincisi, Toplu modda otomatik olarak kaydedilir.

6. Görüntü analizi

NOT: Burada kullanılan analiz hattı, bu çalışmanın amaçlarına göre özelleştirilmiştir. Boru hattı operasyonlarının ayrıntıları Ek Şekil S3'te gösterilmiştir.

1. czi görüntü dosyasını yazılıma aktarın. Analiz panelini açın; açılır menüden Yeni İşlem Hattı...'nı seçin.
2. Bir hücre algılama işlem hattı oluşturmak için Cellpose Python Segmenter'ı işlem hattına¹² aktarın. Model_Name'yi sito2'ye, Input_channel'yi 2'ye, Second_channel'yi 3'e, μm'yi Diameter_in_μm'yi 10'a, Flow_threshold'yi 0.4'e ve Cellprob_threshold'yi 0'a ayarlayın. + İşlem Ekle'ye tıklayarak işlem hattından önce bir Belge Nesnelerini İçe Aktar (Manuel Etiketleri İçe Aktar olarak yeniden adlandırıldı) ve işlem hattından sonra bir Nesne Özellik Filtresi (Boyut Filtresi olarak yeniden adlandırıldı) operatörü ekleyin. İşlem hattı ayarlarının değerleri için Ek Şekil S3A'ya bakın.
   1. Görüntüleyiciyi ilgilenilen ilk düzleme taşıma
   2. Nesneleri Çiz Aracı simgesine tıklayın
   3. Çokgen modu simgesine tıklayın
   4. Analiz edilecek alanı çizin
   5. Görüntüleyiciyi ilgilenilen son düzleme taşıma
   6. Analiz edilecek çizim alanı
   7. Yeşil onay işaretine tıklayın Değişiklikleri Uygula
   8. Nesneler Tablosunu Göster simgesine tıklayın
   9. Oluşturulan nesneye sağ tıklayın ve nesneyi uygun bir adla yeniden adlandırmak için Nesneyi Yeniden Adlandır'ı seçin. Oluşturulan nesneye sağ tıklayın ve Etiket Ekle'ye tıklayın. Analiz Bölgesi adlı bir etiket ekleyin.
3. Analiz panelinin üst kısmındaki ileri mavi oka tıklayarak bu işlem hattını çalıştırın.
4. Birincil kirpik ve sentriol algılama işlem hattı oluşturmak için analiz panelini açın, açılır menüden Yeni Boru Hattı...'nı seçin. İşlem hattına şu işleçleri ekleyin: Belge Nesnelerini İçeri Aktar ( El ile Etiketleri İçeri Aktar olarak yeniden adlandırıldı), iki Yoğunluk Eşiği Segmenter işleci işleci ( Kirpikler Eşiği ve Merkezliyol Eşiği olarak yeniden adlandırıldı), Bölme ( Merkezlitaş Bölme olarak yeniden adlandırıldı), Nesne Özellik Filtresi ( Merkezlisel Bölme boyutu filtresi olarak yeniden adlandırıldı) ve Bölme ( Bölme - Hücre olarak yeniden adlandırıldı). İşlem hattı ayarlarının değerleri için Ek Şekil S3B'ye bakın.
5. Analiz panelinin üst kısmındaki ileri mavi oka tıklayarak bu işlem hattını çalıştırın.
6. Nesneler penceresini açın. Im/Export...'a tıklayın, Excel Export...'u seçin. Kaydetmek için aşağıdaki özellikleri seçin: # Alt Öğeler, Ad, Üst Adlar, 3B yönelimli sınırlar Kısa kenar, Orta kenar, Uzun kenar, Açı XY, Açı XZ, Açı YZ, Sınırlayıcı Kutu X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, SizeX, SizeY, SizeZ, Geometri Merkezi X, Y, Z, Düzlem İlk, Son, Sayım, Küresellik (Mesh), Hacim (Mesh), Surface Area (Mesh).

Sonuçlar

6 haftalık farenin büyüme plakası, tarif edilen protokol ve dokuda haritalanan primer kirpik organizasyonu kullanılarak görüntülendi. Büyüme plakasının üç bölgesinin de (dinlenme, proliferatif ve hipertrofik) bir görüntüsü yakalandı ve analiz hattından geçirildi (Şekil 2A). Bireysel hücreler, siliyer aksonemleri kırmızı ve sentriolleri yeşil renkte olmak üzere DAPI boyama ile tanımlanabilir. Bu yöntemi kullanan çözünürlük, tek tek sentriolleri ayırt etmek için yeterince yüksektir (Şekil 2B). Bu çözünürlükte, kirpikler 3 boyutlu ortamlarında farklı yönlere işaret ederek görselleştirilebilir (Video 1).

Daha yüksek büyütme hedeflerine sahip daha düşük çözünürlüklü görüntüler, daha geniş bir doku bölgesindeki birincil kirpikleri görselleştirmek için de yakalanabilir; ancak bunlar kirpik oryantasyonunun 3D analizi için uygun değildir. Örneğin, eklem kıkırdağındaki primer kirpikler 20x objektif ile görüntülendi ve bu da yöntemin diğer dokularda da işe yaradığını gösterdi (Şekil 2C). Bu çözünürlükte, kırmızı renkli siliyer aksonemler tanımlanabilir, ancak sentriollerin ayırt edilmesi daha zordur. Subkondral kemik, çok fazla GFP arka plan sinyali sunma eğilimindedir ve bu dokuda sentriolün tanımlanmasını zorlaştırır.

Boru hattı, tek tek hücreleri, birincil kirpikleri ve sentriolleri tespit edebilir ve 10 haftalık farelerde olduğu gibi, kolonların daha az iyi tanımlandığı yüksek düzeyde organize genç büyüme plakaları ve daha yaşlı büyüme plakaları için çalışır (Şekil 3). Hücreler ve kirpikler, z-yığını boyunca görüntülenebileceği gibi 3D olarak algılanır.

Şekil 1: Deneysel iş akışı. Doku toplamadan görüntü analizine kadar protokoldeki farklı adımların akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: ARL13B-CENTRIN-2 faresinin murin dokularındaki primer kirpikler. (A) 6x objektif ile görüntülenen, DAPI'nin beyaz, CENTRIN-2'nin yeşil ve ARL13B'nin kırmızı olduğu 40 haftalık bir büyüme plakası. (B) Tek bir birincil silyum ve iki sentriyolünü yakınlaştırın. (C) 4 haftalık bir farenin eklem kıkırdağı ve subkondral kemiği, 20x objektif ile görüntülendi. (D) Kas-iskelet dokusu ile aynı boru hattı kullanılarak görüntülenen 6 haftalık bir farenin böbreği. (E) Böbrekteki bireysel primer kirpikleri ve merkezlerini gösteren D'deki beyaz kutunun büyütülmesi. Ölçek çubukları = 20 μm (A,D), 4 μm (B), 60 μm (C), 6 μm (E). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hücre ve kirpik algılama boru hattı. 10 haftalık bir büyüme plakası üzerinde görüntü analizi boru hattının örnek uygulaması. (A) Yazılımda açılan görüntü. (B) Hücre algılama boru hattının sonucu. (C) Kirpikler ve sentriol tespit boru hattının sonucu. Kirpikler pembe ve sentrioller yeşil renktedir. Yan görünüm, çözünürlüğün 3D'de farklı yönlere yönlendirilmiş kirpikleri ayırt edecek kadar yüksek olduğunu örneklemektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: ARL13B-CENTRIN-2 faresinden alınan 6 haftalık bir büyüme plakasının üç boyutlu rekonstrüksiyonu. Üç boyutlu rekonstrüksiyon Imaris yazılımında yapıldı ve animasyon videosu olarak kaydedildi. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Mikroskop sisteminde görüntü elde etme ayarları. (A) Kanalları eklemek ve Airyscan modunu seçmek için Akıllı Kurulum penceresi. (B) Döşemeleri görüntüye seçmek ve önizlemek için döşeme görüntüleyici. (C) Airyscan Dedektör Ayarlama penceresi, tüm karolar yeşile döndüğünde Airyscan dedektörlerinin hizalamasının onaylandığı yer. (D) Üç kanal için lazer ayarları. (E) Edinme Modu ve Z-Stack ayarları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Mikroskop sisteminde görüntü işleme ayarları. (A) Airyscan İşleme ayarları. (B) Dikiş ayarları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S3: Özel görüntü analizi işlem hatları. (A) GFP ve DAPI kanallarını kullanan hücre algılama boru hattı. (B) Sırasıyla mCherry ve GFP kanallarını kullanan birincil kirpikler ve merkezsel tespit boru hattı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokolde, doku toplandıktan hemen sonra doku işleme ve gömme adımlarına devam etmek esastır. Bununla birlikte, doku blokları ve slaytları -20 ° C'de en az 3 ay boyunca saklanabilir. Bu protokoldeki birkaç adım, özellikle kesit kalınlığı, büyütme ve z-yığını parametreleri olmak üzere farklı uygulamalara uyacak şekilde değiştirilebilir. Bu, görüntüleme derinliğini ve elde edilen çözünürlüğü etkileyecektir. Sayısal açıklık ve çözünürlük modundaki değişiklikler, daha da yüksek bir çözünürlük elde etmek için kullanılabilir ve z-yığınları aralık boyutu azaltılabilir. Ancak bu, görüntüleme süresini artıracak veya görüntülenebilecek görüş alanının boyutunu azaltacaktır. Açıklanan görüntüleme parametreleri, birincil kirpik oryantasyonunun 3D analizi için tanımlanan minimum gereksinimlerdir.

Yüksek çözünürlük elde etmek için montaj ortamı seçimi önemlidir. Montaj ortamının kırılma indisi, z yığınındaki görüntü bozulmasını en aza indirmek için daldırma ortamınınkine benzer olmalıdır. Montajcının kırılma indisi ve burada kullanılan daldırma yağı, sırasıyla 1.52 ve 1.518 kırılma indekslerine sahiptir. Burada kullanılan konfokal mikroskop üzerindeki Airyscan işlevi, süper çözünürlüklü görüntüler sunar. Diğer süper çözünürlüklü mikroskoplar kullanılabilir; Bununla birlikte, konfokal modun yalnızca görüntülenen alanların boyutu için gereken çözünürlüğü elde etmek için yeterli olmadığını gördük. Multiplex SR-8Y Airyscan modunun maksimum çözünürlüğü x/y'de 120/160 nm ve z'de 450 nm ve maksimum kare/sn sayısı 47,5'tir. x/y'de maksimum 140 nm ve z'de 450 nm maksimum çözünürlük sunan, ancak maksimum 25 kare/sn sayısıyla yarı hızda görüntü sunan Multiplex SR-4Y Airyscan modunun, birincil kirpikleri 3D olarak görüntülemek için önemli bir fark göstermediğini bulduk. Benzer şekilde, bu mikroskopta en yüksek çözünürlüğü sunan Airyscan süper çözünürlük (SR) modu - x/y'de 120 nm ve z'de 350 nm - maksimum kare / sn sayısı 4.7¹³ olduğu için görüntülenmesi daha uzun sürer.

Arka plan GFP sinyali, kas gibi diğer dokularda da gözlenebilir. Bunu en aza indirmek için, diğer dalga boylarıyla örtüşmeyi azaltmak için lazerlerin aralığı daraltılabilir. Bu çizgi daha önce embriyodaki birincil kirpikleri, birincil hücre kültürlerini, kas liflerini ve retina pigment epitelini ^9,14,15 görüntülemek için kullanılmıştır. Böbrek, kıkırdak ve kemik dokusunda primer kirpikleri başarılı bir şekilde görüntüledik. Farklı dokular için görüntüleme ayarlarının bir miktar optimizasyonu muhtemelen gerekli olacaktır; Bununla birlikte, bu kriyoseksiyon protokolü sinyalin korunmasını sağlamalıdır.

İki hücreli kalın kesitler (40-60 μm) kesitler, tüm hücrelerin ve birincil kirpiklerinin görüntülenmesine izin verdiği için büyüme plakasında 3D oryantasyon bilgisi elde etmek için yeterlidir. Adipositler gibi hücrelerin kondrositlerden daha büyük olduğu diğer dokular için, hücre popülasyonu verilerini toplamak için daha kalın bölümler gerekebilir. Kullanılan mikroskobun derinlik çözünürlüğüne bağlı olarak, daha kalın kesitlere derinlemesine görüntüleme yapmak mümkün olmayabilir. Doku temizleme teknikleri, ihtiyaç duyduğu süre nedeniyle muhtemelen endojen mCherry ve GFP sinyalinin kaybına yol açacaktır. Ekstremitedeki diğer görüntülemeler için temizleme yöntemleri kullanıldığından bu durum araştırıldı, ancak bu bağlamda gerekli bulunmadı. Endojen CD31-RFP ile ilgili deneyimimiz, temizleme tekniklerinin dikkatli, numuneye özel olarak optimizasyona ihtiyaç duyacağını önerdi.

Bu ARL13B-CENTRIN-2 çizgisi, dokulardaki primer kirpiklerin organizasyonunu daha fazla incelemek için diğer fare çizgileri ile çaprazlanabilir. Örneğin, agrekan eksprese eden hücrelerde (doğum sonrası kondrositler^{) silinmesi} siliasyonu önleyen bir birincil kirpik proteini olan IFT88'i şartlı olarak nakavt etmek için bir agrekan-Cre IFT88^fl/fl ile çaprazladık5,6. Bu ARL13B ve CENTRIN-2 floresan sinyalleri daha sonra dokulardaki siliyer yapı seviyesindeki genetik bozulmaların etkinliğini ve siliyer organizasyondaki ilişkili değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Devam eden çalışmalar şu anda tam olarak bunu yapıyor. İlk amacımız, bu daha sağlam metodoloji ile IFT88 delesyonunun kirpik prevalansı üzerindeki etkisini ölçmek olacaktır. Daha önce, bunu immünofloresan kullanarak ölçtük ve bunun %20'lik bir azalma olduğunu tahmin ettik⁶. Bu yöntem aynı zamanda primer kirpikleri diğer proteinlerle, örneğin bir hücre zarı proteini ile kombinasyon halinde görüntülemek için immünohistokimya ile birleştirilebilir.

ARL13B üzerindeki transgen, ARL13B ekspresyonu ve birincil kirpik uzunluğu üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Önceki çalışmalar, fare beyninin belirli bölgelerinde transgen olmayan ARL13B'ye kıyasla ARL13B-CENTRIN-2 hattı ile farklı birincil kirpik uzunluklarını ölçmüş, diğerlerinde hiçbir fark olmaksızın¹⁶. Başka bir çalışma, fare embriyonik fibroblastlarında¹⁰ etiketlenmemiş ARL13B'ye kıyasla GFP etiketli bir ARL13B fare hattında primer kirpik uzunluğunda farklılıklar gözlemledi. Devam eden çalışmalar, ARL13B-CENTRIN-2 fare hattını kullanarak sonuçları transgenik olmayan ARL13B'ye karşı antikor boyama ile karşılaştırarak, büyüme plakası ve diğer dokulardaki primer kirpik uzunluğundaki herhangi bir değişikliği doğrulamaktadır.

Bu protokoldeki görüntü analizi boru hattı, daha sonra primer kirpiklerin siliasyon yüzdesini, uzunluğunu ve 3D oryantasyonunu ve ayrıca büyüme plakasındaki merkezriol sayısını ve konumunu ölçmek için tasarlanmıştır. Görüntü analizi yazılımı, ilgili adımları değiştirerek özel işlem hatlarının oluşturulmasına olanak tanır. Bu boru hattının çıktısı, tespit edilen hücreler, kirpikler ve sentrioller için seçilen özelliklerin ölçümlerini içeren bir elektronik tablodur. Postanaliz daha sonra çalışmanın amaçlarına göre R veya başka bir yazılımda gerçekleştirilebilir. Görüntüleme ayarlarında olduğu gibi, boru hattı adımları ve belirli ayarlar, farklı görüntüler üzerinde ve çalışmanın amaçlarına göre çalışacak şekilde değiştirilebilir. Genel olarak, bu yöntem, birincil kirpiklerin büyüme plakasında daha önce yayınlanmış olandan daha yüksek verimli analizine izin verir. İncelenebilecek hücre sayısı ve ilişkili kirpikler, daha büyük ve daha güvenilir ölçümlere izin verir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
22 x 50 mm Kapak Astarı	FisherScientific
arivis Vision4D yazılımı	Zeiss	N/A	Görüntü analiz yazılımı
Konfokal lazer tarama mikroskobu	Zeiss	Zeiss 980 Airyscan 2
CoverGrip Lamel Mastik	Biyotyum	23005
Kriyofilm tipi 3C(16UF) (levha tipi) 2.0 cm genişlik	Section-lab	C-FUF303	Doğrudan Section-lab'den satın alınacak
Cryostat	Leica	CM1900 UV
DAPI	invitrogen	D1306
Tek Kullanımlık Taban Kalıpları	epredia	58952
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu	su gibco	14190
Formalin	Sigma	20260630
Imaris yazılımı	Oxford Aletleri	N/A	3D rekonstrüksiyon için görüntü analiz yazılımı
Daldırma Yağı 518F	Zeiss	ISO 8036
Mikrotom bıçakları	Tüy	02.075.00.006
SlowFade Cam Antifade Mountant	invitrogen	S36917
Sucrose	Sigma	S9378
Süper Kriyoembedding Ortamı (SCEM)	Section-lab	C-EM001	Doğrudan Section-lab'den satın alınacak
Superfrost Plus Mikroskop slaytları	avantor	631-0108
Zen yazılımı	Zeiss	N/A	Konfokal lazer tarama mikroskobu için Ücretsiz Yazılım

12373128