Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnce Partikül Maddeye Maruz Kalan Zebra Balığı Embriyolarında Polisiklik Aromatik Hidrokarbonların Tespiti için Modifiye Edilmiş Bir QuEChERS-HPLC Yöntemi

1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67757

⸱

13 Haziran 2025

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Zebra balığı embriyolarında 16 PAH'ın iç seviyelerini değerlendirmek için modifiye edilmiş bir QuEChERS-HPLC yöntemi geliştirdik.

Özet

Aerodinamik çapı2,5 μm veya daha az olan ince partikül maddeye (PM 2,5) annenin maruz kalması, insanlarda spontan düşük ve çeşitli konjenital hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, altta yatan mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Zebra balığı embriyoları, PM2.5'in gelişimsel toksisitesini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak PM2.5'in birincil toksik bileşenleri olan polisiklik aromatik hidrokarbonların (PAH'lar) iç seviyelerinin ölçülmesi bir zorluk teşkil etmektedir. Bu çalışmada, ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) öncelikli kirletici listesinde listelenen 16 PAH'ın iç seviyelerini değerlendirmek için Hızlı, Kolay, Ucuz, Etkili, Sağlam ve Güvenli Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (QuEChERS-HPLC) yöntemi geliştirdik. Zebra balığı embriyoları, döllenmeden 2-72 saat sonra (hpf) PM2.5'ten ekstrakte edilebilir organik madde (EOM) ile muamele edildi. Numune hazırlama için QuEChERS yöntemi, PAH'ların kalitatif ve kantitatif analizleri için HPLC-FLD/DAD (floresan dedektörlü ve diyot dizi dedektörlü HPLC) kullanılmıştır. PM2.5'e maruz kalan zebra balığı embriyolarında altı PAH (Fenatren, Antrasen, Floren, Asenaften, Floranten ve Piren) başarıyla tespit edildi. Bu yöntem, PM2.5'in neden olduğu gelişimsel toksisitenin mekanizmalarını araştırmak için çok önemlidir.

Giriş

Aerodinamik çapı2,5 μm veya daha az olan ince partikül madde (PM 2,5). önde gelen bir çevresel risk faktörüdür. Küçük boyutu nedeniyle, PM2.5 dolaşım sistemine girebilir ve maternal-fetal bariyere nüfuz edebilir. Epidemiyolojik çalışmalar, annenin PM2.5'e maruz kalmasını spontan düşük ve çeşitli konjenital hastalıklarla ilişkilendirmiştir 1,2,3,4. Bununla birlikte, PM2.5'in embriyonik toksisitesinin altında yatan mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır. PM2.5'in birincil toksik bileşeni olan PAH'lar, mutajenik ve kanserojen özellikleri nedeniyle insanlar için oldukça toksiktir 5,6. Yüzlerce PAH'tan 16'sı ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA) tarafından yüksek öncelikli kirleticiler olarak atanmıştır.

Zebra balığı, Danio rerio, insanlara genetik benzerliği, hızlı gelişimi, yüksek üreme hızı ve bakım kolaylığı nedeniyle güçlü bir omurgalı model organizmadır. Zebra balığı embriyolarının şeffaflığı, tüm vücudun mikroskop altında doğrudan gözlemlenmesine olanak tanıyarak detaylı çalışmalara olanak tanır. Çözünmüş PAH'lar difüzyon7 ile zebra balığı embriyolarına girebilir. Birçok çalışma, PM2.5 8,9,10,11'den Ekstrakte Edilebilir Organik Maddenin (EOM) toksik etkilerini ve mekanizmalarını araştırmak için zebra balığı embriyolarını kullanmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu, zebra balığı embriyolarında12 iç PAH seviyelerini tespit etmeden, yalnızca EOM'deki 16 öncelikli PAH'ı karakterize etmiştir. Bu zorluk, zebra balığı embriyolarının küçük boyutundan ve embriyonik matrisin karmaşıklığından kaynaklanıyor olabilir.

Hızlı, Kolay, Ucuz, Etkili, Sağlam ve Güvenli (QuEChERS) yöntemi, gıda ve çevre numunelerindeki pestisit kalıntılarının, veteriner ilaçlarının ve diğer kirleticilerin analizi için kullanılan yenilikçi bir numune hazırlama tekniğidir13,14. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile birleştirildiğinde, bu yöntem zebra balığı15'teki pestisitleri tespit etmek için kullanılmıştır. İki veya daha fazla benzen halkası içeren PAH'lar, güçlü floresan özelliklerine sahiptir ve bu da onları floresan dedektörleri kullanılarak algılama için özellikle uygun hale getirir. Bu çalışmada, EOM'ye maruz kalan zebra balığı embriyolarında 16 PAH seviyelerini değerlendirmek için modifiye bir QuEChERS-HPLC yöntemi geliştirdik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Örnek tedavi

  1. PM2.5 koleksiyonu
    1. PM2.5'i 47 mm kuvars membran filtrelerde toplayın.
      NOT: PM2.5 , Çin'in Suzhou kentindeki kentsel alanda toplanmıştır.
  2. EOM çıkarma
    1. Filtreyi parçalara ayırın ve 150 mL asetonitril içeren konik bir cam şişeye yerleştirin.
    2. Şişeyi 1 saat boyunca 35 ° C'de ultrasonikleştirin ve ekstraktı dört adet 50 mL tüpe aktarın.
    3. 20 dakika boyunca 7.000 × g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı bir döner buharlaştırıcıya aktarın ve yaklaşık 5 mL'ye konsantre edin.
    4. 35 °C'lik bir su banyosunda nitrojen akışı altında kuruyana kadar buharlaştırın ve kalıntıyı dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün.
  3. Zebra balığı embriyo tedavisi
    1. Zebra balıklarını devridaim yapan bir su sisteminde 28 ° C'de 14 saat aydınlık ve 10 saat karanlık döngüde tutun16.
    2. Döllenmiş yumurtaları (grup başına 200 embriyo) toplayın ve bunları devridaim su sisteminden 30 mL su ile cam Petri kaplarına (soda-kireç camı, 80 x 15 mm) aktarın.
    3. Döllenmeden 2 saat sonra (hpf) 200 embriyo içeren bir cam Petri kabına 30 μL EOM (10 mg / mL) ekleyin. İşlenmeyen gruplar boş denetimler olarak işlev görür.
      NOT: EOM'un nihai konsantrasyonu, kardiyak malformasyon hızına bağlı olarak 10 mg / L'dir (Ek Şekil S1).
    4. Bulaşıkları 28 °C'lik bir inkübatöre koyun.

2. QuEChERS numune hazırlama

  1. Embriyolu bulaşıkları 72 hpf'de inkübatörden çıkarın. Embriyoları 3x saf su ile yıkayın.
  2. Embriyoları 1,5 mL'lik tüplere (farklı gruplara göre) aktarın ve fazla suyunu alın.
  3. Embyros17'yi liyofilize etmek ve liyofilize etmek için tüpleri 30 dakika boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya koyun. Daha sonra embriyoları bir cam çubuk kullanarak öğütün.
  4. Spike geri kazanımını test etmek için DMSO kontrol grubuna 25 μL 16 PAH karışık standart solüsyon (2.0 μg / mL) ekleyin.
  5. 1 mL n-heksan ekleyin ve 30 saniye boyunca girdap yapın, ardından 35 ° C'de 30 dakika ultrasonikasyon yapın.
  6. 7.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
  7. 2.5 ve 2.6 adımlarını tekrarlayın.
  8. Toplanan süpernatanları 35 ° C'lik bir su banyosunda nitrojen akışı altında kuruyana kadar buharlaştırın.
  9. 1 mL asetonitril ekleyin ve 30 saniye boyunca girdap yapın.
  10. 10 mg birincil ikincil amin (PSA), 45 mg magnezyum sülfat ve 15 mg C18 salmastrası ekleyin, ardından 30 saniye boyunca girdaplayın.
  11. 7.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
  12. Adım 2.9'u tekrarlayın ve 7.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
  13. Süpernatanı nitrojen altında 0.5 mL'ye kadar buharlaştırın.
  14. 0,22 μm mikro gözenekli bir zardan süzün.

3. HPLC kullanılarak PAH'ların belirlenmesi

  1. Asetonitril ile 16 PAH karışık standardı için bir dizi çalışma çözeltisi (1 ila 500 ng/mL arasında değişen) hazırlayın ve bunları mobil faz olarak asetonitril/su kullanarak sıvı bir kromatografa enjekte edin.
    1. 20 μL enjekte edin ve aşağıdaki elüsyon prosedürünü kullanın: 0-18.5 dk,% 40 asetonitril ila% 100 asetonitril; 18.5-28 dk, %100 asetonitril; 28-29.5 dk, %100 ila %40 asetonitril; Durma süresi: 32 dakika; sütun sıcaklığı: 25 °C; akış hızı: 1.8 mL/dak. 5 ng/mL ila 500 ng/mL aralığını kapsayan, x ekseninde standart çalışma çözeltilerinin kütle konsantrasyonlarını ve y ekseninde karşılık gelen tepe alanlarını içeren standart bir eğri çizin.
      NOT: PAH'ların uyarma/emisyon dalga boyları Ek Tablo S1'de bulunabilir.
  2. Saflaştırılmış numuneyi (adım 2.14'ten itibaren) bir Floresan dedektörü (FLD) ve diyot dizi dedektörü (DAD) ile sıvı kromatografa enjekte edin.
  3. Bekletme sürelerini karşılaştırarak PAH'ların varlığını belirleyin ve ilişkili tepe alanlarını ölçün.
    NOT: PAH'ların kütle konsantrasyonları, adım 3.1.1'den daha önce oluşturulan standart eğri kullanılarak belirlenmiştir.
  4. Numunelerin ölçülen kütle konsantrasyonlarına dayalı olarak 16 PAH'ın iç konsantrasyonlarını hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

EOM maruziyeti, numune hazırlama ve PAH tespiti için tüm prosedür Şekil 1'de gösterilmektedir. HPLC-FLU / DAD için, 0.3 ila 5.0 ng / mL arasında bir algılama aralığı ile 3: 1'lik bir sinyal-gürültü oranı kabul edilebilir olarak kabul edildi. Yöntem tespit limitleri 3.0 × 10-4 ila 5.0 × 10-3 ng/organizma arasında değişmektedir. Tüm kalibrasyon eğrileri yüksek doğrusallık sergiledi (r2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Zebra balığı embriyoları, gelişimsel toksisite çalışmaları için güçlü bir omurgalı modelidir, ancak küçük boyutları, PAH'lar gibi yarı uçucu organik bileşiklerin (SVOC'ler) tespitini zorlaştırır. Numune hazırlama sırasında, zebra balığı embriyolarının kontaminasyonunu önlemek çok önemlidir. Numunelerin uygun şekilde temizlenmesi, bileşiklerin maruz kalma ortamından numune ekstraktına taşınmasını önlemek için önemli bir adımdır. Eksik yıkama, aşırı tahmine yol açabilirken, aşırı yıkama, e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe numarası: 81972999) ve Suzhou Bilim ve Teknoloji Geliştirme Planı (Tıbbi Uygulamalar Üzerine Temel Araştırma, SKY2023036 ve SKY2023115) tarafından mali olarak desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
16 PAH karışık standart çözeltiler o2si Akıllı Çözümler (Güney Karolina, ABD)110124-0616 PAH karışık standart çözeltiler  naftalin (Nap), asenaftilen (Acy), as-naften (Ace), floren (Flo), fenantren (Phe), antrasen (Karınca),floranten (Grip), piren (Pyr), benzo [a] antrasen (BaA), krizen (Chr), benzo [b] floranten (BbF), benzo [k] floranten (BkF),benzo [a] piren (BaP), indeno [1,2,3-cd] piren (IcdP), dibenz [a, h]antrasen (DahA), benzo [g,h,i] perilen (BghiP).
1260 Infinity II LC SistemiAgilent Technologies (Santa Clara, ABD)FLD (G1321A); DAD SL (G1315C)
AsetonitrilScharlab (Barselona,İspanya)AC03661000çözücü
CNWBOND HC-C18 SPE ANPEL Laboratuvar Teknolojileri (Şangay) Inc. (Şangay, ÇİN)SBEQ-CA0801C18 ambalajı, polar ve polar olmayan organik bileşikleri iyi bir şekilde adsorbe edebilen ve ayırabilen, hidrofilik ve hidrofobik arasında iyi bir dengeye sahip ters fazlı bir ambalajdır.
Diyatomlu toprakAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, ABD)12214013Organik safsızlıkların ayrılması, saflaştırılması ve uzaklaştırılması için‌
Dağıtıcı SPE 15 mL, ENAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, ABD)5982-5056Numune saflaştırma
FiltresiANPEL Laboratuvar Teknolojileri (Şangay) Inc. (Şangay, ÇİN)SCAA-104Organik faz iğne filtresi (naylon), 0.22 ve mikro; m
HexaneScharlab (Barselona, İspanya),HE02481000 çözücü
MilliporeMerck (New Jersey, ABD)Ultra saf su hazırlayın
Organomasyon - N-EVAP Azot EvaporatörleriOrganomasyonu (Massachusetts, ABD)Çözücüleri buharlaştırın
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (Waltham, ABD)santrifüjleme
  Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (New York,ABD)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, ABD)959990-918Bu sütun, PAH'ların hassas ve güvenilir analizini elde etmek için HPLC sistemlerinde yaygın olarak kullanılır.

Kaynaklar

  1. Wang, H., et al. Association of maternal exposure to ambient particulate pollution with incident spontaneous pregnancy loss. Ecotoxicol Environ Saf. 224, 112653(2021).
  2. Grippo, A., et al. Air pollution exposure during pregnancy and spontaneous abortion and stillbirth. Rev Environ Health. 33 (3), 247-264 (2018).
  3. Tanner, J. P., et al. Associations between exposure to ambient benzene and pm2. 5 during pregnancy and the risk of selected birth defects in offspring. Environ Res. 142, 345-353 (2015).
  4. Feng, Y., et al. Global air pollution exposure and congenital anomalies: An updated systematic review and meta-analysis of epidemiological studies. Int J Environ Health Res. 34 (5), 2333-2352 (2024).
  5. Lin, Y., et al. Sources, transformation, and health implications of pahs and their nitrated, hydroxylated, and oxygenated derivatives in PM2.5 in Beijing. J Geophys Res-Atmos. 120 (14), 7219-7228 (2015).
  6. Chen, Y., et al. Determining priority sources of PM2.5-bound polycyclic aromatic hydrocarbons by their contribution to disability adjusted life years. Atmos Environ. 248, 118202(2021).
  7. Carls, M. G., et al. Fish embryos are damaged by dissolved pahs, not oil particles. Aquat Toxicol. 88 (2), 121-127 (2008).
  8. He, Y., et al. Developmental toxicity of the organic fraction from hydraulic fracturing flowback and produced waters to early life stages of zebrafish (Danio rerio). Environ Sci Technol. 52 (6), 3820-3830 (2018).
  9. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Sci Total Environ. 719, 135097(2020).
  10. Manjunatha, B., Deekshitha, B., Seo, E., Kim, J., Lee, S. J. Developmental toxicity induced by particulate matter (PM2.5) in zebrafish (Danio rerio) model. Aquat Toxicol. 238, 105928(2021).
  11. Chen, J., Zhang, M., Aniagu, S., Jiang, Y., Chen, T. PM2.5 induces cardiac defects via AHR-SIRT1-PGC-1α mediated mitochondrial damage. Environ Toxicol Pharmacol. 106, 104393(2024).
  12. Zhang, H., et al. Crosstalk between AHR and Wnt/β-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355, 31-38 (2016).
  13. González-Curbelo, M., et al. Evolution and applications of the QuECHERS method. TrAC Trends Anal Chem. 71, 169-185 (2015).
  14. Wilkowska, A., Biziuk, M. Determination of pesticide residues in food matrices using the qQuECHERS methodology. Food Chem. 125 (3), 803-812 (2011).
  15. Zhao, C., et al. Acute toxicity and bioconcentration of pyrimorph in zebrafish, Brachydanio rerio. Pest Manag Sci. 67 (9), 1178-1183 (2011).
  16. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  17. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  18. Ji, C., et al. AHR-mediated m6A RNA methylation contributes to PM2.5-induced cardiac malformations in zebrafish larvae. J Hazard Mater. 457, 131749(2023).
  19. Alegbeleye, O. O., Opeolu, B. O., Jackson, V. A. Polycyclic aromatic hydrocarbons: A critical review of environmental occurrence and bioremediation. Environ Manage. 60 (4), 758-783 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

PAH TespitiNumune HazırlamaFloresans DedektörüDiyot Dizilimli DedektörÖzütlenebilir Organik MaddeGelişimsel Toksisite
İnce Partikül Maddeye Maruz Kalan Zebra Balığı Embriyolarında Polisiklik Aromatik Hidrokarbonların Tespiti için Modifiye Edilmiş Bir QuEChERS-HPLC Yöntemi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.