Yöntem makalesi

Kanser Hücrelerinde Kodlamayan RNA'lar Arasındaki Sentetik Ölümcül Etkileşimleri Hedeflemek için Çift CRISPR-Girişim Stratejisi

DOI:

10.3791/67752

⸱

30 Mayıs 2025

 ,  ,  , 
1Chemical Genomics Centre of the Max Planck Society, 2Max Planck Institute of Molecular Physiology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, melanom hücrelerinde uzun kodlamayan RNA'ları hedefleyen ikili bir CRISPRi sistemi sunmaktadır. Potansiyel terapötik stratejiler için kansere özgü lncRNA etkileşimlerini belirleyerek kombinatoryal gen yıkımı ve sentetik ölümcül taramayı mümkün kılar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), insan genomunda 100.000'den fazla tahmin edilen, geniş ve işlevsel olarak çeşitli bir RNA molekülü sınıfını temsil eder. lncRNA'lar, protein kodlayan genlere kıyasla türler arasında daha az korunmuş olsalar da, gen regülasyonunda, kromatin etkileşimlerinde ve kanserin ilerlemesinde kritik roller oynarlar. Kansere katılımları onları umut verici terapötik hedefler haline getirir. KRAB-MeCP2 gibi bir transkripsiyonel baskılayıcı ile kaynaşmış katalitik olarak aktif olmayan Cas9 kullanan CRISPR girişimi (CRISPRi), nükleer lncRNA'ları hedeflemek ve işlevlerini değerlendirmek için kesin bir yöntem sunar. Bu çalışma, insan melanom hücrelerinde lncRNA'ların kombinatoryal hedeflemesi için optimize edilmiş, dCas9-KRAB-MeCP2'ye dayalı Staphylococcus aureus ve Streptococcus pyogenes'ten ortogonal CRISPRi teknolojilerini kullanan ikili bir CRISPRi sistemini tanıtmaktadır. Protokol, lncRNA çiftlerinin kombinatoryal gen yıkımını veya sentetik ölümcül taramasını kolaylaştırarak kanser araştırmaları için yeni bir araç sağlar. Bu yaklaşım, lncRNA'lar arasındaki sentetik ölümcüllüğü keşfederek, kanser hücresinin hayatta kalması için kritik olan lncRNA etkileşimlerini tanımlamaya yardımcı olabilir ve yeni terapötik stratejiler sunar. İkili sistemin işlevselliği gösterilmekte ve kritik kansere özgü lncRNA etkileşimlerini belirleme potansiyeli vurgulanmaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan melanom hücre hattı 501-mel (RRID: CVCL_4633), Aifantis Laboratuvarı (New York Üniversitesi) tarafından nazikçe sağlandı. Lenti-X 293T HEK hücre hattı Takara Bio'dan satın alındı. Bu hücre hatları, steril koşullar altında% 5 CO2 atmosferinde% 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM) yüksek glikozunda kültürlendi. Hücreler %80-90 birleşim noktasına ulaşana kadar geçirildi. Hücre hatları mikoplazma kontaminasyonu için düzenli olarak test edildi.

1. Çevrimiçi bir gRNA tasarım platformu kullanarak gRNA'ların tasarlanması

  1. Hangi varyantın üstün nakavt sonuçları verdiğini değerlendirmek için her hedef lncRNA için SpCas9'a özgü bir gRNA ve SaCas9'a özgü bir gRNA tasarlayın.
  2. İstenen lncRNA'ları, burada RP11-120D5.1 (RP11) ve XLOC_030781 (XLOC), her biri için en verimli gRNA'yı kullanarak hedefleyin S. pyogenes (gRNA-sp) Cas9 ve S. aureus (gRNA-sa) Cas9.
    NOT: S. pyogenes gRNA'ları Petroulia ve ark.28'den ekstrakte edilebilir.
  3. gRNA tasarım araçlarının önerdiği şekilde hedef dışı eşleşmeleri en aza indirirken, yüksek hedef puanlarla ifade edilen en yüksek hedef etkinliğine öncelik vermek için sahaya özel önerileri izleyin.
    1. GRCh38 (hg, Homo sapiens) genomunu seçin. Belirli SpCas9 (NGG) ve SaCas9 (NNGRRT) için PAM sitesini seçin.
    2. Hsu ve ark.29'un hedef dışı puanlama yöntemini kullanın. Optimum performans için gRNA'ları transkripsiyonel başlangıç bölgesinin etrafında -150 bp ila +50 bp'lik bir pencere içinde konumlandırın.
    3. En yüksek hedef ve hedef dışı puana sahip gRNA'ları seçin (Ek Tablo 1'e bakınız).
  4. Bir lncRNA'yı hedefleyen ikili bir gRNA vektörü oluşturmak için burada Rosa26'ya karşı hedeflemeyen veya karıştırılmış bir kontrol gRNA'sını her hedef gRNA ile birleştirin. Hedef gRNA'ların bir plazmitte kombinasyonu, her iki hedef bölgenin bölgeye özgü modifikasyonunu sağlar.
    NOT: Kontrol gRNA'sını ve hedef gRNA'yı barındıran ikili gRNA vektörü, bir hedef lncRNA'nın yıkılmasını sağlarken, bölgeleri hedefleyen gRNA'ları içeren çift gRNA vektörleri, hedeflenen lncRNA'ların aynı anda yıkılmasına izin verir.

2. gRNA klonlama

  1. gRNA dizisini içeren iki DNA parçası kullanarak bir örtüşme uzatma PCR gerçekleştirin. Najm ve ark.6 tarafından açıklandığı gibi amplifikasyon için U1 ileri astar ve H27 ters astarı (Ek Tablo 2'ye bakınız) kullanın.
    1. HF tamponlu 25 μL 2x Yüksek kaliteli PCR ana karışımı ve S. pyogenes veya S. aureus gRNA içeren her DNA fragmanından 1 μL ile 50 μL'lik bir PCR reaksiyonu ayarlayın. Reaksiyonu aşağıdaki döngü koşulları altında çalıştırın: 30 saniye boyunca 98 ° C'de ilk denatürasyon, ardından 5 saniye boyunca 98 ° C'de 15 döngü denatürasyon, 55 s boyunca 10 ° C'de tavlama ve 72 s boyunca 15 ° C'de uzama.
    2. İlk 15 döngüyü tamamladıktan sonra 2,5 μL U6 ileri astar ve 2,5 μL H1 ters astar ekleyin ve reaksiyonu aynı koşullar altında 20 döngüye daha tabi tutun ve 72 ° C'de 5 dakikalık bir son uzatma ile reaksiyonu uygulayın.
    3. PCR ürünlerini, üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.
    4. 10 μL'lik bir reaksiyonda 37 ° C'de 30 dakika boyunca 1 μL BsmB1 kısıtlama enzimi ve 1 μL 10x tampon kullanarak 1 μg modifiye plazmiti sindirin.
    5. PCR ürünlerini, diğerleri tarafından açıklandığı gibi bir HiFi DNA montaj reaksiyon protokolü kullanarak sindirilmiş çift gRNA-Zeo-GFP plazmidine klonlayın (Ek Şekil 1 ve Ek Dosya 1'e bakın)30.
    6. Üreticinin talimatlarına göre 50 μL bakteri kültürünü 4 μL montaj ürünü ile karıştırarak kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerini dönüştürün.

3. Lentivirus üretimi

DİKKAT: Uygun güvenlik yönergelerini takip ederken aktif lentivirüsleri tüm adımlarda kullanın. Kaçınılmaz aerosol oluşumundan kaynaklanan tehlikeleri önlemek için her zaman Sınıf 2 güvenlik kabininde virüslerle çalışın. Santrifüjleme gibi güvenlik kabini dışındaki tüm çalışmaları, Risk Grubu 2 organizmalarla kullanım için onaylanmış aerosol geçirmez kaplarda ve rotorlarda gerçekleştirin. Çalışma alanında her zaman laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler dahil olmak üzere uygun koruyucu giysiler giyin. Çalışma yüzeyleri bir dezenfektan solüsyonu ile muamele edilmeli ve diğer atıklar da bir dezenfektan solüsyonu ile muamele edilmeli ve en az 240 dakika UV ışığı altında kapalı kabinde kalmalarına izin verilmelidir. Kullanılan serolojik pipetler ve pipet uçları, otoklavlanabilir şişelere atılmadan önce dezenfektan bir solüsyonda durulanmalıdır. Daha sonra atıklar S2 çöp konteynerine atılmalıdır. S2 atığı otoklavlama yoluyla etkisiz hale getirilecektir. Transdüksiyonlu hücre hatları, transdüksiyondan en geç 2 gün sonra ve ancak kültür ortamının virüssüz bir ortamla en az iki tam değişikliğinden sonra S1 koşulları altında ele alınabilir.

  1. Bir hemositometrede 10 μL hücreyi 10 μL Tripan mavisi çözeltisi ile karıştırarak Lenti-X 293T HEK hücrelerini sayın. Plaka: Ertesi gün ~% 80 birleşme elde etmek için 10 cm plaka başına 4 x 106 Lenti-X 293T HEK hücresi.
  2. Bu adımdan itibaren Sınıf 2 laboratuvarda çalışır. 500 μL uygun bir transfeksiyon ortamını 11.25 μg transfer vektörü SpdCas9-KRAB-MeCP2 (bkz. Ek Dosya 2), 5.5 μg zarf plazmidi VSV-G ve 16.5 μg pPAX2 vektörü ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. İkinci dCas9 varyantı için, SadCas9-KRAB-MeCP2 transfer vektörünü kullanın (bkz. Ek Dosya 3).
  3. Ayrı bir tüpte, 500 μL indirgenmiş serum ortamını 36 μL PEI reaktifi ile karıştırın (stok: 1 mg / mL). Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  4. Karışımları birleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Karışımı dikkatlice hücre ortamına (6 mL) damla damla ekleyin ve gece boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Lentiviral verimin azalmasını önlemek için hücrelerin bağlı kaldığından emin olun.
  5. Ortamı 12-15 saat sonra serolojik bir pipet kullanarak otoklavlanabilir bir atık şişesine atın. Şu andan itibaren, serolojik pipetler ve pipet uçları da dahil olmak üzere sarf malzemelerini otoklav atığına atmadan önce dezenfektan solüsyonla durulayın. Yeni bir pipet kullanarak transfekte edilmiş hücrelere 5 mL taze DMEM ortamı ekleyin.
  6. Transfeksiyondan 48 saat sonra serolojik bir pipet kullanarak süpernatanı 50 mL'lik bir kanonik tüpe aktararak lentivirüsleri hasat edin. Kanonik tüpü buzdolabında saklayın. Hücrelere 5 mL taze ortam ekleyin ve hücreleri 24 saat daha inkübe edin.
  7. Süpernatanı ilk hasadı içeren aynı 50 mL kanonik tüpe aktararak lentivirüslerin toplanmasını tekrarlayın. Yine, 5 mL taze ortam ekleyin, 24 saat inkübe edin ve süpernatanı daha sonra 50 mL kanonik tüpe aktarın. Birinci, ikinci ve üçüncü hasadın birleşik süpernatanlarını filtrasyon ve santrifüjlemeye kadar 50 mL kanonik tüpte 4 ° C'de saklayın.
  8. Kombine süpernatanı, ayrılmış hücreleri ve kalıntıları peletlemek için Risk Grubu 2 organizmalarla kullanım için onaylanmış aerosol geçirmez kaplarda ve rotorlarda 500 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 0.2 μm steril hücre kültürü dereceli şırınga filtrelerinden süzün.
  9. Filtrelenmiş süpernatanı, 100 kDa ila yaklaşık 500 μL arasında uygun bir moleküler ağırlık kesimine sahip bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak 1.000 x g ve 4 ° C'de konsantre edin. 50-100 μL'lik virüs alikotlarını daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.

4. Lentivirus transdüksiyonu ve stabil transfekte edilmiş hücrelerin seçimi

DİKKAT: Virüslerle her zaman Sınıf 2 güvenlik kabininde çalışın.

  1. Transdüksiyondan 1 gün önce, 2 mL'lik bir son kültür hacmi ile 2 x 105 hücre / kuyuda 6 oyuklu bir plakada plaka 501-mel hücreleri.
  2. Kültür ortamını, 6 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda polibren ile desteklenmiş 2 mL önceden ısıtılmış DMEM ortamı ile değiştirin.
  3. Şu andan itibaren, Sınıf 2 laboratuvarında çalışmak gereklidir. Hücrelereaynı anda Sp dCas9-KRAB-MeCP2 ve SadCas9-KRAB-MeCP2 içeren 50 μL lentivirüs ekleyin. Serolojik pipetler ve pipet uçları da dahil olmak üzere sarf malzemelerini otoklav atığına atmadan önce dezenfektan solüsyonla durulayın. Plakayı hafifçe çalkalayın ve 37 °C'de% 5 CO2 atmosferinde inkübe edin.
  4. Ortamı serolojik bir pipet kullanarak otoklavlanabilir bir şişeye atın ve transdüksiyondan 16 saat sonra blasticidin (10 μg / mL) ve puromisin (2 μg / mL) içeren 2 mL taze ortam ekleyin.
  5. Ortamı 2 gün sonra blasticidin (10 μg/mL) ve puromisin (2 μg/mL) içeren taze 2 mL besiyeri ile değiştirerek seçime devam edin. Transdüksiyondan 7 gün sonra transdüksiyon hücreleri S1 koşulları altında ele alın.
    NOT: Antibiyotik seçimi, transdüksiyona uğramamış tüm kontrol hücreleri ölene kadar yapılmalıdır. Transfer vektöründeki direnç kasetine bağlı olarak alternatif seçim stratejileri kullanılabilir. Gerekirse, bir öldürme eğrisi kullanarak antibiyotik konsantrasyonlarını optimize edin. Yeterli seviyelerde dCas9 füzyonlarını eksprese eden hücre popülasyonlarını elde etmek için akış sitometrisi veya seri seyreltme ve kaplama yoluyla ayrıntılı tek hücreli klon seçimi ve ardından protein miktar tayini gerekebilir.

5. Protein miktar tayini ve Western blot analizi

  1. Bir hemositometrede 10 μL hücreyi 10 μL Tripan Mavisi çözeltisi ile karıştırarak stabil transfekte edilmiş 501-mel hücrelerini sayın. Hücrelerin 1 x 106'sını 500 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin.
  2. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve hücre peletini proteaz inhibitörleri içeren 50 μL RIPA tamponunda yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 15 dakika inkübe edin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleme ile hücre kalıntılarını temizleyin. Süpernatanı -20 °C'de saklayın veya başkaları tarafından tarif edildiği gibi protein miktar tayini için hemen kullanın31.
  3. 10 μg proteini 4 x LDS tamponu, 50 mM DTT ile karıştırın ve 20 μL'ye kadar damıtılmış su ile doldurun. Daha önce tarif edildiği gibi 1 saat boyunca 135 V'ta Tris/glisin bazlı SDS-PAGE kullanarak proteinleri %10'luk bir ayırma jeli üzerinde ayırın32. Proteinleri, ıslak tank transferi ile 90 dakika boyunca 90 V'ta bir PVDF membranına aktarın.
  4. Membranı oda sıcaklığında 180 rpm'de 1 saat boyunca bloke edici tamponda (TBS-T'de %5 yağsız süt) inkübe edin.
  5. Dahili kontrol olarak engelleme tamponuna 1: 10.000 anti-GAPDH fare monoklonal antikoru ekleyin. Birincil antikor anti-Cas9'u (S. pyogenes) veya anti-Cas9'u (S. aureus) bloke edici tamponda 1: 1.000 seyreltme olarak ekleyin ve hafifçe çalkalama ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  6. Membranı 3x TBST tamponu ile her biri 10 dakika yıkayın. İkincil anti-fare HRP antikoru (1: 10.000) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  7. Her biri 10 dakika boyunca TBST tamponu ile 3 kez yıkayın. ECL Substrate ve bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri tespit edin.

6. Çift LncRNA baskılama canlılık deneyi

DİKKAT: Virüslerle her zaman Sınıf 2 güvenlik kabininde çalışın.

  1. Transdüksiyondan 1 gün önce 100 μL önceden ısıtılmış DMEM ortamında 96 oyuklu bir plakada transdüksiyondan 7 gün sonra, stabil transfekte edilmiş SadCas9-KRAB ve SpdCas9-KRAB içeren tohum 0.1 x 105.
  2. Transdüksiyon gününde, kültür ortamını, 6 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda polibren ile desteklenmiş 100 μL önceden ısıtılmış DMEM ortamı ile değiştirin. Şu andan itibaren, Sınıf 2 laboratuvarında çalışmak gereklidir. Hücrelere uygun hacimde lentivirüs ekleyin.
    NOT: Çift gRNA vektörünü içeren lentivirüslerin hacmi, lentivirüsleri titre ederek doğrusal bir eğri oluşturmak için GFP kullanılarak incelenmelidir.
  3. Ortamı, transdüksiyondan 16 saat sonra 500 μg / mL Zeosin, 5 μg / mL blastisidin ve 1 μg / mL puromisin içeren taze ortamla değiştirin.
  4. Üreticinin talimatlarına göre bir hücre canlılığı testi kullanarak transdüksiyondan 5 gün sonra lüminesans tespiti gerçekleştirin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SadCas9-KRAB-MeCP2 ve SpdCas9-KRAB-MeCP2'nin ekspresyon kasetleri, eşit miktarda lentivirüs ile transdüksiyon kullanılarak aynı anda 501-mel hücrelerine entegre edildi. Bu CRISPRi protokolü, dCas9-KRAB-MeCP2 varyantlarının ekspresyonuna dayandığından, Western blot analizi, protein seviyesindeki varlıklarını doğrulamak için idealdir. Pozitif transfekte edilmiş hücrelerin zenginleştirilmesini takiben, dCas9-KRAB-MeCP2 ortologlarının varlığını doğrulamak için Western blot analizi için örnekler toplandı. Başarılı transdüksiyondan sonra, SpdCas9-KRAB-MeCP2 füzyon proteinine (202 kDa) ve SadCas9-KRAB-MeCP2 füzyon proteinine (170 kDa) karşılık gelen tek bir bant beklenir ve Şekil 2A'da gösterildiği gibi, ilgili Cas9 ortologlarına özgü antikorlar kullanılarak doğrulanmıştır. Bununla birlikte, Western blot mümkün değilse, mRNA seviyesinde füzyon proteinlerini doğrulamak için qPCR kullanılabilir.

Fonksiyonel baskılayıcıları stabil bir şekilde eksprese eden 501-mel hücreleri oluşturulduktan sonra, bir çift gRNA vektörü kullanılarak ikinci lentiviral transdüksiyon gerçekleştirildi. RP11 ve XLOC'un daha önce kısa süreli metastatik melanom kültürlerinde yukarı regüle olduğu gösterilmişti ve bireysel CRISPRi hedeflemesi, proliferasyon ve hücre sağkalımı üzerindeki etkilerini gösterdi28. Bu nedenle, bu lncRNA çiftini, modifiye edilmiş hücrelerde kümülatif, kolayca gözlemlenebilir bir büyüme fenotipi öngörerek, kavram kanıtı sentetik öldürücü kodlamayan bir RNA kombinasyonu olarak değerlendirme için seçtik.

Canlılık deneyleri kullanarak kanser hücrelerinde ikili CRISPRi'nin etkilerini araştırmak için, hedeflenen her iki lncRNA'nın da etkili bir şekilde baskılanması gerekir. qPCR, transkript seviyelerini ölçerek bu baskıyı doğrulamak için en uygun yöntemdir. Geliştirilen ikili CRISPRi protokolünün işlevselliğini, RNA seviyelerini belirleyerek ve potansiyel olarak ölümcül RP11 ve XLOC çiftini hedeflerken hücre canlılığını inceleyerek değerlendirdik. Bu nedenle, hedef RNA seviyelerini düşürmek için RP11 ve XLOC'u hedefleyen farklı gRNA'lar tanıtıldı. RNA'nın baskılanması, SadCas9-KRAB-MeCP2 veya SpdCas9-KRAB-MeCP2 için hedefe özgü gRNA'lar kullanılarak araştırıldı, Rosa26'yı hedefleyen bir kontrol gRNA'sı ile birlikte ayrı ayrı ve kombinasyon halinde test edildi (bkz. Şekil 2B). XLOC veya RP11'i hedefleyen gRNA'lar ayrı ayrı kendi hedeflerini etkili bir şekilde bastırsa da, hem XLOC hem de RP11'in aynı anda yıkılması yalnızca XLOC-sa/RP11-sp çifti ile sağlandı.

Seçilen XLOC-sa/RP11-sp gRNA çifti ile 501-mel hücre hattında hem XLOC hem de RP11 RNA seviyeleri başarılı bir şekilde azaltıldığından, bir ikili lncRNA baskılama canlılık testi gerçekleştirildi (bkz. Şekil 2C

figure-results-1


Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, iki ortogonal türden dCas9-KRAB-MeCP2'ye dayalı CRISPRi kullanarak melanom hücrelerinde ikili bir lncRNA hedefleme stratejisi uyguladık. Bu sistemi kullanarak, sentetik öldürücü bir lncRNA çifti olan RP11 ve XLOC'u başarılı bir şekilde bastırdık ve bu da tek tek bastırıldıklarından farklı olarak hücre ölümünün artmasına neden oldu. Bununla birlikte, CRISPRi sistemleri, potansiyel olarak sonuç yorumlamasını etkileyen, hedef dışı gen baskısı riski taşır. Deneysel doğrulama yapılmamasına rağmen, in silico gRNA tasarımı sırasında potansiyel hedef dışı etkileri en aza indirdik.

İletim verimliliğindeki değişkenlik tekrarlanabilirliği etkileyebilir. Bu nedenle, değişen lentivirüs konsantrasyonları kullanılarak standart bir eğri kalibrasyonu ile belirlenen eşit miktarda lentivirüs uygulayarak iletimi optimize ettik. Bununla birlikte, yeni tasarlanan vektörün artan kargo boyutu, lentiviral paketleme verimliliğine sınırlamalar getirebilir ve özellikle iletilmesi zor hücre hatlarında iletim verimliliğini potansiyel olarak azaltabilir. Sonuç olarak, yeterli transdüksiyon ve sağlam dCas9 ekspresyonu elde etmek, bazı durumlarda yüksek viral titreler gerektirebilir. Ek olarak, dCas9-KRAB-MeCP2 protein seviyeleri ve hedeflenen lncRNA'ların RNA ekspresyonu sık sık izlenerek yetersiz yıkım önlenebilir. Alternatif olarak, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için yalnızca bir baskılayıcı sisteme sahip dCas9 versiyonları mevcuttur, ancak düşük verimlilikmaliyeti 25 vardır.

Sadece XLOC-sa-RP11-sp kombinasyonu başarılı aktivite gösterirken, ters XLOC-sp-RP11-sa konfigürasyonu etkisizdi. Knockdown etkinliğindeki bu fark için makul bir açıklama, PAM özgüllüğü ve kromatin erişilebilirliği arasındaki etkileşimdir33. SaCas9 ve SpCas9'un farklı PAM dizilerini tanıdığı göz önüne alındığında, XLOC-sp-RP11-sa oryantasyonundaki SpCas9 için hedef bölge optimal bir PAM'den yoksun olabilir, böylece bağlanma afinitesini ve sonraki aktivitesini azaltır. Ayrıca, iki dCas9 füzyon proteini varyantının uzamsal düzenlemesi, kromatin mimarisini ve erişilebilirliği 34,35 etkileyebilir ve potansiyel olarak XLOC-sp-RP11-sa konfigürasyonunda transkripsiyonel mekanizmanın veya ilişkili düzenleyici faktörlerin işe alınmasını kısıtlayabilir. Bu bulgular, SaCas9 ve SpCas9'un belirli bir genomik bağlam içinde göreceli olarak konumlandırılmasının, optimize edilmiş CRISPR tabanlı modülasyon stratejileri için daha fazla araştırmayı garanti eden bir özellik olan fonksiyonel etkinliklerini kritik bir şekilde etkileyebileceğini göstermektedir.

Geliştirilen protokol, ikili gRNA vektörünü modifiye ederek diğer sentetik öldürücü kodlamayan RNA çiftlerini hedeflemek veya taramak için uyarlanabilir. Bir hücre ilgi hattı, her iki dCas9 varyantını da kararlı bir şekilde ifade ettiğinde, çeşitli yaklaşımlar uygulanabilir hale gelir. RNAi, ASO'lar ve shRNA'lar gen susturma için kullanılabilirken, CRISPRi daha basit bir tarama metodolojisi sunar ve küçük kimyasal bileşikler veya inhibitörlerle kombinasyonu da düşünülebilir. Bu protokol, ikili gRNA vektörünü bir çift gRNA kütüphanesi ile değiştirerek, kanser hücrelerinde sentetik öldürücü çiftlerin veya diğer genetik bağımlılıkların sistematik olarak taranmasına izin verir, böylece kanser hücresi hedeflemesinin hassasiyetini artırır.

Her ne kadar dCas9-KRAB-MeCP2 varyantlarının lentiviral transdüksiyon yoluyla entegrasyonunu sağlamış olsak da, istenen enzimleri 501-mel hücrelerine dahil etmek için alternatif stabil transfeksiyon yöntemleri de kullanılabilir. Bu özellikle önemlidir, çünkü deneyimlerimize göre, dCas9-KRAB-MeCP2 gibi büyük yapıların susturulması zamanla meydana gelebilir36,37. Alternatif olarak, dCas9-KRAB'ın daha küçük bir alternatif olduğu gösterilmiştir23. Deneyimlerimize göre, Cas9 ortologlarından türetilen daha küçük dCas9-KRAB füzyon proteinleri ile transdüksiyon, uzun süreli kültivasyon sırasında protein ekspresyonunun azalmasına yol açmıştır (bkz. Ek Şekil 2). Bu nedenle, tutarlı protein ekspresyonu, tekrarlayan zaman noktalarında düzenli olarak izlenmelidir. Ek olarak, iki büyük füzyon proteininin seçim belirteçleri ve çift gRNA ekspresyon kasetleri ile birlikte transdüksiyonu, hücresel stresi indükleyebilir veya lentiviral paketleme kapasitelerine ulaşabilir.

Çift CRISPRi'de %100 knockdown verimliliği elde etmek, yetersiz gRNA tasarımı veya yetersiz dCas9 ekspresyonu nedeniyle zor olabilir. Bunu ele almak için, en etkili dizileri belirlemek için hedef başına birden fazla gRNA, gelişmiş tasarım araçları kullanılarak test edilmelidir. Ek olarak, geliştirilmiş vektör tasarımı ve klonal hücre hatlarının karakterizasyonu yoluyla dCas9-KRAB-MeCP2 ekspresyonunun optimize edilmesi, knockdown verimliliğini artırabilir.

CRISPRi sistemini entegre etmek için alternatif stratejiler arasında, zaman içinde kararlı ekspresyonu sürdürmesiyle bilinen güvenli liman genomik bölgelerine kararlı bir şekilde yerleştirilmesini sağlamak için transpozaz vektörlerinin veya CRISPR'ye yönelik entegrasyonun kullanılması yer alır38. Bununla birlikte, melanom hücreleri de dahil olmak üzere birçok hücre tipinin39'u transfekte etmesi zordur ve bu da lentiviral transdüksiyonu tercih edilen yöntem haline getirir. Transpozaz veya Cas bazlı enzimlerin elektroporasyonu, dCas9-KRAB-MeCP2 yapılarını melanom hücrelerine40 entegre etmek için alternatif bir yol sunabilir. İndüklenebilir bir nakavt sisteminin uygulanması, hücresel stresi en aza indirmek için kurucu ekspresyon yerine dCas9-KRAB-MeCP2 ekspresyonunu gerektiği gibi aktive etmek için avantajlı olacaktır.

Son olarak, geliştirilen yaklaşım melanom hücreleriyle sınırlı değildir, ancak sentetik ölümcüllüğün araştırıldığı herhangi bir hücre tipine genişletilebilir. Bu yaklaşımın açıkça gRNA kütüphanesi tarama modalitesine doğru ölçeklendirilmesi amaçlanmıştır. Bununla birlikte, artan kombinatoryal karmaşıklık nedeniyle, örneğin, kontroller ve en az 300 x kapsama dahil olmak üzere gen çifti başına üçten fazla gRNA ile, eksprese edilen lncRNA'ların yalnızca bir alt transkriptomik fraksiyonu pratik olarak hedeflenebilir. Bu nedenle, kullanıcılar, kitaplık taramasına devam etmeden önce lncRNA ekspresyon seviyeleri ve bunların belirli hücresel bağlamlardaki bilinen alaka düzeyi gibi faktörleri göz önünde bulundurarak adayları dikkatli bir şekilde önceden seçmelidir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın kombinatoryal çok yönlülüğü, onu çeşitli kanser türleri ve potansiyel olarak diğer hastalıklar arasında lncRNA'ların sentetik ölümcül etkileşimlerini ve diğer genetik bağımlılıklarını araştırmak için değerli bir araç haline getirir. Bu, hücrelerdeki bu ağ etkileşimlerini incelemek için şu anda mevcut olan araç setini genişletir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jochen Imig şu anda Pfizer Inc. tarafından finanse edilen CGCIII'dir. CGCIII, Pfizer Inc., Merck KGaA ve AstraZeneca PLC tarafından desteklenmektedir. Sponsorların çalışmanın tasarımında, yürütülmesinde, yorumlanmasında veya yazılmasında hiçbir rolü yoktu. Tüm yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stefan Raunser'e (Max Planck Moleküler Fizyoloji Enstitüsü, Dortmund) Biyogüvenlik Seviye 2 laboratuvar alanına erişim için teşekkür ederiz. Entelektüel katkıları için Eric Wang'a ve değerli tartışmaları için Imig laboratuvarının tüm geçmiş ve şimdiki üyelerine özel teşekkürler. Jochen Imig şu anda CGC III'te Pfizer Inc. tarafından finanse edilen CGCIII'dir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amicon Ultra Santrifüj Filtre, 100 kDa MWCOMillipore UFC910024
anti-Cas9 (S. aureus) (6H4) fare monoklonal antikoruHücre Sinyalizasyon Teknolojisi48989
anti-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3) monoklonal antikorHücre Sinyalizasyon Teknolojisi14697
anti-GAPDH fare monoklonal antikoru Sigma AldrichG8795
Anti-Fare IgG (tüm molekül)– TavşanSigma AldrichA9044
Bio-Rad ChemiDoc MP Görüntüleme SistemindeBio-Rad
Blasticidine S hidroklorürSigma Aldrich15205-25MG
CellTiter-Glo Lüminesan Hücre Canlılık TestiPromegaG7570
SantrifüjEppendorf5804R
SantrifüjEppendorf5415R
CFX Connect Gerçek Zamanlı PCR Tespit SistemiBio-Rad
Berraklık Batı ECL Substratı, 500 mLBio-Rad1705061
CO2 İnkübatör Modeli CB 170Bağlayıcı
cOmplete Proteaz İnhibitörü KokteyliRoche11697498001
Esp3I (BsmB1) kısıtlama enzimiThermo ScientificER0451
Falcon 10 mL Serolojik PipetCorning356551
Falcon 25 mL Serolojik PipetCorning357525
Falcon 5 mL Serolojik PipetCorning356543
Fetal SığırSerumu Sigma AldrichF9665-500ML
Gibco Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM), yüksek glikoz, piruvatGibco41966029
İnsan melanom hücre hattı 501-melAifantis Lab (New York Üniversitesi) tarafından nazikçe sağlandı. RRID: CVCL_4633
Immobilon -P PVDF MembranMilliporeIPVH00010
Lenti-X 293T HEK hücre hattıTakara Bio632180
Mini Trans-Blot Hücre sistemi Bio-Rad
Mini-PROTEAN Tetra Handcast SystemBio-Rad
NEBuilder HiFi DNA Montaj Reaksiyonu New England BiolabsE2621
Yağsız süt tozu Biomol54650
NuPAGE LDS Numune Tamponu (4x)InvitrogenNP0008
Tek Atış Stbl Kimyasal Olarak Yetkin E. coliInvitrogenC737303
Opti-MEM I Azaltılmış Serum OrtamıGibco31985062
PCR Tüpleri 0.5 ml (Düz Kapak)VWR International732-3207
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Corning45000-446
Phusion HF Tampon ile Yüksek Kaliteli PCR Master KarışımıThermo ScientificF531L
Pierce BCA Protein Test Kiti  Thermo Scientific23225
PolibreneSigma AldrichTR-1003-G
Polietilenimin, dallıSigma Aldrich408727
Puromisin dihidroklorürSanta Cruz Biyoteknolojisc-108071A
QIAquick PCR Saflaştırma Kiti ve nbsp;Qiagen28104
SafeSeal Mikrosantrifüj Tüpü 1.5 mLSarstedt72,706
Sodyum klorür, 5 M Aqua Solüsyonu, RNaz İçermeyenAlfa AesarJ60434.AE
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)Sigma AldrichL3771
Şırınga Filtresi PES 33mm 0.2 & mu; MFisher Scientific15206869
TC Çanak 100, StandartSarstedt8,33,902
TC Plaka 6 Kuyu, Standart, FSarstedt83,39,20,005
Tris tabanıRoche10708976001
TWEEN 20Sigma AldrichP9416-50ML
üretilen peroksidaz antikoru ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  2. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  3. Szcześniak, M. W., Wanowska, E., Mukherjee, N., Ohler, U., Makałowska, I. Towards a deeper annotation of human lncRNAs. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 1863 (4), 194385(2020).
  4. Fang, S., et al. NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs. Nucl Acids Res. 46 (D1), D308-D314 (2018).
  5. Lin, J., et al. Human-specific lncRNAs contributed critically to human evolution by distinctly regulating gene expression. eLife. 12, RP89001.2(2023).
  6. Sarropoulos, I., Marin, R., Cardoso-Moreira, M., Kaessmann, H. Developmental dynamics of lncRNAs across mammalian organs and species. Nature. 571 (7766), 510-514 (2019).
  7. Melé, M., et al. Human genomics. The human transcriptome across tissues and individuals. Science. 348 (6235), 660-665 (2015).
  8. Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
  9. Liu, S. J., Dang, H. X., Lim, D. A., Feng, F. Y., Maher, C. A. Long noncoding RNAs in cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 21 (7), 446-460 (2021).
  10. Ahmad, M., Weiswald, L. B., Poulain, L., Denoyelle, C., Meryet-Figuiere, M. Involvement of lncRNAs in cancer cells migration, invasion and metastasis: cytoskeleton and ECM crosstalk. J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 173(2023).
  11. Jain, A. K., et al. LncPRESS1 Is a p53-Regulated LncRNA that Safeguards Pluripotency by Disrupting SIRT6-Mediated De-acetylation of Histone H3K56. Mol Cell. 64 (5), 967-981 (2016).
  12. Bergmann, J. H., et al. Regulation of the ESC transcriptome by nuclear long noncoding RNAs. Genome Res. 25 (9), 1336-1346 (2015).
  13. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  14. Yoon, J. H., et al. LincRNA-p21 suppresses target mRNA translation. Mol Cell. 47 (4), 648-655 (2012).
  15. Huarte, M. The emerging role of lncRNAs in cancer. Nat Med. 21 (11), 1253-1261 (2015).
  16. Badowski, C., He, B., Garmire, L. X. Blood-derived lncRNAs as biomarkers for cancer diagnosis: the Good, the Bad and the Beauty. NPJ Precis Oncol. 6 (1), 40(2022).
  17. Zong, X., et al. Knockdown of nuclear-retained long noncoding RNAs using modified DNA antisense oligonucleotides. Meth Mol Biol. 1262, 321-331 (2015).
  18. Gagnon, K. T., Li, L., Chu, Y., Janowski, B. A., Corey, D. R. RNAi factors are present and active in human cell nuclei. Cell Rep. 6 (1), 211-221 (2014).
  19. Zeng, Y., Cullen, B. R. RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm. RNA. 8 (7), 855-860 (2002).
  20. Yang, J., et al. CRISPR/Cas9-mediated noncoding RNA editing in human cancers. RNA Biol. 15 (1), 35-43 (2018).
  21. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355 (6320), aah7111(2017).
  22. Tsung, K., et al. CRISPRi screen of long non-coding RNAs identifies LINC03045 regulating glioblastoma invasion. PLoS Genet. 20 (6), e1011314(2024).
  23. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  24. Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the right tool for the job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
  25. Yeo, N. C., et al. An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation. Nat Meth. 15 (8), 611-616 (2018).
  26. Parrish, P. C. R., et al. Discovery of synthetic lethal and tumor suppressor paralog pairs in the human genome. Cell Rep. 36 (9), 109597(2021).
  27. Najm, F. J., et al. Orthologous CRISPR-Cas9 enzymes for combinatorial genetic screens. Nat Biotechnol. 36 (2), 179-189 (2018).
  28. Petroulia, S., et al. CRISPR-inhibition screen for lncRNAs linked to melanoma growth and metastasis. bioRxiv. , (2024).
  29. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  30. New England Biolabs. NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction (E2621) v2. , (2020).
  31. Cortés-Ríos, J., et al. Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times. Anal Biochem. 608, 113904(2020).
  32. Junior, N. Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) v1. , (2019).
  33. Chen, X., Liu, J., Janssen, J. M., Gonçalves, M. A. F. V. The chromatin structure differentially impacts high-specificity CRISPR-Cas9 Nuclease strategies. Mol Ther Nucl Acids. 8, 558-563 (2017).
  34. Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).
  35. Daer, R. M., Cutts, J. P., Brafman, D. A., Haynes, K. A. The impact of chromatin dynamics on Cas9-Mediated genome editing in human cells. ACS Syn Biol. 6 (3), 428-438 (2017).
  36. Chavez, M., Rane, D. A., Chen, X., Qi, L. S. Stable expression of large transgenes via the knock-in of an integrase-deficient lentivirus. Nat Biomed Eng. 7 (5), 661-671 (2023).
  37. Ellis, J. Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors. Human Gene Ther. 16 (11), 1241-1246 (2005).
  38. Shrestha, D., et al. Genomics and epigenetics guided identification of tissue-specific genomic safe harbors. Genome Biol. 23 (1), 199(2022).
  39. Chu, Z., et al. Enhanced gene transfection and induction of apoptosis in melanoma cells by branched poly(β-amino ester)s with uniformly distributed branching units. J Control Release. 367, 197-208 (2024).
  40. Han, S. Y., et al. Nucleofection is a highly effective gene transfer techfnique for human melanoma cell lines. Exp Dermatol. 17 (5), 405-411 (2008).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dual CRISPRiSynthetic Lethal ScreeningLong Non Coding RNAsGene KnockdownLentiviral TransductionCell Viability AssaydCas9 KRAB MeCP2Combinatorial Targeting

İlgili makaleler