Bu çalışma, korunmuş floresan sinyalleri ile temizlenmiş tüm beyin ve omurilik örneklerinin çıkarılması ve hazırlanması için bir protokol sunmakta, sinirbilim araştırmalarını ilerletmek için deneysel verimliliği ve veri bütünlüğünü artırmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Beyin-Omurilik Örneklerinin Ekstraksiyonu ve Doku Temizleme Hazırlanması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Merkezi sinir sistemine odaklanan sinirbilim araştırmaları, hücre dağılımı, nöronal bağlantı ve moleküler dinamikler dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını gerektirir. Tüm beyin ve omuriliği araştırmak için geleneksel metodolojiler genellikle doku dilimlerini izole etmeyi, bölümlere ayırmayı ve taramayı ve ardından emek yoğun üç boyutlu görüntü rekonstrüksiyonu sürecini içerir. Bu geleneksel yaklaşım hem zaman alıcı hem de hantal olabilir. Doku temizleme ve tüm organ görüntüleme tekniklerindeki gelişmeler, tüm beyin ve omuriliğin analizinde devrim yaratmıştır. Bu yenilikçi yöntemlerin potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için, omurilik ile bağlantılarını korurken beyin örneklerini çıkarmak ve temizlemek çok önemlidir. Bu protokol, omuriliğe bağlı beyin örneklerinin hazırlanması için ekstraksiyon ve temizleme prosedürlerinin ana hatlarını çizen ayrıntılı ve sistematik bir kılavuz sağlar. Bu yaklaşım, bu süreçleri kolaylaştırarak, deneysel verimliliği ve veri bütünlüğünü önemli ölçüde artırır, böylece sinirbilim araştırmalarındaki ilerlemeleri teşvik eder ve merkezi sinir sisteminin karmaşıklıklarına ilişkin daha kapsamlı araştırmalar yapılmasını sağlar.
Giriş
Sinir dağılımının doğru haritalanması ve analizi, merkezi sinir sisteminin yapısal ve işlevsel organizasyonu hakkında değerli bilgiler sağlar, yenilikçi terapötik stratejilerin önünü açar ve nöral mekanizmalara ilişkin genel anlayışımızı geliştirir. Şu anda, araştırmacılara omuriliğe bağlı beyin örneklerinin hazırlanması ve çıkarılması ve başarılı doku temizliğinin elde edilmesi konusunda rehberlik edecek kapsamlı video eğitimleri eksiktir.
Birkaç doku temizleme yaklaşımı mevcuttur: hidrofobik, hidrofilik, hidrojel bazlı ve doku genişleme temizleme yöntemleri 1,2,3
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri, Hayvan Araştırmaları Raporlama In Vivo Deneyler (ARRIVE) kılavuzlarına ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışma, Şanghay Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Renji Hastanesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada 7-8 haftalık STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J suşlu erkek fareler (C57BL/6J x CBA kökenli) kullanıldı. Hayvanlar ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve standart kafeslerde (22 °C ± 2 °C, 12 saat / 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü, yiyecek ve su a....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J suşu erkek farelerde omurilik ile bağlantılı tüm beyni başarıyla izole eder. Ayrıca, floresan sinyallerin tam olarak korunmasını ve yakalanmasını sağlayarak numuneleri şeffaf hale getirerek orijinal floresanın bütünlüğünü koruyan net ve ayrıntılı görüntüler sağlar.
Şekil 1, sağlam bir beyin-omuriliği gösterir ve bu protokolde belirtilen diseksiyon adımlarının.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Önerilen deneysel protokol, beyinleri floresan nöral izleme virüsleri ile etiketlenmiş omuriliklere bağlı farelerin kullanılmasını içerir. Bu protokol, omuriliğe bağlı kalan tüm beyin örneklerinin hazırlanması hakkında kapsamlı ve ayrıntılı talimatlar sağlar. Protokol, araştırmacıların süreci hassas bir şekilde tekrarlayabilmelerini sağlamak için her adımı titizlikle özetler.
Bu protokoldeki birkaç kritik adım, temizleme ve görüntüleme kalitesinin iyileştirilm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.
Teşekkürler
Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (XY Sun'a 82101249 ve 82471204 NO'lu hibe verin). Çin Doktora Sonrası Araştırma Vakfı (XY Sun'a hibe NO. 2022M722125).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 ml şırınga | Shandong Weigao Grubu Tıbbi Polimer | ||
| 502 tutkal | Deli Grubu | ||
| BD insülin şırıngası | Becton, Dickinson ve Şirket | 328421 | |
| Bükme dişli diseksiyon forseps | Jinzhong | JD1050 | |
| Dairesel çelik kelepçe | Weili | ||
| İnce makas | Jinzhong | y00030 | |
| Hemostatik forseps diş ile bükülmüş | Jinzhong | J31020 | |
| Dişli düz hemostatik forseps | Jinzhong | J31010 | |
| İnfüzyon iğnesi 0.7mm | Nazik Grup | ||
| Işık kutusu ölçek hattı | Nuohai Yaşam Bilimleri | NH210901 | |
| Mikrodiseksiyon düz forseps | Jinzhong | WA3020 | |
| NobeliumSoftware | Nuohai Yaşam Bilimleri | Tarama yazılımı | |
| paraformaldehit | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltik pompalar | Nuohai Yaşam Bilimleri | NH1000 | |
| Peristaltik pompa kafası | Nuohai Yaşam Bilimleri | NH-15 | |
| Fosfat tamponlu salin | Servicebio | G4202 | |
| Sodyum heparin | Shanghai Pharma | H31022051 | |
| STOK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J suş fareleri | Jackson Laboratuvar | 007788 | |
| Düz dişli diseksiyon forseps | Jinzhong | JD1060 | |
| Doku temizleme Kiti (hidrofilik) | Nuohai Yaşam Bilimleri | NH-CR-210701 | |
| Doku kültürü tedavi edici 100mm x 20mm | NEST | 704001 | |
| Doku makası | Jinzhong | J21040 | |
| Sodyum pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Venüs makası | Jinzhong | YBC010 |
Kaynaklar
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
