Yöntem makalesi

Bir Murin Kemik İliği Yaralanması Modelinde İntramembranöz Ossifikasyon Yoluyla Postnatal Osteogenezi İncelemek için Geliştirilmiş Metodoloji

DOI:

10.3791/67727

⸱

7 Şubat 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, UConn School of Medicine, 2Department of Neuroscience, UConn School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murin kemik iliği yaralanması modeli, intramembranöz ossifikasyon yoluyla doğum sonrası osteogenezi incelemek için yararlı bir araçtır. Bu basitleştirilmiş cerrahi protokol, yaralanma sonrası yeni kemik oluşumunun ve hücresel yanıtların aşağı akış değerlendirmesi için kemik iliği ablasyon prosedürünü tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzun kemik yaralanmaları endokondral veya intramembranöz kemik oluşum yolları ile iyileşir. Bir kıkırdak şablonu gerektiren endokondral yolun aksine, intramembranöz ossifikasyon süreci, iskelet sapı ve progenitör hücrelerin (SSPC'ler) kemik oluşturan osteoblastlara doğrudan dönüştürülmesini içerir. Deneysel farelerde bu işlemi modellemek için sınırlı cerrahi yöntemler vardır. Burada, intramembranöz ossifikasyon yoluyla kemik onarımının incelenmesini kolaylaştırmak ve osteogenezin doğum sonrası düzenleyicilerini değerlendirmek için farelerde bir kemik iliği yaralanması modeli geliştirdik. Bu yöntem yüksek oranda tekrarlanabilir ve kullanıcı dostudur ve mikro bilgisayarlı tomografi (μBT) ve donmuş kesit histolojisi kullanılarak kısa bir süre içinde (yaralanmadan 3-7 gün sonra) yeni kemik oluşumunun zamansal olarak değerlendirilmesine olanak tanır. Ayrıca, SSPC'lerin ve olgun osteoblastların katkıları, floresan raportör fareler ve bu intramembranöz kemik iliği yaralanması modelinin bir kombinasyonu kullanılarak kolayca değerlendirilebilir. Klinik bağlamlarda, intramembranöz kemik oluşumu, kritik boyut kusurlarının, stabilize kırıkların, kortikal defektlerin, tümör rezeksiyonlarından kaynaklanan travmaların ve eklem replasmanlarının iyileşmesi ile ilgilidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzun kemik yaralanmaları endokondral veya intramembranöz kemik oluşum yolu ile iyileşir. Bir kıkırdak öncü basamağı gerektiren endokondral yolun aksine, intramembranöz kemikleşme yoluyla kemik onarımı, iskelet sapı ve progenitör hücrelerin (SSPCS) kemik oluşturan osteoblastlara doğrudan dönüştürülmesini içerir1. Klinik olarak bu süreç, kritik boyut kusurları, stabilize kırıklar, kortikal defektler, distraksiyon osteogenezisi, tümör rezeksiyonlarından kaynaklanan travma ve eklem replasman implantlarının osseointegrasyonu dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda kemik iyileşmesi ile ilgilidir 2,3. İlginç bir şekilde, uzun kemik kırığı olan hastaların %66-82'sinde yer değiştirmiş kırıklar vardıve bu da kemiği stabilize etmek için fiksasyon cihazları gerektiriyordu 4,5. Bu rijit olarak stabilize edilmiş kemikler, kırık kemik uçları birbiriyle doğrudan temas ettiğinden, öncelikle intramembranöz kemikleşme yoluyla iyileşir 6,7. Bununla birlikte, intramembranöz kemik rejenerasyonunun mekanik rejenerasyonu, endokondral yollar yoluyla kemik oluşumuna kıyasla nispeten az çalışılmıştır. Kemik iyileşmesini artırmak için Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı tedaviler, sınırlı klinik etkinlik ve yüksek maliyetler nedeniyle engellenir ve önemli yan etkilerle ilişkilidir8.

Mekanik kemik iliği ablasyonu, intramembranöz kemik oluşumunu incelemek için değerli bir model sağlar. Bu basit yaralanma modeli, kortikal kemiği bozmadan kemik iliğinde kemik rejenerasyonunun incelenmesine izin verir. BM ablasyonunu takiben, iyileşme süreci farklı ancak örtüşen aşamaları içerir. İlk aşama ilk 1 ila 5 gün içinde gerçekleşir ve enflamatuar hücrelerin ve sitokinlerin iyileşmeyi başlattığı pıhtı oluşumu ve iltihabı içerir. 3. günden 14. güne kadar ikinci aşama, neovaskülarizasyon, mezenkimal kök hücre (MSC) göçü ve proliferasyonu, osteoblastik farklılaşma ve dokuma kemik oluşumu dahil olmak üzere rejenerasyon ile karakterize edilir. Son yeniden şekillenme aşaması ameliyattan yaklaşık 10 gün sonra başlar ve kemik dokusu olgunlaşma ve yeniden yapılanma geçirir ve ilik 569. güne kadar tamamen eski haline gelene kadar yeniden yapılandırılır. Bu hızlı iyileşme zaman çizelgesi, BM ablasyon modelini, özellikle inflamasyon, progenitör hücre alımı ve osteoblast farklılaşmasının kritik dönemlerinde erken kemik onarım yanıtlarını incelemek için ideal hale getirir. Histoloji, akım sitometrisi ve kantitatif μBT analizi gibi teknikler kullanılarak, erken onarım aşamalarında hücresel yanıtlar ve kemik oluşumu değerlendirilebilir. Yukarıda belirtilen teknikleri kullanarak, BM ablasyon modeli, intramembranöz kemik rejenerasyon mekanizmaları hakkında bilgi sağlayabilir ve kemik iyileşmesini arttırmak için temel terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki prosedürler Connecticut Üniversitesi Sağlık Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçekleştirilmiştir. Tüm ameliyatlar Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) kılavuzlarında belirtildiği gibi steril koşullar altında gerçekleştirildi. Ağrı ve enfeksiyon riski, başarılı bir sonuç elde etmek için uygun analjezikler ve antiseptiklerle yönetildi.

1. Cerrahi bölge ve aletlerin hazırlanması

  1. Çalışma yüzeylerini klinik sınıf bir dezenfektan temizleyici ile dezenfekte ederek cerrahi işlem odasını hazırlayın.
    NOT: Cerrah, steril tek kullanımlık eldivenler, saç bonesi, önlük ve maske dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giymelidir.
  2. Steril bir cerrahi ped ile kaplı bir ısıtma yastığı hazırlayın. Tüm steril aletleri ve reaktifleri (Malzeme Tablosu) uygun erişimle toplayın ve düzenleyin.

2. Ameliyat öncesi anestezi

  1. Ameliyattan önce tüm fareleri tartın. Mevcut buprenorfin formülasyonuna dayalı olarak kullanılacak analjezik hacimlerini hesaplayın.
  2. Bir indüksiyon odası ve bir burun konisi düzeneği içeren steril çalışma alanı içinde bir hayvan anestezi ünitesi monte edin. Fare yaşına ve ağırlığına bağlı olarak oksijen çıkışını 2 L min-1'e ve izofluranı %1,5-3'e (h/h) ayarlayın.
  3. Fare sakinleştirildikten sonra, hayvanı indüksiyon odasından çıkarın ve sırtüstü pozisyonda steril bir cerrahi ped üzerine yerleştirin. Her iki göze de oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın. Burun konisini başın üzerine yerleştirin. Ayak parmağını hafifçe sıkıştırarak farenin yeterince uyuşturulup uyuşturulmadığını kontrol edin. Devam etmeden önce arka bacak refleks tepkisi olmadığından emin olun.
  4. Ameliyattan önce, deri altı yoluyla toplam uzun süreli salınan buprenorfin dozunu enjekte etmek için fareyi burun konisinden kısaca çıkarın; Toplam doz 3.25 mg / kg'dır.

3. Cerrahi prosedür açıklaması

NOT: Bu cerrahi prosedür, 10 haftadan 24 haftaya kadar olan C57BL / 6 erkek ve dişi fareleri kullanır. Prosedür, 6 haftadan 33 haftaya kadar olan farelerde ve diğerleri tarafından gösterildiği gibi çeşitli akraba suşlarda yapılabilir10,11. Daha genç fareler daha kısa iğne uzunluklarına ihtiyaç duyabilirken, daha yaşlı veya daha büyük fareler daha uzun bir iğneye ihtiyaç duyabilir.

  1. 26 G'lik bir iğne ile donatılmış 3 mL'lik bir şırıngayı steril salin ile doldurun. Bunu yan tarafa yerleştirin.
  2. Elektrikli veya pille çalışan makaslarla (# 40 bıçak) işlemin yapılacağı arka bacaktan kürkü çıkarın ve cerrahi alandan gevşek kürkü çıkarın. Steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak, cerrahi bölgeyi iyot bazlı bir ovma (%10 Povidon-iyot) ve ardından %70 izopropil alkol ile tedavi edin. Dizin ortasından başlayarak ve dışa doğru dairesel bir tarama yaparak ameliyat bölgesini ovalayın. Sitenin kurumasını bekleyin. Fırçalama adımlarını 3 kez tekrarlayın.
  3. Fareyi sırt üstü yatırın ve ameliyat bacağının dizini esnetin. Farenin bacağını, diz orta parmağın üzerine bükülecek, ikinci parmak uyluk kemiğine ve başparmak kaval kemiğine dayanacak şekilde baskın olmayan elinde tutun.
  4. Bir neşter kullanarak patellanın hemen altında küçük, sığ bir yatay kesi yapın.
    NOT: Bu adım, yerleştirme yerinin görselleştirilmesini geliştirir. Tecrübe ile bu adım atlanabilir.
  5. İğneyi bükülmüş diz boyunca yatay olarak yerleştirerek ve uyluk kemiği ile tibia arasındaki boşluğu hissederek eklem boşluğunu bulun. Bu anatomik bölgeyi yönlendirmek için kullanarak, 25 G'lik bir iğne alın ve dizden proksimal tarafa doğru distal uyluk kemiğine manuel olarak delin (iğneyi çevirerek ve aynı anda iğneye orta derecede basınç uygulayarak). İğneyi patellanın içinden veya çevresinden geçirin.
  6. İğnenin medüller boşluğa merkeze mümkün olduğunca yakın bir şekilde uygun şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için fareyi röntgenleyin (Şekil 1).
  7. 25 G'lik iğneyi çıkarın ve hemen 26 G'lik bir iğneyi ilik boşluğundaki aynı deliğe sokun. Medüller boşluğun kenarlarını pürüzsüz hissedene kadar en az 5 kez dairesel hareketlerle raybalayın. Raybalama hareketlerinin sayısını her fare arasında tutarlı tutun.
    NOT: Adım 3.5 ve 3.7, dikkatli bir şekilde ele alınmazsa cerrahta iğne batması yaralanmasına neden olabilir.
  8. 26 G iğneyi çıkarın ve salin şırıngasına bağlı 26 G iğneyi değiştirin. Geri akış berraklaşana kadar boşluğu yıkayın. Bu tipik olarak 1.5-2 mL salin gerektirir. Şırıngayı ve iğneyi çıkarın ve keskin bir kaba güvenli bir şekilde atın.
    NOT: Sıvıyı iterken direnç olmamalıdır. Eğer öyleyse, boşluğun içinde olduğundan emin olmak için iğneyi yeniden yerleştirin. İğneyi yarıya kadar dışarı çekmek gerekebilir.
  9. Topikal bir yapıştırıcı sütür kullanarak cilt yarasını kapatın.

4. Ameliyat sonrası bakım

  1. Ameliyattan hemen sonra, kalan yarım dozu uzun süreli salimli buprenorfin adım 2.4'teki dozu kullanarak uygulayın.
    NOT: Uzun süreli salınan Buprenorfin, 72 saate kadar ağrı kesici sağlar.
  2. Isıtma yastığı üzerindeki hayvanları, ameliyattan uyanana kadar normal, engelsiz solunum belirtileri açısından izleyin. Yürüyünce fareleri kafeslerine geri koyun.
  3. Ameliyattan sonra 3 gün boyunca fareleri günde bir kez izlemeye devam edin, böylece düzgün bir şekilde iyileştiklerinden ve tam hareket kabiliyetine sahip olduklarından emin olun, ağrı belirtilerini izleyin.

5. μCT taraması ve analizi için kemiklerin işlenmesi

  1. Fareleri, IACUC veya diğer geçerli kurumsal politika tarafından düzenlenen ve onaylanan insancıl ötenazi yöntemine göre ötenazi yapın. Burada, CO2 inhalasyonunun birincil ötenazi yöntemi kullanıldı, ardından ikincil bir servikal çıkık yöntemi kullanıldı.
  2. Arka ayakların etrafındaki cildi soyarak ve kalça eklemindeki tüm uzvu çıkararak uyluk kemiğini hasat edin.
  3. Her bir uzvu bir gömme kasetinde iki sünger arasına sıkıştırın. Kasetlerindeki kemikleri %10'luk bir formalin solüsyonuna aktarın ve farenin yaşını ve boyutunu göz önünde bulundurarak 5-7 gün boyunca 4 °C'de sabitleyin.
    NOT: Hem aşırı fiksasyon hem de yetersiz fiksasyon, kemik iliği çözünürlüğünün zayıf olmasına neden olur.
  4. Fiksasyondan sonra, kasetleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 3 kez 5 dakika yıkayın.
  5. Uzuvları kasetlerden çıkarın ve gerektiğinde bir neşter kullanarak kasları kesin.
    NOT: Aşağı akış uygulamalarına bağlı olarak, kaba kullanım kemiğin periosteal tabakasını bozabilir.
  6. Küçük bir cerrahi makas veya neşter kullanarak bağları dikkatlice keserek uyluk kemiğini dizden ayırın.
    NOT: Tibialar diğer uygulamalar için kullanılabilir veya atılabilir.
  7. Femurları 1.7 mL veya 15 mL konik tüplere% 70 etanol çözeltisine aktarın. Kemikler, μCT taraması için hazır olana kadar 4 °C'de% 70 etanol içinde kalabilir.
  8. Femurları trabeküler parametreler için tarayın ve değerlendirin, kalitatif ve kantitatif veriler üretin.

6. Donmuş kesit alma ve histoloji için kemiklerin işlenmesi

NOT: Kemikler, μCT taraması yapıldıktan sonra donmuş kesit alma ve histoloji için işlenebilir. Tarama, floresan etiketlemeyi veya müteakip antikor boyamasını etkilemez.

  1. Kemikleri% 70 etanolden PBS'ye aktarın ve yıkama başına 5 dakika olmak üzere 3 kez yıkayın.
  2. Her konsantrasyonda gece boyunca 4 ° C'de PBS'de% 10,% 20,% 30 arasında% 30'luk bir dizi sükroz çözeltisinde inkübe edin. Kemikleri 4 ° C'de 5 güne kadar% 30 sükroz içinde veya bu solüsyonda -20 ° C'de 6-12 ay boyunca gömmeye hazır olana kadar saklayın.
    NOT: Sükroz gradyanı kullanmak daha iyi doku penetrasyonu ile sonuçlanır. Adım 6.1'den sonra, kemikler gece boyunca doğrudan% 30'luk bir sükroz çözeltisine yerleştirilebilir.
  3. Kriyo gömme kalıpları kullanarak kemikleri optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömün. Bölümlere hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
  4. Kriyostat sıcaklığı -24 °C ile -26 °C arasında ayarlanmış kriyofilm bant yöntemi kullanılarak kesit gömülü kemikler.
  5. Kriyofilm üzerindeki bölümleri optik yapıştırıcı kullanarak yapışkan bir slayta yapıştırın ve bir ultraviyole (UV) çapraz bağlayıcı kullanarak sertleşene kadar sertleştirin.

7. Akış sitometrisi için işleme

NOT: Bu protokol çeşitli antikorlarla uyumludur. İskelet sapı ve progenitör hücreleri karakterize etmek için, kemik iliğinde nadir hücre popülasyonları olduğu için 3-4 kemiğin bir araya getirilmesi önerilir.

  1. Floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) boyama ortamı (FSM) hazırlayın. 1000 mL FSM çözeltisi yapmak için birleştirin: 100 mL Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS), 10 mL 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 20 mL Fetal sığır serumu (FBS), 870 mL dd H2O. FSM çözeltisini 0,2 μm'lik bir filtreden geçirin.
  2. Doku toplamadan önce, Petri kaplarını kalsiyum ve magnezyum içermeyen 4-5 mL steril PBS ile doldurun.
  3. Sindirim ortamını hazırlayın
    1. Her 4-6 uyluk kemiği için, 0.005 g kollajenaz P ve 0.02 g hyaluronidaz içeren 10 mL PBS'de bir sindirim karışımı hazırlayın. Hafifçe girdaplama ile karıştırın ve karışımı 0.22 μm'lik bir filtreden geçirin.
  4. Ameliyat sonrası 3. günde kemikleri adım 5.2'de açıklandığı gibi hasat edin. Tüm kas ve bağ dokusunu bir neşter bıçağıyla çıkarın.
  5. Bir Petri kabını 5 mL sindirim ortamı ile doldurun. Sindirim ortamına 4-6 kemik yerleştirin. Her kemiği ince ince doğrayın, ilk kesimi uzunlamasına ve yanlamasına yapın.
  6. Dokuyu 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın ve parafilm ile kapatın. Tüpleri alüminyum folyo ile kaplayın.
  7. Tüpü çalkalayıcı üzerinde yatay olarak tutarak 37 °C'de 20 dakika çalkalayın.
  8. Tüpü çalkalayıcıdan çıkarın. Hücreler altta kümelenecektir. Sindirilen materyali alttaki hücreleri rahatsız etmeden nazikçe toplayın ve sindirimi 70 μm'lik bir filtreden geçirin. Süzüntüyü 10 mL soğuk FSM içeren 50 mL'lik yeni bir tüpte toplayın ve buz üzerinde tutun.
  9. Hücrelere, sindirim karışımının kalan 5 mL'sini ekleyin. Tekrar parafilm ile kapatın ve alüminyum folyo ile kaplayın. Tüpü yukarıda anlatıldığı gibi sallayın. 7.7-7.8 adımlarını tekrarlayın.
  10. 37 °C'de 20 dakikalık inkübasyondan sonra, sindirimi, 10 mL FSM ile 70 μm'lik bir filtreden geçirerek, adım 7.8'deki sindirimi içeren aynı tüpe aktarın.
  11. Süspansiyonu 4 °C'de 274 x g'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini toplayın. Tüpe hafifçe vurarak peleti yerinden çıkarın.
    NOT: Merkezkaç kuvveti (g), 170 mm'lik bir rotor yarıçapına dayanmaktadır. Lütfen rotor yarıçapını kontrol edin ve hızı buna göre ayarlayın.
  12. Kırmızı kan hücresi lizizini gerçekleştirmek için 1 mL amonyum-klorür-potasyum (ACK) parçalama tamponu ekleyin. Tüm reaktifleri ve hücreleri buz üzerinde tutun.
  13. Hücreleri RT'de yaklaşık 5 dakika ACK'da inkübe edin. Hücrelerin aşırı parçalanmasını önlemek için 5 dakikayı aşmayın.
  14. 9 mL FSM ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 274 x g'da santrifüjleyin.
  15. Süpernatanı aspire edin. Tüpü bir tüp rafı üzerinde nazikçe tırmıklayarak hücre peletini parçalayın.
  16. 10 mL FSM ekleyin (4 kemik için hacim, kaç kemiğin birleştirildiğine bağlı olarak ayarlanabilir) ve yeniden askıya alın.
  17. Her numuneden bir alikot alın ve üreticinin talimatlarına göre propidyum iyodür (PI) ekleyin. Hücre sayacı ile canlı ve toplam hücreleri sayın.
  18. Akış sitometrisi analizi 12,13,14 için istenen belirteçleri kullanarak numunelerin antikor boyamasına devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekanik kemik iliği (BM) ablasyon prosedürünün başarısı X-ışını görüntülemesi ile doğrulanırken, 26G iğnesi medüller boşluğa yerleştirildi (Şekil 2A). X-ışını görüntüleme, iğnenin uygun olmayan bir açıyla yerleştirildiğini veya kemikten geçtiğini gösterdiğinde, iğne uygun açıda yeniden yerleştirildi ve doğru yerleşimi doğrulamak için yeniden görüntülendi. Başarılı bir pozisyon elde edilemediğinde, hayvan analizden çıkarıldı. Radyografik iki boyutlu (2D) görüntüleme, iğnenin BM boşluğuna yerl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amaç, iskelet sapı ve progenitör hücrelerin (SSPC'ler) kemik iliği boşluğunda/boşluğunda kemik biriktiren osteoblastlara doğrudan dönüştürülmesine odaklanarak, kemik onarımını yöneten moleküler ve hücresel süreçleri incelemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmaktı. Burada tarif edilen mekanik kemik iliği ablasyon yöntemi, intramembranöz kemik oluşumunun araştırılmasına izin veren, mekanik yaralanma ile kemik iliği ablasyonu için optimize edilmiş ve onaylanmış bir proto...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların bildirecek herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansman, NIH/NIDCR R01-DE030716-01 ve NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 tarafından AS'ye, NIH/NIAMS R01AR080131 RG'ye ve UConn REP Yakınsama Hibesi tarafından RG ve AS'ye sağlandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 Formalin Çözeltisi Sigma-AldrichHT501128
25 G 0.625 Air-tite EZ Flo Hipodermik İğneAit Tite / Fisher Scientific14-817-239; ref #NEZ25058
26 G 1/2 "Tek Kullanımlık Hipodermik İğnelerExel International / Fisher Scientific14-840-83; referans #26402Herhangi bir 26 G iğne ikame edilebilir, şırıngadan çıkarılabilir olmalıdır ve nbsp;
3 mL Steril ŞırıngaFisherbrand / Fisher Scientific 14-955-457
AB Steril PedMcKesson / Fisher ScientificNC0593755Alternatif olarak otoklavlanabilir emici pedler kullanabilirsiniz;
Asetik Asit, BuzulKırlangıç SigmaAX0073'ün%1
Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) Parçalama TamponuGibco/ Thermo Fisher Scientific A1049201Akış sitometrisine hazırlanırken kırmızı kan hücresi lizisi için kullanılır;
Anestezi İndüksiyon Odası 2 LVetEquip941444
Betadine (Providone-İyot) Solüsyonu Penn Veteriner Malzemeleri A.Ş. / Fisher ScientificNC0158124
Buprenorfin HCL Enjeksiyonu 0.3 mg / mL  Jenerik/ Covetrus59122Kontrollü madde
Calcein-Sigma Aldrich206700-1MG
Kollajenaz P Roche11249002001Kemik sindirmek için kullanılır
Pamuklu Çubuklar ve AplikatörlerFisherbrand/ Fisher Scientific 22-363-172
Kriyofilm Tip II C(10), 3,5 cmBölüm Laboratuvarı, JaponyaCFS 105
DAPI Boyama Solüsyonu Abcamab228549
Dijital Gram ÖlçeğiToprime / AmazonB06X6LW4V9Fareleri tartmak için herhangi bir marka ölçeği kullanabilir
Diseksiyon Forseps Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-953E; 08-953F
Diseksiyon Makası Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-940
Dayanıklı Düşük Profilli Kriyostat/Mikrotom BıçaklarıTanner ScientificTNR315LP
Ethiqa XR Buprenorfin Uzatılmış Salımlı 1.3 mg/mLEthiqa XR/ Cevetrus72117Kontrollü madde satın almak için eyalet ve federal DEA lisansı almalıdır
Hızlı Yeşil, %0.2Elektron Miskroskopi Bilimleri EMS50-319-57
Fetal Sığır Serumu ısısı inaktiveedilmiş Gibco / Thermo Fisher Scientific A5256801FACS Boyama Ortamı (FSM) yapmak için kullanılır
, Fluoromount-G Montaj Çözeltisi GüneyBiyoteknoloji 0100-01
GLUSEAL Topikal Cilt Yapıştırıcısı AD Cerrahi GLU-550
Keçi anti-Tavşan Alexa 647Thermo FisherA212441:300 seyreltme
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific14065056FACS Boyama Ortamı (FSM) yapmak için kullanılır)
Isıtma Yastığı (büyük)Boncare / AmazonB0CLHSWXSXHerhangi bir marka ısıtma yastığını kullanabilir, kumaş kapağını çıkarabilir 
HematoksilenMilliporeSigma / Fisher ScientificM1051740500
HyaluronidazMilliporeSigmaHX0514Kemik sindirmek için kullanılır
İzofluran Hayvan Anestezi SistemiVetEquip901810
KUBTEC Parametre 2D Kabin X-ray SistemiOncoMed ÇözümleriN/AHerhangi bir X-ışını Kabini görüntüleme sistemi kullanılabilir
Mikrosantrifüj TüplerCorning / Thomas Scientific 8600A52
Mikroskop Kapak Camı, 18 mm x 18 mm, # 1 KalınlıkKüre Bilimsel1414-10
N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit HEPES (1M) Gibco/ Thermo Fisher Scientific156300-80FACS Boyama Ortamı (FSM) yapmak için kullanılır
Norland optik Yapıştırıcı NO61Edmund Optik37-322Kriyofilm bölümlerini bir slayta yapıştırmak için kullanılır 
Osterix Tavşan Monoklonal Antikoru Abcamab2094841:500 seyreltme
Peroxigard Kullanıma Hazır Tek Adımlı DezenfektanVirox Technologies29101Başka herhangi bir klinik/laboratuvar sınıfı dezenfektan
Propidium Iodür (PI)Invitrogen / Thermo Fisher Scientific P1304MPVioability sayımları için ölü hücreleri tespit etmek için kullanılan nükleer floresan lekesi
Şarj Edilebilir Elektrikli DüzelticiWahl/ AmazonB001FWXKUEHerhangi bir kesme makinesi kullanılabilir, daha küçük boyutlu bir düzeltici daha küçük hayvanları tıraş etmeyi kolaylaştıracaktır
Kemirgen Burun KonisiVetEquip921609
Safranin O, %85 saf, sertifikalıFisher Scientific AC419211000
Seal'N Freeze Cryotray Kare KalıplarElektron Miskroskopi Bilimleri EMS62642-01Gömme için kullanılır, diğer gömme kalıpları kullanılabilir. Bu özel model, daha derin bir kalıba ve bloğu kapatmak için bir kapağa sahiptir 
Gümüş NitratSigma AldrichS6506Von Kossa lekesi için gümüş nitrat
Steril Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific10010023Alternatif olarak, filtrelenmiş ve otoklavlanmış taze hazırlanmış PBS kullanılabilir
Steril Standart NeşterlerIntegra Miltex / Fisher Scientific12-460-455
Steril Standart NeşterlerIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Sükroz Tozu 1 KGThermo Fisher Scientific036508-A1
Superfrost Plus Miscroscope SlaytlarFisherbrand/ Fisher Scientific 1255015Yapışkanlı slaytlar
Sure-Tek Doku İşleme / Gömme KasetlerFisherbrand Histosette / Fisher Scientific22-048-141
Doku Artı Optimum Kesme Sıcaklığı OCT BileşikFisher Scientific23-730-571
Doku SüngerleriEpredia / Fisher Scientific84-53Doku süngerleri dokuları aşırı proosese karşı korur.
Toluidin BlueFisher BilimselAC348600050
: ile ikame edilebilir;

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).
  2. Ko, F. C., Sumner, D. R. How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development. Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (2021).
  3. Patt, H. M., Maloney, M. A. Bone marrow regeneration after local injury: a review. Exp Hematol. 3 (2), 135-148 (1975).
  4. Chitnis, A., et al. Long bone fractures: treatment patterns and factors contributing to use of intramedullary nailing. Expert Rev Med Devices. 17 (7), 731-737 (2020).
  5. Singaram, S., Naidoo, M. The physical impact of long bone fractures on adults in KwaZulu-Natal. S Afr J Physiother. 76 (1), 1393(2020).
  6. Kim, T., et al. Orthopedic implants and devices for bone fractures and defects: past, present and perspective. Eng Regen. 1, 6-18 (2020).
  7. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  8. Katagiri, T., et al. morphogenetic protein-induced heterotopic bone formation: what have we learned from the history of a half century. Jpn Dent Sci Rev. 51 (2), 42-50 (2015).
  9. Wise, J. K., et al. Temporal gene expression profiling during rat femoral marrow ablation-induced intramembranous bone regeneration. PLoS One. 5 (10), e12987(2010).
  10. Chen, X. D., et al. Biglycan-deficient mice have delayed osteogenesis after marrow ablation. Calcified Tissue Int. 72 (5), 577-582 (2003).
  11. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration differs among common inbred mouse strains following marrow ablation. J Orthop Res. 33 (9), 1374-1381 (2015).
  12. Jeffery, E. C., Mann, T. L. A., Pool, J. A., Zhao, Z., Morrison, S. J. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells contribute distinct to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29 (11), 1547-1561.e6 (2022).
  13. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol. 13, 930358(2022).
  14. Chan, C. K. F., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160 (1-2), 285-298 (2015).
  15. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration in diversity outbred mice is heritable. Bone. 164, 116524(2022).
  16. Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (1), 35-49 (2015).
  17. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plast Reconstr Surg. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  18. Yu, Y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, T. Creating rigidly stabilized fractures for assessing intramembranous ossification, distraction osteogenesis, or healing of critical sized defects. J Vis Exp. (62), e3552(2012).
  19. Wu, X., et al. Enhancing calvarial defects repair with PDGF-BB mimetic peptide hydrogels. J Control Release. 370, 277-286 (2024).
  20. Stanton, E., et al. A murine calvarial defect model for the investigation of the osteogenic potential of newborn umbilical cord mesenchymal stem cells in bone regeneration. Plast Reconstr Surg. 153 (3), 637-646 (2023).
  21. Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
  22. Petersen, A., et al. A biomaterial with a channel-like pore architecture induces endochondral healing of bone defects. Nat Commun. 9 (1), 4430(2018).
  23. Xiao, X., et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 11 (1), 59(2023).
  24. Yu, V. W. C., Scadden, D. T. Heterogeneity of the bone marrow niche. Curr Opin Hematol. 23 (4), 331-338 (2016).
  25. Matsushita, Y., Ono, W., Ono, N. Growth plate skeletal stem cells and their transition from cartilage to bone. Bone. 136, 115359(2020).
  26. Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
  27. Muruganandan, S., et al. A FoxA2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Intramembranous OssificationBone Marrow InjuryPostnatal OsteogenesisSkeletal Stem CellsBone RegenerationMurine Bone ModelOsteoblast DifferentiationMicro Computed TomographyFrozen Section HistologyBone Repair Mechanisms

İlgili makaleler