Method Article

Kronik yara yönetimi için çekirdek kılıflı 3D biyobaskılı iskele kullanarak hücre dışı vezikül dağıtımını optimize etme

DOI:

10.3791/67764

⸱

February 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Stem Cell and Regenerative Medicine, Natural and Medical Sciences Research Center, University of Nizwa, 2Doctoral Programme in Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Helsinki

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, kronik yara iyileşmesi için çekirdek kılıflı 3D-biyo-baskılı iskelelerin imalatı için bir protokol sunmaktadır. Hücre dışı veziküller mezenkimal kök hücrelerden izole edilir ve karboksimetil selüloz ve aljinat liyazdan yapılan kılıf ile çekirdeğe (aljinat) yüklenir. Bu tasarım, kontrollü iskele bozulmasına ve verimli EV'lerin serbest bırakılmasına izin verir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, kronik yara iyileşmesini arttırmak için tasarlanmış çekirdek kılıflı 3D biyobaskılı iskelelerin üretimi için ayrıntılı bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Protokol, rejeneratif ve immünomodülatör özellikleri ile bilinen mezenkimal kök hücrelerden (MSC'ler) hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izole edilmesini içerir. Bu EV'ler daha sonra benzersiz bir iskele yapısına dahil edilir. İskele, karboksimetil selüloz ve aljinat liyazdan yapılmış bir kılıfla çevrili, EV'lerle yüklü aljinattan oluşan bir çekirdeğe sahiptir. Bu yenilikçi tasarım, yara bölgesinde EV'lerin verimli ve kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasını teşvik ederken kontrollü iskele bozulmasını sağlar. Protokol, EV'lerin hazırlanması ve karakterizasyonu, 3D biyo-baskı için biyo-mürekkeplerin formülasyonu ve istenen çekirdek-kılıf mimarisini elde etmek için baskı parametrelerinin optimizasyonu dahil olmak üzere temel adımları kapsar. İskele, yapısal bütünlüğü ve biyoaktiviteyi birleştirerek, geleneksel yara örtülerinin sınırlamalarını ele almayı, doku yenilenmesini hızlandırmak ve kronik yaralarda iltihabı azaltmak için hedefli bir yaklaşım sunmayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, kronik yara yönetiminde potansiyel klinik uygulamalara sahip gelişmiş biyomateryaller geliştirmek için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir strateji sağlar. Protokol ayrıca, gelecekteki terapötik uygulamalar için uyarlanabilirliği sağlayarak tutarlı sonuçlar elde etmek için kritik hususları vurgulamaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genellikle aşırı iltihaplanma ile bağlantılı kronik yaralar, amputasyonlara yol açabilecek enfeksiyonlar ve doku nekrozu gibi ciddi komplikasyonları önlemek için zamanında tedavi gerektirir. İlerlemelere rağmen, mevcut tedaviler maliyetli, elverişsiz, yan etkilere sahip ve sınırlı etkinliğe sahip olmaya devam ediyor, bu da daha iyileştirici pansumanlara olan ihtiyacı vurgulamaktadır 1,2,3. Kronik yaralar için özel olarak tasarlanmış yeni nesil yara örtülerinin geliştirilmesi, bu zorlukların üstesinden gelmek için çok önemlidir. Ayrıca, yara iyileşmesinin karmaşık doğası, nemlendirme, esneklik, yapışma, biyoaktivite ve biyolojik olarak parçalanabilirlik dahil olmak üzere bir dizi özelliğe sahip pansuman malzemeleri gerektirir4. Bu çalışma, kontrollü bir terapötik ortam sağlamak ve kronik yara iyileşmesini hızlandırmak için hücre dışı vezikülleri (EV'ler) çekirdek kılıflı 3D biyobaskılı bir iskele ile entegre eden biyomühendislik ürünü bir yara örtüsü geliştirmeyi amaçlamaktadır.

Kök hücrelerden elde edilen EV'ler, anti-inflamatuar yanıtları, hücre büyümesini, göçü ve kan damarı oluşumunu teşvik ederek kronik yara iyileşmesine yardımcı olur5. Ek olarak, EV'ler, kronik yara yönetimi için küçük moleküllü ilaçlar, gen ve protein yapıları dahil olmak üzere biyoaktif moleküller sağlayabilir6. Ayrıca, kargoyu enzimatik bozunmadan koruma yetenekleri, terapötik ajanların stabilitesini ve biyoyararlanımını geliştirerek, genellikle in vivo olarak hızla bozunan geleneksel büyüme faktörlerine ve küçük moleküllü ilaçlara göre belirgin avantajlar sunar 7. Bu avantajlara rağmen, EV'lerin hedef dokulara verimli ve sürekli olarak verilmesi önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir.

3D biyo-baskı iskeleleri, EV'lerin terapötik etkilerini artırmaları için bir dağıtım platformu olarak hizmet edebilir8. Bu iskeleler doğal hücresel ortamları taklit eder ve EV'lerin kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasına izinverir 9,10. Ayrıca EV'leri bozulmaya karşı koruyarak mikroRNA'larının ve proteinlerininstabilitesini arttırırlar 11. Han ve ark. EV'lerin 3D biyobaskılı GelMA iskelelerinden etkili bir şekilde serbest bırakılabileceğini gösterdi. Bu salınım, iskelelere12 ekilen insan bukkal yağ yastığı mezenkimal kök hücrelerinde (hBFP-MSC'ler) gelişmiş hücre bağlanmasına ve mekanotransdüksiyon yollarıyla ilgili gelişmiş gen ekspresyonuna yol açtı. Born ve diğerleri, çapraz bağlayıcının konsantrasyonunu optimize ederek, EV'lerin kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasını sağladı. Bu yaklaşım, anjiyogenezi teşvik etmede etkinlik göstermiştir ve EV'lerin düzenlenmiş iletimi için umut verici bir yöntem sunmaktadır13.

Çekirdek kılıf 3D biyobaskı, bir kılıf içine yerleştirilmiş bir çekirdek malzemeyi yazdırarak karmaşık, çok malzemeli yapıların oluşturulmasını sağlar. Çekirdek, hücreleri, büyüme faktörlerini veya ilaçları içerebilirken, kılıf mekanik destek ve koruma sağlar veya bir bariyer görevi görür. Bu yöntemin doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta vasküler ağlar geliştirme, doğal doku yapılarını taklit etme ve ilaç dağıtım sistemleri oluşturma gibi uygulamaları vardır. Malzeme dağılımı ve bileşimi üzerinde hassas kontrol sağlayarak yapıların işlevselliğini ve biyolojik uygunluğunu artırır. Alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında, çekirdek kılıf 3D biyobaskı, malzeme dağılımı ve bileşimi üzerinde hassas kontrol sağlayarak yapıların işlevselliğini ve biyolojik uygunluğunu geliştirir14,15.

Yara örtülerinde tasarlanmış bozulma, değişiklikler sırasında daha az rahatsızlık, iyileşme ve enfeksiyon kontrolü için nemli bir ortam, zamanında terapötik uygulama ve optimal doku rejenerasyonu gibi faydalar sunar 16,17,18. Aljinat (Alg) ve karboksimetil selüloz (CMCh) hidrojeller biyouyumludur ve yaralara hücre dışı veziküller (EV'ler) vermek, hücresel iletişim ve iltihabı azaltma yoluyla iyileşmeyi artırmak için etkilidir18. Bu çalışmada, EV'ler bir Alg çekirdeğine entegre edilirken, hızlı pansuman bozunmasını ve EV'lerin verilmesini sağlamak için bir CMCh ve AlgLiyaz (AlgLiyaz) kılıfı kullanıldı. Bu çekirdek kılıf tasarımı, iskele bozulmasına yanıt olarak EV'lerin hızlı bir şekilde salınmasını kolaylaştırır, terapötik etkinliklerini artırır ve mevcut kronik yara tedavilerinin sınırlamalarını ele alır. Bu çalışmanın birincil amacı, kontrollü EV salınımını duyarlı bir şekilde parçalanabilen bir iskele ile entegre ederek yara iyileşmesini artıran ve sonuçta kronik yaralar için tedavi sonuçlarını iyileştiren biyomühendislik ürünü bir yara örtüsü geliştirmektir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan araştırması, Ulusal Biyoetik Komitesi ve Nizwa Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından belirlenen etik standartlara tam olarak uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışma için etik onay, izin kimliği: VCGSR, AREC/01/2023 kapsamında verilmiştir. Tüm hayvanlar standart laboratuvar koşulları altında barındırıldı ve çalışma boyunca refahlarını korumak için optimal çevresel kontroller, doğru beslenme ve kapsamlı bakım sağlandı. Hayvanları içeren tüm prosedürler, kurumsal politikalara, uluslararası hayvan bakım standartlarına ve ARRIVE yönergelerine sıkı sıkıya bağlı kalmıştır.

1. Hücre kültürü

  1. Sıvı nitrojen deposundan bir şişe MSC (pasaj #2) alın ve kontaminasyonu önlemek için aseptik tekniklerle kullanın. Hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözün ve küçük bir buz parçası kalır kalmaz onları çıkardığınızdan emin olun.
  2. %1 (h/h) MSC SFM XenoFree takviyesi, %1 (h/h) GlutaMAX ve %0.01 (h/h) Gentamisin ile desteklenmiş MSC SFM Bazal Ortam içeren eksiksiz bir ortam hazırlayın. 1 mL önceden ısıtılmış (37 °C) tam ortamı her 5 saniyede bir 3 ila 5 damla oranında şişeye ekleyin ve ardından yavaşça karıştırın. MSC şişesinin tüm içeriğini, Sınıf II biyogüvenlik kabininde aseptik koşullar altında 4 mL önceden ısıtılmış tam ortam içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
  3. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjün uygun şekilde dengelendiğinden emin olun.
  4. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış tam ortamda yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri 4 mL tam ortam içeren bir T25 şişesine aktarın.
  5. Hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için şişeyi hafifçe eğin. Şişeyi 37 °C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
  6. Ortamı her 2 günde bir değiştirin, taze, önceden ısıtılmış, tam ortamla değiştirin. Hücre bozulmasını önlemek için nazik pipetleme kullanın. % 70 -% 80 birleşmeye ulaştıktan sonra, harcanan ortamı T25 şişesinden aspire edin.
  7. Kalıntıları gidermek için hücreleri 3 mL taze PBS ile yıkayın. Yıkama sırasında şişenin tamamen kaplandığından emin olun.
  8. T25 şişesine 1 mL %0.25 tripsin çözeltisi ekleyin, 37 ° C'de 3-7 dakika inkübe edin ve ayrılmayı mikroskop altında 4x büyütmede dikkatlice izleyin.
  9. Hücrenin tamamen ayrılmasını sağlamak için gerekirse şişeye hafifçe vurun. Şişeye önceden ısıtılmış tam ortam ekleyin ve hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için yüzey üzerinde yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
  10. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini taze, eksiksiz bir ortamda askıya alın ve bir Neubauer hemositometresi kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri bir T75 şişesine aktarın. Optimum büyüme için 5.000 hücre/cm2'lik bir tohumlama yoğunluğu sağlayın.
  11. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin. 72 saatlik hücre inkübasyonundan sonra, EV'lerin izolasyonu için şartlandırılmış ortamı hücrelerden toplayın. Toplandıktan hemen sonra kullanın.

2. EV izolasyonu

  1. Hücresel kalıntıları gidermek için toplanan şartlandırılmış ortamın 13 mL'sini 800 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Büyük parçacıkları çıkarmak için 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak süpernatanı nazikçe filtreleyin.
  2. Filtrelenmiş şartlandırılmış ortama 5 mL yağış tamponu ekleyin ve karıştırmak için iyice girdaplayın. Çözeltinin homojen olduğundan emin olun.
  3. EV'lerin çökelmesini sağlamak için karışımı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Karışımı 3.220 x g'da 20 °C'de 30 dakika santrifüjleyin. Tüplerin dengesini kontrol edin.
  4. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. Kalan sıvıyı çıkarmak için peleti 5 saniye boyunca 3.220 x g'da bir kez daha santrifüjleyin.
  5. EV'lere zarar vermemek için EV peletini 200 μL PBS'de nazikçe pipetleyin. Üreticinin talimatlarına göre EV'lerin protein konsantrasyonunu ölçün (BCA Protein Test Kiti).
  6. EV fenotipi18'i doğrulamak için EV'ye özgü belirteçleri (CD63, CD81 ve CD9) tespit etmek için Western blotlama yapın. Analiz, EV'lerin kimliğinidoğrulayan bu belirteçlerin varlığını doğruladı 19.
  7. RNase kontaminasyon riskini en aza indirmek için, ek depolama olmadan doğrudan kullanılması önerilir. İhtiyaç duyulması durumunda, daha sonra kullanmak üzere EV'leri -80 °C'de saklayın. Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için EV'lerin süspansiyonunu 40 μL'lik hacimlere ayırın.

3. PKH-26 ile EV etiketleme

  1. Tampon hazırlama
    1. Steril bir kapta yaklaşık 90 mL steril ultra saf su içinde 0.238 g HEPES çözün. Taze hazırlanmış HEPES solüsyonu kullanın. HEPES çözeltisine 0.85 g NaCl ekleyin.
    2. Kalibre edilmiş bir pH metre kullanarak gerektiği gibi 1 M NaOH veya HCl kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın. Toplam hacmi 100 mL'ye getirmek için deiyonize su ekleyin. Çözeltiyi sterilize etmek için 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
  2. 4 μL PKH-26 boyasını 1 mL hazırlanmış tampon içinde seyreltin. Homojenliği sağlamak için pipetle iyice karıştırın.
  3. Saflaştırılmış EV'leri 700 μg/mL konsantrasyonda 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Hazırlanan PKH-26 çözeltisinin 1 mL'sine 1 mL EV süspansiyonu ekleyin. Sadece boya kontrol grubu için, 1 mL PKH-26 çözeltisine EV'ler olmadan 1 mL tam ortam ekleyin. Sonraki tüm adımlar, potansiyel spesifik olmayan agregasyonu veya misel oluşumunu hesaba katmak için kontrol grubu için de gerçekleştirilir.
  4. Tüpü 10x-15x hafifçe ters çevirerek EV'leri iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin ve EV'lerin boyaya eşit şekilde maruz kalmasını sağlayın.
  5. Steril ultra saf su kullanarak 2 mL taze% 1'lik bir BSA çözeltisi hazırlayın ve etiketleme reaksiyonunu söndürmek için elde edilen karışımın 2 mL'sine ekleyin. Toparlanmayı önlemek için hafifçe karıştırın.
  6. PKH-26 etiketli EV'leri yukarıda belirtilen protokole göre konsantre edin (adım 2.2-2.7). Etiketli EV'leri 300 μL PBS'de yeniden askıya alın. PKH-26 etiketli EV örneğini 30 kDa'lık bir filtre tüpüne pipetleyin.
  7. Numuneyi 3,220 °C'de 30 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Bu adım sırasında, serbest PKH-26 boyası ve küçük moleküller zardan filtrata geçecek ve PKH-26 etiketli EV'ler retentatta tutulacaktır.
  8. İlk santrifüjlemeden sonra, süzüntüyü atın ve retentata 300 μL PBS ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek PBS'deki EV'leri nazikçe yeniden askıya alın.
  9. Kalan serbest boyayı veya küçük molekülleri yıkamak için numuneyi 3.220 x g'da 4 °C'de 30 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
  10. Süzüntü çözeltisinde PKH-26 eksikliğini bir floresan mikroskobu ile doğrulayın. Herhangi bir boya tespit edilirse, yıkama adımlarını tekrarlayın.
  11. Üst çözeltiyi mikropipet ile toplayın ve filtreyi toplama tüpünden çıkarın. Filtreyi dikkatlice ters çevirin (ters çevirin).
  12. Ters çevrilmiş filtreyi 800 x g'da 5 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. Bu, tutulan PKH-26-EV'lerin filtre membranından yeni toplama tüpüne toplanmasına yardımcı olacaktır. Bir sonraki adım için doğrudan PKH-26-EV'leri kullanın.

4. 3D Biyo-baskı

  1. Bioinks hazırlama
    1. Steril ultra saf su kullanarak taze% 4.5 (a / h) sodyum Alg çözeltisi hazırlayın. Çözeltinin tamamen çözülmesini sağlamak için gece boyunca 60 ° C'de karıştırın.
    2. %3,8 (a/a) çözelti elde etmek için CMCh'yi steril ultra saf suda çözün. Taze hazırlayın. Tamamen çözünmesi için gece boyunca 60 °C'de karıştırın.
    3. Hazırlanan biyomürekkepleri 3.220 x g'da 25°C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve baskı işlemine müdahale edebilecek kabarcıkları çıkarın.
    4. EV'lerin %0.01 (a/a) konsantrasyonunu elde etmek için hazırlanan 3 mL Alg çözeltisini etiketli EV'lerle veya bir şırınga karıştırıcı kullanarak yalnızca boya kontrolü ile karıştırın. Nazikçe karıştırarak eşit dağılım sağlayın.
    5. Bir şırınga karıştırıcı kullanarak, 0,5 mU / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1 mL CMCh'yi steril ultra saf suda taze hazırlanmış bir AlgLiyaz çözeltisi ile birleştirin.
  2. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, Alg/Exo biyomürekkebini aynı anda çekirdek kısmına ve CMCh/AlgLyase biyomürekkebini çekirdek/kılıf şırınga kurulumunun kılıf kısmına yükleyin.
  3. Yazdırmadan önce biyomürekkeplerin 15 dakika dinlenmesine izin verin.
  4. 3D biyo-yazıcı kurulumu
    1. 3D biyoyazıcı yazılımını kullanarak, Diyagonal Dolgu Desenli Silindirik Bir Şekil seçerek iskele yapısını oluşturun. Bunun için silindir çapını ve yüksekliğini sırasıyla 20 mm ve 1,1 mm olarak ayarlayın. Gözenek boyutunu 1 mm olarak yapılandırın.
    2. Çekirdek ve kılıf nozulu pompalama hızlarını katman başına 1 mm kalınlıkta 0.25 mm/sn'ye ayarlayın ve hareket hızını 6 mm/sn'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında katman başına 0,25 mm kalınlığında dört katman yazdırın.
  5. Polyester film üzerine yazdırmaya başlayın.
  6. Ekstrüzyon işlemi sırasında iskeleyi çapraz bağlamak için nemlendiriciyi aerosol kalsiyum klorür (%2,2) ile kullanın. İskele yapısından ödün vermeden etkili çapraz bağlama sağlamak için nemlendirici memesini ekstrüzyon kafasından yaklaşık 20 cm uzağa yerleştirin. Daha fazla çapraz bağlama için, iskeleyi 10 dakika boyunca kalsiyum klorür çözeltisine (% 2,2) daldırın.
  7. Fazla kalsiyum klorürü ve bağlı olmayan biyomürekkebi gidermek için iskeleyi 3x steril ultra saf suyla durulayın.
  8. İskelenin bütünlüğünü ve işlevselliğini üç aya kadar korumak için iskelenin 4 °C'de steril bir ortamda saklandığından emin olun.

5. EV'lerin piyasaya sürülmesini izleme

  1. Dairesel kutanöz yara modelinin oluşturulması
    1. İntraperitoneal Ketamin (70 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) enjeksiyonu uygulayarak erkek Akita heterozigot diyabetik fareleri (8 hafta) anesteziye tabi tutun. Refleks yanıtlarının yokluğunu değerlendirerek uygun anesteziyi onaylayın (ör., ayak parmağı sıkıştırma) ve solunum hızını izleyin. Anestezi sırasında kornea kuruluğunu önlemek için gözlere steril veteriner oftalmik merhem sürün.
    2. Sırt derisi bölgesini önce elektrikli bir kesme makinesi kullanarak tıraş ederek hazırlayın. Cilt tahrişinden veya yaralanmasından kaçının. Traş edilen alanı bir povidon-iyot çözeltisi kullanarak sterilize edin.
    3. Steril bir seizer kullanarak, her farenin sırt yüzeyinde 6 mm'lik dairesel tam kalınlıkta bir kutanöz yara oluşturun.
    4. PKH etiketli EV'leri içeren 3D biyobaskılı iskeleyi doğrudan yara yatağına nazikçe yerleştirin. Steril forseps kullanarak hafifçe bastırarak iskelenin yara yüzeyini minimum hava cepleriyle tamamen kapladığından emin olun. İşlemden sonra hayvanın yakından izlendiğinden ve bilincini tamamen geri kazanana ve sternal yaslanmayı sürdürebilene kadar gözetim altında kaldığından emin olun.
  2. Floresan görüntüleme
    1. İmplantasyondan 2 saat, 4 saat, 8 saat, 24 saat sonra, fareleri izofluran kullanarak anestezi altına alın. Anestezi indüksiyonu için, fareleri in vivo görüntüleme sisteminin (IVIS) odasına yerleştirin ve oksijende% 2 -% 3 izoflurana maruz bırakın. Kuruluğu önlemek için farelerin gözlerine oftalmik merhem sürün. Anestezi uygulandıktan sonra, fareleri IVIS sistemine aktarın ve burun kanallarından verilen oksijende% 1 -% 2 izofluran ile koruyun. Görüntülemeye devam etmeden önce hayvanların tamamen uyuşturulduğunu ve stabil olduğunu doğrulayın.
    2. İskeleden salınan PKH etiketli EV'lerden gelen floresan sinyallerini yakalamak için IVIS sistemini kullanın. Görüntüleme sihirbazında, Floresan Görüntüleme seçeneğini seçin ve PKH boyası için uyarma ve emisyon filtrelerini etkinleştirin. Sinyal algılamayı optimize etmek için görüş alanı ve konu yüksekliği dahil olmak üzere kamera ayarlarını yapın. Doğru karşılaştırmalar yapmak için tüm görüntüleme zaman noktalarında tutarlı konumlandırma sağlayın. Görüntüleri almaya başlayın ve elde edilen verileri kaydedin.
    3. IVIS yazılımını kullanarak floresan sinyal yoğunluklarını ölçün. Bu, EV'lerin zaman içinde piyasaya sürülmesinin izlenmesine izin verecektir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV'lerin hem Alg-EVs/CMCh hem de Alg-EVs/CMCh-AlgLyase iskelelerinden in vivo salınımı Şekil 1B,C'de gösterilmektedir. Beklendiği gibi, Alg-EV'ler/CMCh-AlgLyase iskelesi, özellikle 2 saat ve 4 saat zaman noktalarında Alg-EV'ler/CMCh'ye kıyasla daha hızlı bir salınım profili sergiledi. EV'lerin hidrojellerden salınması, difüzyon, şişme, erozyon ve bozunma dahil olmak üzere fizikokimyasal mekanizmaların bir kombinasyonu tarafından yönetilir20. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün en önemli yönlerinden biri, verimli EV teslimatı elde etmek için gerekli olan çekirdek kılıflı iskele tasarımıdır. Tasarım, çekirdek malzeme olarak Alg'yi ve kılıf olarak CMCh ile Alglyase kombinasyonunu içerir. Bu kurulum, EV'lerin kontrollü ve hızlı bir şekilde serbest bırakılmasını kolaylaştırır. Çekirdek malzeme olan Alg, EV'leri kapsayarak korunmalarını ve yerelleştirilmiş teslimatlarını sağlar. CMCh ve Alglyaz'dan oluşan kılıf, EV'lerin zamanında serbest bırakılması için...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Happy Production'dan Said Al-Hashmi ve Abdulrahman Almharbi'ye çekimlerdeki mükemmel çalışmaları için özel teşekkürler. Ayrıca Yüksek Öğrenim, Araştırma ve Yenilik Bakanlığı'na ve Nizwa Üniversitesi'ne mali destekleri ve gerekli kaynakları sağladıkları için şükranlarımızı sunarız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
23 G Mor hassas konik NozulCellinkKT0000002000Minimum tıkanma ile biyomürekkeplerin hassas ekstrüzyonunu sağlamak için
Aljinat liyaz (AlgLyase)Sigma AldrichA1603-100MGAlgyase, aljinatı parçalayan bir enzimdir.
Amicon Ultra Santrifüj Filtre, 30 kDa MWCOMerckUFC9030PKH-26 etiketli EV'leri yıkamak için kullanılır
BCA tahlil KitiThermo Scientific10678484Protein/EV konsantrasyonunu belirlemek için Biyobaskı
SistemiRegematV1Çekirdek kılıf iskelesi imal etmek için
Sığır serum albümini (BSA)sigma-aldrich05470-5GPKH 26 reaksiyonunu durdurmak için 
Kalsiyum klorürSigma AldrichC3306-100GDoku mühendisliğinde biyomürekkepleri çapraz bağlamak ve stabilize etmek için
SantrifüjSigma2-16PEV izolasyonu için kullanılır
Santrifüj 5810 REppendorf22625101Hücre kültürü için kullanılır
Sınıf II Biyolojik Güvenlik KabiniTelstarBio II GelişmişHücre kültürü
CryoCube  F570 Serisi - ULT DondurucuEppendorfF571240035EV'leri saklamak için
floresan mikroskobuOLYMPUS IX73P1F Filtratta kalan PKH-26'yı kontrol etmek için kullanılır
Gentamisin (50 mg/mL)Thermofisher15750Hücre kültürü ortamı için antibiyotik
GlutaMAX-I CTS, (100X), sıvıThermofisherA12860Hücre kültürü ortamı takviyesi
HClSigma Aldrich7647-01-0Tampon hazırlama 
HEPESCarl RothSanatı. Hayır.  6763.3Tampon hazırlama 
Yüksek viskoziteli karboksimetil selüloz (CMCh)BDH27929 4TCMCh, suda çözünür bir selüloz türevidir.
Kuluçka makinesiNew Brunswick  NB-170RHücre kültürü
Invivo görüntülemePerkinElmerIVIS Lumina XRMS Serisi III EV'lerin piyasaya sürülmesini izlemek için, in vivo
Bioinks hazırlama içinmıknatıskarıştırıcı SalvisLABMC35
Eksozom İzolasyonu için miRCURY Eksozom KitleriQiagen76743Evs izolasyonu
NaOhDaejung1310-73-2Tampon hazırlama 
fosfat tamponlu salin (PBS)Thermo ScientificJ61196. APHücre kültürü
PKH 26MCE154214-55-8EV'leri etiketlemek için kırmızı floresan boya
Sodyum aljinat (Alg)Sigma AldrichA0682-100GKahverengi deniz yosunundan elde edilen doğal polisakkarit.
Sodyum klorür (NaCl)Carl RothArt-Nr-P029.1Tampon hazırlama 
StemPro BM Mezenkimal Kök HücrelerThermofisherA1382901Mezenkimal kök hücreler
StemPro MSC SFM XenoFreeThermofisherA1067501Hücre kültürü ortamı
Tripsin% 0.25Thermofisher25050014Hücre ayrışması
Vorteks-KarıştırıcıDaihan ScientificVM-10Çökeltme tamponunu şartlandırılmış ortamla karıştırmak için kullanılır

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falanga, V., et al. Chronic wounds. Nat Rev Disease Primers. 8 (1), 50(2022).
  2. Tran, H. Q., Shahriar, S. S., Yan, Z., Xie, J. Recent advances in functional wound dressings. Adv Wound Care. 12 (7), 399-427 (2023).
  3. Shao, M., et al. Emerging trends in therapeutic algorithm of chronic wound healers: Recent advances in drug delivery systems, concepts-to-clinical application and future prospects. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 34 (5), 385-452 (2017).
  4. Rezvani Ghomi, E., Khalili, S., Nouri Khorasani, S., Esmaeely Neisiany, R., Ramakrishna, S. Wound dressings: Current advances and future directions. J Appl Poly Sci. 136 (27), 47738(2019).
  5. Ding, J. Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in skin wound healing: Roles, opportunities and challenges. Military Med Res. 10 (1), 36(2023).
  6. Sharma, D., Kumar, A., Mostafavi, E. Extracellular vesicle-based biovectors in chronic wound healing: Biogenesis and delivery approaches. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 822-840 (2023).
  7. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Adv Drug Delivery Rev. 106, 148-156 (2016).
  8. Han, P., Ivanovski, S. 3d bioprinted extracellular vesicles for tissue engineering-a perspective. Biofabrication. 15 (1), 013001(2022).
  9. Annabi, N., et al. 25th anniversary article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
  10. Zheng, Y., Pan, C., Xu, P., Liu, K. Hydrogel-mediated extracellular vesicles for enhanced wound healing: The latest progress, and their prospects for 3d bioprinting. J Nanobiotechnol. 22 (1), 57(2024).
  11. Keener, A. B. How extracellular vesicles can enhance drug delivery. Nature. 582 (7812), S14-S14 (2020).
  12. Han, P., et al. 3d bioprinted small extracellular vesicles from periodontal cells enhance mesenchymal stromal cell function. Biomater Adv. 158, 213770(2024).
  13. Born, L. J., et al. Sustained released of bioactive mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles from 3d-printed gelatin methacrylate hydrogels. J Biomed Mater Res A. 110 (6), 1190-1198 (2022).
  14. Kjar, A., Mcfarland, B., Mecham, K., Harward, N., Huang, Y. Engineering of tissue constructs using coaxial bioprinting. Bioact Mater. 6 (2), 460-471 (2021).
  15. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3d bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  16. Deshayes, S., Kasko, A. M. Polymeric biomaterials with engineered degradation. J Poly Sci A Poly Chem. 51 (17), 3531-3566 (2013).
  17. Xu, Q., et al. Injectable hyperbranched poly (β-amino ester) hydrogels with on-demand degradation profiles to match wound healing processes. Chem Sci. 9 (8), 2179-2187 (2018).
  18. Vakilian, S., et al. Engineered local delivery of extracellular vesicles loaded with si-tnf-α, via a core-sheath 3d-bio-printed scaffold as an effective wound dressing. J Drug Delivery Sci Technol. 101, 106189(2024).
  19. Mirsanei, Z., et al. Synergistic effects of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles and dexamethasone on macrophage polarization under inflammatory conditions. Inflammopharmacology. 32 (2), 1317-1332 (2024).
  20. Ma, Y., Brocchini, S., Williams, G. R. Extracellular vesicle-embedded materials. J Controlled Release. 361, 280-296 (2023).
  21. Jia, Q., Zhao, H., Wang, Y., Cen, Y., Zhang, Z. Mechanisms and applications of adipose-derived stem cell-extracellular vesicles in the inflammation of wound healing. Front Immunol. 14, 1214757(2023).
  22. Lou, P., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics for the regeneration of chronic wounds: Current knowledge and future perspectives. Acta Biomater. 119, 42-56 (2021).
  23. Cai, Y., Chen, K., Liu, C., Qu, X. Harnessing strategies for enhancing diabetic wound healing from the perspective of spatial inflammation patterns. Bioactive Mater. 28, 243-254 (2023).
  24. Li, Z., et al. Multifunctional hydrogel-based engineered extracellular vesicles delivery for complicated wound healing. Theranostics. 14 (11), 4198(2024).
  25. Cabral, J., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Extracellular vesicles as modulators of wound healing. Adv Drug Delivery Rev. 129, 394-406 (2018).
  26. Moghadasi Boroujeni, S., Mashayekhan, S., Vakilian, S., Ardeshirylajimi, A., Soleimani, M. The synergistic effect of surface topography and sustained release of tgf-β1 on myogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 104 (7), 1610-1621 (2016).
  27. Jayaraman, P., et al. Controlled release of drugs in electrosprayed nanoparticles for bone tissue engineering. Adv Drug Delivery Rev. 94, 77-95 (2015).
  28. Huang, X., Brazel, C. S. On the importance and mechanisms of burst release in matrix-controlled drug delivery systems. J Controlled Release. 73 (2-3), 121-136 (2001).
  29. Smith, A. M., Senior, J. J. Alginate hydrogels with tuneable properties. Adv Biochem Eng Biotechnol. 178, 37-61 (2021).
  30. Yan, X., Sha, X. Nanoparticle-mediated strategies for enhanced drug penetration and retention in the airway mucosa. Pharmaceutics. 15 (10), 2457(2023).
  31. Pant, B., Park, M., Park, S. -J. Drug delivery applications of core-sheath nanofibers prepared by coaxial electrospinning: A review. Pharmaceutics. 11 (7), 305(2019).
  32. Pinheiro, A., et al. Extracellular vesicles: Intelligent delivery strategies for therapeutic applications. J Controlled Release. 289, 56-69 (2018).
  33. Yoshioka, M., Kayo, T., Ikeda, T., Koizuni, A. A novel locus, mody4, distal to d7mit189 on chromosome 7 determines early-onset niddm in nonobese c57bl/6 (akita) mutant mice. Diabetes. 46 (5), 887-894 (1997).
  34. Fang, R. C., et al. Limitations of the db/db mouse in translational wound healing research: Is the noncnzo10 polygenic mouse model superior. Wound Repair Regen. 18 (6), 605-613 (2010).
  35. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  36. Sellers, R. S. Translating mouse models: Immune variation and efficacy testing. Toxicol Pathol. 45 (1), 134-145 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Vesicle Delivery3D Bioprinted ScaffoldChronic Wound ManagementMesenchymal Stem CellsCore Sheath ScaffoldExtracellular Vesicle IsolationBioink FormulationScaffold Cross LinkingWestern BlottingDiabetic Wound Healing

Related Articles