Yöntem makalesi

In Vitro Ventriküler Destek Cihazları için Tromboz Testi

1.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67731

⸱

21 Mart 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 3Department of Cardiovascular Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

Bu makalede

Özet

Devridaim test platformu içinde ventriküler destek cihazlarında (VAD) trombozu indüklemek için bir tezgah üstü protokol sunuyoruz. Bu yöntem, kan akış yolundaki trombojenik sıcak noktaları belirlemeye hizmet eder ve hayvan modellerinde klinik öncesi testlerden önce trombodirencin iyileştirilmesine yardımcı olabilir.

Özet

Tromboz riski, ventriküler destek cihazlarının (VAD'ler) geliştirilmesinde ve klinik kullanımında önemli bir endişe kaynağı olmaya devam etmektedir. VAD trombojenisitesinin geleneksel değerlendirmeleri, öncelikle hayvan çalışmaları yoluyla, maliyetli ve zaman alıcıdır, etik kaygıları artırır ve sonuçta insan sonuçlarını doğru bir şekilde yansıtmayabilir. Bu sınırlamaları ele almak için, trombozu provoke etmek ve kan akış yolundaki potansiyel yüksek riskli alanları belirlemek için tasarlanmış agresif bir in vitro test protokolü geliştirdik. Maruyama ve ark.'nın çalışmaları tarafından motive edilen bu protokol, modifiye edilmiş bir antikoagülasyon stratejisi kullanır ve hazır bileşenleri kullanır, bu da onu VAD'lerin in vitro kan testini yapan çoğu laboratuvar için erişilebilir hale getirir. Bu yöntemin faydasını, minyatür manyetik olarak havaya kaldırılmış bir pediatrik VAD'nin (PediaFlow PF5) yinelemeli testi ve iyileştirilmesi yoluyla gösterdik. Yöntem, erken VAD prototiplerindeki tasarım ve üretim kusurlarının neden olduğu trombojenik sıcak noktaların belirlenmesinde etkili olmuş ve hayvan çalışmalarına geçmeden önce hedeflenen iyileştirmeleri mümkün kılmıştır. Pulsatil akışın olmaması ve donör kan özelliklerinin etkisi de dahil olmak üzere sınırlamalarına rağmen, bu protokol erken evre VAD gelişimi ve risk azaltma için pratik bir araç olarak hizmet eder.

Giriş

Ventriküler destek cihazları (VAD'ler) ileri kalp yetmezliği olan hastaların tedavisinde bir bakım standardı haline gelmiştir, ancak tromboz ve inme riski önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir 1,2. VAD'ler içindeki tromboz tipik olarak, değerli olmakla birlikte, önemli maliyetler ve lojistik zorluklar sunan klinik öncesi hayvan çalışmaları sırasında değerlendirilir. Bu çalışmalar kaynak yoğundur, zaman alıcıdır ve tüm testi tehlikeye atan ve ek denemeler gerektiren tek bir kusura karşı hassastır. Bu sadece mali yükü artırmakla kalmaz, aynı zamanda tekrarlanan hayvan testlerine duyulan ihtiyaç nedeniyle etik kaygıları da gündeme getirir.

Trombosit birikimini ve trombozu tahmin etmek için birçok sayısal model olmasına rağmen 3,4,5,6, VAD 7,8,9 gibi makro ölçekli cihazlarda trombüs oluşumunu simüle etmek için sadece birkaçı uygundur. Dahası, mevcut modeller kaçınılmaz olarak idealize edilmiş yüzeyler ve basitleştirilmiş "su geçirmez" geometriler varsayar ve bu da gerçek dünyadaki pompa tertibatlarının karmaşıklıklarını ve kusurlarını doğru bir şekilde yansıtmaz. Trombosit-yüzey etkileşimleri göz önüne alındığında, bu makro ölçekli modeller genellikle tek tip olarak öngörülen malzeme özelliklerini kullanır (tipik olarak yüzey-akı sınır koşullarında bir katsayı olarak modellenir)10,11,12. Sonuç olarak, sayısal modeller kanla yapılan deneysel testlerin yerini tamamen alamaz.

Hem malzeme seçimi hem de yüzey kalitesi, VADyüzeylerine trombosit yapışmasında kritik rol oynar 13,14,15,16,17. Pürüzlü noktalar veya düzensizlikler gibi kusurlar trombosit yapışmasını ve trombüs oluşumunu teşvik edebilir. Ek olarak, akış yolundaki bileşenler arasındaki yarıklar tromboz için bir nidus görevi görebilir ve pıhtıların oluşabileceği ve büyüyebileceği korumalı ortamlar sağlayabilir18,19. Montaj sırasında gres, yağlayıcı veya sızdırmazlık maddelerinin kullanılması da risk oluşturabilir, çünkü bu maddeler akış yoluna sızabilir ve kanla etkileşime girerek komplikasyon riskini daha da artırabilir.

Bu nedenle, hayvan testlerine veya klinik kullanıma tabi tutulmadan önce VAD'lerin trombodirencini güvenilir bir şekilde değerlendirebilen iyi tanımlanmış bir in vitro test protokolüne ihtiyaç vardır. Hemoliz20'nin değerlendirilmesi için yaygın olarak kabul edilen bir ASTM standardı olmasına rağmen, klinik olarak ilgili çalışma koşulları21 altında VAD'lerin trombojenisite testi için böyle bir standart mevcut değildir. Kan pompaları için in vitro tromboz testinin fizibilitesini gösteren otuz yıl öncesine dayanan ufuk açıcı çalışmalararağmen 22,23,24,25, hayvan testleri bugüne kadar trombozu değerlendirmek için fiili uygulama olarak devam etmiştir 26. İn vitro yöntemlerin daha geniş çapta benimsenmesinin önündeki engel, muhtemelen pıhtılaşmanın karmaşık doğası olmuştur ve test sonuçlarını etkileyebilecek çok sayıda kafa karıştırıcı faktör ile içsel pompa trombojenisitesini metodolojik sınırlamalar ve prosedürel hatalar nedeniyle ortaya çıkan artefaktlardan ayırt etmeyi zorlaştırmaktadır.

Bu, deneycilerin tuzaklardan kaçınmaları için bir rehber olarak ayrıntılı bir protokolü paylaşmamızı motive etti, böylece in vitro testlerin kullanımını teşvik etti ve hayvan çalışmalarına olan bağımlılığı azalttı. Maruyama ve ark.27'den türetilen burada açıklanan protokol, 5. nesil PediaFlow (PF5) pediatrik VAD 28,29'un tasarımı sırasında rafine edilmiş ve doğrulanmıştır. Bu test yönteminin, hayvan testlerinden önce VAD prototiplerindeki potansiyel trombojenik risklerin sistematik olarak tanımlanmasında ve ele alınmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan küçükbaş hayvan tam kanı ticari bir satıcıdan elde edilmiştir ve bu nedenle Cornell Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından bir inceleme gerektirmemiştir.

1. Test akış döngüsünün inşası

NOT: Bu protokolde kullanılan döngü bileşenlerinin ve diğer tüm malzemelerin ayrıntılı bir listesi için Malzeme Tablosuna bakın.

  1. İntravenöz (IV) torbayı değiştirin.
    1. Şekil 1'de gösterildiği gibi, hacmini ve şeklini ayarlamak için bir IV torbasını değiştirmek için plastik bir ısı yalıtım malzemesi kullanın.
      NOT: Torbanın şekli havanın alınmasını kolaylaştırır ve torbanın sıvı hattı30,31 boyunca bir hemostat ile kenetlenmesine izin verir. Sızdırmazlık hattının konumu, toplam 150 mL'lik bir astarlama hacmi elde etmek için VAD'ın ve borunun astarlama hacmine göre seçilir.
    2. Torbanın üst kısmında 4 mm'lik bir kesi yaparak bir havalandırma deliği açın. Kesizyona dikenli bir dişi luer kilidi yerleştirin ve bölgeyi RTV silikon kauçuk yapıştırıcı ile kapatın. Luer kilidine tek yönlü bir musluk takın.
  2. Şekil 3'de gösterildiği gibi modifiye edilmiş IV torbası, polivinil klorür (PVC) boru, polikarbonat dikenli konektörler ve 1 ve 1 muslukları kullanarak test döngüsünü monte edin.
  3. Basınç manometresini bağlayın.
    1. 6 inçlik uzatma hatlarını giriş ve çıkış tarafındaki basınç bağlantı noktalarına takın. Uzatma hattının diğer ucuna tek yönlü bir musluk takın.
      NOT: Vana, adım 4.3'te açıklandığı gibi, pompayı çalıştırmadan önce uzatma hattını sıvıyla doldurmak için manometre borusunun bağlantısının kesilmesine izin verir.
    2. Her 1/8" iç çaplı (ID) borunun bir ucunu bir manometre dikenine bağlayın ve diğer uca bir erkek luer bağlantı parçası yerleştirin.
    3. Erkek luer bağlantı parçalarını tek yönlü musluklara bağlayın. Basınç okumalarını etkinleştirmek için vanaları açın.
  4. Akış hızını ölçmek için kelepçeli bir ultrasonik akış probu uygulayın.
  5. Akış direncini düzenlemek için çıkış basınç portunun distaline bir Hoffman kelepçesi yerleştirin.

2. Kalsiyum klorür (CaCl2) çözeltisinin hazırlanması

  1. 1 M'lik bir çözelti hazırlamak için toz haline getirilmiş CaCl2'yi 1x TRIS tamponlu salin (pH 7.4) içinde çözün. Kalsiyum ve fosfat çözünmeyen bir çökelti oluşturmak üzere reaksiyona girdiğinden fosfat içeren tamponlardan (örneğin, PBS veya DPBS) kaçının.
  2. CaCl2'yi büyük miktarlarda hazırlıyorsanız, çözünmesi ekzotermik bir işlem olduğundan, CaCl2 tozunu birkaç adımda aşamalı olarak ekleyin.
  3. Gerekirse hidroklorik asit (HCl) veya sodyum hidroksit (NaOH) kullanarak çözeltinin pH'ını 6-8'e titre edin.

3. Kanın hazırlanması

NOT: Bu çalışmada kullanılan küçükbaş kanı, Malzeme Tablosunda listelenen ticari bir satıcıdan elde edilmiştir. Kan, 14 G'lik bir iğne kullanılarak toplandı ve hayvan standart bir tarımsal ayakta durma pozisyonunda tutuldu. Toplama işlemi iğne batırılmasından tamamlanmasına kadar 10-12 dakika sürdü. Kan, 14 kısım CPD ila 86 kısım kan ile antikoagüle edildi (CPD formülasyonu: 26.3 g / L Na-Sitrat, 25.2 g dekstroz, 3 g / L sitrik asit ve deiyonize [DI] suda 2.2 g / L Na Fosfat). Kan torbası, gece boyunca buz paketleri ile yalıtılmış bir kapta sevk edildi ve toplandıktan sonraki 24 saat içinde deney için kullanıldı.

  1. Donör kanını kullanım için hazırlayın.
    1. Kanı nazikçe karıştırmak ve oda sıcaklığına (RT) ulaşmasını sağlamak için kan torbasını 15-30 dakika boyunca eğilebilir bir platforma yerleştirin.
    2. Kan transferi için belirlenmiş bir polikarbonat kabın içine manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
    3. Makroagregaları çıkarmak için kanı bir transfüzyon filtresinden behere aktarın. Hücresel bileşenlere zarar vermemek için kanı nazikçe tutun. Serbest düşmeyi önlemek ve hücresel travmayı en aza indirmek için kanı kap duvarları boyunca dökün.
      NOT: Büyük trombüs varsa veya filtre tıkanırsa kanı atın.
    4. Beheri veya kabı manyetik bir karıştırıcı üzerine yerleştirin ve kanın yüzeyi büyük bir girdap oluşturmadan hafifçe dönmeye başlayana kadar hızı ayarlayın. En az 5 dakika sürekli karıştırın.
    5. Değerlerin türler için normal aralıkta olduğundan emin olmak için hematokrit ve trombosit sayısını ölçün.
  2. Hedef CaCl2 konsantrasyonunu belirlemek için titrasyonlar gerçekleştirin.
    NOT: Sitrat kan, pıhtılaşma ve tromboz testini sağlamak için yeniden kalsifiye edilir ve kaçak pıhtılaşmayı önlemek için heparin eklenir. Testin başlangıcı için hedef aktif pıhtılaşma süresi (ACT) 300 saniyedir. Bu bölümde verilen referans ACT değerlerinin donör koyun kanı kullanılarak elde edildiğini ve türe ve toplama sırasında kullanılan antikoagülasyon seviyesine bağlı olarak değişebileceğini lütfen unutmayın. Ek olarak, ACT ölçümleri 32,33,34 cihazları arasında değişebilir. Belirli bir laboratuvar kurulumu için en uygun ACT aralığını belirlemek için biraz deneme yanılma gerekebilir.
    1. Stok çözeltilerinin kontaminasyonunu önlemek için hazırlanan 1 M CaCl2 çözeltisinin 2 mL'sini ve 0.5 mL heparin sodyumunu (1000 U / mL) üreticinin ambalajından mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
    2. 10 mL kanı 14 mL polipropilen test tüplerine aktarın. Bu tür dört tüp hazırlayın.
    3. Kanda 0.5 U / mL heparin konsantrasyonu elde etmek için, 10 mL kan örneğine 5 μL heparin sodyum ekleyin.
    4. Kanda 5 mM'lik bir kalsiyum konsantrasyonu elde etmek için, 10 mL kan örneğine 50 μL 1 M CaCl2 çözeltisi ekleyin. Dağıtım sırasında, CaCl2'yi daha geniş bir alana dağıtmak için pipet ucunu döndürün.
    5. Tüpü hemen 10 kez ters çevirin, yatay olarak yuvarlayın (düz bir yüzeyde veya avuç içi arasında), ardından iyice karıştırmayı sağlamak için 10 kez daha ters çevirin.
    6. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir bakım noktası tam kan pıhtılaşma sistemi kullanarak ACT'yi ölçün. İlk ACT tipik olarak 400-500 s arasında değişecektir.
    7. Heparin konsantrasyonunu sabit tutarken, 300 s'lik bir ACT elde etmek için CaCl2 konsantrasyonunu (yaklaşık 7-8 mM'ye) artırın.
    8. Son konsantrasyonu ve elde edilen ACT'yi ayrı bir kan tüpünde doğrulayın.

4. Test öncesi prosedürler

NOT: Bu bölümde açıklanan tüm adımlar Bölüm 5 ve 6 için geçerlidir. Pompayı döngüde sığır serumu, albümin (BSA) veya kan ile çalıştırmadan önce bu adımları gerçekleştirin. Mekanik stresi en aza indirmek için yerçekimi beslemesini kullanarak damarlar arasında kan aktarın. Aşırı basınç oluşturabileceğinden, kanı sürmek için şırınga pistonunu kullanmaktan kaçının. Ek olarak, hücresel bileşenlere zarar vermemek için dar açıklıklardan kanı boğmaktan kaçının.

  1. Test döngüsünün doldurulması ve boşaltılması
    1. Enjeksiyon portuna 30 inçlik bir uzatma hattı takın ve 60 mL'lik bir şırınga namlusunu huni olarak bağlayın. Havalandırma deliği görevi görmesi için rezervuar vanasını açın.
    2. Sıvıyı huniye dökün ve dosyalamayı hızlandırmak için gerektiği kadar yükseltin. Halkayı, torbanın üst kısmındaki havalandırma deliğinin 1-2 cm altına kadar doldurun. Havalandırma deliğini ve enjeksiyon portu musluklarını kapatın.
    3. Boşaltmak için havalandırma deliğini ve enjeksiyon portu musluklarını açın ve huniyi tezgah seviyesinin altına indirin. Kalan sıvıyı boşaltmak için pompayı drenaj portunun üzerine kaldırın.
  2. Test döngüsünün havasının boşaltılması
    NOT: Pompayı çalıştırmadan önce döngüyü BSA veya kanla doldururken bu prosedürü gerçekleştirin.
    1. Döngünün herhangi bir yerinde hava sıkışmadığından emin olun. Boruya ve rezervuara hafifçe vurarak ve sıkarak yüzeylerdeki hava kabarcıklarını çıkarın.
    2. Eksenel akışlı bir kan pompasını değerlendiriyorsanız, kaldırma kuvveti yoluyla herhangi bir havayı serbest bırakmak için dikey konuma döndürün. Santrifüj pompa kullanıyorsanız, ikincil akış yollarında hava sıkışmadığından emin olmak için ters çevirin ve döndürün.
    3. Hava kabarcığı olmadığından emin olmak için borunun yatay bölümlerini ve boru ile konektörler arasındaki bağlantıları yakından inceleyin.
    4. Sıvı seviyesini üst dar kısma yaklaştırmak için IV torbasını sıkın ve sıvı-hava arayüzünü ortadan kaldırmak için torbayı sıvı hattı boyunca bir hemostat ile sıkıştırın. Havalandırma vanasını kapatın.
  3. Basınç hatlarının ve numune alma portunun doldurulması
    1. Basınç hatlarının sonundaki vanayı kapatın, manometre hortumunu çıkarın ve 3 mL'lik bir şırınga takın. Vanayı açın ve uzatma hattına (yaklaşık 4 cm) 1-2 mL sıvı çekin.
    2. Vanayı kapatın, şırıngayı çıkarın ve manometre borusunu yeniden bağlayın. Basınç okumalarını etkinleştirmek için vanayı açın.
    3. Örnekleme portunu bir şırınga kullanarak astarlayın.
  4. Enjeksiyon ve numune alma portlarının temizlenmesi
    1. Tüy bırakmayan bir mendili üç eşit parçaya kesin veya yırtın. Bir parçanın köşesini bir uç oluşturacak şekilde bükün ve kalan kanı emmek için porta yerleştirin.
    2. İkinci parçayı bükün, tuzlu suyla nemlendirin ve ıslak ucu porta yerleştirin. Kalan tüm kanı çıkarmak için portun etrafında çevirin.
    3. Limanda kalan tuzlu suyu emmek için üçüncü parçayı kullanın.
      NOT: Bu temizleme prosedürünü bir kan örneği çektikten hemen sonra veya portlarda artık kan olduğunda gerçekleştirin.

5. Kanla temas eden yüzeylerin pasifleştirilmesi

  1. Döngüyü %1 BSA solüsyonu ile doldurun ve VAD'yi en az 30 dakika dolaştırmak için çalıştırın.
  2. Döngüde sızıntı olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse yeniden monte edin.
  3. Hemodilüsyonu önlemek için BSA çözeltisini tamamen boşaltın.

6. Tromboz testi

  1. Test döngüsünü hazırlayın.
    1. Döngüyü 150 mL kanla doldurun.
    2. Döngüyü havadan alın ve basınç hatlarını ve s'yi doldurunamp4.2-4.4 adımlarında açıklandığı gibi port.
    3. Pompayı düşük bir hızda çalıştırın ve pompa içinde sıkışan hava kabarcıklarını çıkarmak için yaklaşık 5 saniye çalıştırın, ardından pompayı durdurun.
    4. Torbada herhangi bir kabarcık oluşursa, hava alma işlemini tekrar gerçekleştirmek için adım 4.2'yi tekrarlayın.
    5. Döngüdeki kanı dolaştırmak için pompayı düşük bir hızda yeniden başlatın.
  2. Döngüdeki kana heparin ekleyin.
    1. Test sırasında kullanım kolaylığı için 1 mL heparin sodyum (1000 U/mL) ve 1.5 mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA; 0.5 M) üreticinin ambalajından ayrı tüplere aktarın.
    2. Bir şırınga kullanarak maddeleri döngüye uygulamak için 3 musluğun enine portunu kullanın. Musluk üzerindeki erkek luer kilidini, üstteki hava kabarcıklarını yakalamak için enjeksiyon portu yukarı bakacak şekilde çevirin.
    3. 150 mL kana 75 U heparin sodyum ekleyerek döngüde 0.5 U / mL'lik bir heparin konsantrasyonu elde edin. 75 U heparini (1000 U / mL konsantrasyon kullanılıyorsa 75 μL) bir mikropipete aspire edin ve aynı anda pipeti dağıtarak ve şırınga pistonunu çekerek 3 mL'lik bir şırıngaya dağıtın. Tüm sıvının dökülmeden aktarıldığından emin olun.
    4. Şırıngayı, port yukarı bakacak ve şırınga ucu dikey olarak aşağı bakacak şekilde, luer kilidi aracılığıyla enjeksiyon portuna takın. Şırınga pistonunu kanla doldurmak için çekin ve şırıngaya herhangi bir hava aspire ederken heparini kanla karıştırın. Hava kabarcığının şırınganın üstüne yükselmesine izin verin. Karışımı ilmeğin içine enjekte edin ve hava girmediğinden emin olun.
    5. Heparinize kanın porttaki boşlukla sınırlı kalmamasını sağlamak için şırınganın içine ve dışına 4-5 kez kan akıtın. Döngüye hava girmediğinden emin olun.
  3. Döngüdeki kanın ACT'sini titre edin.
    1. Heparin ile aynı prosedürü kullanarak 150 mL kana 750 μL 1 M CaCl2 çözeltisi ekleyerek döngüde 5 mM'lik bir başlangıç kalsiyum konsantrasyonu elde edin.
      1. Yüksek kalsiyum konsantrasyonlarına maruz kalan kan, şırıngada pıhtılaşmaya başlayabilir. Kalan havayı çıkardıktan sonra sıvıyı hızlı bir şekilde enjekte edin. İsteğe bağlı olarak, erken pıhtılaşma riskini azaltmak için şırıngadaki CaCl2'yi 1 ml TRIS tamponlu salin ile seyreltin.
    2. İlk ACT'yi ölçmek için bir kan örneği almadan önce enjekte edilen CaCl2'nin en az 2 dakika döngüde dolaşmasına izin verin.
    3. Örnekleme portuna 1 mL'lik bir şırınga takın. Durgun kanı porttan temizlemek için 0,5 mL atık kan çekin ve atın.
    4. Yeni bir 1 mL şırınga takın, analiz için 0,5 mL kan alın ve ACT'yi ölçün. Adım 4.4'teki prosedürü kullanarak örnekleme portunu temizleyin.
    5. Hedef CaCl2 konsantrasyonunu bildirmek için adım 3.2'deki titrasyon değerlerine bakın. 300 s'lik bir ACT elde etmek için kalsiyum konsantrasyonunu kademeli olarak artırın. Hızlı pıhtılaşmayı önlemek için CaCl2'nin tamamını bir kerede eklemekten kaçının.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan testte, 5 mM'lik başlangıç kalsiyum konsantrasyonu 450 ± 50 s'lik ACT ile sonuçlandı ve 7-8 mM'lik nihai konsantrasyon 300 ± 20 s'lik ACT verdi. Bu yanıt değişebilse de, testin başlangıcı için ACT'yi 300 s'ye veya altına getirmeyi hedefleyin.
  4. Testi başlatın.
    1. Döngüde 300 s'lik ACT elde edildiğinde, 1 saatlik teste başlayın. Rotor hızını değiştirerek ve Hoffman kelepçesini kullanarak direnci düzenleyerek pompayı istenen akış hızına ve basınca ayarlayın.
    2. 6.3.3-6.3.4 adımlarını izleyerek ACT'yi her 15 dakikada bir ölçün.
    3. ACT 200 s'nin altına düşerse, döngüye 25 U daha heparin sodyum enjekte edin.
  5. Testi sonlandırın.
    1. 1 saatin sonunda, daha fazla pıhtılaşmayı önlemek için döngüye EDTA enjekte edin ve kanda 5 mM'lik bir nihai konsantrasyonu hedefleyin. (0,5 M EDTA çözeltisi kullanıyorsanız 1,5 mL enjekte edin.)
    2. EDTA'nın dolaşmasına ve 2 dakika karışmasına izin verin, ardından pompayı durdurun.
  6. Pompanın bağlantısını kesin ve yıkayın.
    1. Pompa girişine ve çıkışına bağlı boruyu kanama durdurucular kullanarak kelepçeleyin, kelepçeleri giriş ve çıkış dikenlerinden 3-4 cm uzağa yerleştirin.
    2. Pompayı serbest bırakmak için boruyu dikkatlice ayırın.
    3. Kanı pompadan boşaltın ve döngüyü bir kaba akıtın.
    4. Pompada kalan kanı, pompa giriş ve çıkışından yerçekimi ile besleyerek veya tuzlu su pipetleyerek yıkayın.
      NOT: Adım 6.7 ve 6.8 aynı anda gerçekleştirilir.
  7. Pompa akış yolunu kontrol edin.
    1. Bir endoskop / boreskop kamera kullanarak pompa giriş ve çıkışının görüntülerini yakalayın.
    2. Pompayı sökün (varsa). Bileşenleri tuzlu su banyosunda yıkayın ve bir diseksiyon dürbünü veya makro lens kullanarak trombüs olup olmadığını kontrol edin.
    3. Dokümantasyon için kanla temas eden yüzeylerin fotoğrafını çekin.
      NOT: Tutarlı inceleme ve kapsamlı dokümantasyon, karşılaştırmalı testler için kritik öneme sahiptir.
  8. Kullanılmış kanı süzün.
    1. Bir toplama kabının açıklığını kaplayacak kadar büyük 100 μm'lik bir naylon örgü kumaş parçası kesin.
    2. Kanın içinden etkili bir şekilde akmasına izin vermek için ağı hafif bir örtü ile kabın üzerine yerleştirin. Filtreleme sırasında kaymasını önlemek için ağın kenarlarını sabitleyin.
    3. Kullanılmış kanı naylon ağdan geçirin. Kanı kurumun biyolojik atık işleme yönergelerine göre atın.
    4. Yakalanan trombüsler için ağı inceleyin ve bulguları belgeleyin.
  9. Histolojik analiz için hazırlanın.
    1. Histolojik analiz planlanıyorsa, uygun güvenlik prosedürlerini izleyerek formalin çözeltisinde bulunan herhangi bir trombüsü düzeltin.
      DİKKAT: Formaldehitle çalışırken daima çeker ocak kullanın.

7. Temizleme prosedürü

  1. Akış döngüsünü sökün. PVC kan torbasını ve hortumunu atın.
  2. Kanla temas eden diğer tüm bileşenleri (konektörler, musluklar, luer kilitleri vb.) gece boyunca %1 enzim aktif toz deterjan solüsyonuna batırın. Ilık musluk suyuyla, ardından DI suyla durulayın ve havayla kurutun.
    1. Pıhtılar kalırsa, deterjan çözeltisindeki bileşenleri sonikleştirin. İyice durulayın ve havayla kurulayın.
  3. Pompayı temizleyin.
    1. Pompa demonte edilebiliyorsa, kanla temas eden bileşenleri %1'lik çok amaçlı bir temizleyici/yağ çözücü solüsyonu, ardından %1'lik bir enzim aktif toz deterjan solüsyonu ile ıslatın ve sonikleştirin.
    2. Pompa demonte edilemiyorsa, temizleme solüsyonlarıyla dolu yeni bir akış döngüsüne bağlayın ve en az 30 dakika yüksek hızda çalıştırın. Gerektiği kadar tekrarlayın.
  4. Pompayı ılık musluk suyuyla, ardından DI suyla iyice durulayın ve havayla kurutun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması, trombosit birikiminin lokalize alanlarının tanımlanmasını sağlayarak pompanın akış yolundaki sorunlu noktaları ortaya çıkarır. Bu protokolün tutarlı bir şekilde uygulanması, tanımlanan bu "sıcak noktaları" ele alarak artımlı iyileştirmelere izin verir.

Örneğin, PediaFlow PF5 VAD'nin geliştirilmesi sırasında, bileşenlerin minyatür boyutu nedeniyle stator kanatlarının basınç tarafının manuel olarak parlatılmasında zorluklarla karşılaştık. İn vi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yeni bir pompanın ilk insan denemesi her zaman tehlikeli bir çabadır, çünkü klinik öncesi çalışmalar insanlarda VAD'lerin trombojenisitesini güvenilir bir şekilde tahmin edemez26. Özellikle, hayvan deneylerinde trombozdan kurtulma özgürlüğü gösteren bazı VAD'ler daha sonra klinik kullanımda önemli trombojenisite sergilemiştir36. Trombozu provoke etmek için özel olarak tasarlanmış agresif bir in vitro test rejimi, geliştirme sürecin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

S.E.O. şu anda Magenta Medical için danışman olarak görev yapmaktadır ve daha önce Boston Scientific'te danışman olarak görev yapmıştır. Başka hiçbir yazarın bildirecek herhangi bir ilgili finansal açıklaması veya çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe R01HL089456 ve ABD Ordusu Tıbbi Araştırma Satın Alma Faaliyeti Projesi W81XWH2010387 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
14 mL test tüpleriFalcon352059Geçmeli kapaklı yuvarlak tabanlı polipropilen test tüpleri
1 muslukQosina99759Dişi Luer Kilidi, Döndürme Kilitli Erkek Luer
3 muslukQosina997712 Dişi Luer Kilidi, Dönen Erkek Luer Kilidi
Werfen 000JACT+45/Boxiçin ACT+ küvetler
Çok amaçlı temizleyici/yağ çözücüSimple Green2710200613005Simple Green Temizleyici ve Yağ Çözücü. % 1 çözelti kullanın.
Dikenli konektörlerQosina73311Malzeme: polikarbonat; ¼ ” X & Frac14; ” düz konektör
Luer kilitli dikenli konektörlerQosina73316Malzeme: polikarbonat; ¼ ” X & Frac14; ” luer kilitli düz konektör
Sığır Serum Albümini (BSA)Thermo Scientific ChemicalsAAJ6465522Veya eşdeğeri
Kalsiyum klorür, CaCl < alt > 2 < / alt >Termo Bilimsel KimyasallarAA89866-30Susuz, & ge; %96,0 ACS
Diseksiyon kapsamı (önerilir)Olympushttps://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/ Olympus SZH10 (sürekli yakınlaştırma büyütme 7x - 70x) veya benzeri
DPBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan)Gibco14200075Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu, kalsiyum yok, magnezyum yok, 10X (kullanımdan önce 1X'e seyreltilmelidir)
EDTAKaliteli Biyolojik351-027-721EA0.5 M, pH 7.0– 8.0 (Etilendiamintetraasetik asit)
Endoskop / borescope / otoskop kamera (isteğe bağlı)Bebirdhttps://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers3– 4 mm prob çapı
Enzim aktif toz deterjanAlconox1304-1Alconox Tergazyme. % 1 çözelti kullanın.
Uzatma Hattı, 30 "Qosina 3621830 "uzunluk,   erkek luer kilidine dişi luer kilidi
Uzatma Hattı, 6 "Qosina 362126 "uzunluk,   erkek luer kilidine dişi
luer kilidi Dişi luer kilidi, dikenliQosina115481/8 inç ID Boruya uyar; Malzeme: Polikarbonat;
Akış ölçerTransonikhttps://www.transonic.com/t402-t403-consolesTransonik TS410 modülü
HemostatFisherbrand13-820-004En az 5 cm uç uzunluğuna sahip kilitli kanama durdurucu
Heparin SodyumMcKesson Paketleme Hizmetleri9495131000 U/mL konsantrasyonlu
Hoffman kelepçeHumboldtH8720İnce dişli kelepçe
IV torba (uyumlu kan deposu)Qosina51494Malzeme: PVC, 2 Tüp portu 0.258 "ID. 100 ml'lik torba, ısıyla kapatan bir bez kullanılarak modifiye edilmiştir
Tüy bırakmayan mendillerKimberly-Clark Professional34120Kimtech Bilim Silecekleri
Manyetik karıştırıcıINTLLABMS-500Veya benzeri
Erkek luer kilidi, dikenliQosina115491/8 inç ID Boruya uyar; Malzeme: Polikarbonat;
Manometre (dijital)Sper Scientific840081SPER-840081 veya benzeri
Naylon filtreleme ağıMcMaster-Carr9318T21100-μ m (0.0039") açılış boyutu
Küçükbaş kanLampire 7209004Donör tam kan, ACD 14:86 ile antikoagüle, gece boyunca gönderilir
Plastik torba ısı mühürleyenUlineH-190Uline H-190 veya benzeri (kesicisiz)
Silikon kauçuk yapıştırıcıPürüzsüz B00IRC1YI0Sil-Poxy veya benzeri
Luer kilitli şırınga, 1 mLFisher Scientific14-955-646Fisherbrand araştırma amaçlı iğnesiz manuel şırınga
Luer kilitli şırınga, 3 mLFisher Scientific14-955-457Araştırma amaçlı iğnesiz Fisherbrand manuel şırınga
Luer kilitli şırınga, 60 mLFisher Scientific14-955-461Fisherbrand araştırma amaçlı iğnesiz manuel şırınga
Transfüzyon filtresiHaemonetics Corporation SQ40S/SQ40NSHematetik Şirketi SQ40S pall kan transfüzyon filtresi
TRIS Tamponlu SalinTermo Bilimsel KimyasallarAAJ62938K2TBS 10x (kullanmadan önce 1X'e seyreltilmelidir), pH 7.4
BoruTygonADF00017Tygon ND-100-65 boru (tıbbi sınıf)
Ultrasonik akış sensörüTransonikhttps://www.transonic.com/hqxl-flowsensorsKullanılan boru boyutu için uygun akış sensörü modelini seçin. ME6PXL kelepçeli sensör 3/8" OD boruları. Sensör, test sıvısı (örn. 24C'de kan) ve boru sınıfı (örn. Tygon ND-100-65) için Transonic tarafından kalibre edilir.
Ultrasonik sonikatör (isteğe bağlı)Branson UltrasonikCPX952238RBranson CPX2800H veya benzeri
VAD sistemiPediaFlowPF5Test edilecek VAD sistemi; pompa ve kontrolörü içerir
Tam Kan Pıhtılaşma SistemiWerfenhttps://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-eliteHemochron Signature Elite veya Signature Jr
Hemochron

Kaynaklar

  1. Kirklin, J. K., et al. Eighth annual INTERMACS report Special focus on framing the impact of adverse events. J Heart Lung Transplant. 36 (10), 1080-1086 (2017).
  2. Kormos, R. L., et al. The Society of Thoracic Surgeons Intermacs Database Annual Report: Evolving indications, outcomes, and scientific partnerships. Ann Thorac Surg. 107 (2), 341-353 (2019).
  3. Leiderman, K., Fogelson, A. An overview of mathematical modeling of thrombus formation under flow. Thromb Res. 133 (SUPPL. 1), S12-S14 (2014).
  4. Anand, M., Rajagopal, K. A short review of advances in the modelling of blood rheology and clot formation. Fluids. 2 (3), 35(2017).
  5. Belyaev, A. V., Dunster, J. L., Gibbins, J. M., Panteleev, M. A., Volpert, V. Modeling thrombosis in silico: Frontiers, challenges, unresolved problems and milestones. Phys Life Rev. 26- 27, 57-95 (2018).
  6. Manning, K. B., Nicoud, F., Shea, S. M. Mathematical and computational modeling of device-induced thrombosis. Curr Opin Biomed Eng. 20, 100349(2021).
  7. Wu, W. T., Yang, F., Wu, J., Aubry, N., Massoudi, M., Antaki, J. F. High fidelity computational simulation of thrombus formation in Thoratec HeartMate II continuous flow ventricular assist device. Sci Rep. 6 (Decemeber), 1-11 (2016).
  8. Méndez Rojano, R., Lai, A., Zhussupbekov, M., Burgreen, G. W., Cook, K., Antaki, J. F. A fibrin enhanced thrombosis model for medical devices operating at low shear regimes or large surface areas. PLoS Comput Biol. 18 (10), e1010277(2022).
  9. Taylor, J. O., Meyer, R. S., Deutsch, S., Manning, K. B. Development of a computational model for macroscopic predictions of device-induced thrombosis. Biomech Model Mechanobiol. 15 (6), 1713-1731 (2016).
  10. Strong, A. B., Stubley, G. D., Chang, G., Absolom, D. R. Theoretical and experimental analysis of cellular adhesion to polymer surfaces. J Biomed Mater Res. 21 (8), 1039-1055 (1987).
  11. Sorensen, E. N., Burgreen, G. W., Wagner, W. R., Antaki, J. F. Computational simulation of platelet deposition and activation: I. Model development and properties. Ann Biomed Eng. 27 (4), 436-448 (1999).
  12. Wu, W. -T., Jamiolkowski, M. A., Wagner, W. R., Aubry, N., Massoudi, M., Antaki, J. F. Multi-constituent simulation of thrombus deposition. Sci Rep. 7 (1), 42720(2017).
  13. Yamane, T. How Do We Select Materials. Mechanism of Artificial Heart. , Springer. Tokyo. (2016).
  14. Sin, D., Kei, H., Miao, X. Surface coatings for ventricular assist devices. Expert Rev Med Devices. 6 (1), 51-60 (2009).
  15. Zhang, M., Tansley, G. D., Dargusch, M. S., Fraser, J. F., Pauls, J. P. Surface coatings for rotary ventricular assist devices: A systematic review. ASAIO J. 68 (5), 623-632 (2022).
  16. Linneweber, J., Dohmen, P. M., Kerzscher, U., Affeld, K., Nosé, Y., Konertz, W. The effect of surface roughness on activation of the coagulation system and platelet adhesion in rotary blood pumps. Artif Organs. 31 (5), 345-351 (2007).
  17. Jayaraman, A., Kang, J., Antaki, J. F., Kirby, B. J. The roles of sub-micron and microscale roughness on shear-driven thrombosis on titanium alloy surfaces. Artif Organs. 47 (3), 490-501 (2023).
  18. Jamiolkowski, M. A., Pedersen, D. D., Wu, W., Antaki, J. F., Wagner, W. R. Visualization and analysis of biomaterial-centered thrombus formation within a defined crevice under flow. Biomaterials. 96, 72-83 (2016).
  19. Zhussupbekov, M., Wu, W. -T., Jamiolkowski, M. A., Massoudi, M., Antaki, J. F. Influence of shear rate and surface chemistry on thrombus formation in micro-crevice. J Biomech. 121, 110397(2021).
  20. ASTM F1841-19: Standard practice for assessment of hemolysis in continuous flow blood pumps. , ASTM International. At https://www.astm.org/f1841-19.html (2019).
  21. Sarode, D. N., Roy, S. In vitro models for thrombogenicity testing of blood-recirculating medical devices. Expert Rev Med Devices. 16 (7), 603-616 (2019).
  22. Swier, P., Bos, W. J., Mohammad, S. F., Olsen, D. B., Kolff, W. J. An in vitro test model to study the performance and thrombogenecity of cardiovascular devices. ASAIO Trans. 35 (3), 683-686 (1989).
  23. Schima, H., et al. In vitro investigation of thrombogenesis in rotary blood pumps. Artif Organs. 17 (7), 605-608 (1993).
  24. Tayama, E., et al. In vitro thrombogenic evaluation of centrifugal pumps. Artif organs. 21 (5), 418-420 (1997).
  25. Paul, R., et al. In vitro thrombogenicity testing of artificial organs. Int J Artif Organs. 21 (9), 548-552 (1998).
  26. Jamiolkowski, M. A., Snyder, T. A., Perkins, I. L., Malinauskas, R. A., Lu, Q. Preclinical device thrombogenicity assessments: Key messages from the 2018 FDA, industry, and academia forum. ASAIO J. 67 (2), 214-219 (2021).
  27. Maruyama, O., Tomari, Y., Suciyama, D., Nishida, M., Tsutsui, T., Yamane, T. Simple in vitro testing method for antithrombogenic evaluation of centrifugal blood pumps. ASAIO J. 55 (4), 314-322 (2009).
  28. Olia, S. E., et al. Preclinical performance of a pediatric mechanical circulatory support device: The PediaFlow ventricular assist device. J Thorac Cardiovasc Surg. 156 (4), 1643-1651.e7 (2018).
  29. Borovetz, H. S., Olia, S. E., Antaki, J. F. Toward the Development of the PediaFlowTM Pediatric Ventricular Assist Device: Past, Present, Future. Appl Eng Sci. 11, 100113(2022).
  30. Herbertson, L. H., et al. Multilaboratory study of flow-induced hemolysis using the FDA benchmark nozzle model. Artif Organs. 39 (3), 237-248 (2015).
  31. Olia, S. E., Herbertson, L. H., Malinauskas, R. A., Kameneva, M. V. A reusable, compliant, small volume blood reservoir for in vitro hemolysis testing. Artif Organs. 41 (2), 175-178 (2017).
  32. Doherty, T. M., Shavelle, R. M., French, W. J. Reproducibility and variability of activated clotting time measurements in the cardiac catheterization laboratory. Catheter Cardiovasc Interv. 65 (3), 330-337 (2005).
  33. Chia, S., Van Cott, E. M., Raffel, C. O., Jang, I. -K. Comparison of activated clotting times obtained using Hemochron and Medtronic analysers in patients receiving anti-thrombin therapy during cardiac catheterisation. Thromb Haemost. 101 (03), 535-540 (2009).
  34. Li, H., Serrick, C., Rao, V., Yip, P. M. A comparative analysis of four activated clotting time measurement devices in cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Perfusion. 36 (6), 610-619 (2021).
  35. Hastings, S. M., Ku, D. N., Wagoner, S., Maher, K. O., Deshpande, S. Sources of circuit thrombosis in pediatric extracorporeal membrane oxygenation. ASAIO J. 63 (1), 86-92 (2017).
  36. Starling, R. C., et al. Unexpected abrupt increase in left ventricular assist device thrombosis. N Engl J Med. 370 (1), 33-40 (2014).
  37. Hastings, S. M., Deshpande, S. R., Wagoner, S., Maher, K., Ku, D. N. Thrombosis in centrifugal pumps: Location and composition in clinical and in vitro circuits. Int J Artif Organs. 39 (4), 200-204 (2016).
  38. Patel, M., Jamiolkowski, M. A., Vejendla, A., Bentley, V., Malinauskas, R. A., Lu, Q. Effect of temperature on thrombogenicity testing of biomaterials in an in vitro dynamic flow loop system. ASAIO J. 69 (6), 576-582 (2023).
  39. ASTM F2888-19: Standard practice for platelet leukocyte count-An in-vitro measure for hemocompatibility assessment of cardiovascular materials. , ASTM International. Available from: https://www.astm.org/f2888-19.html (2019).
  40. Patel, M., Serna, C., Parrish, A., Gupta, A., Jamiolkowski, M., Lu, Q. Alternative anticoagulant strategy to improve the test sensitivity of ASTM F2888-19 standard for platelet and leukocyte count assay. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 112 (12), e35514(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tromboz TestiKan Ak YoluTezgah st ProtokolAktive Edilmi P ht la ma S resiKalsiyum Klor r TitrasyonuTrombosit BirikimiPompa PrototiplemeHayvan Deneyleri Alternatifleri

İlgili makaleler