Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

FLICK Testi Kullanılarak İlaç Yanıtının Kapsamlı Analizi

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67768

⸱

6 Haziran 2025

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

Bu makalede

Özet

Bu protokol, ilaca bağlı büyüme oranlarını ve ölüm oranlarını hesaplamak ve ilaca bağlı hücre ölümü mekanizmasını değerlendirmek için bu testin kullanımına ilişkin ayrıntılı talimatlar da dahil olmak üzere, ilaç yanıtlarını değerlendirmek için FLICK testinin nasıl kullanılacağını açıklar.

Özet

İlaç etkinliğini anlamak için, ilaca bağlı hücre ölümünün derecesini karakterize etmek kritik bir ihtiyaçtır. İlaca bağlı hücre ölümünün seviyesini ölçme çabaları, her biri kendi aktivasyon zamanlaması ve biyokimyasal ayırt edici özelliklere sahip, moleküler olarak farklı düzenlenmiş ölüm formlarının varlığıyla karşı karşıyadır. Ayrıca, bazı nekrotik ölüm alt tipleri için, ayırt edici özellikler sadece geçici olarak gözlenir ve hücre yırtılması nedeniyle hızla kaybolur. Bu nedenle, ölüm yoluna özgü tahlillerin bir kombinasyonunu kullanırken bile, toplam hücre ölümü miktarını veya her bir ölüm alt tipinin nispi katkılarını doğru bir şekilde ölçmek zordur. Diğer bir konu, ölüme özgü birçok tahlilin, ilaçların hücre çoğalmasını nasıl etkilediğini göz ardı etmesi ve ilaçla tedavi edilen bir popülasyonun genişleyip genişlemediğini yorumlamayı zorlaştırmasıdır. FLICK testi, stimülasyonu takiben toplam hücre ölümü seviyesinin, ölüme özgü bir şekilde ölçülmesine izin verir, ancak aynı zamanda aktive edilen ölüm tür(ler)ine büyük ölçüde agnostiktir. Ek olarak, FLICK testi, toplam popülasyon büyüklüğü ve hücre çoğalma hızı hakkındaki bilgileri tutar. Bu yazıda, FLICK testinin temel kullanımını, farklı biyolojik materyal türleri kullanılırken bu testin nasıl giderileceğini ve her bir hücre ölümü tipinin gözlemlenen bir ilaç tepkisine katkılarını ölçmek için FLICK testinin nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Giriş

Anti-kanser ilaçları için, ilaç duyarlılığının klinik öncesi değerlendirmesi genellikle ilaçların kültür1'deki hücrelerin canlılığını nasıl etkilediğinin test edilmesini içerir. İlaca maruz kalmayı takiben hücre canlılığı, en az iki ayrı etkinin bir ürünüdür: hücre proliferasyonunun ilaca bağlı inhibisyonu ve hücre ölümünün aktivasyonu2. Ne yazık ki, hücre ölümü kalıcı ilaç yanıtları için gerekli olan kritik bir özellik olmasına rağmen, standart yaklaşımlar bir ilacın hücre ölümünü ne derece aktive ettiğini netleştirmekte başarısız olmaktadır3.

Yaygın ilaç yanıtı tahlilleri, hücreleri doğrudan sayanları (örneğin, Coulter Counter, akış sitometrisi veya mikroskopinin bazı kullanımları), hücrelerin çoğalma yeteneğini ölçenleri (örneğin, koloni oluşumu deneyi) veya bir metabolik aktiviteyi ölçenleri (örneğin, CellTiter-Glo, tetrazolyum bazlı MTT veya MTS tahlilleri). Bu tahlillerin ortak bir özelliği, üretilen verilerin canlı hücre sayısı ile orantılı olmasıdır. İlaçlar, büyüme inhibisyonunu ve hücre ölümünü nasıl koordine ettikleri konusunda önemli ölçüde farklılık gösterdiğinden, ilaca maruz kalmayı takiben canlı hücrelerin sayısı, ilaca bağlı hücre ölümünün seviyesi hakkında güvenilmez bir fikir verir3. Ayrıca, kanser hücreleri genellikle hücre kültüründe hızla çoğaldığından, canlı hücrelerin sayısı, herhangi birhücre ölümüne neden olmadan tedavi edilmeyen popülasyona göre önemli ölçüde azaltılabilir4. Bu nedenle, merkezi bir kusur, hücre ölümünün derecesinin hem canlı hem de ölü hücrelerin sayısını ölçmeden ölçülememesidir.

İlaca maruz kaldıktan sonra ölü hücrelerin sayısını ölçmek, birkaç nedenden dolayı doğru bir şekilde yapmak zordur2. İlk olarak, bir düzineden fazla düzenlenmiş hücre ölüm yolu mevcuttur 5,6,7,8. Her bir düzenlenmiş hücre ölümü tipini tanımlamak için genellikle biyokimyasal belirteçler mevcut olsa da, bu belirteçler özgüllüklerine göre değişir ve tüm ölüm alt tiplerini aynı anda ölçmek için tek bir test kullanılamaz. İkinci olarak, her bir hücre ölümü formu için aktivasyon zamanlaması, bağlama bağlı olarak oldukça dramatik bir şekilde değişebilir, bu nedenle ölüm zaman içinde nicelleştirilmedikçe tam bir resim ortaya çıkamaz 9,10. Hücre ölümünü ölçmek için yapılan birçok biyokimyasal tahlil, bir son nokta ölçümü üretir, bu nedenle kinetik veri üretmek zor olabilir ve maliyetle sınırlı olabilir. Üçüncü bir komplikasyon, ölü hücrenin kendisinin, canlı hücre durumu ile ayrışmış hücre kalıntıları arasında geçici bir ara durum olmasıdır. Ölü hücrelerin stabilitesi, ölüm alt tipine bağlı olarak değişir, apoptoz gibi bazı türler nispeten kararlı cesetler oluştururken, diğer ölüm türleri hızlı parçalanmaya neden olur. Bu nedenle, ölü hücrelerin toplanmasını ve sayılmasını gerektiren ölümü ölçme yöntemleri de hücre ölümünün önyargılı bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır. Son olarak, dördüncü bir sınırlama, hücre ölümünün derecesini ölçen biyokimyasal tahlillerin tipik olarak bir ilacın proliferasyonu nasıl değiştirdiğine dair herhangi bir içgörü sağlayamamasıdır. Bu nedenle, genel nüfus büyüklüğü - ve daha da önemlisi, nüfusun genişleyip genişlemediği - yorumlanamaz.

STACK ve SPARKL gibi bazı mikroskopi tabanlı tahliller, zaman içinde canlı ve ölü hücreleri ölçmede etkilidir ve bu tahliller, ilaca bağlı hücre ölümü hakkında kapsamlı bilgiler üretebilir10,11. Bununla birlikte, bu tahliller, Incucyte mikroskobu gibi özel araçlar gerektirir ve bu da verimde ve bu yaklaşımlara erişimde sınırlamalar yaratır. Ek olarak, mikroskopi tabanlı teknikler, ölü hücrelerin deney süresi boyunca mikroskobun odak düzleminde kalmasını gerektirir, bu da ölü hücrelerin plakadan yapışkanlığını kaybettiğinde veya ölü hücreler çürüdükçe zamanla nicelleştirilmesini sağlama yeteneğini tehlikeye atar. Benzer şekilde, mikroskopi bazlı tahliller, hücreler belirli bir odak düzleminin içine ve dışına sürüklendikçe, süspansiyon kültürleri bağlamında uygulandığında zorluklarla karşı karşıyadır.

Yukarıda vurgulanan sorunları ele almak için, FLICK (Hücre Ölümü Kinetiğinin Floresan Tabanlı ve Lizise Bağlı Çıkarımı)12,13 adlı bir test oluşturduk. FLICK testinin amacı, hücrelerin nasıl öldüğüne bakılmaksızın, ilaca bağlı hücre ölümünün seviyesini belirlemektir. FLICK yöntemi, floresansı DNA bağlanmasına bağlı olan hücre geçirimsiz boyalar kullanır. FLICK'in önemli bir özelliği, erişilebilir DNA'ları sayesinde zaman içinde ölü hücre birikimini etiketlemek için bu floroforların kullanılması ve ardından testin sonunda herhangi bir canlı hücreye nüfuz etmek için mekanik deterjan bazlı bir lizisin kullanılmasıdır. Bu veriler, matematiksel modelleme ile birleştirildiğinde, hem canlı hem de ölü hücre popülasyonlarının sürekli zamansal çözünürlükle ve ölü hücrelerin toplanmasını veya işlenmesini gerektirmeden nicelleştirilmesini sağlar. Ayrıca, ölü hücre floresansını değerlendirmek için bir plaka okuyucunun kullanılması, ölü hücrelerin bozulmadan kalmasına gerek kalmadan ölü hücrelerin değerlendirilmesine izin verir, böylece hücre yırtılması ile sonuçlanan nekrotik ölüm biçimlerine karşı bir önyargıyı hafifletir. Son olarak, FLICK testi minimum plaka kullanımı gerektirir ve hızlı bir şekilde kinetik ölçümler üreterek yüksek verimli ilaç taramasına olanak tanır. Bu protokolde, ilaca bağlı büyüme oranını, ölüm oranını ve/veya hücre ölümü mekanizmalarını çıkarmak için FLICK'in nasıl kullanılacağı da dahil olmak üzere FLICK testinin kullanımına odaklanıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. İlgilenilen her hücre hattı için geçirgenlik süresinin optimizasyonu

NOT: Açıklanan hacimler ve miktarlar bir hücre satırını optimize etmek içindir. Bu değerler, test edilecek hücre satırlarının sayısına göre ölçeklendirilmelidir.

  1. 96 oyuklu, optik tabanlı, siyah duvarlı bir plakanın her bir oyuğuna istenen sayıda hücre yerleştirin. 100 μL tam ortam ekleyin ve hücrelerin gece boyunca plakaya yapışmasına izin verin.
    NOT: Kaplanmış hücre sayısı, hücrelerin büyüme hızı, optimal yoğunluklar ve testin uzunluğu dikkate alınarak optimize edilmelidir. 72 saat boyunca ölçülen yapışık kanser hücre hatları için tipik başlangıç hücre sayıları, kuyu başına 1500 - 5000 hücredir. Örneğin, U2OS hücreleri, FBS, 2 mM glutamin ve %1 Pen-Strep ile DMEM'de oyuk başına 2000 hücrede kaplanabilir ve standart koşullarda (%5 CO2, 37 ° C, nem ile) gece boyunca kültürlenebilir.
  2. 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1,5 mL'lik %1,5'lik bir Triton-X çözeltisi hazırlayın. %1,5 Triton-X solüsyonunu maksimum hızda 5 saniye boyunca vorteksleyin. En az 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
  3. Triton-X'in birkaç saniye girdaplama yoluyla tamamen çözündüğünden emin olmak için çözeltiyi görsel olarak inceleyin. Çözeltinin homojen olduğundan emin olun.
  4. Kaplanmış hücrelerin her bir oyuğuna 10 μL% 1.5 Triton-X çözeltisi ekleyin. Karıştırmayın.
    NOT: Bu aşamada, kabarcık oluşumu nedeniyle tekrarlanan pipetleme kullanılarak karıştırılması istenmez.
  5. Hücreleri en az 1 saat boyunca nem hücre kültürü inkübatörü ile% 5 CO2, 37 ° C'ye geri döndürün.
    NOT: Triton-X çözeltisinin uygulanmasından sonra, çoğu hücre hattı 2-3 saat içinde tamamen parçalanır. SYTOX Green gibi boyalar kullanıldığında 24 saate kadar beklemenin floresan sinyali üzerinde minimum etkisi vardır. Triton-X yüzdesinin arttırılması, parçalanması zor hücre hatları için inkübasyon süresini kısaltabilir.
  6. 10x objektif kullanarak bir ışık mikroskobunda hücre morfolojilerini gözlemleyin. Hücre gövdeleri artık görünmeyene kadar hücreleri saatte bir inceleyin. Hücre geçirgenliği için gereken süreyi kaydedin.
    NOT: Bir floresan mikroskobu mevcutsa, lizis, SYTOX Green gibi hücre geçirimsiz bir DNA boyası kullanılarak görüntülenebilir. Boya, Triton-X çözeltisine 10x nihai konsantrasyonda eklenebilir ve geçirgenlik, floresan mikroskobu ile doğrulanabilir.

2. DNA boyasının seçimi ve kalibrasyonu

NOT: FLICK testi için bir gereklilik, DNA bağlanmasına bağlı bir şekilde bir sinyal yayan, hücre canlılığını etkilemeyen ve hücre sayısı ile doğrusal olarak ölçeklenen bir sinyal üreten hücre tarafından zorunlu kılınmış bir floroforun kullanılmasıdır. Bu protokol SYTOX Green kullanır. Benzer özelliklere sahip diğer boyalar da FLICK testi için uygun olabilir, ancak bunların her biri değerlendirilmeli ve kalibre edilmelidir. Örnekler için Tablo 1'e bakın.

  1. Seçilen DNA boyası için, üreticinin tavsiyesine göre test edilecek konsantrasyon aralığını belirleyin.
  2. Test edilecek her konsantrasyon için, 180 μL hücre kültürü ortamında 40.000 hücreyi, 96 oyuklu, optik altlı, siyah duvarlı bir plakanın en sol sütunu boyunca üç kopya halinde plakalayın. Kalan kuyucuklara 90 μL ortam ekleyin.
    NOT: Bu, plakanın sıraları boyunca doğrusal bir hücre titrasyonu oluşturmak için kullanılacaktır. İlk kuyuların nihai konsantrasyonu 20.000 hücre / kuyu olacaktır. Kuyunun üstünden floresan okuyan plaka okuyucular için optik alt plakalar gerekli değildir. Hücre kültürü ortamı, test edilen hücreleri büyütmek için kullanılan ortamla aynı olmalıdır. Örneğin, U2OS hücreleri kullanılıyorsa, 40.000 hücre 180 μL DMEM'de yeniden süspanse edilmelidir.
  3. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 90 μL'yi en soldaki sütundan sağdaki bitişik sütuna aktararak 1:2 seri seyreltme oluşturun. Karıştırmak için 15x pipetleyin.
  4. İkinci sütundan üçüncü sütuna, ardından üçüncü sütundan dördüncü sütuna geçerek 2.3 adımını tekrarlayın ve bu şekilde devam edin. Plakanın ikinci ila son sütununda titrasyonu bitirin. Hücre kültürü ortamının arka plan sinyalinin elde edilebilmesi için son sütunu hücreler olmadan bırakın.
  5. Sondan ikinci sütun için, 90 μL'yi çıkarın, böylece tüm oyuklar çeşitli sayıda hücre içeren 90 μL ortama sahip olur. Hücrelerin 37 ° C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe 6 saat boyunca yapışmasına izin verin.
  6. Test edilecek her bir boya konsantrasyonu için 10x'lik bir DNA boyası çözeltisi hazırlayın ve DNA boyası, ilgilenilen hücrelerin kültürlenmesi için kullanılan tam büyüme ortamına seyreltilir. Adım 1'de açıklandığı gibi PBS'de 1,5 mL'lik %1,5 Triton-X çözeltisi hazırlayın.
  7. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 10x DNA boyasından 10 μL ekleyin. Hücrelere nüfuz etmek için her oyuğa 10 μL% 1.5 Triton-X çözeltisi ekleyin. Hücreleri bu çözeltide, adım 1'de belirlenen en uygun süre boyunca inkübe edin.
    NOT: Triton-X'in eklenmesinden sonra, DNA boyasının nihai konsantrasyonu 1x'ten biraz daha azdır, ancak bu önemsizdir. İnkübasyondan sonra, tüm plaka parçalanmalıdır. Manuel hücre titrasyonu, optimal DNA boya konsantrasyonunu ve floresan elde etmek için en uygun ayarları belirlemek için kullanılacaktır.
  8. Hücre titrasyon plakası boyunca floresan yoğunluklarını ölçün. DNA boyasının üreticisi tarafından belirtildiği gibi bir dizi edinim ayarında floresan miktarını belirleyin. Kullanılan plaka okuyucuya bağlı olarak, uyarma ve emisyon dalga boylarını ve/veya dijital kazancı değiştirin.
  9. Hücre içermeyen sütunun ortalama sinyalini çıkararak her ölçümden arka plan sinyalini kaldırın. Bu değerler, seri seyreltme plakasındaki kuyucukların en sağdaki sütununda bulunabilir.
  10. Her bir edinim ayarı için her bir DNA boya konsantrasyonunun doğrusallığını belirleyin. Doğrusallık, hücre numarasının floresan sinyaline karşı grafiği çizilerek ve doğrusal regresyon gerçekleştirilerek belirlenebilir. Belirleme katsayısı (r2), floresan sinyalinin hücre sayısı ile doğrusal olarak ilişkili olma derecesini bildirir.
  11. En iyi doğrusallık ve dinamik aralık kombinasyonuna sahip olan alım ayarlarını ve DNA boya konsantrasyonunu seçin.
    NOT: 0 ile 20.000 hücre arasındaki tüm hücre numaraları aralığını göz önünde bulundurun. Kazanç ve DNA boya konsantrasyonunun, 0 ile 1000 hücre arasında, düşük hücre sayılarında doğrusal olduğundan emin olun. Birkaç cihaz ayarı veya DNA boya konsantrasyonları, tüm aralık boyunca güçlü bir korelasyon sağlayabilir. Bununla birlikte, ölü hücrelerdeki küçük değişikliklerin doğru bir şekilde ölçülebilmesi için alt uç hassasiyetinin sağlam olması önemlidir.

3. İlaçla tedavi edilen plakalarda hücre kaplama, kuyu içi ilaç uygulaması ve zaman içinde ölü hücre floresan ölçümü

NOT: İlaç seyreltme plakaları, deneysel ihtiyaçlara göre esnek bir şekilde tasarlanabilir. Genel olarak, ilaç seyreltme plakaları, bir veya birkaç ilacın bir log veya yarı log seyreltme serisini içerecektir.

  1. Deney için en uygun kaplama düzenini göz önünde bulundurun. Dış kuyular, plakanın iç kuyularına kıyasla farklı sıcaklıklar, oksijenlenme ve buharlaşma yaşadığından, büyüme varyasyonu ile ilişkili gürültüyü azaltmak için 96 oyuklu bir plakanın dış kuyularından ölçümlerden kaçının.
    NOT: Plakanın manzarası boyunca kontrollerin dahil edilmesi, büyüme verilerinin sağlamlığını artıracaktır. Plakanın ortasına ve kenarlarına kontrol kuyuları eklemeyi düşünün.
  2. Deney için gerekli plaka sayısını belirleyin. İlaç verme sırasında kuyucuk başına ortalama hücre sayısını belirlemek için testin başında parçalanacak bir ek plaka ekleyin (yani, T0 kontrol plakası).
  3. Tam büyüme ortamında bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
    1. Deney için gereken plaka sayısına bağlı olarak (adım 3.2'de hesaplanmıştır), gerekli hücre süspansiyonunun hacmini belirleyin. Oyuk başına 90 μL'de tohumlama plakaları varsa, plaka başına yaklaşık 10 mL gereklidir. Gerekli plaka sayısını 10 mL ile çarpın.
      NOT: Rezervuarın ölü hacmini ve pipetleme sırasındaki hacim kaybını hesaba katmak için bu hacmin artırılması arzu edilir. Örneğin, hesaplanan hacim 1.2 ile çarpılabilir.
    2. Hücreleri sayın ve oyuk başına istenen hücre sayısına göre bir hücre seyreltmesi hazırlayın. Örneğin, 96 oyuklu bir plakanın oyuklu başına 90 μL'lik ortamda 2000 hücreyi tohumlamayı hedefliyorsanız, toplam 3 plaka için, deney için gereken toplam hücre sayısını aşağıdaki gibi hesaplayın:
      figure-protocol-1
      Benzer şekilde, sayılan hücre süspansiyonu 400.000 hücre / mL ise, deney için gereken hücre süspansiyonunun hacmi şöyle olacaktır:
      figure-protocol-2
    3. Eklenecek sayılan hücre süspansiyonunun hacmini çıkararak kaplama için kullanılan hücre kültürü ortamının hacmini düzeltin.
      36 mL ortam - 2 mL hücre süspansiyonu = 34 mL düzeltilmiş ortam hacmi
  4. Sayılan hücre süspansiyonunu serolojik bir pipet kullanarak doğru ortam hacmiyle karıştırın. Bu hücre süspansiyonunu V tabanlı bir reaktif rezervuarına aktarın.
  5. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 90 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Hacim başına istenen hücre konsantrasyonunun korunmasını sağlamak için istenen hücre konsantrasyonunu sağlamak için serolojik bir pipetle tekrarlanan pipetleme kullanarak reaktif rezervuarındaki hücre süspansiyonunu düzenli olarak karıştırın.
  6. Hücrelerin 37 ° C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe (genellikle 12-24 saat) gece boyunca yapışmasına izin verin.
  7. Adım 1.5'de açıklandığı gibi PBS'de %1'lik bir Triton-X çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltinin hacmi tüm plakaları parçalamak için yeterli olmalıdır. PBS'de yaklaşık 1.5 mL% 1.5 Triton-X, 96 oyuklu bir plakayı parçalamak için yeterlidir.
    NOT: PBS'deki %1,5 Triton-X çözeltisi bir haftadan fazla stabildir ve kolaylık sağlamak için önceden yapılabilir.
  8. Bir ilaç seyreltme plakası yapmak için gereken hücre kültürü ortamının miktarını belirleyin. İlaç seyreltme plakalarını U veya V tabanlı 96 kuyulu şeffaf plakalarda hazırlayın.
    1. Seyreltilmiş ilacın hacminin deney için yeterli olduğundan emin olmak için, pipetleme sırasında hacim kaybını hesaba katmak için gereken minimum hacmi artırın. Örneğin, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 10 μL'lik ilaçlar eklenecekse ve deney üç plaka içeriyorsa, kuyucuk başına 30 μL seyreltilmiş ilaç gereklidir. Hacim kaybını hesaba katmak için oyuk başına 40-50 μL ilaçlı ortam hazırlayın. T0 kontrol plakası için gereken ortamı hesaba katmak için gereken ortam hacmine 1,5 mL ekleyin.
  9. Seçilen DNA boyasının 10x konsantrasyonunu tam büyüme ortamında hazırlayın. Bu konsantrasyon, adım 2.11'de seçilen konsantrasyona dayanmaktadır. Bu çözümün toplam hacmi adım 3.8'de hesaplanmıştır.
  10. Adım 3.9'daki DNA boyası + büyüme ortamını kullanarak, test edilecek her ilacın 10x konsantrasyonunu hazırlayın. İlaç seyreltme plakasında her bir ilacın sadece en yüksek dozunu oluşturun ve ilaçları çok kanallı bir pipetle seri olarak seyreltin, her bir kuyucuk arasında 15 kez karıştırın.
    NOT: İlaç seyreltme plakasında belirli bir ilaç için en yüksek dozu yaparken, konsantrasyonun doğru olduğundan emin olmak için ilacın hacmi hesaba katılmalıdır.
  11. Çok kanallı bir pipet kullanarak, hücreleri içeren plakalara adım 3.10'dan 10 μL ilaç + DNA boya çözeltisi ekleyin.
    NOT: Seri seyreltmenin oluşturulduğu ilaç seyreltme plakaları için, ilaçlar en düşük ilaç konsantrasyonundan başlayarak ve en yüksek konsantrasyona kadar çalışarak hücrelere eklenirse, çok kanallı pipetin uçlarının değiştirilmesine gerek yoktur. Bununla birlikte, çok kanallı pipet üzerindeki uçlar, her plaka arasında ve uçlar farklı bir ilaç veya daha yüksek bir ilaç konsantrasyonu içeren bir kuyucukta kullanıldığında değiştirilmelidir.
  12. İlaçların eklendiği tüm plakalar için floresan okuyun. Bu floresan okuması T0 okumasıdır (yani, Zaman = 0 saat'teki ölü hücreler).
  13. T0 floresan okumasını aldıktan sonra plakaları inkübatöre geri koyun.
  14. T0 kontrol plakasına adım 3.9'da oluşturulan 10x DNA boya çözeltisinden 10 μL ve adım 3.7'de %1.5 Triton-X çözeltisinden 10 μL ekleyin. Bu plakayı, adım 1.8'de seçilen süre boyunca inkübatöre geri koyun.
  15. Adım 1.6'da açıklandığı gibi hücreler tamamen parçalandıktan sonra T0 kontrol plakasını okuyun.

4. İlaçla tedavi edilen plakalar için zaman içinde ölü hücre floresansını ölçün

NOT: Plakaların inkübatörden çıkma süresini en aza indirin. Sıcaklıktaki uzun süreli değişiklikler hücre canlılığını etkileyebilir ve ışığa maruz kalmak SYTOX Green gibi DNA floroforlarını tehlikeye atabilir.

  1. İlaçlamadan sonra her 3-4 saatte bir ilaçla tedavi edilen tüm plakalar için floresan okumaları alın. Çok hassas ölüm kinetiği gerekmedikçe plakaların gece boyunca okunmasına gerek yoktur.
    NOT: Zaman noktalarının sabit/standart aralıklarla alınmasına gerek yoktur. Genel olarak, zaman noktaları, ölüm kinetiğinin aşağı akış analizinde hatalara neden olmadan yalnızca normal çalışma saatleri içinde alınabilir. Kinetik olarak, ölüm başlangıcından önceki dönemde, ölümün yükselen evresinde ve doygunluk/plato evresinde bazı ölçümler yapıldığı sürece çıkarımda bulunulabilir.
  2. İstenilen son zaman noktasında, bir floresan okuması elde edin. Hemen ardından, hücreleri parçalamak için adım 3.7'de hazırlanan% 1.5% Triton-X çözeltisinden 10 μL ekleyin.
  3. Plakaları inkübatöre geri koyun ve hücrelerin 1. adımda belirlenen süre boyunca geçirgenleşmesine izin verin.
  4. Geçirgenliği takiben floresan okumaları elde edin. Bu floresan değeri, her bir kuyucuk için toplam hücre sayısı (yani canlı + ölü hücreler) ile orantılıdır.

5. Öldürücü fraksiyon kinetiğini hesaplayın

NOT: Bu protokolde açıklanan hesaplamalar herhangi bir formatta veya yazılımda analiz edilebilir. Ancak MATLAB, R veya Python gibi bir programlama ortamı kullanmak daha hızlı ve daha esnek analize olanak tanır.

  1. P kesilmiş ortalamayı kullanarak T0 kontrol plakasından ortalama floresan değerlerini hesaplayın. Bu değer, ilaçlamadan önceki toplam hücre sayısı ile orantılıdır.
  2. Eğri uydurma ve üstel büyüme fonksiyonu kullanarak, deneydeki tüm kuyular için nüfus artışının kinetiğini hesaplayın. Her kuyucuk için ilk popülasyon büyüklüğü, adım 5.1'de hesaplanan ortalama T0 floresan değeridir. Her bir kuyucuk için nihai popülasyon büyüklüğü, adım 4.4'te hesaplanan geçirgenlik sonrası değerdir. Testin süresi, adım 4.4'te seçilen test son noktasına kadar 0 saat arasındadır.
  3. Adım 5.2'de belirlenen büyüme parametrelerini kullanarak, her kuyucuk için tahlilde ölçülen her zaman noktasındaki toplam hücre sayısını hesaplayın. Adım 5.2'de hesaplanan toplam hücrelerden ölü hücre ölçümünü çıkararak ölçülen her zaman noktasındaki canlı hücre sayısını belirleyin.
    NOT: Tahlildeki küçük miktarlarda gürültü nedeniyle, bazen canlı hücre sayısı küçük bir negatif sayı olabilir. Bu, manuel olarak 0'a ayarlanabilir, çünkü negatif sayıda canlı hücre olamaz ve büyük olasılıkla o kuyudaki tüm hücrelerin öldüğünü gösterir.
  4. Ölü hücre floresan sinyalini her zaman noktası için toplam hücre sinyaline bölerek her zaman noktası için öldürücü fraksiyonu (LF) hesaplayın.
  5. Gecikme Üstel Ölüm (LED) denklemini ölümcül kesir zaman seyri verilerinesığdırın 10. Herhangi bir önemli ölümcüllüğe neden olmayan bir ilacın dozları için keyfi kinetik parametrelerden kaçınmak için, 0'a eşit bir eğime sahip doğrusal bir modele uyun. Deneydeki gürültüye veya engebeli koşullar için gözlemlenen LF'ye dayalı olarak önemli ölümcüllük seviyelerini belirleyin.
  6. LED denkleminden ölüm başlangıç zamanını (DO) kaydedin. LED denkleminin dört parametresi vardır: ilk LF (LFi), platodaki LF (LFp), ilk ölüm oranı (DR) ve DO. Bu parametreleri doğrusal olmayan bir regresyon (yani eğri uydurma) kullanarak verilerden çıkarın.
  7. Her dozda her ilaç için tahlil uç noktasında fraksiyonel canlılığı (FV) hesaplayın. Uç nokta LF değerini 1'den çıkarın veya canlı hücre sayısını toplam hücrelere bölün.
    NOT: FV, yalnızca tahlil son noktasında değil, herhangi bir zaman noktasında hesaplanabilir. Bu veriler doz farmakolojisini değerlendirmek için kullanılır (ör., ilaç IC50 veya EC50).

6. GR değerini hesaplayın

  1. Tahlilin başlangıcında her kuyucuk için ortalama canlı hücre sayısını belirleyin. Bu değeri, adım 3.15'te hesaplanan geçirgenlik sonrası T0 okumasını kullanarak ve adım 3.12'de toplanan her kuyu için T0 okumasını çıkararak hesaplayın. Aşağıdaki GR denkleminde (adım 6.3), bu değer x0 olarak adlandırılır.
    NOT: Bazen bir ilacın en yüksek dozu, DNA boyasının floresan okumasına müdahale edebilir. Kontrol kuyuları kullanılarak 0 zamanında ortalama canlı hücre sayısının hesaplanması istenebilir.
  2. Kontrol kuyuları için (xctrl), tahlil uç noktasındaki her bir kuyucuk için ortalama canlı hücre sayısını belirleyin. Tedavi edilen her ilaç durumu için test son noktasındaki ortalama canlı hücre sayısını belirleyin (x (c)).
    NOT: Plaka boyunca hücre büyümesindeki varyasyona bağlı olarak, her bir oyuğun normalizasyonu için farklı xctrl değerleri kullanılabilir. Örneğin, xctrl değerleri plaka boyunca sistematik olarak değişiyorsa, plakanın ortalama xctrl değeri yerine en yakın xctrl değerinin kullanılması istenebilir.
  3. İlaçla tedavi edilen her kuyu için, aşağıdaki denklem4'ü kullanarak normalleştirilmiş büyüme hızı inhibisyon değerini (GR) hesaplayın:
    figure-protocol-3
    4 parametreli bir lojistik regresyon kullanarak eğri uydurma gerçekleştirin. GR, -1 ile 1 arasında bir ölçektedir.

7. GRADE yöntemini kullanarak ilaca bağlı büyüme ve ölüm oranlarını hesaplayın

NOT: GR, gerçek hücre çoğalma oranını değil, net nüfus artış oranını temsil eder. Uyuşturucuya bağlı nüfus artışı ve ölüm oranları, GR ve öldürücü fraksiyonun (LF) bir kombinasyonu kullanılarak hesaplanabilir.

  1. Aşağıdaki denklemi çözmek için T0 kontrol okumasından (x0) elde edilen ortalama canlı hücre sayısını, tahlil uç noktasındaki kontrol koşulundan ortalama canlı hücre sayısını (xctrl) ve saat cinsinden testin uzunluğunu (t) kullanarak deney sırasında hücre hattının iki katına çıkma süresini (τ) belirleyin:
    figure-protocol-4
    NOT: Hücre ikiye katlama süresinin (τ) doğru hesaplanması, hücrelerin test uzunluğu boyunca sürekli olarak iki katına çıkmasını gerektirir. Temas inhibisyonu yaşayan hücreler için, hücreler, istenen tahlil süresi boyunca birleşmeyecek başlangıç yoğunluklarında tohumlanmalıdır. Örneğin, U2OS'un ortalama ikiye katlama süresi 24 saattir. 72 saatlik bir tahlilde kuyu başına 2000 hücrenin tohumlanması, büyüme hızlarını yorumlamak için en uygunudur.
  2. Büyüme/ölüm oranları ile nüfus büyüklüğü arasındaki ilişkiyi belirleyin. Bunu yapmak için, bir doğum/ölüm modeli ve büyüme ve ölüm oranlarının tüm makul ikili kombinasyonlarıyla başlatılan bir simülasyon kullanın. Bu simülasyon, T0 kontrol plakasından (x0) ortalama canlı hücre sayısını, testin uzunluğunu (t) ve kullanıcı tanımlı bir makul çoğalma oranları (p) ve ölüm oranları (d) aralığını gerektirir.
    figure-protocol-5
    figure-protocol-6
    1. Büyüme oranları için makul değerleri belirlemek için, en yüksek büyüme oranı olarak saat başına iki katına çıkan hücre popülasyonunda (1 / T) işlenmemiş büyüme oranı ve en düşük büyüme oranı olarak 0 ile başlayın. Bu aralığı eşit aralıklı 500 parçaya bölün. Benzer bir işlem, 0 ile 1 arasında bir aralığı test ederek ölüm oranı için de uygulanabilir.
      NOT: 500 hızın tüm ikili kombinasyonları herhangi bir programlama ortamı kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak bazı yazılımlar kullanılıyorsa hesaplama açısından çok yoğun olabilir. Bunu, 50 büyüme ve ölüm oranlarının tüm ikili kombinasyonlarına indirgemek, çıkarımın kesinliğinde bir azalma ile bu sorunu hafifletebilir. Bu protokolle birlikte bir elektronik tablo şablonu sağlanmıştır.
  3. Simüle edilmiş her proliferasyon (p) ve ölüm (d) oranı çifti için GR ve LF değerlerini (yukarıda açıklanmıştır) belirleyin.
    NOT: Adım 7.2-7.3, her bir teorik proliferasyon ve ölüm oranı çiftini, bu teorik çift için hesaplanan GR ve LF değerleriyle birlikte içeren bir tablo oluşturacaktır. Bu, deneysel olarak gözlemlenen bir çift GR ve LF değerini bir çift ilaca bağlı proliferasyon ve ölüm oranlarıyla ilişkilendirmek için bir arama tablosu olarak işlev görecektir. Proliferasyon ve ölüm oranları için 500'den fazla ayrık değerin test edilmesi, sayısal olarak daha kesin bir değerle sonuçlanacaktır, ancak bu hassasiyet seviyesi muhtemelen testin hassasiyetinin ötesinde olacaktır.
  4. Arama tablosunda deneysel olarak hesaplanan her bir GR/LF çifti ile her bir teorik GR/LF çifti arasındaki ikili mesafeyi hesaplayın. Deneysel olarak gözlemlenen GR/LF değerleri çiftine minimum mesafeye sahip teorik çifti, gerçek ilaca bağlı proliferasyon ve ölüm oranları olarak çıkarın.

8. Yol seçici kimyasal inhibitörler kullanılarak ölüm yollarının belirlenmesi

NOT: Kimyasal inhibitörler tek başına belirli bir ilacın ölüm mekanizmasını kesin olarak belirlemek için yetersizdir. Ölüm yollarının kimyasal inhibitörleri, morfolojik değerlendirme, yola özgü biyokimyasal belirteçler ve genetik bağımlılıkların değerlendirilmesini içermesi muhtemel olan sonraki deneylerde hangi biyokimyasal veya fenotipik yanıtların araştırılması gerektiğini belirlemek için kullanılmalıdır.

  1. İlgilenilen ölüm yollarının kanonik aktivatörü bağlamında bir doz inhibitör konsantrasyonu aralığını test ederek ilgilenilen hücre hattındaki her bir hücre ölümü inhibitörünün dozunu optimize edin (Tablo 2). İdeal olarak, seçilen inhibitör dozu kendi başına hücre canlılığını etkilememelidir (GR metriğini kontrol edin).
    NOT: Tüm hücre hatları tüm ölüm yollarını aktive edemez. Farklı ölüm yollarının aktivatörlerini/inhibitörlerini test ederken biyokimyasal veya fenotipik doğrulama gerekebilir.
  2. Bir inhibitör elek için en uygun kaplama düzenini düşünün. Toplu etkileri en aza indirmek için, her ilacı, değerlendirilmekte olan inhibitör(ler) ile aynı plakada tutun ve replikasyonlar ayrı plakalarda olsun.
  3. Adım 3.3'e benzer şekilde, 96 oyuklu, optik tabanlı, siyah duvarlı bir plakanın her bir oyuğunda istenen sayıda hücreyi tohumlayın. İnhibitör ve ilacın hacimlerini hesaba katmak için kaplama hacmini 80 μL'ye düşürün.
  4. Tam ortamda test edilecek inhibitörlerin 10x konserasyonunu hazırlayın ve her bir oyuğa 10 μL ekleyin. Hücreleri 2-4 saat boyunca ölüm yolu inhibitörleri ile ön işlemden geçirin. Daha sonra, ilgilenilen ilaçları ekleyin ve 3-5. adımlarda olduğu gibi floresan okuması elde edin.
  5. İnhibitör(ler)in etkinliğini değerlendirmek için ölüm başlangıç zamanındaki (DO) ve/veya maksimum öldürücü fraksiyondaki değişikliği değerlendirin. DO, Gecikme Üstel Ölüm (LED) modelinden çıkarılan bir parametredir. 5.6 - 5.7 arasındaki adımlara bakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, U2OS hücrelerinin HDAC inhibitörü Belinostat'a duyarlılığını araştırdık. Bu deneyler, ölü hücreleri etiketlemek için 2 μM SYTOX Green kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 1A). Kinetik okumalar, 130 kazanç ayarında bir floresan plaka okuyucu kullanılarak yapılmıştır (Şekil 1B). Hücreler, testin sonunda 2 saat boyunca PBS'de% 1.5 Triton-X çözeltisi içinde parçalandı (Şekil 1C-D).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

FLICK testi, bir ilacın bir hücre popülasyonunun büyümesi ve ölümü üzerindeki etkisinin kapsamlı bir değerlendirmesini oluşturmak için sağlam bir yöntemdir. Bu yöntem doğrudan hücre sayımı yapmadığından, protokoldeki kritik adımlar, triton geçirgenlik adımları sırasında tahlil doğrusallığını ve tam lizizi sağlamaktır. Doğru geçirgenlik süresi, bu protokolde vurgulandığı gibi görsel olarak veya zaman içinde plaka floresansını okuyarak ve sinyal platolarının ne zaman olduğunu belirleyerek ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Lee Lab'ın tüm geçmiş ve şimdiki üyelerine, laboratuvarımızın ilaç yanıtlarını değerlendirme konusundaki bakış açısına katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden MJL'ye (R21CA294000 ve R35GM152194) sağlanan fonlarla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BelinostatApexBioA4612
CamptothecinApexBioA2877
Konik santrifüj tüpü, 15mLFisher Scientific12-565-269
DMEMCorning10017CVHücreleri tohumlamak ve ilaçlamak için
DMSOFisher ScientificMT-25950CQCHücreleri
tohumlamak ve ilaçlamak içinFisherbrand 96-Well, Hücre Kültürü ile Tedavi Edilmiş, U-Şekilli Tabanlı MikroplakaFisher Scientific FB012932Hücreleri tohumlamak ve ilaçlamak için (pim plakası)
Greiner Bio-One  HÜCRE YILDIZI & mu; Şeffaf 96 kuyulu, Hücre Kültürü ile Tedavi Edilmiş, Düz Tabanlı MikroplakaGreiner655090Hücreleri tohumlamak ve ilaçlamak için
IncuCyte S3Essen BiosciencesHerhangi bir faz mikroskobu
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlMATLAB sürüm R2023b'de çalışacaktır, bir lisans gereklidir
Mikroplaka floresan okuyucuTecanSparkÖlü hücre floresansını ölçmek için
PalbociclibApexBioA8316
PBSCorning21-040-CMHerhangi bir PBS çalışır
Spark Çok Modlu Mikroplaka OkuyucuTecanhttps://www.tecan.com/spark-overviewSparkControl yazılım sürümü 2.2
Steril rezervuar, 25 mLFisher Scientific13-681-508Hücreleri tohumlamak ve ilaçlamak için
Sytox Green nükleik asit lekesiThermo Fisher ScientificS7020Ölü hücre floresansını ölçmek için DNA lekesi
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-APGeçirgen hücreler için
U2OSATCCHTB-96Bu protokolde kullanılan örnek bir hücre hattı
Z-VAD-FMKApexBioA1902

Kaynaklar

  1. Hafner, M., Niepel, M., Sorger, P. K. Alternative drug sensitivity metrics improve preclinical cancer pharmacogenomics. Nat Biotechnol. 35 (6), 500-502 (2017).
  2. Dixon, S. J., Lee, M. J. Quick tips for interpreting cell death experiments. Nat Cell Biol. 25 (12), 1720-1723 (2023).
  3. Schwartz, H. R., et al. Drug GRADE: An Integrated Analysis of Population Growth and Cell Death Reveals Drug-Specific and Cancer Subtype-Specific Response Profiles. Cell Rep. 31 (12), 107800(2020).
  4. Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 1-11 (2016).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Tsvetkov, P., et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 375 (6586), 1254-1261 (2022).
  7. Holze, C., et al. Oxeiptosis, a ROS-induced caspase-independent apoptosis-like cell-death pathway. Nat Immunol. 19 (2), 130-140 (2018).
  8. Maltese, W. A., Overmeyer, J. H. Methuosis Nonapoptotic Cell Death Associated with Vacuolization of Macropinosome and Endosome Compartments. Am J Pathol. 184 (6), 1630-1642 (2014).
  9. Inde, Z., Forcina, G. C., Denton, K., Dixon, S. J. Kinetic Heterogeneity of Cancer Cell Fractional Killing. Cell Rep. 32 (1), 107845(2020).
  10. Forcina, G. C., Conlon, M., Wells, A., Cao, J. Y., Dixon, S. J. Systematic Quantification of Population Cell Death Kinetics in Mammalian Cells. Cell Syst. 4 (6), 1-18 (2017).
  11. Gelles, J. D., et al. Single-Cell and Population-Level Analyses Using Real-Time Kinetic Labeling Couples Proliferation and Cell Death Mechanisms. Dev Cell. 51 (2), 277-291.e4 (2019).
  12. Richards, R., et al. Drug antagonism and single-agent dominance result from differences in death kinetics. Nat Chem Biol. 16 (7), 791-800 (2020).
  13. Richards, R., Honeywell, M. E., Lee, M. J. FLICK: an optimized plate reader-based assay to infer cell death kinetics. STAR Protoc. 2 (1), 100327(2021).
  14. Honeywell, M. E., et al. Functional genomic screens with death rate analyses reveal mechanisms of drug action. Nat Chem Biol. 20 (11), 1443-1452 (2024).
  15. Jannoo, R., Xia, Z., Row, P. E., Kanamarlapudi, V. Targeting of the Interleukin-13 Receptor (IL-13R)α2 Expressing Prostate Cancer by a Novel Hybrid Lytic Peptide. Biomolecules. 13 (2), 356(2023).
  16. Gelles, J. D., Chipuk, J. E. Why not add some SPARKL to your life (and death)! Mol Cell Oncol. 7 (1), 1685841(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

la Yan t AnaliziH cre l m KantifikasyonuB y me H z nhibisyonuLetal FraksiyonFloresans Plaka OkuyucuSeri Dil syonH cre ProliferasyonuApoptozis TespitiDoz Yan t
FLICK Testi Kullanılarak İlaç Yanıtının Kapsamlı Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.