Method Article

Aşırı Bakım Fenotiplerinin Değerlendirilmesi için Drosophila melanogaster Tımar Davranışının Miktarının Belirlenmesi

DOI:

10.3791/67708

⸱

March 21st, 2025

 , 
1Simmons University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yöntem, belirli tımar davranışları için Drosophila melanogaster'den elde edilen görüntülerin manuel olarak açıklanmasını içerir. Atipik kendi kendine bakım fenotiplerini değerlendirmek için hem tımar nöbetlerinin sayısının hem de tımar için harcanan toplam sürenin ölçülmesine izin verir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalıplaşmış tımarlamada gözlemlenebilir değişiklikler, model organizmalarda translasyonel olarak uygulanır. Bu değişiklikler, insan davranışında benzer sapmaları ortaya çıkaran patolojileri temsil eder; örneğin, aşırı tımarlama, Tourette Sendromu veya obsesif-kompulsif bozukluk gibi durumlarda mevcut olan obsesif ve kompulsif davranışlar için bir vekil görevi görür. Sunulan tımar testi, Drosophila melanogaster'deki anormal kendi kendine tımar fenotiplerinin değerlendirilmesine izin verir. Sinekler 10 dakikalık bir süre boyunca kaydedilir ve bu kayıtlar önceden tanımlanmış tımar davranışları için kör olarak gözlemlenir ve açıklanır. Hem tımar etme sıklığının hem de kendi kendine tımar etmek için harcanan zamanın nicel ölçümleri, çekime manuel olarak açıklama eklenerek elde edilebilir. Tahlil nispeten ucuzdur, laboratuvar ortamlarında halihazırda mevcut olmayan az sayıda malzeme gerektirir ve tımarlamayı gözlemlemeyi amaçlayan herhangi bir çalışmanın özel ihtiyaçlarına uyacak şekilde kolayca uyarlanabilir. Ek olarak, bilgisayar bilimi ağırlıklı otomatik yöntemlerle karşılaştırıldığında, testi gerçekleştirmek için gereken düşük beceri seviyesi, protokolü küçük laboratuvarlar ve öğrenciler için çok uygun hale getirir. Bu testi gerçekleştirmek için gereken adımları ve mevcut sınırlamalarını ayrıntılı olarak tartışıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster , davranışsal ve nörobiyolojik çalışmalarda iyi bilinen bir model organizmadır ve benzer insan davranışlarını yönlendiren mekanizmalar hakkında fikir verir. Bu organizmada kendi kendini tımar etme, birbirinden kolayca ayırt edilebilen basmakalıp kalıpları takip eden, yüksek düzeyde düzenlenmiş ve iyi tanımlanmış bir davranıştır1. Sinek tarafından sergilenen ayrı tımar davranışları genellikle anatomik bölge2'ye göre sınıflandırılabilir, en kolay şekilde posterior veya anterior olarak tanımlanır. Drosophila tımar başlangıçta ön bölgeye odaklanacak ve daha sonra arka ucageçecektir 3. Tipik koşullar altında, sinekler temizliği korumak için (örneğin tozu temizleyerek) tımar etme davranışları sergiler ve patojenik mikroplar gibi potansiyel olarak zararlı dış uyaranlara maruz kalmaya yanıt olarak ortaya çıkarlar4.

Tımar davranışındaki anormallikler, özellikle spontan obsesif tımarlama, çeşitli model sistemlerinde obsesif ve/veya kompulsif davranışın bir göstergesi olarak kullanılmıştır. Kemirgenler, kuşlar ve köpekler gibi organizmalarda takıntılı tımar davranışlarını gözlemleyen translasyonel bulgular, insanlarda benzer kompulsif davranışları ortaya çıkaran koşullar hakkında fikir vermiştir5. Bunlar trikotillomani, obsesif kompulsif bozukluk ve Tourette Sendromu6 gibi durumları içerir. Aşırı tımar davranışı, Drosophila melanogaster'deki benzer nörogelişimsel durumların modellerinde davranışsal fenotiplerin değerlendirilmesinde bir ölçüt olarak da kullanılmıştır. Frajilite-X Sendromu (FSX) ve ilişkili otizm spektrum bozukluğunun (ASD) sinek modellerinde takıntılı tımar davranışları gözlenmiştir. Aşırı spontan tımarlama, ASD ve FSX ile ilişkili gen FMR17'nin ortoloğu olan dfmr1'in mutasyonları altında meydana gelir. Ek olarak, bu mutantlarda arka ve ön uçlar arasındaki tımar dağılımında kayda değer bir değişiklik vardır8. Bu değişiklikler, bu koşullara sahip bazı hastalar tarafından sergilenen obsesif ve kompulsif beden odaklı davranışların yansıması olarak yorumlanır. Burada tarif edilen tımar testini kullanırken, ticari olarak temin edilebilen GAL4 sürücüleri ve UAS-RNAi hatları9 tarafından üretilen Drosophila geni Atg8a'nın RNAi aracılı bir yıkımından sonra sineklerde tımar davranışlarını gözlemledik.

Bu yöntem, belirli tımar davranışları için sineklerden alınan görüntülerin manuel olarak açıklanmasını içerir. Boyalar gibi dolaylı yöntemler kullananlar gibi tımar davranışını değerlendirmeyi amaçlayan önceki çalışmalar, tımarlamanın etkinliğini ölçmede etkili olsa da, tımar süresinin veya sıklığının ölçülmesine izin vermemektedir10. Bununla birlikte, bu tahlil, hem genel olarak hem de anatomik bölgeye göre Drosophila tımar sıklığının ve süresinin ölçülmesine izin verir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, kolayca değiştirilebildiği ve hesaplama geçmişine sahip olmayan kişiler tarafından yürütülebildiği için mevcut otomatik yöntemlere göre bazı avantajlar sunar. Çoğu laboratuvarda kolayca bulunabilen gerekli ekipmanla, aşırı kendi kendini bakım fenotipinin varlığını değerlendirmek için uygun maliyetli bir yol sunuyoruz (bkz. Bu, yöntemi öncelikle lisans kurumları için kolayca erişilebilir hale getirir ve eğitim ortamlarına veya öğretim laboratuvarlarına kolayca uyarlanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Protokole genel bir bakış Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Çekimler için hazırlık

  1. Dört adet üç kuyulu tabağı beyaz bir yüzeye yan yana yerleştirin ve her birini bir cam slaytla kaplayın.
  2. Bulaşıkların üzerine bir kamera (burada bir Raspberry Pi sistemi, ancak yüksek çözünürlüklü video yapabilen herhangi bir kamera yeterlidir) yerleştirin.
    1. Tüm bulaşıkların çerçevede ve odakta olduğundan emin olmak için kontrol edin.
    2. Slaytlarda, çanaktaki sineklerin görünürlüğünü sınırlayacak parlama olmadığından emin olmak için kontrol edin. Plaka konumunu ayarlayarak veya kayıt alanındaki ışıkları kısarak parlamayı ortadan kaldırın.
    3. Sinek uzuvlarını doğru bir şekilde görselleştirmek için yüksek çözünürlük (minimum 1920 x 1080 piksel) kullanın.
  3. Kaydın yapıldığı bankta bulaşıkların ve kameranın konumunu işaretleyin.
    NOT: Bu, cihazın gelecekteki kullanımında 2. adım için harcanan süreyi sınırlayacaktır. Tahlillerin aynı anda ve aynı alanda gerçekleştirilmesi, amaçlanan manipülasyonların ötesindeki faktörlere dayalı olarak davranıştaki değişkenliği sınırlayacaktır.
  4. 4-9 günlük sinekleri parafilm ve kağıt havlu ile kaplı bir buz bloğu üzerinde soğuk algınlığı ile hafifçe uyuşturun (CO2 anestezisinin davranış üzerinde önemli bir etkisi olacaktır).
    1. Sinekleri bloğa hafifçe vurun ve uyuşturulduktan sonra, sinekleri bir boya fırçası kullanarak mümkün olduğunca çabuk gözlem odalarına taşıyın.
      NOT: Her türlü anesteziye aşırı maruz kalmak sinekleri olumsuz etkileyebileceğinden, bu transfer mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.
  5. Her kuyucuğa tek bir sinek yerleştirin.
  6. Dosyaların anesteziden sonra 30 dakika boyunca yeni ortamlarına alışmalarına izin verin. Bu noktadan sonra sinek içeren kuyucuklara dokunmayın veya rahatsız etmeyin, çünkü eklenen stres faktörleri davranışı etkileyecektir.

2. Sineklerin kaydedilmesi

  1. 30 dakikalık alışma işleminden sonra, bir kamera kullanarak sinekleri kaydedin.
  2. Davranışsal veri toplama için PiSpy11 üzerinden çalışan bir Raspberry Pi kamera kullanın.
    NOT: Yazılım ücretsizdir ve GitHub'da (https://github.com/gpask/PiSpy) mevcuttur ve bir Pi sistemi 300 doların altında bir fiyata kolayca kurulabilir. Zaten mevcutsa diğer kameralar da görüntü kaydetmek için yeterlidir
  3. Aşağıdaki komut akışıyla Pi ile bir kayıt başlatın.
    1. Terminali açın ve cd PiSpy yazın. Ardından python3 PiSpy.py yazın, istediğiniz kayıt uzunluğunu girin ve istediğiniz kare hızını girin. İstediğiniz çözünürlüğü seçin ve Hızlı Yakalama'ya tıklayın.
    2. Sineklerin odakta olduğundan ve yeterince görünür olduğundan emin olmak için Önizleme Kamerası işlevini kullanın.
  4. Sinekleri 10 dakika boyunca önerilen 24 fps kare hızında kaydedin ve dosyayı kaydedin (PiSpy otomatik olarak videolar klasörüne kaydeder).

3. Video analizi (Şekil 2)

  1. Videoyu analiz etmek için dosyayı Elan 6.8 yazılımına12 aktarın.
    NOT: Bu yazılım, başlangıçta videoların ayrıntılı açıklamaları ve tımar davranışlarının derinlemesine analizi için psikolinguistik tallows için geliştirilmiş olsa da,
  2. Kişilerin görüntülerine manuel olarak açıklama eklemek için her satırı aşağıda gösterildiği gibi atayın.
    1. Bunu aşağıdaki komut akışıyla yapın: Katman > Yeni Katman Ekle > Katman Adı'ndaki çanağa Konum yazın > Ekle'yi tıklayın.
  3. Bir çalışmanın ihtiyaçlarına bağlı olarak, çeşitli spesifik davranışları (ön ve arka tımar, yürüme, uyuma ve ayakta durma) not edin ve ölçün.
    1. Aşağıdaki adımları izleyerek ek açıklamalar yapın.
      1. Ek açıklama eklenecek katmana çift tıklayın. İmleci sağ tıklayın ve tek bir bakım maçının sergilendiği bir süre boyunca seçili katman boyunca sürükleyin. Sol tıklayın, Yeni Ek Açıklama'yı seçin ve yeni vurgulanan zaman dilimine çift tıklayın. Bu zaman noktasında sergilenen davranışın kısaltmasını yazın.
    2. Videoları yavaşça izleyin, fareyle gezinin ve açıklama ekleyin. Davranışların yanlış tanımlanmasını önlemek için açıklama sırasında tek bir sinek kuyusuna yakınlaştırın. Bunlar, camın kenarına sinek tarafından vurmayı veya başlangıçta tımar gibi görünebilecek bacakları kaydırmayı içerebilir.
  4. Videoya tamamen açıklama eklendikten sonra, her davranışın bir dökümünü alın. Bu özelliği kullanmak için videolarda aynı kısaltmanın veya ek açıklamanın kullanıldığından emin olun.
    NOT: Elan 6.8, bir davranışın kaç kez meydana geldiğini, davranışların toplam süresini ve her bir davranış için harcanan ortalama süreyi sağlayacaktır.
    1. Bakım nöbetlerini 2 saniye kesintisiz bakım olarak tanımlayın. Gözlemlenen her davranışı aşağıdaki gibi tanımlayın. Testin yapılmasından önce anatomik bölgeler için parametreleri tanımlayın.
      1. Anterior grooming: Sinek gövdesinin ön bölgesinde gerçekleştirilen tımarlamayı anterior tımar olarak tanımlayın.
        NOT: Bu davranış hemen hemen her zaman, sineğin ön iki bacağı ile baş veya hortum gibi ön kısımda bir sürtünme hareketi içerecektir.
      2. Posterior tımarlama: Sinek gövdesinin ön-arka ucunda gerçekleştirilen tımarlamayı posterior tımar olarak tanımlayın.
        NOT: Ek olarak, basitlik için arka bölgeye kanatlar dahil edilmiştir. Bu davranış hemen hemen her zaman merkezi ve en arka bacak seti ile anında bir sürtünme hareketini içerecektir. Posterior tımarın meydana geldiğinin iyi bir göstergesi, ilk bakışta, Şekil 2D'de gösterildiği gibi, sineğin en arka bacakları eksikmiş gibi görünmesidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu tahlil, açıklamalı görüntülerden tımar davranışlarının zamanını ve sıklığını ölçen nicel veriler üretir. Kurulumun ve davranışların nasıl tanımlandığının temsili bir görüntüsü Şekil 2'de özetlenmiştir. Video analizinin getirdiği öznellik göz önüne alındığında, videoların tüm ek açıklamaları, analizi yapan araştırmacıya kör edilmelidir.

Bu yöntem, Drosophila geni Atg8a'nın tımar davranışının gelişimindeki rolünü değerlendirmek için kullanıldı. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel olarak, bu kolayca yürütülebilir ve uygun maliyetli test, Drosophila melanogaster tımar davranışının sağlam bir şekilde karakterize edilmesini sağlar. Bu teknik, daha önce tanımlanmış çok sayıda tımar davranışının sıklığı, meşgul olmak için harcanan zaman ve anatomik dağılımı hakkında fikir verir. Bakımın gerçekleşeceğine veya devam etmekte olduğuna dair iyi bir gösterge, bacak yerleşimindeki değişiklikler, özellikle de 6 bacaktan herhangi birinin kaldırılmasıdır. Özellikl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel tasarımla ilgili geri bildirimleri için John Young'a, el yazması revizyonu için Eric Luth'a ve figür tasarımı yardımı için Madeleine Hatfield'a teşekkür ederiz. Bu çalışma Simmons Üniversitesi ve Biyoloji Bölümü tarafından finanse edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16 GB Micro SD kartAdafruit1294İşletim sistemi ekranının tanıtımında kullanım için
Adafruit3578HDMI veya esnek kablo ile bağlanabilen herhangi bir ekran yeterlidir
Drosophila Atg8a-RNAi UAS hattıBloomington Stock Center34340Temsili verilerde kullanılan hat
Drosophila Ok6 SürücüN/AN/ATemsili verilerde kullanılan hat
Cam kaydıraklarFisher Scientific12-550-A3Sinekleri muhafazada tutar
Soğutucular AdafruitBilgisayarın aşırı ısınmasını önler
LensAdafruit4563Yalnızca HD kamera ile kullanılır
PiCameraAdafruit4561Burada HD versiyonu kullanılmıştır ancak bütçe kısıtlamaları altında standart bir kamera kullanılabilir
Raspberry pi 4Adafruit4292Bilgisayar PiSpy,
Ribbion KablosuAdafruit1648Kamera ve ekran SB bileşenlerinin bağlanmasında kullanım için
KılıfAdafruit4301Bilgisayarı korur
Spot PlateFisher ScientificS99406Pyrex versiyonları zaten kullanımımız için mevcuttu ancak hücre kültürü kapları veya plastik spot plakaları da yeterli
TripodBest Buy6355959Kameranın askıya alınması ve konumlandırılması için, bunu yapabilen herhangi bir cihaz yeterlidir
USB C Güç KaynağıAdafruit1995Bilgisayara güç sağlar
üzerinde çalışır

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mueller, J. M., Zhang, N., Carlson, J. M., Simpson, J. H. Variation and variability in Drosophila grooming behavior. Front Behav Neurosci. 15, 769372(2022).
  2. Szebenyi, A. L. Cleaning behaviour in Drosophila melanogaster. Anim Behav. 17 (4), 641-651 (1969).
  3. Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951(2014).
  4. Ringo, J. M. How do flies keep clean? Head grooming in Drosophila. J Ethol. 38, 167-172 (2020).
  5. Feusner, J. D., Hembacher, E., Phillips, K. A. The mouse who couldn't stop washing: pathologic grooming in animals and humans. CNS Spectr. 14 (9), 503-513 (2009).
  6. Berridge, K. C., et al. Sequential super-stereotypy of an instinctive fixed action pattern in hyper-dopaminergic mutant mice: a model of obsessive compulsive disorder and Tourette's. BMC Biol. 3, 4(2005).
  7. Russo, A., Diantonio, A. Wnd/DLK is a critical target of FMRP responsible for neurodevelopmental and behavior defects in the Drosophila model of Fragile X syndrome. Cell Rep. 28, 2581-2593.e5 (2019).
  8. Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).
  9. Tian, Y., et al. GABA- and acetylcholine-related gene expression in blood correlate with tic severity and microarray evidence for alternative splicing in Tourette syndrome: a pilot study. Brain Res. 1381, 228-236 (2011).
  10. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. J Vis Exp. 125, e55231(2017).
  11. Morris, B. I., et al. PiSpy: an affordable, accessible, and flexible imaging platform for the automated observation of organismal biology and behavior. PLoS One. 17 (10), e0276652(2022).
  12. ELAN (Version 6.8) [Computer software]. Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. , Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. At https://archive.mpi.nl/tla/elan" (2024).
  13. Müller, N. Tourette's syndrome: clinical features, pathophysiology, and therapeutic approaches. Dialogues Clin Neurosci. 9 (2), 161-171 (2007).
  14. Southall, T. D., Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 system: a versatile toolkit for gene expression in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  15. Hatfield, T., Johnson, S. Knockdown of the GABARAP ortholog Atg8a elicits deficits in learning and promotes obsessive behaviors in Drosophila melanogaster. MicroPubl Biol. 2024, (2024).
  16. Bartholomew, N., et al. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  17. Sindhurakar, A., Butensky, S. D., Carmel, J. B. Automated forelimb tasks for rodents: current advantages and limitations, and future promise. Neurorehabil Neural Repair. 33 (7), 503-512 (2019).
  18. Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, e34497(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila GroomingGrooming BehaviorExcessive GroomingManual AnnotationBehavioral QuantificationAtg8a KnockdownNeurodevelopmental DisordersTourette Syndrome ModelELAN SoftwareRNAi Mutants

Related Articles