Yöntem makalesi

Erken Evre Zebra Balığı Larvalarında Küçük Molekül Taraması ve Toksisite Testi

DOI:

10.3791/67759

⸱

7 Mart 2025

 ,  , 
1Department of Applied Biomedical Science, Faculty of Health Sciences, University of Malta, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine and Surgery, University of Malta, 3Centre for Molecular Medicine and Biobanking, University of Malta

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, zebra balığı larvalarında döllenmeden 3-7 gün sonra bir ilaç tarama prosedürünü ve ardından morfolojik değerlendirmeyi tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı, insan translasyonel araştırmaları, küçük moleküllerin ve çevresel kirleticilerin toksisite testi, terapötik ilaç keşfi ve diğer biyomedikal araştırma uygulamaları için önde gelen bir model organizma haline gelmiştir. Sunulan protokol, erken evre zebra balığı larvalarında (döllenmeden 3-7 gün sonra, dpf) ilaç taraması ve toksisite testi için net bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır. Zebra balığı larvalarında toksisite testini tanımlayan çeşitli metodolojiler, diğerlerinin yanı sıra maruz kalma süreleri, ortam değişiklik oranı ve morfoloji puanlaması için standart bir protokolden yoksun olsa da yayınlanmıştır. Deneyleri yürütmek için ideal larva yaşlarını, bu yaşlar için en iyi çalışan plaka boyutlarını, test bileşiğinin israfını sınırlarken güvenilir sonuçlar sağlayan ortam değişikliklerinin oranını ve istatistiksel olarak kolayca ölçülebilen bir morfoloji puanlama sistemini deneysel olarak belirledik. El yazması, ilaç toksisitesi testindeki boşluğu hedeflemeyi ve Balık Embriyosu Akut Toksisite testine benzer standart bir yönteme doğru ilk adımı atmayı amaçlayan, 3 ila 7 dpf arasındaki zebra balığı larvalarında toksisite testi için bir protokolü ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı (Danio rerio) son zamanlarda güçlü bir omurgalı model organizma olarak ortaya çıkmıştır ve biyomedikal araştırmaları ilerletme çalışmaları için giderek daha popüler hale gelmiştir1. İnsan protein kodlayan genlerin yaklaşık% 70'i en az bir zebra balığı ortoloğuna sahiptir ve insan hastalığına neden olan genlerin ~% 82'si zebra balığında en az bir ortolog gene sahiptir2. Genetik koruma, benzer temel organ modellemesi ve morfolojisi ile birleştiğinde, zebra balığını insan hastalıkları araştırmaları için ilginç bir model haline getirir ve ilaç geliştirme için çok önemli olan moleküler düzeyde 1,2,3 türler arası karşılaştırmalara izin verir.

Zebra balığı, döllenmeden 10 saat sonra (hpf) kuyruk tomurcuğunun oluşması ve ilk somitlerin 16 hpf'de ortaya çıkmasıyla hızla gelişir. Embriyolar, döllenmeden ~ 2-3 gün sonra (dpf) koryondan çıkar. 4 dpf ile sindirim sistemi tamamen gelişir ve 5 dpf ile yüzme keseleri şişirilir, bu da serbestçe yüzmelerine ve yiyecek avlamalarına izin verir. 5 dpf ile beslenme kabiliyetine rağmen, beslenmeyen larvalar en az 7 dpf'ye kadar yalnızca yumurta sarısı türevi besinlerle hayatta kalabilir, bu da kontaminasyona neden olabilecek ve ilaç taraması, toksikoloji ve davranış testlerine müdahale edebilecek harici besleme ihtiyacını ortadan kaldırır4. 7 dpf ile larvalar ayrıca kalp ve damar sistemi, kas ve kemik dahil olmak üzere çeşitli temel organ sistemleri ile eksiksiz bir vücut planı geliştirir 5,6. Zebra balığı embriyoları ayrıca ex vivo olarak döllenir, dışarıdan gelişir ve erken yaşam evrelerinde optik olarak şeffaftır, bu da onları gen düzenleme ve küçük moleküllerin taranması için oldukça erişilebilir hale getirir3. Ek olarak, küçük boyutları ve yüksek doğurganlık oranları, istatistiksel gücü artıran daha fazla kopyanın dahil edilmesine ve ayrıca ilaç hacimlerinden tasarruf sağlayan ve verimi artıran çok kuyulu plakaların kullanımına izin verir.

Bir hayvan modelinde yeni küçük moleküllerin taranması, ilaçların hem yararlı hem de olumsuz etkiler üretme yeteneğini belirlemek, böylece hangi bileşiklerin daha ileri testler için uygun olduğunu ve aktivitelerini değiştirmek için modifikasyon gerektirebilecek diğerlerini belirlemek için önemlidir. Uyuşturucu tarama sürecinin bir parçası olarak, hedef bileşik/lerin öldürücü konsantrasyonunun 50 (LC50) tanımlanması gerekmektedir. Bu, ön toksisite testinin bir parçası olarak test hayvanlarının %50'sinde ölüme neden olan bir çalışma konsantrasyonu sağlar.

Zebra balığı embriyolarında döllenmeden 96 saat sonrasına (hpf) kadar toksisite testi için standartlaştırılmış bir protokol, yani Balık Embriyosu Akut Toksisitesi (FET) testi (TG236)7 mevcuttur. FET testinde, yeni döllenmiş yumurtalar 96 saate kadar beş konsantrasyonda kimyasala maruz bırakılır ve (i) yumurta pıhtılaşması, (ii) somit oluşumunun olmaması, (iii) yumurta sarısı kesesinden kuyruk tomurcuğu ayrılmasının olmaması ve (iv) kalp atışı eksikliği. Test, akut toksisitenin ve LC50'nin belirlenmesine izin verir. Ayrıca, diğerlerinin yanı sıra, tarama için kullanılacak test odası boyutları (24 oyuklu plakalar), test odasındaki yumurta dağılımı ve barınma koşulları hakkında da tavsiyelerde bulunarak geçerli ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar7.

FET testi embriyonik aşamada toksisite testi için uygun olmakla birlikte, 4 dpf'nin ötesine geçmez. Bu zaman noktasında gelişmeye başlayan fenotipler için (örneğin, notokord6'nın mineralizasyonu), bu tür bir dokunun morfolojik değerlendirmesini sağlamak için ilaç taraması 4 dpf'den daha fazla ilerlemelidir. Ayrıca, ilaç maruziyetinin, ilgilenilen fenotipin gelişmesinden en az bir gün önce başlamasını öneriyoruz. Bildiğimiz kadarıyla, erken evre zebra balığı larvalarında, özellikle 3 ila 7 dpf yaşlarındaki zebra balıklarında ilaç taraması için FET'e benzer standart bir protokol mevcut değildir. Zebra balığı larvalarında 4 dpf'nin üzerindeki ilaç testini tanımlayan birkaç çalışma yayınlanmış olsa da, test odalarının boyutu, biyolojik ve teknik kopyaların sayısı, ortam değişikliklerinin oranı, maruz kalma süreleri ve değerlendirilen morfolojik kusurlar dahil olmak üzere kullanılan metodolojide tutarlılık eksikliği vardır 8,9,10,11,12,13 . Bu nedenle, standartlaştırılmış toksisite testi için doğrulanmış bir protokol geliştirdik ve ardından zebra balığı larvalarındaki morfolojik değişikliklerin 3-7 dpf'de görsel olarak gözlemlenmesini izledik. Önerilen protokol daha sonra davranış analizi, gen ekspresyon profili oluşturma ve histomorfometri gibi diğer aşağı akış fenotipleme testleri için kullanılabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı, 2010/63/EU sayılı AB Direktifine göre ele alınmıştır. Tüm deneyler, Malta Üniversitesi Fakülte Araştırma Etik Komitesi (FREC) ve Ortak FREC Hayvan Araştırmaları Sektörel Alt Komitesi (JFARSS) tarafından onaylandı. Önerilen protokolün bir akış şeması Şekil 1'de bulunabilir.

1. Yumurta üretimi, toplanması ve bakımı

  1. Balıkları bir gün önce, son yemden en az bir saat sonra, erkekleri ve dişileri ayıran bölücüler olacak şekilde üreme tanklarına yerleştirin. Daha iyi yumurta üretimi sonuçları için, daha yüksek bir dişi/erkek oranı kullanın. Balıkları 14 saat:10 saat aydınlık/karanlık döngüsüne sahip ve 27-28 °C ortam sıcaklığında bir odaya yerleştirin.
    NOT: 1 L'lik bir üreme tankı üç yetişkin balığı tutabilirken, 1,7 L'lik bir üreme tankı beş yetişkin balığı tutabilir.
  2. Ertesi sabah, ışığın başlamasını takiben, üreme tanklarındaki suyu değiştirin ve bölücüleri çıkarın. Üreme tankının kolayca eğimli olmaması durumunda, çiftleşmeyi teşvik etmek için sığ suyun mevcut olduğundan emin olmak için eğimli bir konuma yerleştirin. Yavaş yumurta üretimi ve çiftleşme aktivitesi durumunda, üreme tanklarındaki suyu her 45 dakikada bir değiştirin. Balıkları 3 saate kadar veya gerektiği kadar çiftleşmeye bırakın.
  3. Çiftleşme tamamlandıktan sonra, uzun süreli yumurta bağlanmasını önlemek için yumurta üretmeyen dişileri hafifçe sıkın. Balıkları kendi tanklarına geri koyun.
  4. Bir süzgeç kullanarak üreme tanklarındaki yumurtaları toplayın, embriyo suyu (E3) ile durulayın ve E3 içeren bir Petri kabına yerleştirin. E3'ü hazırlamak için 16.67 mL 60x E3 (300 mM NaCl; 10 mM KCl; 20 mM CaCl 2.2H2O; 20 mM MgSO4.7H 2O) 1 mL %0.01 metilen mavisi ve 982 mL deiyonize su ile karıştırın. Döllenmemiş yumurtaları veya kalıntıları temizleyin. 100 mm x 15 mm Petri kabı başına 50 yumurta ve 150 mm x 15 mm Petri kabı başına 120 yumurta ile Petri kaplarının kalabalık olmadığından emin olun.
  5. Yumurtaları 28,5 °C'ye ayarlanmış ve 14 saat:10 saat gündüz/gece döngüsüne sahip bir kuluçka makinesinde saklayın. 1 dpf'de, E3'ü yenileyin ve mantar büyümesini sınırlamak için canlı olmayan yumurtaları çıkarın.

2. Test plakası hazırlama

  1. 3 dpf'de, 100 μL hacme ayarlanmış 1.000 μL'lik bir mikropipet kullanarak 96 oyuklu bir plakada her bir oyuklu bir sağlıklı görünümlü, yumurtadan çıkmış embriyoyu aktarın.
    NOT: Çatlamamış embriyolar kullanılmamalıdır, çünkü bu değişken bileşik alımına neden olabilir. Sağlıklı görünen embriyoların kullanılması, test sırasında yanlılığı da sınırlar. Pipet ucunun boyutu, zebra balığı embriyosunun herhangi bir fiziksel hasara neden olmadan kolayca toplanmasını sağlar. Ek olarak, bir mikropipet, bir transfer pipetinin aksine kuyuya dağıtılan hacmin daha iyi kontrol edilmesini sağlar.
  2. 12 oyuklu bir plakada, her bir test kimyasalı için istenen konsantrasyonları ayrı kuyucuklarda hazırlayın (burada, 100 μM ila 6.25 μM konsantrasyon aralığında Bosutinib). Her bir oyukta, mikropipetler kullanarak gerekli hacimde test kimyasalı ekleyin ve E3 kullanarak 2,4 mL'ye kadar yapın.
    NOT: İlgili test kimyasalları için kullanılacak yeterli konsantrasyonları belirlemek için bir literatür taraması yapılmalıdır. Herhangi bir bilgi mevcut değilse, uygun bir konsantrasyon aralığı belirlenene kadar birkaç konsantrasyon denenebilir. En az beş konsantrasyon kullanılmalıdır, en yüksek konsantrasyon% 100 mortaliteye neden olur ve en düşük konsantrasyon gözlemlenebilir bir etkiye neden olmaz7.
  3. Stok test kimyasalını çözmek için kullanılan çözücüye bağlı olarak bir araç kontrolü hazırlayın.
    NOT: Birçok test bileşiği suda çözünür değildir ve bu nedenle sulu bir çözelti oluşturmak için etanol veya dimetil sülfoksit (DMSO) gibi belirli çözücüler ("araçlar") içinde çözülmeleri gerekir. DMSO, zebra balığında güvenli bulunan konsantrasyon olan bir araç kontrolü olarak kullanıldığında tercihen %1'lik bir konsantrasyonu aşmamalıdır14.
  4. 3 oyuklu plakada bulunan herhangi bir E96 solüsyonunu 200 μL'lik bir mikropipet kullanarak çıkarın ve test edilen karşılık gelen ortamın 100 μL'si ile değiştirin. Konsantrasyon başına toplam 24 larvayı test ettiğinizden emin olun. Test kimyasallarını ilgili test plakası kuyucuklarına aktarmak için tek veya 8 kanallı 200 μL'lik bir mikropipet kullanın. Kontrolleri dahil edin (örneğin, E3, kimyasal araç, pozitif kontroller, vb.).
    NOT: Plaka kurulumu, dört adede kadar farklı test kimyasalını veya aynı kimyasalın dört farklı konsantrasyonunu barındırır. Kontrollerle birlikte aynı kimyasalın (örneğin, Bosutinib) beş konsantrasyonunun araştırılması için kurulan test plakalarının bir örneği Şekil 1'de gösterilmektedir.
  5. Maruziyetten 24 saat sonra, morfolojik skorlama (bölüm 3'te açıklandığı gibi) ve 50 μL ortamı çıkararak ve yeni hazırlanmış ortamla değiştirerek yarım orta bir değişiklik yapın. İşlemdeki ölü larvaları çıkarın ve kaydedin. Larvaları 28,5 °C'ye ayarlanmış ve 14 saat:10 saat gündüz/gece döngüsü ile donatılmış bir kuluçka makinesinde tutun. İşlemi 7 dpf'ye kadar tekrarlayın.

3. Morfolojik değerlendirme

  1. Bir stereo ışık mikroskobu kullanarak, bireysel test larvalarını uygun bir büyütmede gözlemleyin.
    NOT: Değerlendirilebilecek morfolojik kusur örnekleri Tablo 1'de verilmiştir.
  2. Morfolojinin iki bağımsız golcü tarafından değerlendirilmesini sağlayın, iki golcü arasında anlaşmazlık olması durumunda üçüncü birine danışılsın.
  3. Morfolojiyi ikili bir yöntem (yani, mevcut/yok) kullanarak puanlayın, burada 'yok' normal morfolojiyi gösterir ('0' olarak puanlanır) ve 'mevcut' morfolojik anormalliğin varlığını gösterir ('1' olarak puanlanır). Şekil 2 , etkilenmemiş bir zebra balığı (Şekil 2A), hafif perikardiyal ödemli bir zebra balığı (Şekil 2B), yumurta sarısı kanaması ve yumurta sarısı ekstansiyonu ile şiddetli perikardiyal ödem (Şekil 2C), azalmış pigmentasyon ile gecikmiş gelişim, yüzme kesesi ve toplam uzunluk (Şekil 2D), şişmiş yumurta sarısı ve bükülmüş bir kuyruk yüzgeci (Şekil 2E), kuyruk yüzgeci olmaması (Şekil 2F), eğri notokord (Şekil 2G), kesilme (Şekil 2H) ve nekrozlu ölüm (Şekil 2I). Tüm anormal fenotipleri '1' ve etkilenmemiş zebra balığını '0' olarak puanlayın.

4. LC50 tayini

  1. Morfoloji değerlendirmesinin ardından, konsantrasyona karşı kümülatif yüzde mortaliteyi 7 dpf'de çizin. Şekil 3'te bir örnek gösterilmiştir. % 50 mortaliteye neden olan konsantrasyonu tahmin etmek için konsantrasyon eğrisini kullanın.
  2. LC 50 konsantrasyonu tahmin edildikten sonra,96 oyuklu bir plakada 24 kopya larvayı bu tek tahmini LC50 konsantrasyonuna maruz bırakarak yukarıda açıklanan deneyi tekrarlayın.

5. Teknik kopyalar

  1. Sonuçların tekrarlanabilir olduğundan emin olmak için aynı kimyasalın seçilen beş konsantrasyonunu kullanarak tüm prosedürü iki ayrı durumda en az iki kez daha tekrarlayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anormallikler, 7 dpf'ye kadar deneysel zaman çizelgesi boyunca tek tek veya kümülatif olarak incelenebilir. Anormallik başına maksimum morfoloji skoru, kullanılan larva sayısının yüzdesi olarak morfolojik anormallikleri hesaplamak için kullanılabilir. Örneğin, 7. günde perikardiyal ödem morfoloji skorları, olası 24 skor üzerinden 1 ve 2 skorerleri için sırasıyla 19 ve 20 ise, yani 24 üzerinden 19 veya 20 larva perikardiyal ödem gösterir, yüzde skoru şu şekilde hesaplanabilir:

figure-results-1

Ek Tablo S1 , kronik miyeloid lösemi15 tedavisi için endike olan bir tirozin kinaz inhibitörü olan Bosutinib bileşiği için toksisite testini takiben 4 dpf'de morfoloji puanlama sonuçlarını (her iki skorerin) göstermektedir. Aynı morfoloji puanlaması, 5 dpf ila 7 dpf arasındaki maruz kalan balıklar için tekrarlanır. Bileşik, 100 μM ila 6.25 μM arasında bir konsantrasyon aralığı kullanılarak test edildi. Farklı zaman noktalarında üç teknik kopya gerçekleştirildi ve larvaların% 50'sinin hayatta kaldığı konsantrasyon olan LC50'yi belirlemek için 7 dpf'deki ortalama kümülatif mortalite oranı kullanıldı. LC50 , herhangi bir maruz kalma zaman noktasında belirlenebilir. Ancak, bunu 7 dpf'de hesaplamanızı öneririz.

7 dpf'deki kümülatif ortalama mortalite, Şekil 3'te görülebilen bir LC50 eğrisi oluşturmak için kullanıldı. Bosutinib için LC50 konsantrasyonunun 37.95 μM olduğu tahmin edildi.

NOT: Bu tahmini LC50 konsantrasyonu kesinlikle bu model sistem için geçerlidir ve daha sonra daha sonraki aşağı akış fenotipleme testleri için kullanılabilir.

figure-results-2
Şekil 1: Larvalarda 3-7 dpf'de önerilen ilaç taramasının şeması. 96 oyuklu test plakaları, Bosutinib bileşiği için 100 μM ila 6.25 μM arasında değişen beş konsantrasyonun araştırılması için kurulmuştur. Kısaltma: dpf = döllenmeden sonraki gün sayısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 2: Çeşitli kimyasal konsantrasyonlara maruz kalan 5 dpf'de (maruziyetten 2 gün sonra) zebra balığı larvalarında gözlenen temsili morfolojik kusurlar. (A) Kontrol (etkilenmemiş) zebra balığı, (B) Hafif perikardiyal ödem gösteren zebra balığı larvaları, (C) Şiddetli perikardiyal ödem ve yumurta sarısı kanaması olan zebra balığı, (D) Gelişimsel gecikmeli, pigmentasyonu azalmış, küçük yüzme keseli zebra balığı, (E) Şişmiş sarısı ve kuysal yüzgeci olan zebra balığı, (F) Kuyruk yüzgeci olmayan zebra balığı, (G) Kavisli notokordlu zebra balığı, (H) Kesik kuyruklu zebra balığı, ve (I) Nekrozlu ölü zebra balığı. Kusurlar kırmızı ok uçları ile belirtilmiştir. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 3: % mortaliteye karşı konsantrasyonu gösteren LC50 eğrisi. Test edilen beş konsantrasyon 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM ve 6.25 μM idi ve % mortalite sırasıyla% 100,% 100,% 29.2,% 12.5 ve% 12.5 idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Morfolojik KusurlarAçıklama
Perikardiyal ödemKalbin gerilmesi ve kan dolaşımının bozulması ile kalbin etrafında sıvı birikmesi
Kalp atışları (dakika başına)Dakikadaki vuruş sayısında azalma
Yumurta sarısıKardiyak defektlerle aynı anda ortaya çıkabilen yumurta sarısı ödemi veya kanamasının varlığı veya yokluğu
Sarısı uzatmaŞişmiş, ince veya olmayan yumurta sarısı
Kavisli notokordBükülmüş veya dalgalı bir notokord ve/veya kıvrık kuyruk varlığı
Yüzme kesesiYüzme kesesinin varlığı, yokluğu veya kısmi gelişimi
PigmentasyonAynı yaştaki tedavi edilmemiş balıklara kıyasla daha az veya hiç melanosit yok
NekrozVücudun herhangi bir yerinde nekroz varlığı (hafif veya şiddetli) veya nekroz olmaması
Gecikmiş geliştirmeAynı yaştaki vahşi tip kontrollere kıyasla gecikmiş gelişme veya durdu.
Dokunma tepkisiBir irkilme sonrasında gecikmiş veya hiç yanıt yok (örneğin, pipet ucu kullanarak)
KesilmeArka zebra balığı gövdesinin olmaması (yani kuyruğun oluşumu)
Yüzgeç -leriİnce yumurta sarısı uzantısının eşlik edebileceği kuyruk yüzgecinin varlığı veya yokluğu
Küçültülmüş gövde ekseniNormal görünen ancak ölçüldüğünde balıkların uzunluğu daha kısadır

Tablo 1: İlaç maruziyeti çalışmalarının ardından gözlemlenebilecek görsel morfolojik kusurların bir listesi.

Ek Tablo S1: Bosutinib için 4 dpf'de (maruziyetten 1 gün sonra) temsili morfolojik sonuçlar. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı ilaç taraması için önemli bir model haline gelmiştir. Toksisite testi yapmak için bir metodoloji belirlemeye çalışırken, farklı laboratuvarlardan birkaç zıt yöntem bulduk 8,9,10,11,12,13. Açıklanan yöntemler, farklı yaşlarda larvaları, değişken deneysel zaman çizelgelerini, farklı ortam değişim oranlarını ve farklı morfoloji puanlama sistemlerini kullanır. Deneme yanılma yoluyla, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayan açıklanan metodolojiyi oluşturduk.

Plaka boyutu seçme
Başlangıçta, larvaların hareket etmek ve büyümek için yeterli alana sahip olduğundan emin olmak için 24 oyuklu bir plakada deneyler yapıldı. Plakalar, kuyu başına 10 larva, konsantrasyon başına iki kuyu ve oyuk başına 1 mL ilaç çözeltisi ile düzenlendi. Bu düzenleme tekrarlanabilir sonuçlar vermedi ve larvaların kuyudan eşit miktarda ilaç emmediği sonucuna yol açtı. Denemeler daha sonra, kuyu başına bir larva ile 96 oyuklu ve 48 oyuklu bir plaka kullanılarak gerçekleştirildi, bu da 96 oyuklu plakalardaki larvaların büyüme ile ilgili herhangi bir sorun göstermediğini gösterdi. Bu nedenle, deneyler daha az alan ve ilaç hacmi kullanılarak 96 oyuklu bir plakada devam etti.

Günlük ortam değişimi
Zebra balığı ilacı ortamdan emdiğinden, ilacın ortamdaki tutarlı bir konsantrasyonunu korumak için bir dereceye kadar orta değişikliğin gerekli olduğunu tespit ettik. Ayrıca, orta ölçekli bir değişiklik, kuyuda biriken potansiyel atık malzemeyi ortadan kaldırır, bu da toksik bir ortam sağlayabilir ve önyargılı sonuçlara yol açabilir. Bosutinib ile bir deneme yapıldı, burada aynı ilaç için üç plaka kuruldu, biri günlük orta değişim olmadan, biri günlük yarım orta değişim ile ve biri tam günlük orta değişim ile. Orta değişikliği olmayan plak artmış mortalite oranları sergilerken, yarım ve tam besiyeri değişikliği olan plaklar 7 dpf ile aynı sonuçla sonuçlandı. Böylece, günlük yarı orta değişim seçildi. Bu seçim, daha sonraki sonraki deneyler için gerekli olabilecek pahalı ve sınırlı test malzemesinin daha az tüketilmesini sağlar.

Maruz kalma süresi
Bu protokolde kullanılan test larvalarının yaşı ve seçilen ilaca maruz kalma süresi, ilgilendiğimiz fenotipin kemik mineralizasyonu olmasından kaynaklanmaktadır. Kemik oluşumu ~ 4 dpf'de başladığından, test kimyasallarının kemik gelişiminin başlangıcını etkileyip etkilemediğini belirlemek için 3 dpf'de zebra balığı ile başlamayı seçtik. Daha sonra, sonuçları saptırabilecek beslenme eksikliği göz önüne alındığında, 8 dpf'den itibaren yüksek derecede mortalite gözlendiğinden, ilaç maruziyet çalışmalarını 7 dpf'de sonlandırdık. Bununla birlikte, çalışmanın doğasına ve ilgilenilen fenotipe bağlı olarak zaman dilimleri ayarlanabilir.

Sınırlama
Bu metodolojinin bazı sınırlamaları vardır. 3 dpf zebra balığının çok kuyulu test plakalarına aktarılması zaman alıcıdır. Larvaları toplamadan ortamı kuyulardan çıkarmak da aynı derecede zahmetlidir. Larvaların işlem sırasında zarar görmemesini sağlamak için ortamın tek kanallı bir pipet kullanılarak her kuyudan yavaşça çıkarılması gerekir. Ayrıca, günlük yarım orta değişim, test bileşiğini yeniler ve atık materyalin kuyudan uzaklaştırılmasını sağlarken, 5 günlük maruziyet boyunca kuyuda stabil bir ilaç konsantrasyonunun korunabileceğini garanti etmez. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi analizi, her bir larva tarafından emilen gerçek ilaç miktarı hakkında daha fazla bilgi verebilirken, test artık yüksek verimli bir tarama yöntemi olarak nitelendirilmeyecektir.

Sonuç olarak, bu metodoloji, 4 dpf'nin ötesinde zebra balığı kullanılarak toksisite testindeki boşluğu hedeflemeyi, vahşi tip, mutant ve transgenik zebra balığı hatlarına uygulanabilir ve embriyonik aşamada FET ile eşit olan standart bir protokole doğru adımlar atmayı amaçlamaktadır. Bu, daha önceki aşamalarda mümkün olmayabilecek diğer aşağı akış fenotipleme testleri için yollar açar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, tümü XjenzaMalta tarafından Bilim ve Teknoloji Vakfı için ve adına finanse edilen bir Teknoloji Geliştirme Programı (TDP) fonu olan ZeEBRA (R&I-2019-018), bir TDPLite fonu olan STRONG (R&I-2024-007L), bir TDPLite fonu, NASDAC (SINO-MALTA-2022-08) ve bir Go2Market hibesi olan SHOW (R&I-2018-007A) projeleri tarafından desteklenmektedir. Şekil 1 , BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpüStarlabE1415-1510
10 & mikro; L mikropipet (P10)GilsonF144802 
10/20 ve mikro; L pipet uçlarıStarlabS1110-3810
1000 & L mikropipet (P1000)GilsonF123602 
1000 ve mikro; L pipet uçlarıStarlabS1111-6001
12 oyuklu plakaStarlabCC7672-7512Steril, tek sarılı, işlem görmemiş, kapaklı
20 ve mikro; L mikropipet (P20)GilsonF123600 
200 ve mikro; L mikropipet (P200)GilsonF123601 
200 ve mikro; L çok kanallı pipet GilsonF81024
200 ve mikro; L pipet uçlarıStarlabS1113-1006
96 oyuklu plakaStarlabCC7672-7596Steril, tek sarılı, düz tabanlı, işlenmemiş, kapaklı
İç ızgara eğimli tabanlı yetiştirme tankları, tank bölücüler ve kapaklarTecniplastZB17BTISLOP, ZB17BTE,  ZB17BTL, ZB17BTDEğimli iç tank
File süzgeç//
Nitril eldivenMercator//
Petri-kabı StarlabCC7672-3394/CC7672-3359100 x 20 mm veya 60 x 15 mm
Leica M205 FCA Floresan stereo mikroskopLeica10450826
Işık modüllü 2 raf içeren Peltier soğutmalı inkübatör soğuk beyazMemmertIPP110ecoplus, T8Gündüz/gece döngüsü
Dimetil Sülfoksit ile donatılmıştırBiochem Chemopharma504341000içinde %1'lik bir çözelti hazırlamak
Biochem Chemopharma303080500E3
Magnezyum sülfat heptahidratBiochem Chemopharma313060500için E3
Potasyum KlorürBiochem Chemopharmahazırlamak 316030500E3
SCREEN-WELL  Wnt Pathway kütüphanesi (Bosutinib)EnzoBML-2838-0500
Sodyum KlorürFisher ScientificS/3161/53E3'ü hazırlamak için
, , E3 Kalsiyum klorür dihidrat için hazırlamak

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  3. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  4. Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
  5. Keenan, S. R., Currie, P. D. The developmental phases of zebrafish myogenesis. J Dev Biol. 7 (2), 12(2019).
  6. Tonelli, F., et al. Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 489(2020).
  7. OECD. Test no. 236: Fish embryo acute toxicity (FET). , (2013).
  8. Chen, J. R., Lai, Y. H., Tsai, J. J., Hsiao, C. D. Live fluorescent staining platform for drug-screening and mechanism-analysis in zebrafish for bone mineralization. Molecules. 22 (12), 2068(2017).
  9. He, H., Wang, C., Tang, Q., Yang, F., Xu, Y. Possible mechanisms of prednisolone-induced osteoporosis in zebrafish larva. Biomed Pharmacother. 101, 981-987 (2018).
  10. Huang, H. X., et al. Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening. Animal Model Exp Med. 1 (1), 53-61 (2018).
  11. Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. Drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish. J Vis Exp. (158), e60996(2020).
  12. Nishimura, Y., et al. Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing. Congenit Anom (Kyoto). 56 (1), 18-27 (2016).
  13. Hayot, G., et al. Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system. J Vis Exp. (203), e66153(2024).
  14. Hoyberghs, J., et al. DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay. Front Toxicol. 3, 804033(2021).
  15. Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia. Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

la Ke fiMorfoloji Skorlamasevresel Kirleticiler96 Kuyucuklu PlakaPerikardiyal demStereo I k Mikroskobu

İlgili makaleler