Method Article

Pseudomonas aeruginosa'da Motilite Fenotiplerini Gözlemlemek için Yüksek Verimli Yöntem

DOI:

10.3791/67761

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Département de biologie, Faculté des sciences, Université de Sherbrooke

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'da çeşitli motilite tiplerinde yer alan genetik faktörleri tanımlamak için hızlı ve etkili bir yöntem sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hareketlilik davranışları genellikle bir bakterinin çevresindeki mevcut kaynakları kullanma yeteneğinde önemli bir rol oynar. Bu, özellikle yüzey kolonizasyonuna, biyofilm oluşumuna ve konak savunmasından kaçışa katkıda bulunan önemli patojenik özellikler olan sürü ve seğirme dahil olmak üzere çeşitli hareketlilikler sergileyebilen çok yönlü patojen Pseudomonas aeruginosa için geçerlidir. Bu el yazması, P. aeruginosa'nın motilite davranışlarını incelemek için yüksek verimli bir motilite protokolü sunmaktadır. Protokol, örneğin, motilitesinde yer alan genetik faktörleri tanımlamak ve analiz etmek için genom çapında bir mutant kütüphaneden birden fazla P. aeruginosa suşunun aynı anda test edilmesine izin verir. Yaklaşım, motiliteyi kapsamlı bir şekilde inceleme ve P. aeruginosa'nın motilitesinin altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında bilgi edinme imkanı sunar. Burada açıklanan protokol, diğer bakteri türlerinin yanı sıra farklı motilite testlerini de barındıracak şekilde değiştirilebilir, böylece çeşitli bağlamlarda bakteri davranışının anlaşılmasını ilerletmek için güçlü bir platform sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa, olağanüstü metabolik çok yönlülüğü nedeniyle çeşitli ortamları kolonize edebilen fırsatçı bir patojendir 1,2. Bu çok yönlülük, planktonik bir büyüme modundan biyofilmlere geçiş için çok önemlidir ve bu da sudan insan vücuduna kadar çok çeşitli nişlerde gelişme kapasitesine katkıda bulunur 3,4,5. Bu büyüme modları arasındaki geçişe, yüzme, sürü oluşturma ve seğirme dahil olmak üzere çeşitli hareketlilik türlerini kullanarak bu ortamlarda hareket etme konusunda kapsamlı bir yetenek yardımcı olur 1,6. Her bir motilite tipine farklı mekanizmalar ve hücresel yapılar aracılık eder ve P. aeruginosa'nın çevresel ipuçlarına yanıt vermesine izin verir 7,8. Yüzme motilitesi, tek bir polar flagellum tarafından yönlendirilir ve sıvı ortamdan besin maddelerine doğru hareket etmek için kullanılır, örneğin9. Sürü hareketliliği, kamçı ve biyoyüzey aktif madde üretimi ile kolaylaştırılan koordineli bir harekettir ve kolonilerin yarı katı yüzeylere yayılmasına izin verir10,11. Son olarak, seğirme motilitesi flagella'dan bağımsızdır. Bunun yerine, seğirmeye tip IV pili (T4P) aracılık eder ve yüzeylerin üzerinde hareket etmek için kullanılır12,13. Seğirme motilitesi, ilk yüzey bağlanmasını sağlayarak P. aeruginosa'nın biyofilm oluşumunun erken aşamalarına da katkıda bulunur. İlk bağlanmayı takiben, seğirme, bakterilerin yüzeyler boyunca hareket etmesine ve daha sonra olgun biyofilmleredönüşebilen mikro koloniler oluşturmasına izin verir 1,4,13.

Geleneksel olarak, bakteriyel motilite testleri ayrı ayrı, her seferinde bir suş, yumuşak bir agar plakası üzerinde veya mikroskopi yöntemleri 6,14,15 kullanılarak gerçekleştirilir. Yarı katı ortamlar, bakteri motilitesinin incelenmesinde uzun yıllardır kullanılmaktadır. Günümüzde, bu teknikler bakterilerdeki motilite fenotiplerini tanımlamak için hala kullanılmaktadır. Örneğin, geleneksel olarak, oğul verme motilitesi, M9 ortamı içeren bir Petri kabının merkezine 2.5 μL'lik bir P. aeruginosa kültürünün% 0.5 -% 0.8 agar konsantrasyonunda16 aşılanmasıyla gözlenir. Seğirme motilitesi genellikle, bir bıçaklama kültür ortamı yoluyla P. aeruginosa'yı aşıladıktan sonra, agar (% 1'de) ile bir Petri kabının tabanı arasındaki arayüz yüzeyindeki bakterilerin yayılmasına bakılarak ölçülür. 48 saatlik inkübasyondan sonra büyük bir interstisyel koloni genişlemesi halesi elde edilirken, seğirmeyen suşlar böyle bir koloni genişlemesi bölgesi üretmez 1,17,18.

Daha yakın zamanlarda, transpozon mutajenez yaklaşımları, P. aeruginosa 19,20,21'de motilite veya biyofilm oluşumunda rol oynayan yeni genler keşfetti. Örneğin, seğirme motilitesinde yer alan yeni genler, P. aeruginosa19'da yüksek yoğunluklu bir transpozon mutant kütüphanesi kullanılarak bulundu. Fonksiyonel genomikte bir başka yararlı araç, sıralı mutant koleksiyonlarınınkullanılmasıdır 22,23. Escherichia coli'deki tüm esansiyel olmayan genler için tek gen delesyonlarını içeren Keio koleksiyonu24, muhtemelen en iyi bilinen mutant koleksiyonudur ve farklı ortamlardakibüyümeden 25 hücre morfolojisine26 ve daha fazlasına kadar çeşitli fenotipleri etkileyen genleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu tür koleksiyonlar Salmonella enterica serovar Typhimurium27, Bacillus subtilis28, P. aeruginosa29 ve diğer birçok tür için de mevcuttur. Bu koleksiyonlar aynı zamanda genom çapında bir şekilde motiliteyi incelemek için çok uygundur ve bu da P. aeruginosa'nın motilitesini incelemek için yüksek verimli bir yöntemin geliştirilmesine yol açar. Burada yöntem, P. aeruginosa mutantlarının yüksek yoğunluklu plakalar üzerinde hem seğirme hem de sürü halinde hareket etme motilitesine katkısı değerlendirilerek test edilmiştir. Bu yüksek verimli yöntem, çeşitli motilite fenotipleri için kullanılabilir ve diğer bakterilerin motilitesini incelemek için de uygundur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu prosedürün genel iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Deneysel iş akışı. (1) Deneylerde ilgilenilen hareketlilik türüne göre gerekli miktarda hareketlilik ortamı hazırlayın. (2) Manuel veya otomatik bir çoğaltıcı sistem kullanarak, mutant koleksiyonun P. aeruginosa transpozon yerleştirme mutant kütüphanesi için kaynak stok plakalarını, plakaların tüm kuyucuklarında hassasiyet ve tek tip aşılamaya vurgu yaparak uygun yoğunlukta hazırlayın. (3) Numuneleri mutant koleksiyonun kaynak plakalarından motilite plakalarına aktarın. (4) Kuluçkadan sonra, motilite fenotiplerini gözlemleyin ve analiz edin ve yüksek kaliteli görüntüler kullanarak ilgilenilen motiliteye dahil olan genleri tanımlayın. (5) Yüksek verimli motilite deneyleri yoluyla tanımlanan isabetleri doğrulamak için geleneksel motilite testleri gerçekleştirin. BioRender ile oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sürü plakaları - M9 mediaSeğirme plakaları - LB mediaKaynak plakaları - LB ortamı
200 mL 5x M9 tuz çözeltisi10 g NaCl10 g NaCl
10 mL %20 glikoz10 g Tripton10 g Tripton
25 mL kasamino asit5 g Maya Özü5 g Maya Özü
1 mL 1M MgSO410 g Agar15 g Ağar
500 mL %1 agar1L'ye dH2O ekleyin1L'ye dH2O ekleyin
1L'ye dH2O ekleyinGentamisin (son konsantrasyon 15 μg/mL)

Tablo 1: Testte kullanılan çeşitli plakalar için ortam bileşimi.

1. Kültür ortamı plakalarının hazırlanması

NOT: Stok çözeltilerini ve saklama koşullarını hazırlamak için Malzeme Tablosuna bakınız. Plakalar düz bir yüzeye doldurulmalıdır. Kururken, plakalar yüzeyde düz olmalıdır (yani istiflenmemelidir). Bu, plakadaki kültür ortamının eşit şekilde kurumasını sağlar. Tipik bir ayak izine sahip herhangi bir tek kuyulu plaka işe yarayabilir, ancak Singer Instruments Plus Plakaları veya VWR tek kuyulu işlenmemiş doku kültürü plakaları gibi daha büyük iç boyutlara sahip plakalar (iç duvarlar olmadan), plaka başına daha yüksek bir koloni yoğunluğu ile çalışmayı kolaylaştırır.

  1. Tablo 1'deki tarife göre deneyler için uygun miktarda ortam hazırlayın. Agarın katılaşmasını önlemek için ortamı ~ 45 ° C - 50 ° C arasında tutun.
    1. Kaynak plakaları için, tam PA1.5 kütüphanesi-59 x 25 mL =~ 1500 mL'yi çoğaltmak için gerekli olan% 1.5 agar ve 15 μg / mL gentamisin içeren 59 LB (lizojeni et suyu) plakası hazırlayın. Kitaplığı 384 yoğunluklu formatta yükseltmek için 15 plaka daha LB% 1.5 agar ve 15 μg / mL gentamisin hazırlayın: 15 x 25 mL = ~ 400 mL.
    2. Seğirme plakaları: 96 yoğunluklu formatta çalışıyorsanız, 59 seğirme plakası hazırlayın (LB %1 agar). 384 yoğunluklu formatta çalışıyorsanız 15 seğirme plakası hazırlayın.
    3. Sürü plakaları: 15 (384 yoğunluk formatı) veya 59 (96 yoğunluk formatı) sürü plakası (M9-glikoz %0,5 agar) hazırlayın
  2. Kapağı bir tabaktan çıkarın ve plaka başına 25 mL ortam dökün. Plakanın her köşesini teker teker nazikçe kaldırarak ortamı plaka boyunca eşit olarak dağıtın. Bu kıpırdama hareketini 2x-3x tekrarlayın. Kapağı tekrar tabağa koyun.
  3. Plakaların gece boyunca oda sıcaklığında (RT) katılaşmasına ve kurumasına izin verin. Plakalar hemen kullanılmazsa, hava geçirmez torbalara koyun ve kuru bir yerde saklayın. 3 hafta boyunca saklanabilirler.

2. P. aeruginosa transpozon mutant kütüphanesinin kaynak plakalarının hazırlanması

NOT: Kaynak plakaları, daha sonra motilite plakalarını aşılamak için kullanılan PA14 kütüphanesinin bir kopyasını içeren LBA-gentamisin plakalarına atıfta bulunur. P. aeruginosa transpozon mutant kütüphanesi (PA14 kütüphanesi) 59 donmuş 96 oyuklu plakadan oluşan bir settir29. Her format için kaynak plakaları hazırlama adımları aşağıda açıklanmıştır. Bu protokol, Rotor+ çoğaltıcıya erişimi olmayan laboratuvarlar için uyarlanabilir. Araştırmacılar, 1. gün boyunca PA14 kütüphanesinin donmuş plakalarının çoğaltılması için burada kullanılan yaylı 96 pinli çoğaltıcılar gibi manuel çoğaltıcıları kullanarak aynı deneysel prosedürleri başarıyla gerçekleştirebilirler ( Malzeme Tablosuna bakın) veya diğer 96 pinli çoğaltıcılar. Manuel çoğaltıcıların sterilize edilmesi ve her kullanım arasında soğumaya bırakılması gerekir.

  1. 1. Gün: PA14 kütüphanesinin 59 donmuş 96 oyuklu plakadan kaynak plakalara kopyalanması
    1. Yaylı 96 pinli bir çoğaltıcıyı, 8 dakika boyunca maksimum sıcaklıkta sıcak bir plakaya yerleştirerek sterilize edin. Sterilizasyondan sonra, bakterileri öldürmemek için çoğaltıcının yeterince soğumasını bekleyin (~ 10 dakika).
    2. Bir kaynak plakası alın. Steril 96 pimli çoğaltıcıyı kullanarak, çoğaltıcı pimlerini dikkatlice 96 oyuklu bir plakaya daldırın, ardından hücreleri doğrudan kaynak plakasının yüzeyine aktarın. PA59 kütüphanesinin 96 oyuklu 14 plakasının tümü kaynak plakalarına kopyalanana kadar tekrarlayın.
    3. 96 yoğunluklu kaynak plakalarını 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
      NOT: Yöntem 96 yoğunluklu bir formatta kullanılıyorsa, bu kaynak plakaları daha sonra motilite plakalarını aşılamak için kullanılabilir.
  2. 2. Gün: 96 yoğunluklu formattan 384 yoğunluklu formata yükseltme
    NOT: 96 yoğunlukta çalışılıyorsa 2. gün atlanabilir.
    1. İnkübasyondan sonra, plakaları (bir yüzey üzerinde düz, istiflenmemiş) oda sıcaklığında (~ 1 saat) soğumaya bırakın. Kapaklarda yoğuşma varsa, koloniler arasında çapraz kontaminasyona neden olabilecek su damlacıklarının plakaların üzerine düşmesini önlemek için hassas bir görev mendili kullanarak yoğuşmayı giderin.
    2. Doğru koloni transferini sağlamak için çoğaltıcıyı aşağıdaki parametrelerle yapılandırın. Çoğaltıcıyı AÇIN . Bir çalışma modu seçin bölümünde, Depolanan Programları Seç ve Çalıştır'ı seçin.
    3. Kaynak plakalarını seç bölümünde PlusPlate 96 Agar'ı seçin. Hedef plakaları seçin bölümünde PlusPlate 384 Agar'ı seçin. Pedleri seç bölümünde, Kısa Pim 96'yı seçin.
    4. Program seçeneklerini çoğalt bölümünde, Genel'i seçin ve Geri Dönüştür > Hiçbiri'ne tıklayın.
    5. Kaynak bölümünde, Ofset'i seçin ve Rastgele > Varsayılan Yarıçap'a tıklayın. Hedef bölümünde, Sabitleme'yi seçin ve basıncı %20'ye ayarlayın. Diğer tüm ayarları varsayılan olarak bırakın.
    6. Kısa Pimli RePads 96'yı uygun bölmeye yerleştirin.
    7. Kaynak ve hedef plakaları çoğaltıcının belirlenen platformuna yerleştirin. 96 yoğunluklu kaynak plakalarını (plaka 1, 2, 3 ve 4) ve yeni boş kaynak plakasını (LBA plakaları) platforma yerleştirin. Seçilen parametreleri kullanarak, mikrobiyal dizi sabitleme robotu, kolonileri 96 yoğunluklu plakalardan yeni 384 yoğunluklu plakaya aktaracaktır. Çalıştır'a basın.
    8. Platformdaki tüm plakaları değiştirin (sonraki dört 96 yoğunluklu kaynak plakası ve yeni bir boş kaynak plakası) ve tüm plakalar yükseltilene kadar tekrarlayın. Son plaka seti için plaka 57, 58, 59 ve 1'i kullanın. Her 384 yoğunluklu plaka, dört adet 96 yoğunluklu plakadan alternatif kolonilerden oluşacaktır (bkz. Şekil 2). 384 yoğunluklu LBA plakalarını 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.
      NOT: Bu 384 yoğunluklu kaynak plakaları daha sonra protokolü 384 yoğunlukta gerçekleştirmek için motilite plakasını aşılamak için kullanılabilir. İnkübasyondan sonraki herhangi bir adımda, plakalar 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklanabilir.

figure-protocol-2
Şekil 2: 96 yoğunluklu plakalardan 384 yoğunluklu plakalara yükseltme. Dört adet 96 yoğunluklu kaynak plakadan koloniler aktarılır ve tek bir 384 yoğunluklu plakada birleştirilir. 384 yoğunluklu plakanın her çeyreği, her mutantın konumunu koruyarak orijinal 96 oyuklu plakalardan birine (kırmızı, mavi, sarı ve yeşil) karşılık gelir. BioRender ile oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Yüksek verimli motilite deneyi

NOT: Protokol burada 384 yoğunluklu formatta gerçekleştirilmiştir, ancak aynı protokol, 384 yerine 96 seçimini kullanarak kaynak plakalardan motilite plakalarına aktarmak için çoğaltıcı üzerindeki parametreleri değiştirerek 96 yoğunluklu bir formata uyarlanabilir.

  1. İnkübasyondan sonra, plakaları (bir yüzey üzerinde düz, istiflenmemiş) oda sıcaklığında (~ 1 saat) soğumaya bırakın. Kapaklarda yoğuşma meydana gelirse, koloniler arasında çapraz kontaminasyona neden olabilecek su damlacıklarının plakaların üzerine düşmesini önlemek için hassas bir görev mendili kullanarak çıkarın.
  2. İstenen tahlil için uygun sayıda plaka (96 yoğunluklu format için 59 veya 384 yoğunluklu format için 15) alın: Oğul verme için M9-glikoz %0.5 agar plakaları, LB ve seğirme için %1 agar plakaları.
  3. Doğru koloni transferini sağlamak için çoğaltıcıyı aşağıdaki parametrelerle yapılandırın.
    1. Çoğaltıcıyı AÇIN . Bir çalışma modu seçin bölümünde, Depolanan Programları Seç ve Çalıştır'ı seçin. Kaynak plakalarını seç bölümünde PlusPlate 384 Agar'ı seçin.
    2. Hedef plakaları seçin bölümünde PlusPlate 384 Agar'ı seçin. Pedleri seç bölümünde, Kısa Pim 384'ü seçin. Program seçeneklerini çoğalt bölümünde, Genel > Geri Dönüşüm > Hiçbiri'ni seçin.
    3. Singer Programları'nda, Çok Çoğalt'ı seçin.
    4. Kaynak bölümünde, Varsayılan Yarıçap > Rastgele > Ofset'i seçin. Hedef bölümünde, Sabitleme'yi seçin ve basıncı %2'ye ayarlayın. Diğer tüm ayarları varsayılan olarak bırakın.
  4. Kısa Pimli RePads 384'ü uygun bölmeye yerleştirin.
  5. Kaynak ve hedef plakaları çoğaltıcının belirlenen platformuna yerleştirin. 384 yoğunluklu kaynak plakalarını ve boş hareketli plakaları platforma yerleştirin. Çalıştır'a basın Seçilen Parametreleri kullanarak, mikrobiyal dizi sabitleme robotu, kolonileri 384 yoğunluklu kaynak plakalarından motilite plakalarına aktaracaktır. Her 384 yoğunluklu plaka, bir 384 yoğunluklu kaynak plakadan bir kopyadan oluşacaktır.
  6. Transferin eşit olduğundan ve tüm kolonilerin motilite plakalarının agar yüzeyine uygun şekilde sabitlendiğinden emin olun. Aşılanmış hareketlilik plakalarını plastik torbalara koyun. Plakaları içeren torbaları 18 saat boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre dikkatlice yerleştirin.
    NOT: Plakalar, nemi korumak ve düzensiz kurumayı önlemek için torbalara yerleştirilir. Plakaları, kapakları yukarı bakacak şekilde inkübatöre yerleştirin.
  7. Kuluçkadan sonra, koloni büyümesi ve kontaminasyon olmaması için motilite plakalarını kontrol edin.
  8. 3. Gün: Görüntüleme motilite plakaları
    NOT: Singer Instruments PhenoBooth, motilite plakalarının yüksek çözünürlüklü görüntülerini yakalamak için kullanılır. Bilimsel düzeyde bir kamera kullanır ve 23 megapiksel görüntüler üretir. Petri kaplarından ve dikdörtgen plakalardan kolonilerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini yakalamak için beş aydınlatma kanalı içerir. Diğer yüksek kaliteli görüntüleyiciler de çalışır.
    1. Kuluçka döneminden sonra motilite plakları görüntüleme işlemi için hazır hale gelir. Phenobooth'u AÇIN ve Phenobooth yazılımına karşılık gelen Simgeye tıklayın.
    2. Proje Seç sayfası açılır; Koloni Sayımı > Yeni Proje'ye tıklayın. Görüntüleri Konum alanında saklamak için İstediğiniz Dosya Yolu'nu seçin. Çözünürlük alanında 5626 x 4220'yi seçin. Tamam'a tıklayın, cihaz artık fotoğraf çekmeye hazırdır.
    3. Kapağı çıkardıktan sonra plakayı orta tarafı yukarı bakacak şekilde okuyucuya yerleştirin. Plakanın sıkışmasını önlemek için okuyucuyu kapatmadan önce plakanın doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
    4. Aydınlatma sekmesinde parametreyi beyaz ışık olarak ayarlayın. Önizleme'ye tıklayın. Motilite fenotiplerini gözlemlemek için en uygun parametreleri elde etmek için PhenoBooth ayarları sekmesindeki pozlama ayarlarını yapın.
    5. Edin'e tıklayın; Yakalanan görüntüler ekranın sol tarafında görünecektir. Bitirdikten sonra yazılımı kapatın (yakalanan tüm görüntüler Konum sekmesinde daha önce seçilen dosyaya kaydedilecektir).
      NOT: Phenobooth, görüntüleri JPEG formatında kaydeder, ancak aşağı akış analiz adımları için görüntüler TIFF, JPEG veya PNG formatında olabilir.

4. Motilite fenotiplerinin analizi

NOT: Görüntü analizi, French ve ark.30,31 tarafından ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde gerçekleştirilir. Veri analizi yapmak için bir komut dosyası31'den (ImageJ Macro) edinilebilir.

  1. Kısaca görüntüler, motilite plakası üzerindeki her koloni için bir değer üreten ImageJ32'de işlenir. İlk olarak, görüntüleri 8 bit formatına dönüştürün ve threshold komutunu kullanarak kolonileri ve ilişkili motilite alanlarını arka plandan bölümlere ayırın. Her koloninin etrafına bir İlgi Alanı (ROI) çizin ve hareketlilik alanını ölçün. Bu, her kuyu için satırlara göre düzenlenmiş entegre bir yoğunluk değeri içeren bir tablo oluşturur. Bu tablo, daha fazla analiz için bir CSV dosyası olarak kaydedilebilir.
    1. Makroyu ImageJ'de çalıştırın ve görüntüleri içeren klasörü açın.
    2. İstendiğinde, plakanın düz olması için Önizleme seçeneğini kullanarak plakanın açısını değiştirerek plakanın dönüşünü ayarlayın. Memnun kaldığınızda, tıklayın OK düğmesine basın.
    3. Ardından, dikdörtgeni kolonilerin etrafında hareket ettirin ve plakanın kolonileri içeren kısmını kırpmak için kullanın. Hazır olduğunuzda, tıklayın OK düğmesine basın.
    4. Bir sonraki istem, her bir koloninin etrafına ROI çekmek ve hareketlilik alanını ölçmek için kullanılan ızgarayı tanımlayacaktır. Uygun koloni yoğunluğunu seçin. Gerekirse çeşitli parametreleri, her daire bir koloninin etrafında olacak şekilde ayarlayın. Hazır olduğunuzda, Tamam mı? kutusunu işaretleyin ve OK düğmesine basın. Bu, her koloni için hareketlilik alanını ölçecek ve verileri içeren klasöre bir CSV dosyası kaydedecektir.
  2. Bu CSV dosyasını, her bir motilite alanını karşılık gelen mutantla tanımlamak için yine satırlar halinde düzenlenmiş plaka göstergesiyle birleştirin. Daha düşük entegre yoğunluk değerleri, hareketsiz olan veya azalmış hareketlilik gösteren mutantlara karşılık gelir.

5. İsabetlerin doğrulanması için geleneksel motilite testleri

NOT: Yüksek verimli motilite protokolünde etkilenen motiliteye sahip mutantları gözlemledikten sonra, elde edilen isabetleri ayrı ayrı doğrulamak önemlidir. Bireysel motilite protokolü, yüksek verimli test için kullanılandan farklıdır, ancak kullanılan ortam aynıdır.

  1. Sürü hareketliliği testi
    NOT: Sürü motilitesi, Ha ve ark.16 tarafından ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi gerçekleştirilir.
    1. Kısaca, M9 (% 0.5 agar), glikoz, kasamino asitler veMgS04 ile bir agar çözeltisini otoklavlayın. Soğutulmuş, karıştırılmış agarı Petri plakalarına dökün (plaka başına 25 mL).
    2. Gece boyunca 2.5 μL bakteri kültürü ile aşılayın. Mutilite fenotiplerini gözlemlemek için kapaklar yukarı bakacak şekilde 37 ° C'de 18 saat inkübe edin.
  2. Seğirme motilite testi
    NOT: Seğirme motilitesi Haley ve ark.33,34 tarafından ayrıntılı olarak tarif edildiği şekilde gerçekleştirilir.
    1. Kısaca, bir LB %1 agar otoklavlayın (bakınız Tablo 1). Soğutulmuş, karıştırılmış LB %1 agarı Petri plakalarına (plaka başına 25 mL) dökün.
    2. Bakterileri seğirme plakalarının dibine bıçakla aşılayın (% 1 agar). Plakaları 37 °C'de 48 saat ve ardından RT'de 48 saat daha inkübe edin. Agarı plakadan çıkarın ve Petri kabını %1 kristal menekşe ile boyayarak seğirme bölgesini görselleştirin.
    3. PhenoBooth'u 3. adımda açıklanan parametrelerle kullanarak Petri kaplarının fotoğrafını çekin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolü, gen inaktivasyonunun yüksek verimde P. aeruginosa'nın motilitesi üzerindeki etkisini karakterize etmek için kullandık. Burada, genom çapında bir P delesyon koleksiyonunda sürü oluşturma ve seğirme motilitesini incelemek için kullanımını detaylandırdık. aeruginosa suşu PA14 (PA14 kütüphanesi). Protokol, çok yönlülük ve kullanım kolaylığı sunarak, farklı kültür ortamları veya mutant koleksiyonları kullanmak gibi protokolün farklı adımlarında değişi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan yüksek verimli motilite protokolü, birçok koloninin motilite fenotipini hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile işlememize ve analiz etmemize olanak tanır. Geleneksel manuel yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yarı otomatik yaklaşım, bakteri hareketliliğinin genom çapında değerlendirilmesine izin vermek için hareketlilik testlerinin ölçeklenebilirliğini ve verimini artırır. Protokol, PA14 kütüphanesi ile kullanım için optimize edilmiştir, ancak bu tahlil, E. coli<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir açıklama beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PA14 kütüphanesinin bir kopyasını sağladığı için McMaster Üniversitesi'ndeki Surette laboratuvarına teşekkür ederiz. Dr. Fabrice Jean-Pierre'e el yazması hakkındaki yararlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (RGPIN-2019-06044) tarafından desteklenmiştir ve Fonds de recherche du Québec - Santé'den (FRQS; #295613) yeni araştırmacılar için bir başlangıç hibesi almıştır. J.-P.C., Fonds de recherche du Québec-Santé'den (FRQS) Chercheur boursier junior 2 bursuna sahiptir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 kuyu plakası   Corning   3701 
Agar Fisher Scientific   BP1423-2 Son konsantrasyon sırasıyla sürü hareketliliği için %0,5 veya seğirme hareketliliği için %1 olmuş. 
Casamino Asitler   Fisher Scientific   223050 %20 su stoku hazırlayın. Filtre 0.22 μ m filtre ve 4 °C'de saklanır. Son konsantrasyon M9 minimum ortamda %0,5.& nbsp;
Crystal violet Bio Basic   CB0331Suda %1 bir çözelti hazırlayın. 
D-Glukoz   Bio Basic   GB0219 %20 (1,1 M) stok suyun içinde hazırlayın ve otoklavlama ile sterilize edin. Nihai konsantrasyon %0,2 minimum M9 ortamında. 
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
Gentamisin sülfat   Bio Basic   GB0217 30 mg/ml bir stok suda hazırlayın. Filtre 0.22 μ m filtre ve 4 derece hızda sakla; C – son konsantrasyon plakalar 15 ve mikro; g/mL..    
Aşılama Halkası ve İğne Fisher Scientific 22363597
M9 Minimal Tuzlar, 5X Fisher Scientific 2485101M stok suyu hazırlayın ve otoklavla sterilize edin. Son konsantrasyon 1 mM en az M9 ortamında. & nbsp;  
Magnezyum Sülfat (MgSO4)   Fisher Scientific M63-500  1 M MgSO4 stokunu suda hazırlayın. Filtre 0.22 μ M filtre ve oda sıcaklığında saklayın. Son yoğunlaşma 
PA14 Transpozon Yerleştirme Mutant Kütüphanesi   Liberati ve ark., 2006 (Bkz. referans 29)Tüm koleksiyon için 59 adet 96 kuyuyla levha. Her kuyunun içinde LB'de %25 gliserol içeren tek bir mutant bulunur.
Petri kabı 92x16mm Sarstedt 82.1473.001
PhenoBooth+ Singer Instruments https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ 11,3 g tozu 200 mL arıtılmış suda çöz. 121 derece ve derecede otoklav; C 15 dakika için & nbsp;
Plastik Şırınge 10 mL Fisher Scientific 14955459
Rotor+     Singer Instruments https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/ 
Kısa pinli RePads 384 yoğunluk Singer Instruments   REP-004 
Kısa pinli RePads 96 yoğunluk/nbsp;  Singer Instruments   REP-002 
Sodyum Klorür (NaCl)   Fisher Scientific BP358-212 
Yaylı 96 pinli replikatörEnzyScreen   CR1000 
Cerrahi bıçak paslanmaz No. 25 Fisher Scientific 08-918-5F
Tripton Oxoid   LP0042B 
Uniwell plakalarıSinger Instruments   PlusPlates: PLU-003   Plaka boyutu: 54 & Times; 34 & Times; 38 cm - iç duvarları yok, bu da daha büyük iç boyutlar sağlar.
Uniwell plakalarıVWRTek kuyu doku kültür plakaları: 75780-348PlusPlates ile aynı boyutlarda.
Maya Ekstraktı Fisher Scientific 248510 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burrows, L. L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annu Rev Microbiol. 66, 493-520 (2012).
  2. Khan, F., Pham, D. T. N., Oloketuyi, S. F., Kim, Y. M. Regulation and controlling the motility properties of Pseudomonas aeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (1), 33-49 (2020).
  3. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa new insights into pathogenesis and host defenses. Pathog Dis. 67 (3), 159-173 (2013).
  4. Ribbe, J., Baker, A. E., Euler, S., O'Toole, G. A., Maier, B. Role of cyclic Di-GMP and exopolysaccharide in type IV pilus dynamics. J Bacteriol. 199, e00859-e00916 (2017).
  5. Arora, S. K., Neely, A. N., Blair, B., Lory, S., Ramphal, R. Role of motility and flagellin glycosylation in the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa burn wound infections. Infect Immun. 73 (7), 4395-4398 (2005).
  6. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  7. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, e47365(2019).
  8. Breidenstein, E. B. M., Fuente-Núñez, C., de la Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  9. Toutain, C. M., Zegans, M. E., O'Toole, G. A. Evidence for two flagellar stators and their role in the motility of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (2), 771-777 (2005).
  10. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and requires flagella and pili. J Bacteriol. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  11. Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environ Microbiol. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  12. Kühn, M. J., et al. Mechanotaxis directs Pseudomonas aeruginosa twitching motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (30), e2101759118(2021).
  13. Talà, L., Fineberg, A., Kukura, P., Persat, A. Pseudomonas aeruginosa orchestrates twitching motility by sequential control of type IV pili movements. Nat Microbiol. 4 (5), 774-780 (2019).
  14. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. J Bacteriol. 31 (6), 575-580 (1936).
  15. Turnbull, L., Whitchurch, C. B. Motility assay: Twitching motility. Methods Mol Biol. 1149, 73-86 (2014).
  16. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods Mol Biol. 1149, 67-72 (2014).
  17. Semmler, A. B. T., Whitchurch, C. B., Mattick, J. S. A re-examination of twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 145 (Pt 10), 2863-2873 (1999).
  18. Henrichsen, J. Twitching Motility. Annu Rev Microbiol. 37, 81-93 (1983).
  19. Nolan, L. M., et al. A global genomic approach uncovers novel components for twitching motility-mediated biofilm expansion in Pseudomonas aeruginosa. Microb Genom. 4 (11), e000229(2018).
  20. Overhage, J., Lewenza, S., Marr, A. K., Hancock, R. E. W. Identification of genes involved in swarming motility using a Pseudomonas aeruginosa PAO1 mini-Tn5-lux mutant library. J Bacteriol. 189 (5), 2164-2169 (2007).
  21. De Bleeckere, A., et al. High throughput determination of the biofilm prevention concentration for Pseudomonas aeruginosa biofilms using a synthetic cystic fibrosis sputum medium. Biofilm. 5, 100106(2023).
  22. Brochado, A. R., Typas, A. High-throughput approaches to understanding gene function and mapping network architecture in bacteria. Curr Opin Microbiol. 16 (2), 199-206 (2013).
  23. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  24. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 2006.0008(2006).
  25. Tong, M., et al. Gene dispensability in Escherichia coli grown in thirty different carbon environments. mBio. 11 (6), e02259-e02320 (2020).
  26. French, S., Côté, J. P., Stokes, J. M., Truant, R., Brown, E. D. Bacteria getting into shape: genetic determinants of E. coli morphology. mBio. 8, e01977-e02016 (2017).
  27. Porwollik, S., et al. Defined single-gene and multi-gene deletion mutant collections in Salmonella enterica sv Typhimurium. PLoS One. 9 (7), e99820(2014).
  28. Koo, B. M., et al. Construction and analysis of two genome-scale deletion libraries for Bacillus subtilis. Cell Syst. 4 (3), 291-305.e7 (2017).
  29. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  30. French, S., et al. A robust platform for chemical genomics in bacterial systems. Mol Biol Cell. 27 (6), 1015-1025 (2016).
  31. French, S., Guo, A. B. Y., Brown, E. D. A comprehensive guide to dynamic analysis of microbial gene expression using the 3D-printed PFIbox and a fluorescent reporter library. Nat Protoc. 15 (2), 575-603 (2020).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Haley, C. L., Kruczek, C., Qaisar, U., Colmer-Hamood, J. A., Hamood, A. N. Mucin inhibits Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by significantly enhancing twitching motility. Can J Microbiol. 60 (3), 155-166 (2014).
  34. Déziel, E., Comeau, Y., Villemur, R. Initiation of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and highly adherent phenotypic variants deficient in swimming, swarming, and twitching motilities. J Bacteriol. 183 (4), 1195-1204 (2001).
  35. Gao, P., et al. oprC impairs host defense by increasing the quorum-sensing-mediated virulence of Pseudomonas aeruginosa. Front Immunol. 11, 1696(2020).
  36. Rosenau, F., et al. Lipase LipC affects motility, biofilm formation and rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol Lett. 309 (1), 25-34 (2010).
  37. Anyan, M. E., et al. Type IV pili interactions promote intercellular association and moderate swarming of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 18013-18018 (2014).
  38. Burdman, S., Bahar, O., Parker, J. K., De La Fuente, L. Involvement of type IV pili in pathogenicity of plant pathogenic bacteria. Genes. 2 (4), 706-735 (2011).
  39. Lewis, K. A., et al. Nonmotile subpopulations of Pseudomonas aeruginosa repress flagellar motility in motile cells through a type IV pilus- and pel-dependent mechanism. J Bacteriol. 204 (5), e00528-e00621 (2022).
  40. Chang, C. Y. Surface sensing for biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Front. Microbiol. 8, 2671(2018).
  41. Zegadło, K., et al. Bacterial motility and its role in skin and wound infections. Int J Mol Sci. 24 (2), 1707(2023).
  42. Jurado-Martín, I., Sainz-Mejías, M., McClean, S. Pseudomonas aeruginosa: An audacious pathogen with an adaptable arsenal of virulence factors. Int J Mol Sci. 22 (6), 3128(2021).
  43. Qin, S., et al. Pseudomonas aeruginosa: pathogenesis, virulence factors, antibiotic resistance, interaction with host, technology advances and emerging therapeutics. Sig Transduct Target Ther. 7 (1), 199(2022).
  44. Piskovsky, V., Oliveira, N. M. Bacterial motility can govern the dynamics of antibiotic resistance evolution. Nat Commun. 14 (1), 5584(2023).
  45. Xu, J., Koizumi, N., Nakamura, S. Crawling motility on the host tissue surfaces is associated with the pathogenicity of the zoonotic spirochete Leptospira. Front Microbiol. 11, 1886(2020).
  46. Rasmussen, L., et al. A high-throughput screening assay for inhibitors of bacterial motility identifies a novel inhibitor of the Na+-driven flagellar motor and virulence gene expression in Vibrio cholerae. Antimicrob Agents Chemother. 55 (9), 4134-4143 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pseudomonas AeruginosaBacterial MotilitySwarming MotilityTwitching MotilityHigh Throughput ProtocolMotility AssayGenome Wide MutantBiofilm FormationColony Pinning RobotImageJ Analysis

Related Articles