Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Adeno ilişkili virüs vektörlerinin yavaş retrograd renal pelvis enjeksiyonu yoluyla fare böbreğine etkili ve güvenli gen iletimi

2.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67716

⸱

1 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

Bu makalede

Özet

Bu rapor, fare böbreğine etkili ve güvenli gen transferi için renal pelvis yoluyla AAV vektörlerinin lokalize enjeksiyon yöntemini detaylandırmaktadır.

Özet

Böbreğe gen iletimi için etkili in vivo araçların ve yöntemlerin geliştirilmesi, temel böbrek araştırmalarını ve böbrek hastalıkları için gen tedavisini ilerletmek için çok önemlidir. Ek olarak, gelişmiş genetik testlerle yönlendirilen monogenik böbrek hastalıkları konusunda artan farkındalık, gen terapisinin tedavisi zor genetik böbrek hastalıklarını tedavi etme ve hatta iyileştirme potansiyelinin altını çizmektedir. Bu bağlamda, adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörleri, in vivo gen iletimi için sağlam bir platform olarak artan ilgi görmüştür; bununla birlikte, böbrekteki terapötik olarak ilgili her hücre tipine AAV vektör aracılı gen iletimi için en etkili ve en güvenli yöntem henüz tam olarak belirlenmemiştir. Burada, AAV vektörlerinin yavaş retrograd renal pelvis (RP) enjeksiyonu yöntemi detaylandırılmıştır ve uygun şekilde seçilmiş AAV kapsidleri ile kullanıldığında fare böbreklerini dönüştürme potansiyelinin yüksek olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bu yöntemin sadece standart sezyum klorür ultrasantrifüj ile saflaştırılmış AAV (CsCl AAV) vektörleri ile değil, aynı zamanda özel AAV vektör uzmanlığı gerektirmeyen teknikler kullanılarak hızlı ve basit bir şekilde hazırlanabilen santrifüj olarak ultra filtrelenmiş AAV (CU AAV) vektör mini hazırlıkları ile de etkili olduğu gösterilmiştir. Örnek olarak, bu çalışma, hem CsCl hem de CU AAV-KP3 vektörlerinin yavaş RP enjeksiyonunun, kaçınılmaz olarak doku hasarına yol açan daha önce bildirilen hidrodinamik yaklaşımların aksine, fare böbreğinde belirgin doku hasarı olmaksızın proksimal tübüllerin sağlam bir şekilde transdüksiyonu ile sonuçlandığını göstermektedir. Bu nedenle, bu çalışma, seçilmiş AAV kapsid türevi vektörlerin yavaş retrograd RP enjeksiyonunun böbreğe gen iletimi için etkili ve güvenli bir yöntem olduğunu vurgulamaktadır. Bu yöntem, gen tedavisi çalışmaları da dahil olmak üzere geniş bir böbrek araştırması yelpazesine uygulanabilir olacaktır. CU AAV vektör mini hazırlıklarının kullanılması, verimi önemli ölçüde artıracak ve ön veriler oluşturmak ve önemli içgörüler elde etmek için gereken zaman ve maliyet verimliliğini artıracaktır.

Giriş

Küçük ve büyük deney hayvanlarında böbreğe gen iletimi için etkili ve güvenli yöntemler, temel böbrek araştırmalarını ilerletmek ve yenilikçi terapötik yaklaşımları keşfetmek için çok önemli fırsatlar sunmaktadır. Bu tür yöntemlerin oluşturulması, özellikle çeşitli böbrek hastalıkları için gen terapisi ile ilgilidir. Klinik genetik testlerdeki son gelişmeler, kronik böbrek hastalığı (KBH) olan hastaların yaklaşık %30'unu etkileyen, daha önce tahmin edilenden daha yüksek bir monogenik böbrek bozukluğu prevalansı ortaya çıkarmıştır1. KBH, ilerleyici böbrek hasarı ile karakterizedir ve sonuçta gerçekten etkili hastalık modifiye edici tedaviler olmaksızın böbrek yetmezliğine yol açar. Hemodiyaliz ve böbrek nakli şu anda mevcut tedavilerdir; bununla birlikte, KBH2'li hastalar için yaşam kalitesini önemli ölçüde bozan sınırlamaları vardır. Bu nedenle, genetik hastalıkların tedavisinde klinik olarak kanıtlanmış güçlü bir yaklaşım olan gen terapisi, son yıllarda KBH'ye yol açan genetik böbrek hastalıklarının etkili tedavisi için yeni bir yol olarak büyük ilgi görmüştür 3,4,5,6. Bu yaklaşım, hastalıkların temel nedenlerini doğrudan ele alabilir ve potansiyel olarak bir tedavi sunabilir.

Alandaki sürekli ilerlemelere rağmen, böbreğe gen iletimi hem araştırma hem de terapötik ortamlarda önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir. Organın karmaşık yapısı ve glomerüler endotel hücreleri, glomerüler bazal membran ve podosit ayak süreçlerinden oluşan glomerüler filtrasyon bariyeri dahil olmak üzere benzersiz fizyolojik engeller nedeniyle böbrek hücrelerini terapötik genlerle verimli bir şekilde hedeflemek zordur. Doğrudan renal korteks (RC) enjeksiyonu 7,8, renal arter (RA) enjeksiyonu 9,10,11, renal ven (RV) enjeksiyonu 12,13,14, renal pelvis (RP) enjeksiyonu 15,16,17,18,19,20 dahil olmak üzere böbrek hedefli gen iletimi için çeşitli stratejiler araştırılmıştır,21,22,23,24,25 ve intravenöz (IV) enjeksiyon 19,26,27,28,29,30 viral veya viral olmayan gen iletim vektörlerinin yanı sıra ultrason ve mikrokabarcık aracılı nükleik asit iletimi 31,32. Bu yaklaşımlar, genellikle uzlaştırılması zor olan tutarsız sonuçlar veren değişken iletim verimlilikleri veya fonksiyonel sonuçlar göstermiştir (referans 3,33,34,35'te gözden geçirilmiştir). Böbreğe gen iletimi hala az gelişmiştir ve vektör sistemleri ile metodolojiler arasında doğrudan karşılaştırmalar yapmayı zorlaştırmaktadır. Bununla birlikte, yüksek konsantrasyonlu ajanların doğrudan böbreğe uygulanmasını kolaylaştıran lokalize uygulama yöntemleri, genellikle sistemik IV uygulamadan daha iyi sonuçlar elde etmiştir. Ek olarak, adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörleri, sağlam güvenlik profilleri ve kanıtlanmış klinik çeviri geçmişleri36,37 ile en çok çalışılanlar olmuştur ve renal gen transferi için önde gelen seçenek olarak kabul edilmektedir.

Yaygın AAV serotipleri ve tasarlanmış kapsidler, farelerde IV enjeksiyonu takiben böbrekteki mezanjiyal ve mezenkimal hücrelerin etkili transdüksiyonunu göstermiştir 28,30,38. Özellikle, son çalışmalar, AAV9'un IV uygulamasının, nefrotik sendrom ve Alport sendromunun fare modellerinde podositleri etkili bir şekilde transdüksiyon yapabileceğini göstermiştir, ancak bu etki sağlıklı böbrektegözlenmemiştir 38,39 ve tasarlanmış bir AAV2 kapsidinin IV uygulaması, farelerde hem sağlıklı hem de iltihaplı böbreklerde yalnızca glomerüler endotel hücrelerini hedefleyebilir40. Tarihsel olarak, renal tübüllerin IV yolu ile transdüksiyonu zor olmuştur. Bununla birlikte, yakın zamanda, AAV-KP141 gibi seçilmiş AAV kapsidlerinin RP enjeksiyonunun, proksimal tübüllerin, kıyaslama AAV9 kapsid38 ile elde edilenlerden daha yüksek bir büyüklük sırasından daha yüksek seviyelerde transdüksiyonunu sağlayabildiği keşfedilmiştir. Daha fazla iyileştirmeye ihtiyaç duyulmasına rağmen, bu gelişmeler temel böbrek araştırmaları ve gen tedavisi için yeni yollar açmakta ve daha önce ulaşılamayan fırsatlar sunmaktadır.

Bu makalede, AAV vektörlerinin yavaş retrograd RP enjeksiyonu, fare böbreğine gen iletimi için etkili ve güvenli bir yöntem olarak detaylandırılmıştır38. Bu tekniğin temsili bir örneği olarak, AAV-KP3, farelerde RP enjeksiyonunu takiben AAV9'a kıyasla gelişmiş böbrek transdüksiyonu gösteren altı kapsidden biri (yani AAV-KP1, AAV-KP2, AAV-KP341, AAV-DJ42, AAV2G943 ve AAV2.7m844) olduğu keşfine dayanarak örnek bir kapsid olarak seçilmiştir38. Özellikle, yavaş retrograd RP enjekte edilen böbrek dokuları, daha önce bildirilen hidrodinamik yaklaşımlarla tedavi edilenlerin aksine belirgin bir doku hasarı göstermedi23,24. Ayrıca, hızlı ve basit santrifüjlü ultrafiltrasyon ile kabaca saflaştırılan AAV miniprep vektörleri45 (yani, CU AAV vektörleri), standart sezyum klorür (CsCl) gradyan ultrasantrifüjleme (yani, CsCl AAV vektörleri) ile saflaştırılan AAV vektör preparatları ile elde edilenlerin yaklaşık% 70'i böbrek transdüksiyon seviyelerine ulaştı. Bu nedenle, burada sunulan yöntem ve gözlemler, farelerde ve potansiyel olarak daha büyük hayvanlarda böbreğe gen iletimini geliştirmek isteyen araştırmacılar için değerli ve pratik bir kaynak sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'ndeki (OHSU) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve OHSU'daki hayvan bakımı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada sekiz haftalık C57BL/6J erkek fareler kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Adenovirüs içermeyen plazmit transfeksiyonu ile AAV vektör üretimi

  1. Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)-yüksek glikozunda (4.5 g/L) insan embriyonik böbreğinin (HEK) 293 hücresinin% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 Penisilin ve Streptomisin Karışımı ve% 1 mM L-glutamin ile% 5 karbondioksit (CO2) içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde.
  2. -2. günde (transfeksiyondan 48 saat önce), adım 1.1'de tarif edildiği gibi kültür ortamının 40 mL'sinde T225 şişesi başına 4 x 106 HEK 293 hücre plakası. Bu, 0. günde ~%95 izdihama ulaşır.
    NOT: Kültür ölçeği uygulamaya göre ayarlanabilir. Bir AAV mini hazırlığı için (adım 2), saflaştırma işleminin tipik olarak yaklaşık %50'lik bir malzeme kaybıyla sonuçlandığını göz önünde bulundurarak, hedef titre ve vektör konsantrasyonuna dayalı olarak uygun sayıda şişe hazırlayın. 50 μL'lik bir vektör çözeltisinde 3 x 1011 vg / fare dozunda farelerde RP enjeksiyonu için >6 x10 12 vg / mL AAV9 ve AAV-KP3 vektörleri elde etmek için en az 2 şişe önerilir. CsCl yoğunluk gradyanı saflaştırılmış AAV vektörleri (CsCl AAV'ler) gibi daha büyük ölçekli AAV vektör üretimi için tipik olarak 25 veya daha fazla şişe kullanılır.
  3. 0. Gün: Plazmid DNA transfeksiyonu
    1. Transfeksiyon için hazırlık
      1. Hücrelerin ~% 95 birleşme noktasına ulaştığından emin olun.
      2. % 1 Penisilin ve Streptomisin Karışımı ve 1 mM L-glutamin ile desteklenmiş, ancak FBS (yani serumsuz ortam) olmadan DMEM'i 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
      3. Doğrusal polietilenimin (PEI) çözeltisinin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
    2. Plazmid DNA karışımının hazırlanması
      1. Plazmitleri (her biri 15 μg pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap ve pHelper) steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde CaCl2 veya MgCl2 içermeyen 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde karıştırın. Toplam DNA miktarı 45 μg/şişedir.
        NOT: Plazmid DNA çözelti hacimleri, minimum olmaları durumunda göz ardı edilebilir. Bununla birlikte, toplam çözelti hacmi ≥225 μL ise hacim ayarlaması önerilir. Bu çalışmada kullanılan plazmitlerin dizileri Ek Dosya 1'de mevcuttur.
    3. PEI transfeksiyonu
      1. 1 mL PBS'ye 90 μL PEI çözeltisi (1 mg / mL) ekleyin ve 50 mL'lik bir polipropilen tüpte PBS-plazmid DNA karışımı (yukarıdaki gibi hazırlanır) ile karıştırın. Nihai hacim yaklaşık 2 mL'dir (kültür ortamının %5 hacmi).
      2. Tüpleri 5 saniye boyunca vorteksleyin ve sıvıyı tüplerin dibine toplamak için tüpleri bir santrifüj ile kısa bir süre döndürün.
    4. Plazmid DNA-PEI kompleksleri oluşturmak için oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.
    5. 15 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, adım 1.3.1.2'de hazırlanan 40 mL önceden ısıtılmış serumsuz ortamı plazmit DNA-PEI komplekslerine ekleyin. Hacim yaklaşık 42 mL'dir.
    6. T225 şişesinin kültür ortamını, adım 1.3.4'te açıklanan serumsuz ortam içeren plazmid DNA-PEI kompleksleri ile değiştirin.
    7. Hücreleri bu transfeksiyon ortamındaki 5. gündeki hasada kadar koruyun (ortam değişikliği gerekmez).
    8. 2. Günde, plazmit transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında floresan proteinleri (örneğin, pAAV-CAG-tdTomato) eksprese eden plazmit ile transfekte edilmiş hücreleri gözlemleyin.
      NOT: Yukarıda açıklanan koşullar tipik olarak %70'i aşan transfeksiyon verimliliklerine neden olur. Bazı morfolojik değişiklikler (ör., hücre uzaması), muhtemelen serumsuz ortam nedeniyle gözlenebilir.
    9. 3. ila 5. günlerde, transfekte edilmiş hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatörde% 5 CO2 ile kültürlemeye devam edin.
    10. 5. Günde, hem hücreleri hem de virüs içeren ortamı 50 mL'lik bir polipropilen tüpe toplayın.
    11. Numuneleri kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

2. AAV vektörlerinin santrifüjlü ultrafiltrasyon (CU) saflaştırılması (AAV miniprep)

  1. Dondurulmuş numuneyi adım 1.3.11'den itibaren 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün.
  2. DNA nokta leke tahlili için 1 mL ham lizatı bir kenara bırakın (Fraksiyon 1 olarak kullanılır).
  3. 80 μL 1M magnezyum klorür (MgCl2, son konsantrasyon 2 mM), 160 μL 0.1M sodyum hidroksit (NaOH, son konsantrasyon 0.4 mM) ve 16 μL Serratia marcescens endonükleaz (son konsantrasyon 100 birim / mL) 50 mL'lik bir tüpe. 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Kuluçka sırasında numuneyi her 15 dakikada bir vorteksleyin.
  4. Serratia marcescens endonükleaz ile muamele edilmiş numuneyi 250 mL'lik bir santrifüj şişesine toplayın ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de 10.000 x g'da santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı 50 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 50 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.
  6. 0,45 μm PVDF şırınga filtresi kullanarak kalıntıları gidermek için süpernatanı filtreleyin. DNA nokta leke tahlili için 1 mL 0.45 μm filtrelenmiş numuneyi bir kenara bırakın (Fraksiyon 2 olarak kullanılır).
  7. 100 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) santrifüjlü ultrafiltrasyon tüpüne 10 mL moleküler dereceli su ekleyin ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de 2.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı çıkarın.
  8. Santrifüj ultrafiltrasyon tüpüne PBS'de 15 mL %5 sorbitol ekleyin ve 10 dakika boyunca 4 ° C'de 2.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı çıkarın.
  9. Adım 2.6'da açıklandığı gibi 15 mL'ye kadar 0.45 μm filtrelenmiş numune ekleyin ve yaklaşık 500 μL'lik hedef hacim elde edilene kadar konsantrasyon için 15 dakika boyunca 4 ° C'de 2.000 x g'de santrifüjleyin. DNA nokta leke testi için 1 mL akışı bir kenara bırakın (Fraksiyon 3 olarak kullanılır).
    NOT: Her santrifüjlemeden önce, konsantrasyon gradyanını bozmak için retentatı bir pipetle yeniden askıya alın. Pipet ucuyla membrana dokunmayın. 15 dakikalık santrifüjlemeden sonra hedef hacme ulaşılmazsa, süreyi tüpte kalan hacme göre ayarlayarak santrifüjlemeyi gerektiği gibi uzatın.
  10. Tüm numune filtrelenene ve yaklaşık 500 μL'lik hedef hacme ulaşana kadar adım 2.9'u tekrarlayın. DNA nokta leke tahlili için (Fraksiyon 4 ve Fraksiyon 5 olarak kullanılır) adım 2.10'un birinci ve ikinci yinelemelerinden 1 mL akış tutun.
    NOT: İki veya daha fazla şişeden elde edilen numuneleri işlemek için tek bir santrifüjlü ultrafiltrasyon tüpü kullanılabilir.
  11. PBS'ye 15 mL %5 sorbitol ekleyin ve yaklaşık 500 μL'lik hedef hacme ulaşılana kadar 15 dakika boyunca 4°C'de 2.000 x g'da santrifüjleyin. DNA nokta leke tahlili için 1 mL akış kenara bırakın (Fraksiyon 6 olarak kullanılır).
  12. Adım 2.11'i tekrarlayın (Kesir 7 olarak kullanılır).
    NOT: Aşağı akış deneyleri için daha yüksek AAV titreleri gerekiyorsa, nihai hedef hacim 150 μL'ye daha da düşürülebilir.
  13. Ultra filtrelenmiş AAV vektörünü O-ringli 2 mL'lik vidalı kapaklı bir tüpe aktarın. DNA nokta leke tahlili için 10 μL ultra filtrelenmiş AAV vektörünü bir kenara bırakın (Fraksiyon 8 olarak kullanılır).
  14. Daha önce tarif edildiği gibi DNA nokta leke tahlili ile AAV titrelerini belirleyin46.
    NOT: CU ile saflaştırılmış vektörler (CU AAV), CsCl ile saflaştırılmış vektörlere (CsCl AAV) kıyasla daha yüksek seviyelerde boş kapsid kontaminasyonu ve konak hücre kaynaklı safsızlıklar içerir. Bu faktörler, transdüksiyon verimliliğini ve bağışıklık tepkilerini etkileyebilir ve veri yorumlamada dikkatli bir değerlendirme gerektirir.

3. AAV vektörlerinin CsCl yoğunluk gradyanı saflaştırılması

  1. Dondurulmuş numuneyi adım 1.3.11'den itibaren 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün.
  2. Hücre kalıntılarını gidermek için 30 dakika boyunca 4 ° C'de 10.000 x g'da santrifüjleyin.
  3. Polietilen Glikol 8000 (PEG, %8 nihai konsantrasyon) ve sodyum klorür (500 mM nihai konsantrasyon) ekleyerek süpernatanı toplayın ve süpernatanttaki AAV vektörlerini çökeltin.
  4. 3 saat buz üzerinde inkübe edin.
  5. AAV içeren peletleri elde etmek için 30 dakika boyunca 4 ° C'de 10.000 x g'da santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı çıkarın ve peletleri 10 ml Sarkosyl içeren yeniden süspansiyon tamponu (50 mM HEPES, 150 mM NaCl,% 1 Sarkosil, pH 8.0) ile yeniden süspanse edin.
  7. Pelet süspansiyonunu 15 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın ve gece boyunca 4 °C'de tutun.
  8. Ertesi gün, pelet süspansiyonunu Serratia marcescens endonükleaz (200 birim / mL nihai konsantrasyon) ve MgCl2 (2 mM nihai konsantrasyon) ile muamele edin.
  9. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
  10. 30 dakika boyunca 4 ° C'de 10.000 x g'da santrifüjleyin.
  11. Süpernatanı toplayın ve sezyum klorür (CsCl, kırılma indisinin nihai konsantrasyonu (RI) = 1.3710 +/- 0.0005) ve EDTA (20 mM'lik nihai konsantrasyon) ekleyin.
  12. Numuneyi 29.9 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpüne yükleyin ve dolana kadar tepesi solüsyonu (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, CsCl (RI = 1.3710 +/- 0.0005), pH 8.0) ekleyin.
  13. 22 saat boyunca 12 ° C'de 41.000 x g'da santrifüjleyin.
  14. Her biri 2 mL'lik toplam 15 fraksiyon toplamak için ultrasantrifüj tüpünün altına ve yanına delikler açın.
  15. RI'yi kontrol etmek ve DNA nokta leke tahlilini46 gerçekleştirmek için her fraksiyondan 10 μL kullanın.
  16. RI ve DNA nokta leke tahlili sonuçlarına dayanarak, AAV vektörlerini içeren en iyi 5 fraksiyonu belirleyin.
  17. En iyi 5 fraksiyonu birleştirin (toplam yaklaşık 10 mL) ve RI'yi 1.3710 +/- 0.0005'e ayarlayın.
  18. Numuneyi 11.2 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpüne yükleyin ve dolana kadar tepeleme solüsyonunu ekleyin.
  19. 12 saat boyunca 12 ° C'de 65.000 x g'da santrifüjleyin.
  20. Her biri 0,5 mL'lik toplam 18 fraksiyon toplamak için 11,2 mL ultrasantrifüj tüpünün altına ve yanına delikler açın.
  21. RI'yi kontrol etmek ve DNA nokta leke tahlilini46 gerçekleştirmek için her fraksiyondan 10 μL kullanın.
  22. RI ve DNA nokta leke tahlili sonuçlarına dayanarak, AAV vektörlerini içeren en iyi 6 fraksiyonu belirleyin.
  23. En iyi 6 fraksiyonu (toplamda yaklaşık 3 mL) birleştirin ve bunları bir diyaliz kasetine yükleyin.
  24. CsCl'yi çıkarmak için diyaliz kasetini 1,3 L diyaliz tamponunda (%0,001 iyonik olmayan yüzey aktif madde ile desteklenmiş PBS tamponu) 2 saat boyunca bir karıştırma çubuğu ile yüzdürün.
  25. Adım 3.24'ü iki kez tekrarlayın (toplam 6 saat diyaliz).
  26. Kaseti, tampon değişimi için 2 saat boyunca% 0.001 yüzey aktif madde ile desteklenmiş PBS tamponunda 500 mL% 5 sorbitol'e aktarın.
  27. Diyaliz kasetinden numuneyi bir şırınga ile toplayın ve toplanan numuneyi 0.22 μm PVDF şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.
  28. Kantitatif bir nokta leke testi ile belirlenen AAV titreleri46.

4. SDS-PAGE ile AAV vektör preparatlarının kalite değerlendirmesi ve ardından gümüş boyama

  1. CsCl AAV vektörleri için 1 x 1010 vg ve CU AAV vektörleri için 1 x 109 ve 1 x10 10 vg vektör preparatlarını, toplam 18 μL'de 6x Laemmli tamponu ile karıştırın (vektör hazırlama: 6x Laemmli = 15:3) ve 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
  2. Isıl işlem görmüş AAV vektör preparatlarını %7,5'lik bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve Tris-glisin-SDS jel çalıştırma tamponu kullanarak numuneleri 20 mA'da elektroforez.
  3. Jeli jel kasetinden çıkarın, ultra saf suyla durulayın ve üreticinin talimatlarına göre gümüş boyama kiti kullanarak lekeleyin.
  4. CsCl AAV vektörleri ile yüklenen jeli geliştirici solüsyonunda 7 dakika inkübe ederken, sinyal doygunluğunu önlemek için CU AAV vektörleri ile yüklü jeli 2 dakika inkübe edin.
    NOT: CU AAV vektör preparatları, CsCl AAV vektörlerine kıyasla daha yüksek seviyelerde protein safsızlıkları içerir. Bu nedenle, CsCl AAV ve CU AAV vektörleri ile yüklenen jeller, jel çalıştırıldıktan sonra ayrıldı ve boyama yönteminin yüksek duyarlılığı nedeniyle sinyal doygunluğunu önlemek için ayrı ayrı gümüş boyandı.

5. CU AAV vektör preparatlarında AAV VP proteinlerinin western blot ile tanımlanması

  1. 1 x 109 vg CU AAV vektör preparatlarını 6x Laemmli tamponu ile toplam 18 μL'de karıştırın (vektör preparatasyonu: 6x Laemmli = 15:3) ve 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
  2. Isıl işlem görmüş AAV vektör preparatlarını %7,5'lik bir SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve Tris-glisin-SDS jel çalıştırma tamponu kullanarak numuneleri 20 mA'da elektroforez.
  3. Jeldeki proteinleri, yarı kuru bir transfer sistemi kullanarak metanol içinde aktive edilmiş bir poliviniliden diflorür (PVDF) membranına elektrotransfer edin.
  4. Membranı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca Tween 20 (TBST) ile 1x Tris tamponlu tuzlu su içinde %5 yağsız sütle bloke edin.
  5. Tıkalı membranı birincil antikor çözeltisi (tavşan poliklonal anti-VP antikoru, 1x TBST'de %5 yağsız süt ile 1:1000'e seyreltilmiş) ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  6. Membranı 1x TBST ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  7. Membranı ikincil antikor çözeltisi (yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG antikoru, 1x TBST'de% 5 yağsız süt ile 1: 5000'e seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  8. Membranı 1x TBST ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  9. Bir western blot görüntüleme sistemi kullanarak zar üzerindeki sinyalleri görselleştirin.

6. Renal pelvis (RP) enjeksiyonu

  1. Ameliyat öncesi kurulum ve anestezi
    1. Her farenin vücut ağırlığını plastik bir beherde 0,1 g'a kadar hassas bir ağırlık ölçeğinde ölçün.
    2. Cerrahi öncesi analjezi sağlamak için vücut ağırlığına göre deri altına meloksikam (5 mg / kg) uygulayın.
    3. AAV vektör çözeltisini PBS'de %5 sorbitol ile 6.0 x10 12 vg/mL konsantrasyona seyreltin ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Gaz geçirmez bir cam şırınga ve bir PE-10 polietilen tüpteki ölü boşluğu hesaba katmak için toplam enjeksiyon hacminden (50 μL x enjekte edilecek fare sayısı) 40 μL daha fazla AAV çözeltisi hazırlayın.
    4. Bir iğne tutucu kullanarak 30 G'lik bir iğneden sadece iğne ucunu bükün ve kırın.
    5. Stereomikroskop altında, 30 G iğne ucunu, 15 cm PE-10 tüpünü, 30 G iğneyi ve gaz geçirmez bir cam şırıngayı uçtan bu sırayla bağlayın (Şekil 1D).
    6. Bağlı gaz geçirmez cam şırıngayı bir infüzyon şırınga pompasına yerleştirin.
    7. Adım 6.1.3'te hazırlanan 90 μL AAV vektör solüsyonunu bir infüzyon şırınga pompası kullanarak gaz geçirmez cam şırıngaya aspire edin.
    8. Şırınga pompasının infüzyon modunu aşağıdaki gibi ayarlayın: 50 μL'lik hedef hacim ve 50 μL/dk'lık bir akış hızı.
    9. Bir fareyi, tamamen anestezi uygulanana kadar 1,5 ila 3,0 L/dk akış hızında %100 oksijen ile verilen %4 izofluran ile doldurulmuş plastik bir odaya yerleştirin.
    10. Farenin burnunu %1.5 ila %3.0 izofluran akışı olan bir burun konisine yerleştirin. Cerrahi prosedür boyunca ayak parmağını kıstırma refleksi ile anestezi derinliğini izleyin.
    11. Kornea kurumasını önlemek için pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak gözleri oftalmik merhem ile kapatın.
    12. Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak tüy dökücü bir tüy dökücü ile farenin sol arka tarafındaki tüyü çıkarın.
      NOT: Cilt tahrişini önlemek için tüy dökücü krem durulama yoluyla tamamen çıkarılmalıdır.
    13. Vücut ısısını 37 °C'de tutmak için fareyi bir ısı terapisi pompasına bağlı kapalı döngü bir ısı yastığı üzerine yan konuma getirin (yapışkan bantla sabitlemeye gerek yoktur).
    14. Tıraşlı alanı, insizyon bölgesinden başlayarak dairesel hareketlerle pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak üç alternatif povidon-iyot ve% 70 etanol uygulamasıyla dezenfekte edin.
    15. Fareyi steril bir cerrahi örtü ile örtün.
  2. Sol böbreğe RP enjeksiyonu
    1. Doku forsepsleri ile cildi sıkıştırın ve sol böbreğin bulunduğu yerde kostovertebral açı hizasında cerrahi makasla cilt tabakasına yaklaşık 1 cm'lik bir kesi yapın.
    2. Deri kesisi yaptıktan sonra kas tabakasını aynı uzunlukta kesin.
      NOT: Kesi uzunluğu çok kısaysa, böbrek açığa çıkarılamaz ve bunun yerine daha küçük boyutlu olan dalak yanlışlıkla açığa çıkabilir. Öte yandan, kesi uzunluğu çok uzunsa, böbrek insizyonun kendisi tarafından yerinde tutulmayacak ve sürekli olarak kesi yoluyla karın içine geri kayacaktır.
    3. Böbreğin kesi bölgesinden açığa çıkması için böbreğe doğrudan dokunmayacak şekilde parmaklarınızla karın bölgesine hafifçe bastırın (Şekil 1A).
    4. Renal pelvis küçük beyaz bir alan olarak görünecek şekilde çevredeki yağı minimal olarak çıkarın.
    5. Önce üreteri düz tip bir mikro damar klipsi ile klempleyin ve ardından renal arter ve renal veni kavisli tip bir mikro damar klipsi ile birlikte sıkıştırın.
      NOT: Böbrek rengi koyu kırmızıya döner ve böbreğe giren ve çıkan kan akışının başarılı bir şekilde bloke edildiğini doğrular (Şekil 1B).
    6. Şırınga pompasına bağlı 30 G iğneyi kavisli forseps ile pelvik boşluğa yaklaşık 3 mm sokun ve 1 dakika boyunca 50 μL/dk akış hızında bir infüzyon şırınga pompası kullanarak 50 μL AAV vektör çözeltisi enjeksiyonuna başlayın (Şekil 1C).
    7. Enjekte edilen böbreğin AAV vektörüne maruz kalmasını artırmak için iğneyi ve kelepçeyi 5 dakika tutun.
      NOT: Uygun bekleme süresi değişebilir ve AAV kapsidlerine bağlı olabilir. AAV-KP1 veya AAV-KP3 vektörü ile transdüksiyon için 5 dakikalık bir bekleme süresinin yeterli olduğu gösterilmiştir.
    8. 5 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra kelepçeleri çıkarın.
      NOT: Böbrek rengi hemen koyu kırmızıdan kan kırmızısına döner ve böbrekteki kan akışının restorasyonunu doğrular.
    9. Enjeksiyon iğnesini dikkatli ve yavaş bir şekilde geri çekin, aynı anda pamuk uçlu bir aplikatörü enjeksiyon bölgesinin üzerine basınçla yerleştirin. Enjeksiyon bölgesinden kanama olmadığından emin olun. Hemostatik yama uygulamak gerekli değildir.
    10. Böbreği nazikçe periton boşluğuna geri yerleştirin.
    11. Kas tabakasını 6-0 emilebilir sütür ile ve cildi 5-0 monofilament sütür ile dikin.
    12. Sıvı desteği için farelerin arkasına deri altından 1 mL salin uygulayın.
    13. Kullanılmış 30 G iğne ucunu yeni hazırlanmış bir iğne ucuyla değiştirin, kullanılmış 30 G iğneyi kurumun tehlikeli kimyasal atık yönetimi yönergelerine göre atın ve bir sonraki fareye uygulama için bir infüzyon şırınga pompası kullanarak 50 μL AAV vektör solüsyonu yükleyin.
    14. 6.2.12-6.2.13 adımlarını, 6.2.13 adımının gerekli olmadığı sonuncusu dışında, gruptaki tüm fareler için tekrarlayın.
    15. Planlanan tüm enjeksiyonları tamamladıktan sonra, kontamine iğneleri ve polietilen tüpleri kurumun tehlikeli kimyasal atık yönetimi yönergelerine göre atın.
  3. Ameliyat sonrası izleme ve bakım
    1. RP enjeksiyonundan 24 saat ve 48 saat sonra cerrahi sonrası analjezi için farelerin arkasına deri altından meloksikam (5 mg / kg) uygulayın.
    2. RP enjeksiyonundan 24 saat sonra sıvı desteği için farelerin arkasına deri altından 1 mL salin uygulayın.
    3. Ameliyat sonrası 1 hafta boyunca enjekte edilen farelerin vücut ağırlığını ve genel görünümünü günlük olarak izleyin. % 10'luk bir vücut ağırlığı kaybı meydana gelirse, bir hafta boyunca haftada üç kez farelerin arkasına deri altından 1 mL salin uygulayın. Herhangi bir iyileşme gözlenmezse, etkilenen farelere ötenazi yapılır.

7. Doku toplama ve kriyoseksiyon

  1. Fiksasyon ve kriyoproteksiyon çözeltisinin hazırlanması.
    1. 0,2 M fosfat tamponu (toplam 1 L)
      1. 1 L'lik bir cam beherde 800 mL ultra saf su hazırlayın.
      2. Çözeltiye 6.4 g sodyum fosfat monobazik (NaH2PO4) ve 21.8 g sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4) ekleyin.
      3. Hidroklorik asit ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.
      4. 1 L'ye kadar ultra saf su ile doldurun.
      5. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
    2. %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi (toplam 40 mL)
      1. 10 mL %16 PFA, 7.1.1 adımında hazırlanan 20 mL 0.2M fosfat tamponu ve 10 mL ultra saf suyu karıştırın.
      2. 15 mL'lik bir polipropilen tüpe 10 mL'lik bir alikot.
        NOT: Perfüzyon fiksasyonu için kullanmadan hemen önce %4 PFA solüsyonu yapın.
    3. % 30 sükroz çözeltisi (toplam 40 mL).
      1. 30 mL PBS'yi 12 g sükroz ile karıştırın.
      2. Tamamen çözüldükten sonra, PBS ile 40 mL'ye kadar doldurun.
  2. Perfüzyon fiksasyonu ve doku toplama.
    DİKKAT: %4 PFA çözeltisi solunduğunda güçlü bir zararlı kimyasal olduğundan, perfüzyon fiksasyonu çeker ocakta yapılmalıdır.
    1. Fareyi izofluran ile uyuşturun, sırtüstü pozisyona getirin ve ekstremiteleri hafifçe sıkıştırarak yanıt vermenin tamamen yokluğunu onaylayın.
    2. Fare uyuşturulduktan sonra, kaudal karından ksifoide kadar cerrahi makas kullanarak bir kesi yapın. Ardından, sternumun her iki yanında iki yan kesi yapın ve kalbi ve ana damarları ortaya çıkarmak için göğüs duvarını öne doğru geri çekin.
    3. Dolaşım sistemini sıkıştırmak için sağ atriyumu keskin bir diseksiyon ile açın. Sol ventriküle 25 G'lik bir kelebek iğne yerleştirin ve akışı çıkan aorta doğru yönlendirerek yaklaşık 10 mL / dk hızında 50 mL PBS infüze edin.
      NOT: Kanda otofloresan görüldüğünden, yüksek kaliteli immünofloresan (IF) görüntüleri elde etmek için kan kaybı önemlidir. Kanın tamamen çıkarılmasını sağlamak için, bu çalışmada 50 mL PBS kullanılmıştır, ancak yaygın olarak 20-30 mL kullanılmaktadır.
    4. Adım 7.1.2'de hazırlanan 20 mL %4'lük PFA solüsyonunu aynı oranda demleyin ve solüsyonların değiştirilmesi sırasında hava verilmemesini sağlayın.
    5. Dokuları toplayın ve sabitleme sonrası için% 4 PFA çözeltisi ile doldurulmuş 15 mL'lik bir polipropilen tüpte gece boyunca 4 ° C'de tutun. Toplanan dokuda floresan proteini eksprese edildiğinde, tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün.
  3. Kriyo gömme
    1. Dokuyu, kriyoproteksiyon için adım 7.1.3'te hazırlanan% 30 sükroz çözeltisi ile doldurulmuş 15 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.
    2. Dokular tamamen tüplerin dibine çökene kadar 4 °C'de tutun.
    3. Dokuyu standart desen forsepsli plastik bir kriyokalıba aktarın.
    4. Dokunun doğru şekilde yönlendirildiğinden ve kriyokalıbın tabanı ile aynı hizada olduğundan emin olurken OCT bileşiğini dokunun üzerine yerleştirin.
    5. Üstünü OCT bileşiği ile doldurun. Pipet ucuyla baloncukları çıkarın.
    6. Plastik kriyomoldu, OCT bileşiği tamamen donana kadar (OCT bileşiği beyaza dönecektir) bir buz kovasında kırılmış kuru buzla soğutulmuş 2-metilbütan içeren bir kriyojenik banyoya yerleştirin.
    7. Doku bloklarını kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
  4. Kriyoseksiyon
    1. Kesit almadan önce donmuş doku bloklarını -20 °C'de bir kriyostat mikrotomuna aktarın ve donmuş doku bloklarının sıcaklığının dengelenmesini bekleyin.
    2. Her donmuş doku bloğunu kriyostat mikrotomu kullanarak istenen kalınlığa (tipik olarak 5 μm) bölümlere ayırın. İmmünofloresan boyama için doku bölümlerini bir mikroskop cam lam üzerine yerleştirin.
    3. Bölümler daha sonra kullanılmak üzere -80 °C'de saklanabilir.

8. İmmünofloresan boyama

  1. Dondurulmuş slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kurutun.
  2. Bölümü bir sıvı engelleyici kalemle izole edin ve oda sıcaklığında 5 dakika kurutun.
  3. Bölümleri 10 dakika boyunca 150 μL PBS ile rehidre edin.
  4. Slaytları düz bir yüzeye yerleştirin ve slaytların üzerine bölüm başına PBS ile seyreltilmiş 150 μL %1 sığır serum albümini (BSA) ekleyin. Bloke etmek için oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
  5. 150 μL primer antikor çözeltisi ekleyin (anti-Wilms Tümör 1 (WT1) antikoru,% 1 BSA ile 1: 100'e seyreltilmiş; anti-Na-K-2Cl kotransporter 2 (NKCC2) antikoru,% 1 BSA ile 1: 100'e seyreltilmiş; veya anti-aquaporin 2 (AQP2) antikoru,% 1 BSA ile 1: 100'e seyreltilmiş) ve nemli bir oda altında gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  6. Bölümleri PBS ile oda sıcaklığında 5 dakika, 3 kez yıkayın.
  7. 150 μL ikincil antikor (anti-tavşan IgG Alexa Fluor 647 antikoru,% 1 BSA ile 1: 500'e seyreltilmiş) ve Lotus tetragonolobus lektin (LTL)-floresein (% 1 BSA ile% 1: 200'e seyreltilmiş) ekleyin ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
  8. Bölümleri PBS ile oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.
  9. Slaytları düz bir yüzeye yerleştirin ve nükleer boyama için 150 μL Hoechst 33342 (PBS ile 1: 10.000'e seyreltilmiş) ekleyin. Işıktan koruyarak oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  10. Bölümleri PBS ile oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.
  11. Kızakları 20 μL montaj ortamı ve bir kapak camı ile monte edin. Görüntüleme yapılana kadar slaytları karanlıkta 4 °C'de tutun.

9. Dokudan DNA ekstraksiyonu

  1. Ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak dokulardan DNA ekstraksiyonu (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Dokuyu bir seramik boncuk tüpüne aktarın ve 400 μL DNA ekstraksiyon tamponu ekleyin (100 mM NaCl, 20 mM EDTA,% 1 SDS ve 50 mM Tris-HCl, pH 8.0).
    2. Dokuyu bir homojenizatör kullanarak 3 döngüde 20 saniye boyunca 5 m/s hız ayarında homojenize edin.
    3. Oda sıcaklığında 2.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
    4. Bir P200 pipeti kullanarak 200 μL süpernatan toplayın ve 10 μL Proteinaz K çözeltisi (1 mg / mL'lik nihai konsantrasyon) ekleyin.
    5. 15 saniye girdaplayarak karıştırın ve 55 °C'de 1 saat inkübe edin.
    6. DNA ekstraksiyon kitinden 200 μL lizis tamponu ekleyin.
    7. 15 saniye girdaplayarak karıştırın ve 55 °C'de 15 dakika inkübe edin.
    8. 250 μL %100 etanol ekleyin.
    9. 15 saniye girdaplayarak karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    10. Lizatı DNA ekstraksiyon spin kolonuna uygulayın.
    11. Oda sıcaklığında 6.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
    12. Döndürme kolonunu 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. DNA ekstraksiyon kitinden 500 μL ilk yıkama tamponu ekleyin.
    13. Oda sıcaklığında 6.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
    14. Döndürme sütununu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. DNA ekstraksiyon kitinden 500 μL ikinci yıkama tamponu ekleyin.
    15. Oda sıcaklığında 6.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
    16. Döndürme kolonunu 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. 500 μL %100 etanol ekleyin.
    17. Oda sıcaklığında 6.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
    18. Döndürme kolonunu 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin ve oda sıcaklığında 20.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Bu adım, elüata etanol taşınması aşağı akış uygulamalarına müdahale edebileceğinden, spin kolon membranının tamamen kurutulmasını sağlar.
    19. Döndürme kolonunu yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. DNA ekstraksiyon kitinden spin kolonuna 35 μL elüsyon tamponu ekleyin.
      NOT: Geri kazanılan elüatın hacmi tipik olarak, başlangıçta kolona uygulanan elüsyon tamponunun hacminden yaklaşık 5 μL daha azdır.
    20. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    21. Oda sıcaklığında 20.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
    22. DNA konsantrasyonunu ölçün.
  2. Kantitatif PCR (qPCR) ile vektör genom kopya sayısı ölçümü
    1. Adım 9.1'de hazırlanan ekstrakte edilmiş DNA'yı moleküler dereceli su ile 25 ng / μL'lik bir konsantrasyona seyreltin.
    2. Ekstrakte edilen DNA örneklerinde diploid genomları ölçmek için kullanılacak vektör genom ölçümü için bir qPCR primer çifti (bu çalışmada tdTomato kullanılmıştır) ve fare referans geni için bir qPCR primer çifti tasarlayın (bu çalışmada fare aguti geni kullanılmıştır).
      NOT: Bu çalışmada kullanılan primer dizileri aşağıdaki gibidir;
      tdTomato ileri: 5'-TATGAACGGAGCGAGGGGAG-3'
      tdDomates ters: 5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      fare agouti ileri: 5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      fare agouti ters: 5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. 25 μL'lik bir qPCR reaksiyonu için, adım 9.2.1'de 4 μL seyreltilmiş DNA örneğini (25 μL'lik bir reaksiyon karışımında toplam 100 ng DNA), 12.5 μL'lik 2x qPCR reaksiyon tamponunu, 0.5 μL'lik adım 9.2.2'de hazırlanan 20 μM ileri ve geri asal değerleri karıştırın (her bir primerin 400 nM'lik nihai konsantrasyonu), ve 7.5 μL moleküler dereceli su.
    4. qPCR için plazmit standartlarının DNA konsantrasyonunu dört kez ölçün ve DNA konsantrasyonunun ortalama değerini belirleyin.
      NOT: Bu çalışmada, vektör genom miktar tayini ve normalizasyonu için sırasıyla süper sarmal dairesel pAAV-CAG-tdDomates plazmidi ve fare aguti geninden türetilen PCR hedef dizisini içeren süper sarmal dairesel plazmit kullanılmıştır.
    5. 106 dinamik aralığını kapsayan bir dizi 1:10 seri plazmit DNA standardı dilüsyonu hazırlayın.
      NOT: Her numune ve standart en az iki nüsha olarak analiz edilmelidir.
    6. Aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanarak qPCR gerçekleştirin: 10 dakika boyunca 95 ° C'de bir ilk ısı aktivasyon adımı, ardından 15 saniye boyunca 95 ° C'de 35 döngü denatürasyon ve 60 s boyunca 30 ° C'de tavlama/uzatma.
    7. qPCR reaksiyonunu tamamladıktan ve numunelerde vektör genomlarının ve fare referans geninin çift sarmallı (ds) kopya sayısı değerlerini elde ettikten sonra, hem vektör genomunun hem de referans genin bilinen konsantrasyonlarından oluşturulan standart eğrilere dayalı olarak ds vektör genom kopya sayılarını her numunedeki referans gen kopya numarasına normalleştirerek diploid genomik eşdeğer başına ds vektör genom kopya sayılarını (ds-vg/dge) belirleyin.
      NOT: Ds-vg/dge, 100 ng fare genomik DNA'sının 16.900 diploid (2N) fare hücresini temsil ettiği aşağıdaki yaklaşıma dayalı olarak belirlenebilir (yani, diploid fare hücresi başına 5.92 pg DNA).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yakın zamanda yapılan bir çalışma, RP enjeksiyonu38'i takiben AAV9'a kıyasla renal transdüksiyonda kayda değer bir artış sergileyen küçük bir AAV kapsid alt kümesi tanımlamıştır. Tanımlanan alt küme, DNA karıştırma41 tarafından üretilen kimerik bir AAV kapsidi olan AAV-KP3'ü içerir. Bu nedenle, bu çalışmada RP enjeksiyonu için AAV-KP3 ve kıyaslama olarak AAV9 seçilmiştir. AAV9-CAG-tdDomates vektörü (AAV9) ve AAV-KP3-CAG-tdDomates vektörü (K...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu rapor, fare böbreğine gen iletimi için yerel bir uygulama yöntemi olarak AAV vektörlerinin yavaş retrograd RP enjeksiyonunu ayrıntılı olarak açıklamıştır. RP enjeksiyonunu güvenli bir şekilde gerçekleştirmek için kritik bir adım, enjekte edilen böbreklerde parankimal hasarı önlemek için AAV vektörlerinin enjeksiyon hızının ayarlanmasıdır. Hidrodinamik renal pelvis enjeksiyonu ile ilgili önceki bir raporda, fare böbreğine sadece 3 saniye içinde 100 μL plazmit DNA çözeltisi enjekte edil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

H.N., Takara Bio Inc. ve Capsigen Inc. tarafından lisanslanan AAV ile ilgili teknolojilerin telif hakkını alır, biyoteknoloji şirketleri için danışman olarak hizmet verir, Capsigen Inc.'in kurucu ortağıdır ve Capsigen Inc. ve Sphere Gene Therapeutics'in hisselerine sahiptir.

Teşekkürler

Bize AAV9'un yardımcı plazmidini sağladıkları için Guangping Gao ve James M. Wilson'a ve AAV-KP3'ün yardımcı plazmidi için Katja Pekrun ve Mark A. Kay'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.45 μm PVDF şırınga filtresiMilliporeSigmaSLHVR33RS
1.5 mL mikrosantrifüj tüpü Fisher Scientific05-408-129
15 mL polipropilen tüpCorning352097
16% paraformaldehit (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL santrifüj şişesiFisher Scientific055641S24
2F Silikon hortumSai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G kelebek iğneMedex Supply26708
2-metilbütanMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR reaksiyon tamponuFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G iğneBecton-Dickinson & Co305106
50 mL polipropilen tüpCorning430291
5-0 monofilament sütürEthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 absorbable sütürEthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast
Protein Jelleri, 10 kuyu, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Görüntüleme Sistemi (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL tüpMillipore SigmaUFC910024
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antikoruAbcamab199975Kollektör duktus hücreleri için bir belirteç
Anti-Na-K-2Cl taşıyıcısı 2
(NKCC2) antikoru		StressMarq BiosciencesSPC-401Kalın yükselen bacak
hücreleri için bir belirteç
Anti-tavşan IgG Alexa Fluor 647
antikoru		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms Tümör 1 (WT1) antikoruAbcamab89901Podositleri için bir belirteç
Beckman Coulter OptiSeal Tüpü,
Polipropilen, 29.9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TÜPLERİFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovin serum albümini (BSA)Sigma-Aldrich5470
Santrifüjlü ultrafiltrasyon tüpüMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
Seramik boncuklu tüpFisher Scientific15-340-154
Sezyum klorürSigma-AldrichC3032-1KG
Kıskaç uygulama forsepsFine Science Tools00071-14
Kapalı döngü ısı yastığıStryker Medical8002-062-012
Pamuk uçlu aplikatörPuritan806-WC
Kapak camıFisher Scientific12-541B
Kriostat mikrotomTanner ScientificTN50
Eğik forsepsFine Science Tools11052-10
Eğik tip mikro damar klipsiKleinert-Kutz65145Renal arter ve renal
ven için klipsi
Dializ kasetiFisher ScientificPIA52976
DNA ekstraksiyon kitiQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı-
yüksek glikoz		Corning15-013-CVDMEM-yüksek glikoz (4.5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EtanolDecon Laboratories2716GEA
Fetal boğa serumu (FBS)VWR89510-186
Gaz geçirmez cam şırıngaHamilton1710 TLL
Glutaraldehit çözeltisiSigma-AldrichG6257
Isı terapi pompasıKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomojenizatörFisher Scientific15-340-163
İnsan embriyonik böbrek (HEK) 293
hücreleri		Agilent240073
Buz kovasıFisher Scientific07-210-104
İnfüzyon şırınga pompasıHarvard Apparatus70-4507
IzofluranPiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-glutaminFisher Scientific25030-081
Sıvı engelleyici kalemTed Pella22309
Lotus tetragonolobus lektini (LTL)-
Flororesin		Vector LaboratoriesFL-1321-2Proksimal tübülleri için bir belirteç
Magnezyum klorür (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloksikamVetOneNDC 86136-012-10Analgezic
Mikroskop cam slaytıFisher Scientific12-550-15
Montaj ortamıSouthernBiotech0100-01
İğne tutucuFine Science Tools12501

Kaynaklar

  1. Groopman, E. E., et al. Diagnostic utility of exome sequencing for kidney disease. N Engl J Med. 380 (2), 142-151 (2019).
  2. Hussien, H., Apetrii, M., Covic, A. Health-related quality of life in patients with chronic kidney disease. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 21 (1), 43-54 (2021).
  3. Peek, J. L., Wilson, M. H. Cell and gene therapy for kidney disease. Nat Rev Nephrol. 19 (7), 451-462 (2023).
  4. Khare, V., Cherqui, S. Targeted gene therapy for rare genetic kidney diseases. Kidney Int. 106 (6), 1051-1061 (2024).
  5. Medaer, L., Veys, K., Gijsbers, R. Current status and prospects of viral vector-based gene therapy to treat kidney diseases. Hum Gene Ther. 35 (5-6), 139-150 (2024).
  6. Tavakolidakhrabadi, N., Ding, W. Y., Saleem, M. A., Welsh, G. I., May, C. Gene therapy and kidney diseases. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (4), 101333(2024).
  7. Miyazaki, M., Yamashita, T., Miyazaki, T., Taira, H., Suzuki, A. Gene delivery to renal tubular epithelial cells using adeno-associated virus vector in domestic cats. Res Vet Sci. 87 (3), 408-412 (2009).
  8. Qi, Y. F., et al. Comparison of the transduction efficiency of tyrosine-mutant adeno-associated virus serotype vectors in kidney. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (1), 53-55 (2013).
  9. Takeda, S., et al. Successful gene transfer using adeno-associated virus vectors into the kidney: Comparison among adeno-associated virus serotype 1-5 vectors in vitro and in vivo. Nephron Exp Nephrol. 96 (4), e119-e126 (2004).
  10. Zhong, F., et al. Protein S Protects against Podocyte Injury in Diabetic Nephropathy. J Am Soc Nephrol. 29 (5), 1397-1410 (2018).
  11. Chen, S., et al. Gene delivery in renal tubular epithelial cells using recombinant adeno-associated viral vectors. J Am Soc Nephrol. 14 (4), 947-958 (2003).
  12. Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: Conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
  13. Wang, P., et al. Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway. Sci Transl Med. 10 (462), eaat2039(2018).
  14. Haddad, G., et al. Renal AAV2-mediated overexpression of long non-coding RNA H19 attenuates ischemic acute kidney injury through sponging of microRNA-30a-5p. J Am Soc Nephrol. 32 (2), 323-341 (2021).
  15. Asico, L. D., et al. Nephron segment-specific gene expression using AAV vectors. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 19-24 (2018).
  16. Chung, D. C., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to renal tubule cells via a retrograde ureteral approach. Nephron Extra. 1 (1), 217-223 (2011).
  17. Ito, K., et al. Adeno-associated viral vector transduction of green fluorescent protein in kidney: Effect of unilateral ureteric obstruction. BJU Int. 101 (3), 376-381 (2008).
  18. Konkalmatt, P. R., et al. Renal rescue of dopamine D2 receptor function reverses renal injury and high blood pressure. JCI Insight. 1 (8), e85888(2016).
  19. Rubin, J. D., Nguyen, T. V., Allen, K. L., Ayasoufi, K., Barry, M. A. Comparison of gene delivery to the kidney by adenovirus, adeno-associated virus, and lentiviral vectors after intravenous and direct kidney injections. Hum Gene Ther. 30 (12), 1559-1571 (2019).
  20. Saito, S., et al. rAAV6-mediated miR-29b delivery suppresses renal fibrosis. Clin Exp Nephrol. 23 (12), 1345-1356 (2019).
  21. Shen, X., et al. Transparenchymal renal pelvis injection of recombinant adeno-associated virus serotype 9 vectors is a practical approach for gene delivery in the kidney. Hum Gene Ther Methods. 29 (6), 251-258 (2018).
  22. Wang, J. N., et al. Inhibition of METTL3 attenuates renal injury and inflammation by alleviating TAB3 m6A modifications via IGF2BP2-dependent mechanisms. Sci Transl Med. 14 (640), eabk2709(2022).
  23. Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904(2017).
  24. Woodard, L. E., et al. Hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney. J Vis Exp. (131), e56324(2018).
  25. Yadav, M. K., Yoo, K. W., Atala, A., Lu, B. Lentiviral vector mediated gene therapy for type Dent disease ameliorates Dent disease-like phenotypes for three months in CIC-5 null mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 149-166 (2022).
  26. Hillestad, M. L., Guenzel, A. J., Nath, K. A., Barry, M. A. A vector-host system to fingerprint virus tropism. Hum Gene Ther. 23 (10), 1116-1126 (2012).
  27. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  28. Ikeda, Y., Sun, Z., Ru, X., Vandenberghe, L. H., Humphreys, B. D. Efficient gene transfer to kidney mesenchymal cells using a synthetic adeno-associated viral vector. J Am Soc Nephrol. 29 (9), 2287-2297 (2018).
  29. Williams, R. M., et al. Mesoscale nanoparticles selectively target the renal proximal tubule epithelium. Nano Lett. 15 (4), 2358-2364 (2015).
  30. Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. Standard screening methods underreport AAV-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).
  31. Koike, H., et al. An efficient gene transfer method mediated by ultrasound and microbubbles into the kidney. J Gene Med. 7 (1), 108-116 (2005).
  32. Ishida, R., et al. Kidney-specific sonoporation-mediated gene transfer. Mol Ther. 24 (1), 125-134 (2016).
  33. Davis, L., Park, F. Gene therapy research for kidney diseases. Physiol Genomics. 51 (9), 449-461 (2019).
  34. Rubin, J. D., Barry, M. A. Improving molecular therapy in the kidney. Mol Diagn Ther. 24 (4), 375-396 (2020).
  35. Huang, S., et al. Application of ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated exogenous gene transfer in treating various renal diseases. Hum Gene Ther. 30 (2), 127-138 (2019).
  36. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  37. Wang, J. H., Gessler, D. J., Zhan, W., Gallagher, T. L., Gao, G. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  38. Furusho, T., et al. Enhancing gene transfer to renal tubules and podocytes by context-dependent selection of AAV capsids. Nat Commun. 15 (1), 10728(2024).
  39. Ding, W. Y., et al. Adeno-associated virus gene therapy prevents progression of kidney disease in genetic models of nephrotic syndrome. Sci Transl Med. 15 (708), eabc8226(2023).
  40. Wu, G., et al. Adeno-associated virus-based gene therapy treats inflammatory kidney disease in mice. J Clin Invest. 134 (17), e174722(2024).
  41. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  42. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  43. Shen, S., et al. Engraftment of a galactose receptor footprint onto adeno-associated viral capsids improves transduction efficiency. J Biol Chem. 288 (40), 28814-28823 (2013).
  44. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med. 5 (189), 189ra176(2013).
  45. Gomes, M. M., Wang, L., Jiang, H., Kahl, C. A., Brigande, J. V. A rapid, cost-effective method to prepare recombinant adeno-associated virus for efficient gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol Biol. 1427, 43-57 (2016).
  46. Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative dot blot assay for AAV titration and its use for functional assessment of the adeno-associated virus assembly-activating proteins. J Vis Exp. (136), e56766(2018).
  47. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun. 5, 3075(2014).
  48. Lu, Z. Y., et al. Constitutive and conditional gene knock-out mice for the study of intervertebral disc degeneration: Current status, decision considerations, and future possibilities. JOR Spine. 6 (1), e1242(2023).
  49. Kaspar, B. K., et al. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  50. Werfel, S., et al. Rapid and highly efficient inducible cardiac gene knock-out in adult mice using AAV-mediated expression of Cre recombinase. Cardiovasc Res. 104 (1), 15-23 (2014).
  51. Jinek, M., et al. A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  52. Wang, X., Huang, X., Fang, X., Zhang, Y., Wang, W. CRISPR-Cas9 system as a versatile tool for genome engineering in human cells. Mol Ther Nucleic Acids. 5 (11), e388(2016).
  53. Ueki, K., et al. Establishment of pancreatic -cell-specific gene knock-out system based on CRISPR-Cas9 technology with AAV8-mediated gRNA delivery. Diabetes. 72 (11), 1609-1620 (2023).
  54. Marichal-Gallardo, P., et al. Single-use capture purification of adeno-associated viral gene transfer vectors by membrane-based steric exclusion chromatography. Hum Gene Ther. 32 (17-18), 959-974 (2021).
  55. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  56. Chen, S. H., et al. A simple, two-step, small-scale purification of recombinant adeno-associated viruses. J Virol Methods. 281, 113863(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

AAV VektörleriRetrograd Renal EnjeksiyonBöbrek Gen TedavisiProksimal Tübül TransdüksiyonuCsCl AAVCU AAVBöbrek Hastalığı ModelleriIn Vivo Transdüksiyon
Adeno ilişkili virüs vektörlerinin yavaş retrograd renal pelvis enjeksiyonu yoluyla fare böbreğine etkili ve güvenli gen iletimi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.