Yöntem makalesi

Evaporatif Işık Saçılma Dedektörü ile Birleştirilmiş Sıvı Kromatografisi ile Bir Lipid Nanopartikül RNA Taşıyıcı Sistemdeki Dört Bileşenin Belirlenmesi

DOI:

10.3791/67711

⸱

30 Mayıs 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir evaporatif ışık saçılma dedektörü (ELSD) ile birleştirilmiş yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanarak bir lipid nanopartikül (LNP) RNA dağıtım sistemindeki dört bileşen için kantitatif bir analiz yöntemi oluşturuyoruz. Yöntem iyi ayırma, yüksek hassasiyet ve yüksek verime sahiptir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, lipid nanopartikül (LNP) bileşenlerinin analizi için bir yöntem sunmaktadır. RNA bazlı ilaçlar için önemli bir vektör görevi gören LNP, esas olarak kolesterol, modifikasyonlu PEG, iyonize olabilen lipitler ve yardımcı lipitlerden oluşur. Bu bileşenler zayıf polarite sergiler, bu da ters faz kromatografisi kullanılarak güçlü tutma ve ayırma zorluğuna yol açar ve ayrıca belirgin ultraviyole absorpsiyon özelliklerinden yoksundur. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, bir sıvı kromatografi sistemi, bir buharlaştırıcı ışık saçılma dedektörü (ELSD) ile birleştirildi. Kromatografik kolon tipini sistematik olarak ayarlayarak ve mobil fazın gradyan elüsyon programını optimize ederek, dört kritik bileşenin hızlı ve tam bir temel ayrımı gerçekleştirildi. En son ELSD teknolojisinin kullanılması, algılama hassasiyetini önemli ölçüde artırdı ve yöntemin doğrusal aralığını genişletti. Deneysel sonuçlar, 5 μg/mL ila 250 μg/mL konsantrasyon aralığında, LNP'nin dört bileşeninin, tümü 0.999'dan büyük korelasyon katsayıları ile mükemmel doğrusallık gösterdiğini ve doğruluğun %94.2 ila %108.0 arasında değiştiğini gösterdi. Hassas deneylerde, 10 μg/mL'lik bir standart çözelti için hem alıkonma süresinin hem de tepe alanının nispi standart sapmaları sırasıyla %0.1 ve %2'nin altındaydı. Farklı LNP numunelerini analiz etmek için bu yöntem kullanılırken, tüm bileşenler başarıyla ayrılır ve ilgili içerikleri doğru bir şekilde ölçülür, bu da bu analitik yaklaşımın sağlam uyarlanabilirliğini vurgular.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipid nanopartikül (LNP), esas olarak antisens oligonükleotidler, küçük enterferans yapan nükleotidler, mRNA, vb. gibi nükleik asit ilaçlarının verilmesi için kullanılan en gelişmiş viral olmayan gen dağıtım sistemlerinden biridir 1,2,3. LNP genellikle dört bileşenden oluşur: iyonlaşabilir lipitler, polietilen glikol (PEG) modifiye edilmiş lipitler, fosfolipitler ve kolesterol. Anahtar bileşen, nükleik asit ilaç dağıtımının etkinliğinde belirleyici faktör olan iyonlaşabilir lipitlerdir. Diğer üç bileşen, LNP'nin stabilitesini artırabilir ve bağışıklık sisteminin tanınmasını azaltabilir 4,5,6.

LNP'deki dört bileşenin değişen oranları, nanopartiküllerin kendi kendine montaj sürecini önemli ölçüde etkileyebilir ve aktif farmasötik bileşenin (API) kapsülleme verimliliği, dağıtım etkinliği ve in vivo 7,8,9 salım hızı gibi özellikleri etkileyebilir. Bu nedenle, LNP bileşenleri için kantitatif bir analiz yöntemi oluşturmak ve böylece optimal bir LNP dağıtım sisteminin sentezini kolaylaştırmak esastır10,11.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), farmasötik analizde yaygın olarak kullanılan çağdaş bir analitik tekniktir ve yüksek verimliliği, hassasiyeti ve otomasyon yetenekleri ile saygı görmektedir. HPLC, geleneksel ultraviyole (UV) dedektörleri dahil olmak üzere çeşitli dedektörlerin yanı sıra kırılma indisi dedektörleri (RID), evaporatif ışık saçılma dedektörleri (ELSD), yüklü aerosol dedektörleri (CAD) ve diğerlerinin yanı sıra oldukça seçici radyo frekansı (RF) dedektörleri gibi genel amaçlı dedektörleri kapsar12.

LNP'nin farklı UV emici gruplara sahip olmayan ve bu nedenle UV dedektörlerinde yanıt vermeyen dört bileşeninin analiz edilmesi durumunda, genel amaçlı dedektörlerin kullanımı düşünülmüştür. RID böyle bir seçenek olmasına rağmen, gradyan analizi için uygun değildir ve diğer iki genel amaçlı dedektöre kıyasla nispeten daha düşük hassasiyet sunar; bu nedenle,12 seçilmedi. Ayrıca, CAD dedektörleri yüksek hassasiyete sahip olsa da, engelleyici maliyetleri onları daha az çekici hale getirir12.

Sonuç olarak, ELSD dedektörü seçildi. Bu dedektör, hem yüksek konsantrasyonlu hem de eser bileşenlerin aynı anda analiz edilmesini sağlayan, hassasiyeti artıran ve doğrusal aralığı genişleten ayırt edici bir kazanç modu seçeneğine ('geniş' mod) sahiptir.

Bu makale, kromatografik kolonların optimizasyonu, mobil fazların gradyan elüsyonu ve diğer koşullar yoluyla LNP'nin dört bileşeninin verimli bir şekilde ayrılmasını ve kantitatif analizini sağlayan ELSD ile birleştirilmiş bir HPLC sistemi kullanır13.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Enstrümanın hazırlanması

  1. Enstrüman kurulumu
    1. Bir ELSD ile birleştirilmiş bir HPLC sistemi kurun.
  2. Sütun kurulumu
    1. Kromatografik sütunu (C4-300; 150 mm × 4.6 mm İç Çap, 5 μm), sütun üzerindeki ok yönünü izleyerek, bir ucu otomatik numune alma cihazı çıkışına ve diğer ucu ELSD girişine bağlı olacak şekilde takın.
  3. Mobil faz hazırlığı
    1. Mobil fazları hazırlayın: A fazı, 10 mM TEAA sulu çözeltisi (pH = 7.0) ve B fazı, 10 mM TEAA metanol çözeltisi (pH = 7.0).
    2. A fazını hazırlamak için 1.01 g trietilamin doğru bir şekilde tartın, 1000 mL suda çözün, iyice karıştırın ve asetik asit ile pH'ı 7.0'a ayarlayın.
    3. B fazını hazırlamak için 1.01 g trietilamini 1000 mL metanol içinde çözün, karıştırın ve pH'ı asetik asit ile 7.0'a ayarlayın.
  4. Yöntem düzenleme
    1. LC-ELSD'nin her modülü için güç anahtarlarını açın ve LabSolutions yazılımını başlatın. Ardından, Gerçek Zamanlı Analiz penceresini açın.
    2. Dosya'ya tıklayın ve yeni bir yöntem dosyası oluşturmak için Yeni'yi seçin. Yöntemdeki LC Durdurma Süresi'ni 15 olarak değiştirin ve Tüm Alım Süresine Uygula'ya tıklayın.
    3. Ardından, pompa parametrelerini değiştirmek için Pompa'ya tıklayın. Analiz modunu İkili Yüksek Basınç Gradyanı (B.GE) olarak seçin ve akış hızını 1.0 mL/dk olarak ayarlayın.
    4. Ardından, ilk Pompa B Konsantrasyonunu (%B) %80'e ayarlayın ve mobil faz gradyanını değiştirin: 3 dakikada, %B %80, 4 dakikada, %B %85'tir, 5,5 dakikadan 12 dakikaya, %B %100'dür, 12,1 dakikada, %B %80'e döner.
    5. Ardından, Sütun Fırın'a tıklayın ve fırın sıcaklığını 55 °C'ye ayarlayın. Son olarak, sürüklenme tüpü sıcaklığını 40 °C'ye değiştirmek için ELSD'ye tıklayın. Yöntemi kaydedin.
      NOT: Parametrelerin özeti Tablo 1'de gösterilmiştir.
  5. Enstrümanı başlatın ve dengeleyin.
    1. Enstrümanı başlatmak ve dengelemek için İndir ve Başlat'a tıklayın.

2. Standart çözelti ve numunelerin hazırlanması

  1. Standart çözeltilerin hazırlanması
    1. Dört LNP bileşeni standart maddesinin 10.0 mg'ını ayrı ayrı hassas bir şekilde tartın, 1 mL metanol içinde çözün ve her bileşen için 10 mg / mL konsantrasyonda stok çözeltileri elde etmek için tamamen çözünene kadar vorteksleyin.
    2. Bir pipet kullanarak, dört stok çözeltisinin her birinden 100 μL'yi bir numune şişesine doğru bir şekilde aktarın, ardından 600 μL metanol ekleyin. 1000 μg/mL konsantrasyonda karışık bir ara çözelti 1 hazırlamak için iyice karıştırın.
    3. Dört stok çözeltisinin her birinden 20 μL'yi bir numune şişesine doğru bir şekilde aktarın, ardından 920 μL metanol ekleyin. 200 μg/mL konsantrasyonda karışık bir ara çözelti 2 hazırlamak için iyice karıştırın.
    4. Daha sonra, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL ve 250 μg/mL konsantrasyonlarda bir dizi standart çözelti hazırlayın Tablo 2'ye göre seri seyreltme ile.
  2. Numune hazırlama
    1. Bir pipet kullanarak, 100 μL numuneyi bir numune şişesine doğru bir şekilde aktarın, ardından 900 μL metanol ekleyin ve iyice karıştırın. Bu noktada, numunedeki LNP konsantrasyonunun 10 kat seyreltildiğinden ve LNP'nin nükleik asit ilacından ayrıldığından emin olun.

3. Veri toplama

  1. Standart çözeltileri ve numune çözeltilerini sıvı kromatografın otomatik numune alma cihazına yerleştirin.
  2. Gerçek Zamanlı Analiz penceresinin yardımcı araç çubuğunda Gerçek Zamanlı Toplu İşlem'e tıklayın. Ardından, yeni bir toplu iş tablosu oluşturmak için Dosya menüsünde Yeni'ye tıklayın.
  3. Toplu iş tablosunda, Şişe #, Tepsi Adı, Veri dosyası ve standart ve örnek çözümlerin enjeksiyon hacmini girin ve adım 1.4'te kaydedilen yöntem dosyasını seçin. Toplu iş dosyasını kaydetmek için Dosya menüsünde Toplu İş Dosyasını Kaydet'e tıklayın.
  4. Sıvı kromatograf basıncı ve kromatogramın taban çizgisi stabil olana kadar bekleyin. Ardından, veri toplamayı başlatmak için asistan araç çubuğundaki Gerçek Zamanlı Toplu İşlemi Başlat'a tıklayın.

4. Veri analizi

  1. Kalibrasyon eğrileri oluşturun
    1. LabSolutions yazılımının Tarayıcı Penceresini açın ve bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için standart çözelti verilerini Kantitatif Sonuçlar Görünümüne sürükleyin. Ardından, veri işleme parametrelerini değiştirin. Yöntem görünümünde Düzenle'ye tıklayın.
    2. Tümleştirme Parametreleri penceresinde eğim değerini 10000 olarak değiştirin. Ardından, Tanımlama Parametrelerinde, tanımlama yöntemini Bant olarak değiştirin ve Varsayılan Bant Genişliğini 0,1 dakika olarak ayarlayın.
    3. Bundan sonra, Kantitatif parametreleri değiştirin. Kantitatif Yöntem'i Dış Standart olarak değiştirin ve Kalibrasyon Düzeyi'nin # değerini 7 olarak ayarlayın. Kalibrasyon eğrisi türünü Üstel olarak seçin. Ardından, Bileşiği değiştirin.
    4. Dört LNP bileşeninin adlarını ve standart çözelti konsantrasyonlarını girin. Tutma sürelerini güncellemek için tepe noktasına çift tıklayın. Son olarak, veri işleme parametrelerinin değiştirilmesini tamamlamak için Görüntüle'ye tıklayın.
    5. Nicel sonuçlar görünümündeki örnek türünü Standart (Calc. Point) olarak değiştirin. Konsantrasyonlara göre, standart çözeltinin seviyelerini 1-7 arasında ayarlayın. Kalibrasyon eğrileri oluşturulduktan sonra, menü çubuğunda Dosya'ya tıklayın ve yöntem dosyasını kaydedin.
  2. Numunelerin kantitatif analizi
    1. Numunelerin verilerini, numunelerdeki dört LNP bileşeninin konsantrasyon sonuçlarını görüntüleyecek olan tarayıcı penceresinin Kantitatif Sonuçlar Görünümü'ne sürükleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem kullanılarak LNP standart çözeltisinin analizi, dört bileşen için 1.5'ten daha büyük bir ayırma derecesi elde etti ve temel ayırmayı gerçekleştirdi. Ayrıca, Şekil 1'de gösterildiği gibi yüksek konsantrasyonlu standart çözeltilerde hiçbir kalıntı gözlenmemiştir. 5 ila 250 μg/mL'lik bir konsantrasyon aralığında bir kalibrasyon eğrisi oluşturuldu ve tümü 0,999'u aşan korelasyon katsayıları sergileyerek geniş bir doğrusal aralığı ve mükemmel doğrusallığı gösterdi. Kalibrasyon eğrisi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LNP'nin dört bileşeninin tümü nispeten zayıf bir polarite sergiler. Bir C18 kolonu kullanılarak analiz edildiğinde, hedef bileşikler kolon içinde güçlü bir tutma gösterir ve bu da güçlü bir şekilde tutulan bileşenler için fosfolipid zirvesinin genişlemesine yol açar. Ayrıca, yüksek konsantrasyonlu çözeltiler analiz edildikten sonra, C18 kolonunun başında kalıntılar birikir ve bu da miktar tayininin doğruluğunu tehlikeye atabilir. Kromatogram Şekil 5'te göste...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deney için LNP örneklerini sağladıkları için biyofarmasötik şirketlerine teşekkür ederiz ve kromatografi sütununu sağladığı için Shimadzu (Şangay) Global Laboratory Consumables Co., Ltd'ye teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik asitANPEL Laboratuvar Teknolojileri (Şangay) A.Ş.CAEQ-4-000319-0050
DengeShimadzu (Şangay) Global Laboratuvar Sarf Malzemeleri Co., LtdAP135W
SütunShimadzu (Şangay) Global Laboratuvar Sarf Malzemeleri Co., LtdShimNex WP C4 (380-01235-74)
ELSDShimadzu (Çin) CO., LTDELSD-LT III (228-65900-46)
LabSolutions YazılımıShimadzu (Çin) CO., LTD
LCShimadzu (Çin) CO., LTDLC40D XR
MetanolANPEL Laboratuvar Teknolojileri (Şangay) A.Ş.CAEQ-4-003302-4000
Pipet-100 ve mikro; LShimadzu (Şangay) Global Laboratuvar Sarf Malzemeleri Co, Ltd00-NAR-100
Pipet-1000 ve mikro; LShimadzu (Şangay) Küresel Laboratuvar Sarf Malzemeleri Co, Ltd00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratuvar Teknolojileri (Şangay) Inc.CAEQ-4-012190-0250
Ultra Saf Su SistemiMilliporeZIQ7000T0C
Vorteks KarıştırıcıANPEL Laboratuvar Teknolojileri (Şangay) A.Ş.VM-B
Teknolojisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
  9. Kamanzi, A., et al. Quantitative visualization of lipid nanoparticle fusion as a function of formulation and process parameters. ACS Nano. 18 (28), 18191-18201 (2024).
  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
  13. Zhang, L. Z., et al. Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).
  14. Zhang, Y., Wang, X. Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis. Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lipid Nanopar ac klarLNP Bile en AnaliziGradyan El syonBaz izgisi Ayr mY ksek Performansl S v KromatografisiKalibrasyon E risiD Standart Y ntemi

İlgili makaleler