Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması

1.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67780

⸱

27 Aralık 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

Bu makalede

Özet

Burada, nanofibröz membran bazlı iki katmanlı sistemde fibroblastlarla kültürlenen epitel hücrelerinin membrana nasıl stabil bir şekilde yapışabileceğini ve zar üzerinde büyüyebileceğini gösteriyoruz.

Özet

Epitel hücrelerinin kültüründeki teknik engeller arasında farklılaşma ve fonksiyon kaybı yer alır. Biyomimetik üç boyutlu (3D) hücre kültürü yöntemleri, hücre kültürü verimliliğini artırabilir. Bu çalışma, epitel hücrelerini 3 boyutlu bir ortamda fibroblast kültürü ile doku benzeri katmanlar halinde yetiştirmeyi amaçlayan gelişmiş iki katmanlı bir kültür sistemini tanıtmaktadır. Polivinil alkol (PVA) ve poli(ε-kaprolakton) (PCL) nanofibröz membranlar (NM'ler) elektroeğirme yoluyla üretildi ve sırasıyla epitel hücrelerinin ve fibroblastların kültürü için fizyolojik olarak ilgili bir hücre dışı matris olarak kullanıldı. Üst insert oyuklarında, akciğer epitel hücreleri PVA NM üzerinde ekte edildi ve alt odacıklarda fibroblastlar PCL NM üzerinde kültürlendi. Bu konfigürasyon, doğrudan hücre-hücre temasını ortadan kaldırır ve çözünür faktörlerin aracılık ettiği parakrin sinyalizasyonunun incelenmesini kolaylaştırır. Epitel hücrelerinde zona oklüdleri dahil olmak üzere hücre içi proteinlerin dağılımını, büyüme modelini ve ekspresyonunu analiz etmek için konfokal mikroskopi kullanıldı. Z-istifleme teknikleri, ayrıntılı 3D rekonstrüksiyonları mümkün kılarak epitel tabakası içindeki sıkı bağlantıların ve uzamsal organizasyonun bütünlüğü hakkında kesin bilgiler sağladı. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), nanofibröz membranlar üzerindeki hücre tiplerinin morfolojik özelliklerini değerlendirdi. SEM görüntüleme, karmaşık hücre yüzey yapılarını ve nanofiberlerle etkileşimleri ortaya çıkararak, hücresel mimari ve nanolifli yapı ile hücre etkileşimi hakkında kapsamlı bir bakış açısı sundu. Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi, zaman içinde epitel hücresi ve fibroblast büyüme oranlarını ölçmek için basit bir yöntemdir. Bu hücrelerin birlikte kültürlenmesinin proliferatif davranışlarını ve potansiyel sinerjik etkilerini sağlar. Bu bulgular, epitel dokusu rejenerasyonu, endotelyal, immün ve diğer stroma hücreleri ile tümör mikroçevresi, toksisite testi ve ilaç aktivitesi testi dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik ve farmakolojik bağlamlarda çok önemli olan fibroblastların ve epitel hücrelerinin eşzamanlı kültürü için basit bir insert ko-kültür sisteminin etkinliğini vurgulamaktadır.

Giriş

On yıllar boyunca, klasik iki boyutlu (2D) tek katmanlı kültür, enfeksiyonları, farmakolojiyi ve toksikolojiyi anlamak için gerekli olmuştur 1,2. Bununla birlikte, doku mikro çevresinin karmaşıklığını, çoklu bileşimler arasındaki dinamik etkileşimleri ve üç boyutlu (3D) mimarisini dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, 2D hücre kültürünün doku benzeri yapıları taklit etmede sınırlamaları vardır 3,4. Örneğin, vivo mikro ortamda hücre farklılaşması, çoğalması ve hücresel işlevlerde gerekli olan hücreden hücreye ve hücreden hücre dışı matris (ECM) sinyalizasyonunun eksikliği vardır. Bu nedenlerden dolayı, 3D hücre kültürleri sistemleri geliştirilmiştir5. 3D kültürdeki hücreler büyür ve çevredeki hücre dışı matris ile üç boyutta etkileşime girer. Ayrıca, basit tek hücre tipi in vitro modeller ile in vivo6'da meydana gelen dinamik hücresel etkileşimler arasındaki boşluğu kapatmak için birden fazla hücre tipinden oluşan bir 3D kokültür yaklaşımı geliştirilmiştir. 3D kokültür sistemleri, hücre-hücre iletişimi ve hücre-hücre dışı matris (ECM) etkileşimleriçalışmasında popülerlik kazanmıştır 7,8,9,10. Mevcut 3D kokültür sistemlerinin çeşitli formları vardır ve doğrudan ve dolaylı kokültürolarak ayrılabilir 8,9. Doğrudan kokültürde, kültürlenmiş hücrelerdeki çeşitli hücre fonksiyonları, parakrin etkilerden ziyade esas olarak doğrudan temastan etkilenebilir. Karşılaştırıldığında, dolaylı kokültür, farklı hücre tiplerini ayırmak için bariyerler veya katmanlar kullanarak parakrin etkileşimini araştırmada daha büyük bir avantaja sahiptir.

Biyouyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilen maddeler kullanarak ECM'yi taklit eden biyomimetik iskeleler üretmek için çeşitli malzemeler ve yöntemler kullanılmaktadır10. Nanolifli iskele yapısı, biyolojik dokularda doğal ECM konfigürasyonunu taklit ederek hücre kültürü11,12 için bir 3D mimari sağlar. Elektroeğrilmiş nanofibröz membranlar (NM'ler), farklı hücre tiplerinin doğrudan ve dolaylı olarak birlikte kültürlenmesinde kullanılmıştır 13,14,15.

Epitel hücreleri, ana organların fiziksel bir bariyerini oluştururken, fibroblastlar, ECM'nin yeniden şekillenmesine aracılık eden ve komşu epitelidüzenleyen baskın stroma hücreleridir 6,16,17. Epitel hücreleri ve fibroblastlar, hücre yüzeyindeki integrin reseptörleri aracılığıyla sırasıyla bazal membrandaki laminin ve interstisyel matriksteki fibronektin ile etkileşime girer18. Epitel hücreleri, 150 - 250 nm çapındaki poli (vinil alkol) (PVA) NM'ler ve mikro gözenekler üzerinde kültürlendiğinde, hücre agregatları ve sferoidler yerine çok tabakalar oluştururlar ve büyüme paternleri epitel dokusundaki hücrelerinkine benzer19. Karşılaştırıldığında, 400-1.500 nm çaplara ve 10-50 μm mikro gözeneklere sahip poli (kaprolakton) (PCL) NM'ler, kültürlenmiş fibroblastların büyümesi için interstisyel matrise benzer bir uzamsal boyutluluk sağlar 13,14. Biyouyumlulukları nedeniyle, PVA ve PCL membranları doku mühendisliğinde yaygın olarak kullanılan polimerlerdir20,21.

Bu çalışma, epitel hücrelerini 3 boyutlu bir yapı içinde doku benzeri katmanlar ve fibroblastlar olarak yetiştirmek için gözenekli elektrospun NM'leri kullanan gelişmiş bir iki katmanlı kültür sistemini tanıtmaktadır. Protokol beş ana aşamaya ayrılabilir: nanofiber üretimi, fiber çapraz bağlantı sonrası ve kalite değerlendirmesi, membrana bağlı kültür kuyusunun hazırlanması, hücre tohumlama ve 3D kokültür ve 3D kültürlenmiş hücrelerin tahlilleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Suya dayanıklı PVA nanofiberlerin imalatı

  1. 0.02 g poli (akrilik asit) (PAA) ve 1 g PVA'yı tartın, ardından bunları manyetik bir çubuk içeren temiz bir cam şişeye ekleyin. Şişeye 7,8 mL damıtılmış su ekleyin, şişeyi bir tabak karıştırıcıya yerleştirin ve sıcaklığı 84 °C'ye, hızı 500 rpm'ye ve süreyi 12 saate ayarlayın.
  2. 0.2 mL glutaraldehit (GA) eklemeden önce şişeyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Şişeyi plaka karıştırıcıya yerleştirin ve hızı 500 rpm'ye, süreyi 30 dakikaya ve sıcaklığı oda sıcaklığına ayarlayın.
  3. Elektrospinning için 5 mL'lik bir şırınga kullanın, pistonları namlulardan ayırın ve namluların içindeki küçük plastik kalıntıları ve pistonların ucunu temizleyin.
  4. Sıvı akışını engellemek için iğneler kullanın, ardından her bir varile PVA çözeltisini dökün (hacim: her biri 2,5-3 mL). Pistonları monte edin, ardından iğneleri çıkarın.
    NOT: Solüsyonda bir kabarcık olabilir, bu nedenle baloncuk kaybolana kadar bekleyin. Bu işlem 10-30 dakika sürer.
  5. 27 G'lık yeni bir metal iğne monte edin ve ardından elektrospinning makinesine yerleştirin.
  6. Kollektörü folyo ile iyice sarın.
  7. Enjektör panelinin orijinal konumuna dönmesine izin verin. Makine için aşağıdaki ayarları kullanın: (her pompa) enjeksiyon hacmi: 2 mL, enjeksiyon hızı: 6 μL/dak, silindir hızı: 100 rpm, uçtan kollektör mesafesi: 14 cm. Her pompa için sıvı akışını kontrol edin.
  8. Makineyi yaklaşık 12 kV elektrik potansiyeli ile çalıştırın.
  9. İşlemin başında nemin %40 - 50 ve sonunda %25 - 30 olduğundan emin olun. Nem azaldığında bir nemlendirici kullanın ve nemi artırmak için elektro eğirmeden bir gün önce makinenin içine damıtılmış su içeren bulaşıklar yerleştirin.
    NOT: Bu, PVA nanofiberlerinin başarılı bir şekilde üretilmesinde kritik bir faktördür.
  10. Akışı düzenli olarak kontrol edin. İğne tıkalıysa, makineyi geçici olarak durdurun. Damlayı çıkarmak için bir laboratuvar mendili kullanın ve yeni damla görünene kadar bekleyin. Değilse, iğneyi değiştirin ve ardından makineyi çalıştırmaya devam edin.
  11. PVA nanofiber üretim sürecinin tamamlanması ~ 6 saat sürer. Elektrospinning işlemi bittikten sonra, elyaf matı içeren folyoyu kollektörden ayırın ve nanofiber matı vakum altında kurutucu içinde saklayın.

2. PVA nanofibröz membranın hidroklorik asit (HCl) buharı ile işlenmesi ve lif kalitesinin değerlendirilmesi

NOT: PVA NM'lerin su stabilitesi, HCl buharı ile çapraz bağlama sonrası reaksiyondan sonra iyi korunur. Bu işlem, NM'lerin uygun kalınlığı, gözenek boyutu ve pürüzlülüğü için optimize edilmiştir. PVA çok hidrofilik bir polimerdir ve elektroeğrilmiş PVA nanofiberleri su temasında ve nemli koşullarda kararsızdır. PVA NM'leri, PVA polimerinin imalatından hemen sonra HCl buharı ile muamele edilmelidir.

  1. Trans-kuyu eki için istenen boyutta parçalar halinde bir nanofiber mat kesin.
  2. 1.5 mL saf HCl içeren küçük bir tabak hazırlayın. HCl içeren kabı ve nanofiber parçalarını bir vakum odasına yerleştirin ve kapağı kapatın.
    NOT: HCl buharı, nanofiberi suya dayanıklı hale getirmek için çapraz bağlama sonrası ajan olarak kullanılır.
  3. Vakum pompasına bağlı vanayı açın, HCl dumanı yükselene kadar 10 s bekleyin ve ardından vanayı kapatın. Membranları HCl dumanı ile 2 dakika tedavi edin.
  4. HCl buharı ile işlemden sonra, membranlara birkaç damla damıtılmış su (DW) ekleyin, bunları bir cam slayt üzerine koyun ve zarı folyodan çıkarın. 20 dakika havayla kuruduktan sonra, membranlar doğal olarak slayta yapışır.
  5. Membranları bir otomatik püskürtme kaplayıcı kullanarak ince bir altın tabakası ile karbon bant üzerine kaplayın. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri elde edin.
  6. PVA NM'leri HCl ile çapraz bağladıktan sonra, 3x 1x PBS ile yıkayın ve kalıntı HCl olmadığını doğrulamak için kültür ortamına batırdıktan sonra pH'ı kontrol edin.

3. PCL nanoliflerinin imalatı ve nanolif kalite değerlendirmesi

  1. 1,5 g PCL'yi tartın ve temiz bir cam şişeye ekleyin. Şişeye 8.5 mL kloroform ekleyin, şişeyi bir tabak karıştırıcıya yerleştirin ve PCL'yi oda sıcaklığında 12 saat kloroformda çözün.
  2. 1.7 ve 1.8 adımları dışında 1.3 ila 1.9 arasındaki adımları tekrarlayın, enjeksiyon hızını 8 μL/dk'ya ve voltajı 17.5 kV'a ayarlayın.
    NOT: PCL imalatının tamamlanması ~ 3.5 saat sürer.
  3. Membrandan küçük bir parça kesin ve parçaları 5 dakika boyunca otomatik püskürtme işlemiyle kaplayın. SEM görüntülerini elde edin.

4. Bir trans-kuyuda iki membran tabakasının montajı

NOT: Bu protokolde, 24 oyuklu bir plaka ve ilgili ek kuyusu kullanıyoruz. PVA NM, kesici uç kuyusuna bağlanırken, PCL NM alt kuyuya bağlanır.

  1. PVA ve PCL NM'ler için sırasıyla 10 mm ve 13 mm çapında yuvarlak parçalar halinde bir nanofiber mat kesin.
  2. Membranları ek parçaya ve hazneye iyi bir şekilde tutturmak için yapışkan bir madde olarak polidimetilsiloksan (PDMS) Sylgard 184 kullanın. Kullanmadan önce Sylgard 184 Base (kısım A) ve Kürleme Maddesini (kısım B) plastik bir kapta 10:1 kütle oranında karıştırın. PDMS solüsyonunu tüm karışım kabarcıklarla dolana kadar 2-3 dakika kuvvetlice karıştırmak için temiz bir cam slayt kullanın. Kullanmadan önce balonun oluşmasına ve 10 dakika kaybolmasına izin verin; bu arada slaytın 100 °C'ye ısınmasına izin verin.
  3. PDMS'yi bir cam slayt üzerine yayın ve ek parçanın alt kenarını PDMS'ye hafifçe batırın. PDMS'nin sertleşmesi için (~10-15 dk) ek parçayı sürgülü ısıtıcı üzerinde baş aşağı tutun. PDMS'nin yapışkan olmadığından emin olmak için 200 μL'lik bir uçla dikkatlice kontrol edin.
  4. PVA NM parçalarını 2.2 ila 2.4 adımlarında açıklandığı gibi işleyin.
  5. Ek parçayı PVA NM parçasına hafifçe bastırın, böylece ek parçanın alt kısmı membran parçasının nanofiber tarafına bakar. Kuyunun ortasına bir damla damıtılmış su ekleyin ve folyoyu çıkarmak için forseps kullanın. Ek parçayı 24 oyuklu yeni bir plakaya iyice koyun ve zarın kurumasını bekleyin.
  6. PCL NM parçasını alt kuyuya takarken, 200 μL'lik ucu PDMS karışımına batırdığınızdan ve tam olarak dört köşesine ve ortasına noktaladığınızdan emin olun.
  7. Plakayı sürgülü ısıtıcıya yerleştirin ve montajın kalitesini sağlamak için PDMS'nin 5-7 dakika sertleşmesine izin verin.
  8. PCL NM parçasını, zarın nanofiber tarafı PDMS'ye bağlı olacak şekilde PDMS içeren kuyuya koyun. Tam tutturma için membran parçasının folyo tarafına hafifçe bastırmak için küçük, temiz bir fırça kullanın. Folyoyu kolayca çıkarmak için kuyuya 0,2 mL %70 etanol ekleyin.
  9. Ek parçayı ve alt kuyuyu trans-kuyu kurulumunda gece boyunca UV ışığı altında sterilize edin.
    NOT: Karışık PDMS, daha fazla kullanım için -20 °C'de saklanabilir. DİKKAT: PCL nanolifli membrana bağlı plaka kuru olarak saklanabilir ancak kullanmadan önce %70 etanol ile ıslatılmalıdır.
  10. Ertesi gün, sırasıyla 200 μL ve 500 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek eki ve tabanı 3 x 10 dakika boyunca iyice yıkayın. Ek parça ve alt kuyu kullanıma hazırdır.

5. Kokültür modeli için hücre tohumlama ve iki katmanın montajı

NOT: MLE-12 hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin antibiyotik ile 1x Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)/F12'sinde kültürlendi. NIH3T3 hücreleri %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin antibiyotik ile 1x DMEM yüksek glukoz içinde kültürlendi.

  1. Hücreleri 150 mm'lik bir kültür kabında tutun. % 70-80 birleştiklerinde, hücreleri 10 mL 1x PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de 3 dakika boyunca 2 mL önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin / EDTA çözeltisi ile tripsinize edin.
  2. Hücreleri alttan çıkarmak için tabağa hafifçe vurun ve ardından tripsin enzimini nötralize etmek için her hücre tipine 8 mL tam kültür ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Tohumlanmış hücrelerin NM üzerindeki dağılımını gözlemlemek için hücreleri Cell-Tracker ile boyayın (daha fazla ayrıntı için bölüm 6'ya bakın).
  3. Hücre peletini 5 mL tam DMEM / F12 ortamında yeniden süspanse edin. Hücre sayısını belirleyin ve 6 × 106 MLE-12 hücre / mL ve 8 × 105 NIH3T3 hücre / mL'ye ayarlayın.
    NOT: Komple DMEM/F12 ortamı, MLE-12 ve NIH3T3 hücreleri ile kokültür için kullanılır.
  4. Alt kuyuyu 500 μL tam DMEM/F12 ortamı (PCL'siz kuyu) ile doldurun. PVA nanofibröz membrana bağlı eki trans-kuyuya aktarın ve 50 μL MLE-12 hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  5. Eşzamanlı olarak, PCL nanolifli membrana bağlı alt kuyuyu 500 μL NIH3T3 hücre süspansiyonu ile doldurun ve hücreleri 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  6. 2 saat sonra, MLE-12 hücre içeren eki ve NIH3T3 hücre içeren alt kuyuyu trans-kuyu kurulumunda birleştirin. Bu, üst katman olarak MLE-12 hücreleri ve alt katman olarak NIH3T3 hücreleri ile kokültür modelidir. İki katmanlı zarlardaki hücreleri istenen süre boyunca kokültüre edin.

6. Hücre dağılımı deneyi

  1. Toplam 2 mL tam DMEM / F12 ortamı hacminde 5 μM Cell-Tracker kırmızı ve yeşil solüsyon hazırlayın.
  2. Tripsinizasyondan sonra, MLE-12 hücrelerini önceden hazırlanmış Cell-Tracker kırmızı solüsyonu ve NIH3T3'ü Cell-Tracker yeşil solüsyonu ile karıştırın. Optimum hücre etiketlemesini sağlamak için hücreleri 37 ° C ve% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin. Numunelere 8 mL tam DMEM / F12 ortamı ekleyin ve 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
    NOT: Cell Tracker, hücre canlılığını ve çoğalmasını etkileyemez. Bu nedenle, Cell-Tracker ile boyanmış hücreler, birleşene kadar kültürlenebilir. Boyanmış hücrelerdeki floresan yoğunluğu kültürden 4-5 gün sonra azalabilir.
  3. 5.3 ile 5.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
  4. Konfokal mikroskop altında gözlem yaparken, kesici ucu 24 oyuklu plakadan 12 oyuklu bir plakaya aktarın.
    NOT: Bu, objektif lens ile hücreler arasındaki mesafeyi en aza indirerek hücre morfolojisinin gözlemlenmesine olanak tanır.

7. 3D kokültüre hücrelerin konfokal gözlemleri

NOT: Bir PVA NM'ye epitel hücresi bağlanması, bir PCL NM'ye fibroblastlarınkine kıyasla zayıftır. Eski ortamı pipet aspirasyonu ile manuel olarak atın ve kuyu duvarına nazikçe yeni ortam veya çözelti ekleyin. Boyama işlemi sırasında zarların kurumasına izin vermemeye çalışın.

NOT: Hücre bağlanması, laminin kaplanarak veya PVA nanofiberlerinde19 integrin bağlayıcı motiflerin peptitlerinin dahil edilmesiyle geliştirilebilir.

  1. Ek parçayı 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın. Eski ortamı atın ve 150 μL'lik %4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  2. % 4'lük PFA solüsyonunu çıkarın ve yapışan hücreleri 150 μL 1x PBS ile yıkayın.
  3. Blokaj ve geçirgenlik için, 150 μL% 5 normal keçi serumu ve% 0.2 Triton X-100 1x PBS içinde seyreltilmiş ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  4. Alexa Fluor 594 konjuge anti-zona oklüdens Ab (1:400) ve Phalloidin-iFlour 488'i (1:1.000) antikor seyreltici reaktifi içinde seyrelterek hazırlayın. Bloke edici çözeltiyi çıkarın, oyuk başına 150 μL florofor çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    NOT: Sonuçların kalitesini doğrudan etkileyeceği için antikor çözeltilerini son derece hassas bir şekilde hazırlayın. Işığa maruz kalmaktan kaçının.
  5. Antikor çözeltisini atın ve hücreleri 10 dakika boyunca 150 μL 1x PBS ile yıkayın.
  6. 1x PBS (1:1.000) içinde seyreltilmiş 150 μL Hoechst 33342 ekleyin ve 10 dakika inkübe edin; Işığa maruz kalmaktan kaçının.
  7. Hoechst 33342 solüsyonunu çıkarın ve yapışan hücreleri 150 μL 1x PBS ile 10 dakika yıkayın.
  8. Temiz bir cam slayt hazırlayın ve hassas miktarda sulu montaj jeli ekleyin. Membranları çevreleyen kenardan hassas bir şekilde ayırmak için sivri uçlu forseps kullanın. Membranları, hücreleri içeren tarafın yukarı baktığından emin olarak montaj jelinin üzerine yerleştirin. Kesin miktarda montaj jeli ekleyin ve bir kapak sürgüsü ile örtün. Slaytları oje ile kapatın, hassas ve eksiksiz bir sızdırmazlık sağlayın.
  9. Aşağıdaki görüntüleme ayarlarını kullanarak hücreleri konfokal mikroskop altında gözlemleyin: Lazer Güç kontrolü: 405 Yoğunluk 10; Lazer Güç kontrolü: 488 Yoğunluk 10; Lazer Güç kontrolü: 561 Yoğunluk 10; Dedektör hassasiyeti: 420LP (600 değeri); Dedektör hassasiyeti: 525/50 (700 değeri); Dedektör hassasiyeti: 561LP (750 değer).

8. Nanoliflere hücre bağlanmasının tahlili

  1. Eski ortamı atın ve hücreleri 150 μL 1x PBS ile yıkayın.
  2. Hücreleri, oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1x PBS'de seyreltilmiş 150 μL% 3 GA ile sabitleyin.
  3. Hücreleri 10 dakikada 150 μL 1x PBS ile yıkayın.
  4. 1 saat boyunca 1x PBS'de seyreltilmiş 150 μL% 1 osmiyum tetroksit (OsO4) ekleyerek hücreleri ikincil olarak sabitleyin.
    DİKKAT: OsO4 ve buharı zararlıdır. Çeker ocakta kullanılmalıdır.
  5. Solüsyonu atın ve hücreleri 300 μL 1x PBS ile 2 x 10 dakika yıkayın.
  6. Hücreleri her adımda 10 dakika boyunca %50, %70, %90 ve %95 ila %100 arasında kademeli etanol ile kurutun. 10 dakika boyunca taze% 100 etanol ekleyerek son dehidrasyon adımını gerçekleştirin.
  7. Hücreleri ve zarları tamamen havayla kurutun. Membranları ayırmak için sivri uçlu forseps kullanın ve membranları iki taraflı bir musluk kullanarak numune tutucuya yerleştirin. 2.000x büyütmede SEM altındaki hücreleri gözlemlemeden önce 5 dakika boyunca iyon püskürtme işlemi gerçekleştirin.

9. Hücre büyüme deneyi

NOT: Bu protokolde, CCK-8 testi, üreticinin talimatlarını izleyerek hücre büyüme oranını ölçmek için kullanılır.

  1. 9 kısım önceden ısıtılmış DMEM/F12'yi (hacimce) 1 kısım CCK-8 reaktifi ile karıştırarak CCK-8 karışımını hazırlayın. Eski kültür ortamını çıkardıktan sonra, hücre içeren kuyucuğa 150 μL CCK-8 karışımı ekleyin.
  2. Ek parçayı, alt kuyu içeren hücrelerden ayırmak için yeni 24 oyuklu plakaya aktarın. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 45 dakika inkübe edin.
  3. Süpernatanı toplayın ve 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. 1.800 × g'da 3 dakika santrifüjleyin.
  4. Mikrosantrifüj tüpünden 96 oyuklu plakaya 100 μL süpernatan ekleyin. 450 nm'de optik yoğunluğu (OD) okuyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, nanofibröz membran bazlı iki katmanlı bir model oluşturarak MLE-12 akciğer epitel hücrelerinin ve NIH3T3 fibroblastlarının birlikte kültürlenmesi için kritik adımları özetlemektedir (Şekil 1). Bu model, canlı hücre görüntüleme, immünohistokimya ve kokültüre hücrelerin son nokta kantitatif analizine uygundur. Hücre yoğunluğunu ve büyüme koşullarını optimize ederek diğer hücre tipleri de kullanılabilir.

SEM, fabrikasyon PVA nanofiberlerin herhangi bir b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

2B kültürden 3B kültür modellerine geçiş, in vitro kokültür modellerinin geliştirilmesinde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bir 3D kültür modeli, hücrelerin çoğalabildiği, toplanabildiği ve farklılaşabildiği doku mikro ortamını taklit etmelidir22. Yapı iskelesi tabanlı 3B kokültür modellerinin kullanılması, doku mimarisinin replikasyonunu geliştirir. Bu çalışmada, NM tabanlı bir trans-kuyu sistemi, iki tip hücrenin dolaylı 3D kokültürünü sağlar. A...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Kore Cumhuriyeti (HR16C0001) Sağlık ve Refah Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi'nden bir hibe ile desteklenmiştir; Milli Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Temel Bilimler Enstitüsü (Ulusal Araştırma Tesisleri ve Ekipman Merkezi) hibesi aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Kapasitesinin Artırılması Projesi (2019R1A6C1010003); ve Kore Hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibeleri (2022R1A4A5032702).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 Tripsin / EDTAWelgeneLS015-01
100x Penisilin / StreptomisinGibco10378016
20x PBSLPS çözeltisiCBP007A
% 4 ParaformaldehitBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 konjuge ZO-1 antikoruİnvitrojen339194
Antikor seyreltici OP QuantoEpredia10129-576
CCK-8 tahlil kitiDonginbioCCK-3000
Hücre kültürü kabı (150x20)SPL20151
CellTracker Yeşil CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Kırmızı CMTPXInvitrogenC34552
KloroformSamchunC0584
Konik tüpSPL50050
Kapak camıCorningCLS2980245
DMEM yüksek glikozWelgeneLM001-05
DMEM / F12WelgeneLM 002-05
DURAN Kurutucu tabanları, düzlem flanşlı, vida dişiDWK Yaşam Bilimleri 7.022 260
DURAN Cam Kurutucu Kapak & MuslukDaihan ScienceSM.2444061
DURAN Musluk, PTFE MilliDWK Yaşam Bilimleri 
Elektrospinning makinesiNanoNCESR200RD
Etil alkol, SafSigma Aldrich459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR 
Floresan Lazer Konfokal Tarayıcı Modülü K1-fluoNanoskop Sistemleri
Jel / montajBiomeda Corp.M01
Gluteraldehit çözeltisiSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
Metal nozul 27GNanoNC
OjeDoğa cumhuriyeti
Normal keçi serumuVektörLaboratuvarları S-1000
Osmiyum tetroksitSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
Plastik Syringe_Lure Kilidi (10 mL)HENKE SASS WOLFAL10
Poli (akrilik asit)Sigma Aldrich323667
Poli (vinil alkol)Sigma Aldrich341584
PolikaprolaktonSigma Aldrich440744
Saf HCLDuksan1129
Taramalı Elektron MikroskobuSECSNE-4500M
Sürgülü camMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 setomniscienceOMNI.05255
Synergy H1 Çok Modlu OkuyucuBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
10322671

Kaynaklar

  1. Kämpfer, A. A. M., et al. Development of an in vitro co-culture model to mimic the human intestine in healthy and diseased state. Toxicol In Vitro. 45 (Pt 1), 31-43 (2017).
  2. Barrila, J., et al. Three-dimensional organotypic co-culture model of intestinal epithelial cells and macrophages to study Salmonella enterica colonization patterns. npj Microgravity. 3, 10(2017).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  4. Krause, S., et al. A novel 3D in vitro culture model to study stromal epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng Part C: Methods. 14, 261-271 (2008).
  5. Urzì, O., et al. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).
  6. Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. J Biomed Biotech. 2011, 852419(2011).
  7. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J. R. Soc. Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  8. Liu, R., et al. From 2D to 3D co-culture systems: A review of co-culture models to study the neural cells interaction. Int J Mol Sci. 23 (21), 13116(2022).
  9. Vis, M. A. M., Ito, K., Hofmann, S. Impact of culture medium on cellular interactions in in vitro co-culture systems. Front Bioeng Biotechnol. 8, 911(2020).
  10. Kook, Y. M., Jeong, Y., Lee, K., Koh, W. G. Design of biomimetic cellular scaffolds for co-culture system and their application. J Tissue Eng. 8, 2041731417724640(2017).
  11. Stocco, T. D., et al. Nanofibrous scaffolds for biomedical applications. Nanoscale. 10 (26), 12228-12255 (2018).
  12. Gao, X., Han, S., Zhang, R., Liu, G., Wu, J. Progress in electrospun composite nanofibers: composition, performance and applications for tissue engineering. J Mater Chem B. 7 (45), 7075-7089 (2019).
  13. Kim, T. E., et al. Three-dimensional culture and interaction of cancer cells and dendritic cells in an electrospun nano-submicron hybrid fibrous scaffold. Int J Nanomedicine. 11, 823-835 (2016).
  14. Oh, Y. S., Choi, M. H., Shin, J. I., Maza, P. A. M. A., Kwak, J. Y. Coculturing of endothelial and cancer cells in a nanofibrous scaffold-based two-layer system. Int J Mol Sci. 21 (11), 4128(2020).
  15. Lee, S. J., et al. Bacterial infection-mimicking three-dimensional phagocytosis and chemotaxis in electrospun poly(ε-caprolactone) nanofibrous membrane. Membranes. 11 (8), 569(2021).
  16. DeLeon-Pennell, K. Y., Barker, T. H., Lindsey, M. L. Fibroblasts: The arbiters of extracellular matrix remodeling. Matrix Biol. 91-92, 1-7 (2020).
  17. Lühr, I., et al. Mammary fibroblasts regulate morphogenesis of normal and tumorigenic breast epithelial cells by mechanical and paracrine signals. Cancer Lett. 325 (2), 175-188 (2012).
  18. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J Cell Sci. 119 (19), 3901-3903 (2006).
  19. Tran, T. X. T., et al. Synthetic Extracellular Matrix of Polyvinyl Alcohol Nanofibers for Three-Dimensional Cell Culture. J Funct Biomater. 15, 262(2024).
  20. Oun, A. A., Shin, G. H., Rhim, J. -W., Kim, J. T. Recent advances in polyvinyl alcohol-based composite films and their applications in food packaging. Food Packaging Shelf Life. 34, 100991(2022).
  21. Zhang, W., et al. Applications of poly(caprolactone)-based nanofibre electrospun scaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (4), 414-442 (2021).
  22. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  23. Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From cell-ECM interactions to tissue engineering. J Cell Physiol. 199 (2), 174-180 (2004).
  24. Malakpour-Permlid, A., et al. Identification of extracellular matrix proteins secreted by human dermal fibroblasts cultured in 3D electrospun scaffolds. Sci Rep. 11, 6655(2021).
  25. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  26. Torras, N., García-Díaz, M., Fernández-Majada, V., Martínez, E. Mimicking epithelial tissues in three-dimensional cell culture models. Front Bioeng Biotechnol. 6, 197(2018).
  27. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  28. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
  29. Luo, L., Liu, L., Ding, Y., Dong, Y., Ma, M. Advances in biomimetic hydrogels for organoid culture. Chem Commun. (Camb). 59 (64), 9675-9686 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Elektroeğirme TekniğiPolivinil Alkol MembranPolikaprolakton MembranFibroblast KokültürüParakrin SinyallemeKonfokal MikroskopiTaramalı Elektron Mikroskopi
Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.