Yöntem makalesi

Atomik Kuvvet Mikroskobundan Türetilmiş Kuvvet Haritalarından Doğal Murin Pulmoner Bazal Membranlarının Young Modülünün Çıkarılması

DOI:

10.3791/67784

⸱

31 Ocak 2025

 ,  ,  , 
1Munich University of Applied Sciences, 2Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine - CANTER, Munich University of Applied Sciences, 3Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Medical Faculty, University of Freiburg, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Medical Center, University of Freiburg

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, murin akciğer dokusunun kriyoseksiyonlarının nasıl hazırlanacağını, atomik kuvvet mikroskobu kuvvet haritası deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini ve doğal murin pulmoner bazal membranının Young modülünü belirlemek için verilerin nasıl analiz edileceğini görselleştirir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), birkaç on nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip bir numunenin mekanik özelliklerinin karakterizasyonuna izin verir. Memeli hücreleri, yakın mikro çevrelerinin mekaniğini algıladığı ve tepki verdiği için, yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip dokuların biyomekanik özelliklerinin karakterizasyonu, çeşitli gelişimsel, homeostatik ve patolojik süreçleri anlamak için çok önemlidir. Kabaca 100 - 400 nm kalınlığında ince bir hücre dışı matriks (ECM) alt yapısı olan bazal membran (BM), tümör ilerlemesinde ve metastaz oluşumunda önemli bir rol oynar. Bu kadar ince bir ECM altyapısının Young modülünü belirlemek zor olsa da, BM'nin biyomekanik verileri, BM'nin hücre davranışını nasıl etkilediğine dair temel yeni bilgiler sağlar ve buna ek olarak değerli tanı potansiyeli sunar. Burada, metastaza yatkın majör organlardan biri olan murin akciğer dokusunda BM mekaniğini değerlendirmek için görselleştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Akciğer dokusunda endotel ve epitel hücre tabakaları arasında yer alan BM'nin Young modülünü belirlemek için verimli bir iş akışı tarif ediyoruz. Adım adım talimatlar, murin akciğer dokusunun dondurulmasını, kriyoseksiyonu ve doku kesitleri üzerinde AFM kuvvet haritası kaydını içerir. Ek olarak, şirket içinde geliştirilmiş, kullanıcı dostu bir AFM veri analiz yazılımı olan CANTER Processing Toolbox'ı kullanarak yarı otomatik bir veri analizi prosedürü sunuyoruz. Bu araç, kaydedilen kuvvet haritalarının otomatik olarak yüklenmesini, piezo uzatma eğrilerine karşı kuvvetin kuvvete karşı girinti eğrilerine dönüştürülmesini, Young modülünün hesaplanmasını ve Young modül haritalarının oluşturulmasını sağlar. Son olarak, uzamsal bir filtreleme aracı kullanılarak pulmoner BM'den türetilen Young modül değerlerinin nasıl belirleneceğini ve izole edileceğini gösterir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AFM kuvvet haritaları, nanometre uzamsal çözünürlük ve piconewton kuvvet duyarlılığı 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ile çok çeşitli biyolojik numunelerin nanomekanik özelliklerini belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir teknik olarak ortaya çıkmıştır.. AFM ölçümlerinin fizyolojik koşullar altında biyolojik örneklere uygulanmasına ilişkin öncü araştırmalar P. Hansma ve meslektaşları 13,14,15,16,17,18,19,20 tarafından yapılmıştır. Daha sonra, tek tek moleküllerin21, canlı hücrelerin ve hücre iskeletlerinin 9,10,22,23,24,25,26, doku ve doku kesitlerinin 6,8,11,27,28, 29,30,31 ve biyolojik hidrojeller 3,4,32. Araştırmamızda, biyolojik ve kimyasal bağların 18,33,34,35,36,37 mekanik özelliklerini incelemek ve tek tek hücrelerin 38,39,40 nanomekanik özelliklerini ölçmek için AFM'yi kullandık. Ayrıca, büyüme plakası kıkırdağı8 ölçümleri, kollajen mimarisinin ve hücre dışı matrisin (ECM) Young modülünün doğrudan kondrosit bölünmesini ve sonuç olarak embriyonik gelişim sırasında murin büyüme plakasının büyüme yönünü göstermiştir. Ayrıca eklem kıkırdağı 2,41,42,43,44,45,46,47'de kıkırdak dejenerasyonu ve osteoartrit ile ilişkili değişiklikleri araştırdık.

Son yıllarda, çok sayıda AFM araştırması hem sağlıklı hem de patolojik akciğer dokusunun mekanik özelliklerini incelemiştir 48,49,50,51,52. Bununla birlikte, bu araştırmalar öncelikle BM gibi spesifik doku bileşenlerine odaklanmadan, genel doku mekaniğini inceledi. BM, memeli organlarının ve nöronlar, kaslar, adiposit dokuları ve kan damarları gibi doku yapılarının çoğunu kaplayan özel bir ECM yapısının ince bir tabakasını (insanlarda 100 nm - 400 nm) oluşturur. Murin pulmoner BM'nin mekanik özelliklerinin, meme ve böbrek kanseri hastalarında daha yumuşak bir BM'nin daha yüksek bir sağkalım olasılığı ile ilişkili olacak şekilde metastaz oluşumu sırasında çok önemli bir rol oynadığını keşfettik53. Ayrıca, bu araştırma, salgılanan hücre dışı matris proteini netrin-4'ün, BM40 içindeki hemen hemen tüm laminin ağlarında bulunan önemli bir bileşen olan laminin γ1 ile stokiyometrik 1: 1 etkileşim yoluyla BM'nin Young modülünü azalttığını ortaya koydu.

Burada, 100 - 200 nm ince murin pulmoner BM'nin Young modülünü (EBM) belirlemek için geliştirdiğimiz protokolün görselleştirmesini sunuyoruz. BM'nin Young modülü, sertliğinin bir ölçüsüdür ve doğrusal bir elastik deformasyon54 sırasında ortaya çıkan eksenel gerilmeye (yer değiştirme) karşı gerilmenin (birim alan başına kuvvet) oranı olarak tanımlanır, bu durumda, BM'nin girintili AFM ucu tarafından küçük bir sıkıştırılması. Bir AFM deneyinde, kuvvet ve yer değiştirme (girinti derinliği), AFM konsol sapmasından ve konsol konumundan elde edilebilir ve Young modülü (gerilim-gerinim ilişkisi), girinti ucunun geometrisini açıklayan uygun bir elastik model kullanılarak (bu durumda değiştirilmiş bir Hertz Model55) elde edilen kuvvete karşı girinti eğrisinden çıkarılabilir. Ana adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Başlangıçta, bu protokol, murin akciğer dokusu örneklerinin OCT bileşiğine hazırlanması ve gömülmesi için metodolojiyi tanımlar (bkz. adım 1), böylece AFM kuvvet haritalarını kullanarak BM sertliğinin belirlenmesini sağlayan sonraki kriyoseksiyon prosedürünü (adım 2) kolaylaştırır. Burada sunulan, tek taraflı ve çift taraflı bant kullanan kriyoseksiyon tekniği, akciğer dokusunun fiksasyon gerektirmeden ve kesitin çözülmeden kesit alınmasını sağlar. BM sertliğini değerlendirmek için uygun verileri toplamak için ayrıntılı AFM prosedürü, protokolün üçüncü bölümünde özetlenmiştir. Protokolün bir sonraki bölümünde, üretilen kuvvet hacimlerinin şirket içinde geliştirilen MATLAB tabanlı bir yazılım olan CANTER Processing Toolbox56 kullanılarak otomatik olarak nasıl analiz edilebileceğini (adım 4.1) açıklıyoruz. Bu adımda, Young modülü, girinti geometrisi için düzeltilen modifiye edilmiş bir Hertz modeli, bu durumda dört kenarlı bir piramit55 takılarak kaydedilen her kuvvet-girinti eğrisinden çıkarılır. Son olarak, adım 4.2 ve 4.3'te, alveolar duvarın tüm doku bölmelerini içeren kuvvet haritasında elde edilen kapsamlı Young modül değerleri setinden bazal membrana (BM) özgü Young modül değerlerini çıkarmak için geliştirilen araç kutusunun Uzamsal Filtreleme Aracı ve R2 Filtreleme Aracının nasıl uygulanacağını açıklıyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan numunelerinin işlenmesine ilişkin tüm prosedürler, Danimarka Hayvan Refahı Yasasına göre Danimarka Çevre ve Gıda Bakanlığı Hayvan Deneyleri Konseyi (izin numarası 2017-15-0201-01265) tarafından onaylanmıştır. Bu protokolü göstermek için 13 haftalık bir erkek C57BL/6 fare kullandık.

DİKKAT: Aşağıdaki protokolde, birkaç adım doku örneklerinin işlenmesini gerektirir. Biyolojik numuneleri kullanırken daima yeterli eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.

1. Numune hazırlama

  1. Taze hasat edilmiş bir fare akciğerini tek kullanımlık 15 x 15 x 5 mm'lik bir taban kalıbına yerleştirin. 0,9 mm'lik bir iğneye sahip 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, iğneyi aynı anda geri çekerken numuneye 1: 1 (hacim-hacim) optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamı ile fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi oranını dikkatlice enjekte edin. Numuneyi küçük bir cerrahi cımbızla güvenli bir şekilde tutarken enjeksiyonu oda sıcaklığında gerçekleştirin. Numune şiştiğinde enjeksiyon tamamlanmış kabul edilir ve gözle görülür miktarda sızıntı gözlenir.
  2. Numune tamamen daldırılana kadar kalıba saf OCT doldurun. Tüm akciğerin tamamen donmasını sağlamak için, numuneyi en az 4 saat boyunca -80 °C sıcaklıkta saklayın.
    NOT: Bu noktada numune -80 °C'de en az 2 yıl saklanabilir. Üreticinin OCT için belirttiği spesifikasyonlara göre, gömülü dokunun saklama süresi 10 yıldan fazladır. Genellikle 4 ayı aşan süreler boyunca saklanması gereken numunelerin, nemin numuneye emilmesini önlemek için şeffaf bir filme sarılması önerilir.

2. Gömülü akciğer örneğinin kriyoseksiyonu

  1. Kriyotom odasının sıcaklığını -17 °C'ye ayarlayın, çünkü bu, akciğer dokusu numuneleri için en uygun kesme sıcaklığıdır. Bu özellik mevcutsa, kesme aşaması ünitesinin sıcaklığını -22 °C'ye ayarlayın. Bu, tüm kesit alma işlemi boyunca numune yüzeyinde optimum kesme sıcaklığının korunmasını sağlamaya hizmet eder.
  2. Sıkı ve kabarcıksız yapışmayı sağlamak için 15 mL'lik bir santrifüj tüpünü bant üzerinde yuvarlamadan önce cam sürgünün ortasına dikkatlice yerleştirilmiş çift taraflı yapışkan bant kullanarak 40 mikroskop lamı hazırlayın. Çift taraflı yapışkan bandın uzunluğunun, numuneyi içeren OCT bloğunun genişliğine kabaca eşit olduğundan emin olun. Buzlu kenarlı mikroskop slaytları, numune bilgilerini ve bölüm numarasını içeren bir kalemle etiketlemeye izin verir.
  3. Hazırlanan mikroskop slaytlarını bir slayt kutusuna yerleştirin. Daha sonra, slaytları tutan kutuyu soğutmak için kriyotom odasına yerleştirin.
    NOT: Slaytların soğutulması, bölümleri alırken numunenin mekanik özelliklerini tehlikeye atacak bir donma-çözülme döngüsünün oluşmasını önler.
  4. Her biri donmuş numune bloğu ile kabaca aynı boyutta olan birden fazla tek taraflı yapışkan bant hazırlayın.
  5. Numune tutucunun iç iki halkasını OCT ortamı ile doldurun. Numuneyi, mümkün olduğunca düz olduğundan emin olarak, numune tutucunun üzerindeki OCT ortamı içine yerleştirin. Daha sonra, OCT ortamı tamamen katılaşana ve numune tutucuya sıkıca sabitlenene kadar numune tutucuyu yaklaşık 10 dakika kriyotom odası içine yerleştirin.
  6. Numuneyi taşıyan tutucuyu kriyotomun kesme aşaması ünitesine takın. OCT bloğunun yüzeyine paralel olarak hizalanmış bir kesme düzlemi oluşturmak için kesme aşamasının eğimi ve bıçağın konumu gibi kriyotomun tüm temel bileşenlerini cihazın kullanım kılavuzuna göre ayarlayın.
  7. Kesit kalınlığını 50 μm'ye ayarlayarak numunenin ilk kırpılmasını gerçekleştirin ve doku slaytlarının toplanması için numune içinde istenen konuma (genellikle akciğer örneğinin yüzeyinden yaklaşık 500 μm içinde) ulaşana kadar kesmeye başlayın. Kriyotomun kesit kalınlığını, doku kesitlerinin istenen kalınlığına karşılık gelen 15 μm'ye ayarlayın.
    DİKKAT: Kriyotom gibi bir kesici alet kullanırken dikkatli olmak çok önemlidir. Kişisel güvenliği sağlamak için üreticinin güvenlik yönergelerine uyun ve parmaklarınızı bıçaktan uzak tutun.
  8. Başparmağınızla sıkı bir baskı uygulayarak numuneye bir parça tek taraflı yapışkan bant yapıştırın. Önceden, başparmağınızı kriyotomun hazne duvarına birkaç saniye tutarak soğuduğundan emin olun.
    NOT: Bant, numuneye sıkıca uygulanmalıdır, çünkü herhangi bir yapışma eksikliği, kesit alma sırasında bandın dokudan ayrılmasına neden olabilir.
  9. Kriyotom ile 15 μm'lik bir doku kesiti oluşturun. Kesme işlemi sırasında bölümü yönlendirmek ve yapışkan bandın numuneden ayrılmasını önlemek için bir fırça kullanın. Doku bölümünün pürüzsüz bir yüzeyi için kesme hızının yavaş ve tutarlı kalması çok önemlidir.
  10. Önceki adımda oluşturulan bölüm şimdi bant yukarı bakacak şekilde bıçak bloğu üzerinde düz bir şekilde uzanır. Slayt kutusundan çift taraflı bantla soğutulmuş mikroskop slaytlarından birini kullanın ve almak için bölüme sıkıca bastırın. Ardından, şimdi bölümü taşıyan mikroskop lamını tekrar slayt kutusuna yerleştirin.
    NOT: Mikroskop lamını ve kesiti tutarken, kesme prosedürü sırasında bölümün çözülmesini önlemek için bunları her zaman kriyotom odası içinde tuttuğunuzdan emin olun.
  11. Gerekli sayıda bölüm, yani 40 toplanana kadar önceki üç adımı tekrarlayın.
  12. Bittiğinde, kapağı sürgülü kutunun üzerine koyun ve kuru buz üzerinde -20 °C'lik bir dondurucuya aktarın. Son olarak, kullanılmış tüm öğeleri dezenfekte ederek ve kriyotom odasındaki UV ışığını açarak kriyotomu temizleyin.
    NOT: Protokol bu noktada duraklatılabilir. AFM ölçümleri yapılana kadar numuneleri -20 °C sıcaklıkta saklayın. Bölümler ve OCT ortamı için önerilen saklama süresi 6 haftayı geçmemelidir. Bu zaman diliminin ötesinde, kesitler ve OCT ortamı, önemli yüzey alanları ve nemi emme eğilimlerinin bir sonucu olarak dondurucu yanığına benzeyen değişiklikler gösterebilir.

3. Bir akciğer bölümünün AFM kuvvet haritaları

NOT: Bu protokol için, akciğer bölümlerinin kuvvet-yer değiştirme eğrilerini kaydetmek için JPK NanoWizard 4XP (AFM) ve Bruker'in motorlu aşaması, Leica'nın DMi8'i (ters optik mikroskop) ile birleştirildi.

  1. AFM'yi ayarlama
    1. AFM kurulumunun gerekli tüm cihazlarını açın (örn. bilgisayar, AFM kontrolörü, titreşim yalıtım tablosu, optik mikroskop vb.).
    2. AFM kontrol yazılımını başlatın. Deney Seç genel bakışında, QI Gelişmiş Görüntüleme modunu seçin. Ek olarak, deney verilerinin ve kalibrasyon dosyalarının saklanması gereken konumu belirtin.
      NOT: QI Gelişmiş Görüntüleme uzantısına sahip değilseniz, alternatif bir seçenek olarak Temas Modu Kuvvet Eşleme modunu kullanın.
    3. Gözlemlenen belirli numune türü için uygun bir yay sabitine sahip bir konsol seçin. Yumuşak akciğer dokusu örnekleri için, piramidal uçlu ve 0,6 N/m'lik nominal yay sabiti ile Bruker'den MLCT Konsol F önerilir. Bir çip birden fazla konsol içeriyorsa (MLCT gibi), yalnızca ölçüm için kullanılan konsolun numune ile temas ettiğinden emin olmak için stereo mikroskop altında bir cımbız kullanarak çipten daha uzun konsolları çıkarın.
      NOT: Ölçüm için kullanılandan daha fazla numune ile temas halinde olan diğer konsollar, deney sırasında numunenin istenmeyen şekilde hareket etmesine ve hatta numunenin alttaki banttan ayrılmasına neden olabilir.
      DİKKAT: Mevcut veya sonraki adımda cımbızla ölçüm için kullanılan konsol ile temas etmekten kaçının.
    4. Çipin konsol tutucusuna kurulumunu gerçekleştirin. Tutucuyu AFM kafasına yerleştirin. AFM kafasını, ters çevrilmiş optik mikroskop üzerinde bulunan s'ye yerleştirin.tage. Optik kol yolunu kullanım kılavuzunda belirtildiği gibi hizalayın. Optik kol yolunun uygun şekilde hizalanması, lazer ışını başlangıçta ölçüm konsolunun ön ucuna yerleştirildiğinde ve ardından yansıyan lazer ışını segmentli fotodiyotun merkezine çarptığında elde edilir.
  2. Termal gürültü yöntemini kullanarak konsol kalibrasyonu57
    NOT: Konsolun kalibrasyonu, ters çevrilmiş optik kol hassasiyetinin (InvOLS) ve yay sabitinin belirlenmesini içerir. Kullanılan her konsolun ayrı ayrı kalibrasyonu gereklidir, çünkü konsollar için tipik olarak sağlanan nominal yay sabiti genellikle sadece kaba bir yaklaşımdır. Bir numunenin mekanik özelliklerinin, bu protokolde açıklanan gibi kaydedilmiş kuvvet eğrilerinden belirlendiği deneylerde, InvOLS'nin sert bir alt tabaka üzerinde temas tabanlı bir yöntemle doğrudan belirlenmesi esastır. InvOLS'u belirleyen alternatif yöntemler, örneğin konsolun geometrisinden türetilmesi gibi, yalnızca kaba bir yaklaşım sağlayabilir ve burada açıklanan uygulama türü için uygun değildir. Alternatif olarak, tedarikçinin tam yay sabitini sağladığı yerlerde konsollar kullanılıyorsa, InvOLS, Schiller ve diğerleri tarafından açıklanan bir prosedürle belirlenebilir.58.
    1. AFM'nin örnek aşamasına bir mikroskop lamı yerleştirin. Mikroskop lamı, InvOLS'un temas tabanlı tayini için sert alt tabaka görevi görür.
    2. AFM kafasını numune tablasına yerleştirdikten sonra, konsol tutucu ile mikroskop lamı arasında kalan boşluk sadece yaklaşık 1 - 2 mm olana kadar step motorları kullanarak kafayı indirin. PBS'yi konsol tutucunun yan tarafına uygulayın, aşağı akmasına ve uzun iğneli (0,9 mm x 70 mm) 1 mL'lik bir şırınga kullanarak tutucu ile mikroskop lamı arasındaki boşlukta sıvı bir menisküs oluşturmasına izin verin.
      NOT: Numunenin kuvvet hacmi ölçümleri için kullanılan tampon veya ortam gibi aynı sıvının kalibrasyon işlemi için de kullanıldığından emin olun.
    3. Yazılımda temas tabanlı bir kalibrasyon gerçekleştirmek için Veri Al sayfasına gidin ve Gelişmiş Görünüm seçeneğini seçin. Sağ üst köşede bulunan burger menü düğmesini kullanarak Kalibrasyon Yöneticisine erişin. Bu arayüzde, Method (Yöntem) olarak Contact-based'ı (Kişi tabanlı) seçin ve konsol adı olarak açılır menüden MLCT F konsolunu seçin. Ek olarak, ilgili giriş alanlarında Ayar Noktasını 1 V'a ve Tarama Sayısını 10'a ayarlayın.
    4. Veri Al sayfasında, sol taraftaki kontrol panelinde, otomatik yaklaşma prosedürü için 1 V'luk bir ayar noktası girin. Otomatik yaklaşımı başlatmak için kullanıcı arayüzünün sol üst köşesinde bulunan Mavi Aşağıyı İşaretleyen Ok düğmesine tıklayın. Yaklaşma bittiğinde ve konsol mikroskop lamı ile temas ettiğinde, Kalibrasyon Yöneticisi penceresindeki Kalibre Et düğmesine tıklayın.
      NOT: InvOLS ve konsol yay sabiti daha sonra 10 kuvvet eğrisinin yanı sıra termal gürültü yöntemi57 ile yay sabitini belirlemek için kullanılan termal güç spektral yoğunluğu (PSD) kaydedilerek otomatik olarak belirlenir. Otomatik kalibrasyon prosedürü tamamlandıktan sonra, takılan eğrinin, konsolun kaydedilen PSD'sinin normal modunu (ilk tepe noktası) doğru bir şekilde tanımladığını ve belirlenen yay sabitinin, konsol üreticisi tarafından verilen nominal yay sabiti ile aynı büyüklük sırasına sahip olduğunu görsel olarak kontrol edin. Durum böyle değilse, bağlantı aralığı, uyumun termal güç spektrumunun ilk zirvesine yakınsamasını ve temsil etmesini sağlamak için manuel olarak ayarlanmalıdır.
    5. Kalibrasyon bittikten sonra Kalibrasyon Yöneticisi penceresini kapatın. Kalibrasyon Yöneticisini kapattıktan sonra, önceden seçilmiş dizinde (bkz. adım 3.1.2) daha sonra veri analizi için gerekli olan belirlenen kalibrasyon sonuçlarını içeren bir kalibrasyon dosyası (*.tnd ascii dosyası) oluşturulur. Kalibrasyon değerlerini, veri analizi prosesi sırasında ileride başvurmak üzere, örneğin laboratuvar not defterinde belgeleyin.
      DİKKAT: Bu adımdan itibaren, konsol üzerindeki lazer konumunu değiştirmekten, AFM kafasındaki aynayı ayarlamaktan veya konsol tutucunun yerini değiştirmekten kaçının. Bu öğelerin değiştirilmesi InvOLS'yi etkileyecek ve kalibrasyon değerlerini geçersiz kılacaktır. Termal kaymayı telafi etmek için, AFM kafasının segmentli fotodiyotunun konumunu ayarlayın.
  3. Akciğer bölümündeki bir alveol duvarının analizi
    1. Dondurucudan değerlendirmek için numune slaytını alın. Tüm OCT ortamı berraklaşana kadar numunenin oda sıcaklığında yaklaşık 1 dakika çözülmesine izin verin. Daha sonra, yeniden sulandırmak için akciğer dokusu bölümüne bazı PBS damlacıkları ekleyin.
    2. Akciğer dokusu bölümünü taşıyan mikroskop lamını numune tablasına yerleştirin. AFM kafasını s'ye geri takınamp ve konsol s'nin yaklaşık 1 mm üzerine yerleştirilene kadar kafayı indirin.ample. Doku bölümü ile konsol tutucu arasında sıvı bir menisküs oluşana kadar 0,9 mm x 70 mm'lik bir iğne ile birleştirilmiş 1 mL'lik bir şırınga kullanarak konsol tutucunun yan tarafına bir miktar ek PBS ekleyin.
    3. Kullanıcı arayüzünün sağ üst köşesindeki İngiliz Anahtarı Simgeli Düğmeye tıklayarak Ayarlar Yöneticisine gidin. Ayarlar Yöneticisi'nde aşağıdaki genel ayarları yapın. Yaklaşma Ayarları bölümünde, Hedef Yüksekliği 4 μm olarak ayarlayın. Ardından, Geçerli Mod Ayarları bölümünde, Gelişmiş Geri Bildirim Ayarları'na ilerleyin ve Çarpanı 1 olarak ayarlayın. Son olarak, Kuvvet Ayarları alt bölümünde, yine Geçerli Mod Ayarları bölümünde bulunan, seçeneği seçin Geri çekilmiş piezo itibaren Mod sonunda açılır menü.
    4. Sağlam bir alveol duvarını tanımlamak ve ona gitmek için ters çevrilmiş optik mikroskobu kullanın. Sağlam bir duvar, parlak alan görüntüsünde koyu ve pürüzsüz kenarlarla karakterize edilir. (bkz. Şekil 2A-B).
      NOT: Parlak alan görüntüsünün AFM kontrol yazılımına aktarılması, mümkün olduğunda, konsolun belirli bir alveolar duvara yönlendirilmesine ve bunun üzerindeki bir kuvvet veya QI haritasının doğru bir şekilde yakalanmasına yardımcı olabilir. JPK SPM yazılımında bu işlev Doğrudan Yer Paylaşımı olarak adlandırılır.
    5. Kullanılan AFM'ye, kullanılan konsola ve gözlemlenen örneğe göre sol kontrol panelindeki kuvvet-girinti eğrileri için parametreleri ayarlayın. Bruker'den NanoWizard 4XP ve MLCT Cantilever F için aşağıdaki parametreleri öneriyoruz: Ayar noktası = 5 nN; Z uzunluğu = 8 μm; z hızı = 300 μm/s.
      NOT: Önerilen 8 μm'lik z uzunluğu oldukça büyüktür. Bu, akciğer dokusunun özelliklerine atfedilir. Akciğer dokusunun tipik olarak oldukça yumuşak olduğu göz önüne alındığında, girinti derinliği, 5 nN'lik nispeten mütevazı bir ayar noktasıyla bile belirli noktalarda 4 μm'ye kadar ulaşabilir. Ucun numune ile temas halinde olmadığı taban çizgisinin, kuvvet-girinti eğrisinin en az yarısını oluşturduğunu garanti etmek için, eğrinin toplam uzunluğunun 8 μm olarak ayarlanması önerilir. Bu, daha sonra eğri analizini önemli ölçüde basitleştirecektir. Diğer biyo-AFM'ler için, bu parametreler de uygulanabilir olmalıdır, ancak maksimum girinti kuvvetini belirleyen ayar noktası gibi belirli parametreler için isimlendirme farklı üreticiler arasında farklılık gösterebilir. AFM sistemi burada verilen yüksek dikey hızı elde edemiyorsa, AFM üreticinizin tavsiyesine göre z hızını düşürmeniz gerekir.
      DİKKAT: Sonuçların karşılaştırılabilirliğini sağlamak için, tüm deneylerde aynı z-yaklaşım hızlarını kullanmak esastır.
    6. İlk genel bakış kuvvet haritasının konumunu ve boyutunu ayarlayın, bir hava tarafından diğerine uzanan tüm alveol duvarını kapsadığından emin olun. Murin akciğer dokusu örnekleri için genellikle 20 μm x 20 μm ile 30 μm x 30 μm arasında bir boyut yeterlidir. Haritanın belirli boyutundan bağımsız olarak, piksel sayısını (kaydedilen kuvvet eğrilerinin sayısına karşılık gelir) 50 x 50 olarak ayarlayın. Bu, her harita için 2.500 kuvvet-girinti eğrisinin oluşturulmasına yol açar ve bu da kuvvet haritasının eğim kanalındaki BM'yi tanımlamak için gerekli çözünürlüğü sağlar. (bkz. Şekil 2C-D).
    7. Genel bakış haritasını kaydettikten sonra, kuvvet haritasının yükseklik ve eğim kanalını inceleyin. Yükseklik kanalı, alveolar duvarın sağlam olduğunu gösteriyorsa (bkz. Şekil 2D) ve eğim kanalındaki BM'yi, epitel ve endotelin iki tabakası arasında yer alan açıkça tanımlanmış parlak bir çizgi (bkz. Şekil 2C,E) olarak ayırt etmek mümkünse, BM üzerinde 3 μm x 3 μm veya 4 μm x 4 μm boyutunda daha odaklanmış bir kuvvet haritası yakalayın. Pikselleri 50'de tutun x 50 eğri.
      NOT: Bu prosedür daha yüksek bir harita çözünürlüğüne yol açar ve özellikle BM için daha fazla sayıda Young modülü değerinin kaydedilmesine izin verir (bkz. Şekil 2E-F). Ayrıca, bu, BM ve çevresindeki dokular arasında daha doğru bir ayrım sağlar ve sonraki uzamsal filtreleme işleminin hassasiyetini artırır. Genel bakış haritasının kanalları çökmüş veya yırtılmış bir duvar gösteriyorsa, konsol numuneye sadece uçla değil, aynı zamanda numuneye temas etmesinden kaynaklanan artefaktlar veya eğim kanalında tanımlanabilir bir BM yoksa, BM'nin artefaktsız bir değerlendirmesine sahip bir duvar tanımlanana kadar doku bölümündeki başka bir duvara gider.
      İstenilen alveol duvarı sayısı değerlendirilene kadar aynı akciğer örneğinin diğer bölümlerinde önceki adımları (3.3.6 ve 3.3.7) tekrarlayın. Sağlam sonuçlar elde etmek için her akciğer örneği için en az dört duvar önerilir59.
    8. Ölçüm tamamlandıktan sonra, numune ve PBS ile temas eden tüm ekipman ve malzemeleri temizleyin. Numuneye artık ihtiyaç duyulmuyorsa, otoklavlanabilir bir cam atık kabına atın. Kaydedilen tüm verileri kaydedin ve AFM kontrol yazılımını ve bilgisayarı kapatın. Son olarak, kullanılan tüm elektrikli cihazları kapatın.
      NOT: Bu noktada protokol duraklatılabilir. Deneysel veriler kaydedilir ve daha sonraki bir zaman noktasında analiz edilebilir.

4. Veri analizi

  1. Kuvvet-girinti eğrilerinin analizi
    NOT: Kuvvet Eğrisi Analizi uygulamasının ayrıntılı bir kılavuzu burada bulunabilir: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/2a.-Force-Curve-Analysis.
    1. MATLAB'da CANTER İşleme Araç Kutusu56'yı başlatın ve Kuvvet Eğrisi Analizi uygulamasını açın.
      NOT: Toolbox, bu bağlantıyı izleyerek GitHub deposundan indirilebilir: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool. Yazılımın nasıl kurulacağına ve MATLAB kullanılarak nasıl başlatılacağına dair kapsamlı bir kılavuz içeren README.md dosyası, GitHub deposunda mevcuttur. Araç Kutusu'nda yer alan her uygulama hakkında daha fazla bilgi, https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki adresindeki ilgili wiki'de bulunabilir.
    2. Yüksek çözünürlüklü (3 μm x 3 μm veya 4 μm x 4 μm) kuvvet haritasını Dosya Seç düğmesine tıklayarak, kuvvet haritasının kaydedildiği konuma giderek, üzerine çift tıklayarak ve ardından uygulamanın kullanıcı arayüzündeki Veri Yükle düğmesine tıklayarak yükleyin.
    3. Önceki protokol adımında seçilen kuvvet haritasını kaydetmek için kullanılan konsol için belirlenen kalibrasyon değerlerini (InvOLS ve yay sabiti) (bkz. adım 3.2) isteyen bir açılır pencere belirir. Kalibrasyon değerlerini ilgili düzenleme alanlarına girin. Adım 3.2.4 sırasında belgelenmemişlerse, kalibrasyon değerlerini de içeren otomatik olarak oluşturulan kalibrasyon dosyasına bakın. Uç-numune ayrımının hesaplanması gerekip gerekmediği sorusu için varsayılan seçenek olan evet'i koruyun. Ardından, devam etmek için Gönder düğmesine tıklayın.
    4. Girintili numune için girinti geometrisini ve Poisson oranını seçmeye izin veren ikinci bir açılır pencere belirir. Kullanılan MLCT konsolları için, uç geometrisi olarak Dört kenarlı piramidi seçin ve kenara yarım açı için 17.5° girin (her ikisi de varsayılan değerlerdir). Sıkıştırılamaz bir malzemeyi temsil eden 0,5'lik varsayılan Poisson oranını kullanın. QI haritasının yükleme prosedürüne devam etmek için Gönder düğmesine tıklayın.
      NOT: Yükleme prosedürü sırasında, kaydedilen sapma-yer değiştirme eğrileri (AFM'nin ham verileri), sağlanan kalibrasyon değerlerine dayalı olarak kuvvet-girinti eğrilerine dönüştürülür. Bireysel dönüşüm adımlarının ve ilgili denklemlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması için, Hartmann ve ark.59'un ek bilgilerine bakın.
    5. Yükleme işleminin tamamlanmasının ardından, kuvvet haritasının ilk kuvvet eğrisi ekranda görüntülenecektir. Taban çizgisi düzeltme modu Ofset + Eğim'in seçili olduğundan emin olun. Bu mod, kuvvet indüksiyon eğrisinin taban çizgisini otomatik olarak algılar ve eğimi ve dikey ofseti sıfır olarak düzeltir. Ek olarak, İletişim Noktası Bulucu için algoritma olarak Hertz modeli aracılığıyla seçeneğini belirleyin ve bu seçenek için belirlenen düzenleme alanında %20'lik bir değer kullanın. Bu algoritma, özellikle yumuşak doku numuneleri üzerinde kaydedilen kuvvet-girinti eğrilerindeki temas noktasını tespit etmek için çok uygundur. Son olarak, ilgili düzenleme alanındaki sığma derinliğini 1,5 μm olarak ayarlayın.
      NOT: Mikroskop lamının sertliğinin ortaya çıkan Young modülünü etkilememesini sağlamak için, maksimum uyum derinliğinin doku kesiti kalınlığının 10'ının %60'undan fazla olmayan bir değere ayarlanması önerilir. Düzeltme algoritmaları hakkında daha fazla ayrıntı için, Hartmann ve ark.59'un ek bilgilerine bakın.
      DİKKAT: Sonuçların karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için deneyler boyunca aynı uyum derinliğini kullanın.
    6. Değiştirilmiş Hertz modelinin uyumunu QI haritasının tüm kuvvet-girinti eğrilerine uygulamak için, Tümüne Koru ve Uygula düğmesine tıklayın. Analiz sırasında her bir kuvvet eğrisinin görüntülenmesi gerekip gerekmediğini soran bir iletişim penceresi açılır. Eğrileri göstermeyerek, işlem hızı biraz hızlanır.
    7. Son kuvvet eğrisi analizinin tamamlanmasının ardından, uyum sonuçlarının kaydedilmesi gerekip gerekmediğini soran bir pencere açılır. Sonuçları her ikisinde de kaydetmek için. tsv (sekmeyle ayrılmış değerler) ve .xlsx (Excel) dosya biçimleri için Evet'e tıklayın ve sonuç dosyaları için bir ad girin. Ek olarak, kullanılan kalibrasyon değerleri, seçilen uyum modeli, seçilen temas noktası algılama algoritması, uyum aralığı ve diğer ilgili bilgiler gibi eğrilerin analiziyle ilgili tüm ayrıntıları içeren *.meta_data dosya uzantısına sahip bir metin dosyası kaydedilir.
    8. Ana pencerenin sağ üst köşesindeki Çarpı Simgesine tıklayarak Kuvvet Eğrisi Analizi uygulamasını kapatın.
  2. QI harita sonuçlarının uzamsal filtrelenmesi
    NOT: Uzamsal filtreleme adımı, daha fazla analiz için BM'den kaynaklanan QI haritalarının yalnızca Young modül değerlerinin dikkate alınmasını sağlar. Sonuç Filtreleme Aracı için ayrıntılı bir kılavuzu burada bulabilirsiniz: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/Result-Filtering-Tool.
    1. CANTER İşleme Araç Kutusu'nun uygulama seçim penceresindeki uygulamalar listesinden Sonuç Filtreleme Aracı'nı seçin ve Uygulamayı Başlat düğmesine tıklayarak uygulamayı başlatın.
    2. Uygun sonuçları yüklemek için, Sonuç Filtreleme Aracı kullanıcı arayüzünün üst menü çubuğundaki Aç'a tıklayın. Sonraki açılır pencerede, JPK Haritalar sekmesinde bulunan ilk Ayarla düğmesini bulun ve kuvvet eğrisi analizinin sonuçlarını içeren .tsv dosyasını seçin (bkz. adım 4.1.6). İkinci Ayarla düğmesine tıklayın ve önceden seçilmiş .tsv dosyasına karşılık gelen QI harita dosyasını bulun. Ardından, harita verilerini yüklemek ve eğri analizi sonuçlarını zorlamak için Gönder'i tıklayın.
    3. Elde edilen Young modülü sonuçlarını bir harita görüntüsü olarak görüntülemek için üst Görüntülenen kanal açılır menüsünden Emodul seçeneğini seçin. Ayrıca, QI haritasının yüklenen Young modül değerlerinin dağılımını görselleştirmek için histogram grafiğinin altında bulunan Veri kanalı açılır menüsünden Emodul seçeneğini (henüz seçili değilse) seçin.
    4. Kullanıcı arayüzünün ortasında bulunan Manipülasyon akışı ok düğmesine tıklayın ve sağ tarafı gösterdiğinden emin olun. Görüntü filtresi açma/kapatma düğmesini, histogram eksenlerinin üzerinde bulunan filtre panelindeki Açık konumuna getirin. Filtre geometrisi açılır menüsünden Freehand seçeneğini seçin ve ardından Ekle düğmesine tıklayın.
    5. Üst kanal görüntüsünde, farenin sol tuşunu basılı tutarken BM'yi daire içine alarak filtre maskesini çizin. BM, Young modül haritasında, komşu yumuşak dokuya kıyasla parlak (yüksek Young modül değerleri) bir yapı olarak tanımlanabilir (bkz. Şekil 3A). Maskeyi çizmeyi bitirdiğinizde, farenin sol tuşunu bırakın ve haritaya uygulanacak maskeye çift tıklayın. Sağdaki histogram grafiği artık yalnızca yeşil renkle vurgulanan harita bölgeleri için Young modül değerlerini göstermektedir (varsayılan renk; bkz. Şekil 3C-D).
    6. Yalnızca maskelenmiş Young modül değerlerini içeren yeni bir .tsv sonuç dosyası oluşturmak için, kullanıcı arabiriminin üst menü çubuğunda Kaydet > Histogramı kaydet > Verileri kaydet seçeneklerini tıklatın. Alternatif olarak, histogram çizim eksenlerinin boş bir alanına sağ tıklayın ve bağlam menüsünden Verileri kaydet'i seçin.
    7. .tsv dosyasına hangi sonuçların yazılacağını soran açılır pencerede Tümünü Seç'e tıklayın. Ardından, Tamam düğmesine tıklayarak seçimi onaylayın. Ardından, kaydet iletişim kutusuna .tsv dosyası için bir ad girin, istediğiniz kaydetme konumunu seçin ve son olarak filtrelenmiş sonuçları kaydetmek için Tamam'a tıklayın.
    8. Uygulamanın sağ üst köşesindeki Çarpı Simgesine tıklayarak Sonuç Filtreleme Aracını kapatın.
  3. R2 sonuçların filtrelenmesi
    NOT: Bu protokol adımı, modifiye edilmiş Hertz modelinin takıldığı kuvvet-girinti eğrisine iyi bir uyum gösterdiği durumlarda yalnızca Young modülü sonuçlarının dikkate alınmasını sağlar. R² Filtreleme Aracı için ayrıntılı bir kılavuzu burada bulabilirsiniz: https://github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki/R%C2%B2-Filtering-Tool.
    1. R² Filtreleme Aracını, CANTER İşleme Araç Kutusu'nun uygulama seçim penceresinin uygulamalar listesinden seçerek ve Uygulamayı Başlat'a tıklayarak başlatın.
    2. Kullanıcı arayüzünün üst menü çubuğuna gidin ve .tsv dosyasını aç'a tıklayın. Sonraki dosya yükleme iletişim kutusunda, önceki adım 4.2.5 sırasında kaydedilen BM'nin Young modülü sonuçlarını içeren .tsv dosyasını bulun ve çift tıklayarak seçin.
    3. .tsv dosyasında bulunan veri sütunlarının listesini sunan bir iletişim kutusu görüntülenir. Young modülü verilerini içeren sütun olarak Emodül'ü seçin. Ardından, R² verilerini isteyen ayrı bir liste kutusu iletişim kutusunda rsquare_fit'yi seçin. Yükleme prosedürü tamamlandıktan sonra, yüklenen Young modülü verileri ekranın sol üst tarafında bir histogram şeklinde görüntülenirken, R² veri dağılımı sağ üst taraftaki grafikte gösterilir.
    4. Grafik kullanıcı arayüzünün ortasında bulunan düzenleme alanına 0,96 girin. Girilen değeri kullanarak R² filtresini uygulamak için Verileri Filtrele düğmesine tıklayın. Bu eylem yalnızca R² değeri 0,96 veya daha yüksek olan sonuçları korur. Young modülü sonuçlarının filtrelenmiş dağılımları ve karşılık gelen R² değerleri, kullanıcı arayüzünün alt yarısında görüntülenir.
    5. Yalnızca tanımlanan R² filtre ölçütü olan > 0,96'yı karşılayan sonuçları içeren yeni bir .tsv dosyası oluşturmak için Üst menü çubuğundan Filtrelenmiş verileri kaydet'i seçin. Kaydedilen veriler artık, örneğin, problanan pulmoner BM için Young'ın modül dağılımını görselleştiren Histogram Çizim Aracı kullanılarak bir histogram olarak görüntülenebilir (bkz. Şekil 4A).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlam bir alveolar duvarın tanımlanması ve ölçülmesinden sonra, bu protokolün birincil sonucu, BM'nin filtrelenmiş Young modül değerleridir. Her doku kesitinde AFM ölçümü için uygun bir alveol duvarı bulmanın mümkün olmadığını unutmamak önemlidir. Deneysel gözlemlerimizde, murin akciğer örneklerinden elde edilen kriyoseksiyonların yaklaşık% 75'i ölçülebilir bir alveol duvarı sergiledi. Pulmoner bir BM'de Young modülünün uzamsal dağılımını doğru bir şekilde belirlemek için, 3 μm x 3 μm veya 4 μm x 4 μm'yi kapsayan kuvvet haritalarının kullanılmasını tavsiye ederiz. Bu yaklaşım, tipik olarak kalınlığı 100 nm - 200 nm arasında olan fare pulmoner BM'lerini incelemek için yeterli çözünürlüğü sağlar. Bu nedenle, deneysel yaklaşım, her bir kuvvet haritası için 50 x 50 kuvvet eğrisinin yakalanmasını içerir ve toplam 2.500 kuvvet eğrisi verir. Kuvvet haritası içinde, kuvvet eğrileri eşit aralıklarla yerleştirilmiştir. Bu, BM'nin Young modülüne ek olarak, BM'yi çevreleyen doku yapılarının küçük kuvvet haritalarında bile incelendiği anlamına gelir. Bu nedenle, yalnızca pulmoner BM'nin Young modülünü doğru ve seçici bir şekilde belirlemek için bu protokolde iki aşamalı bir filtreleme işlemi uyguladık.

Operatöre bağlı uzamsal filtrelemenin ilk filtreleme adımı, analiz edilen kuvvet haritasında yer alan toplam sonuç değerlerinin yaklaşık ila %'ini içeren, murin pulmoner BM'den kaynaklanan kuvvet eğrisi uyum sonuçlarını seçer. Bu ilk uzamsal filtrelemeden sonra, daha fazla analiz için yaklaşık 250 - 625 uyum sonucu korunur. Bir sonraki filtreleme adımı, yalnızca değiştirilmiş Hertz modeli tarafından yeterince tanımlanan kuvvet eğrilerinden kaynaklanan BM ile ilgili sonuçların dahil edilmesini sağlar. Bu nedenle, modifiye edilmiş Hertz modeli uyumunun belirleme katsayısı (R2) filtre kriteri olarak kullanılır. Ampirik deneyimlerimiz, R2 değerleri 0.96'dan yüksek olan sonuçların tutulmasının, bu protokole bağlı kalarak elde edilen uyum sonuçları için uygun olduğunu göstermektedir. R2 değerinin, kuvvet eğrisinin taban çizgisinin kalitesinden (düzgünlüğü) ve uzunluğundan, temas noktasının belirlenmesinden ve takılan modelin yakınsamasından önemli ölçüde etkilendiğine dikkat etmek önemlidir. Her iki filtreleme prosedürünün uygulanmasından sonra, tek bir alveolar duvarın BM'si için tipik olarak yaklaşık 100 ila 500 Young modülü değeri kalır.

Bu kalan Young modül değerlerinin BM'den dağılımı bir histogram kullanılarak görselleştirilebilir (Şekil 4A). Pulmoner BM'nin elde edilen Young modül değerlerinin, yalnızca61 pozitif değerlere ulaşabilen rastgele değişkenler için yaygın olarak gözlenen log-normal bir dağılımı takip ettiğine dikkat etmek önemlidir. Bu, Şekil 4B'deki QQ grafiği ile görselleştirilir. Sonuç olarak, log-dönüştürülmüş Young modülü (E) değerlerinin dağılımına normal (Gauss) bir dağılım uydurulabilir. Burada, E değerlerini dönüştürmek için doğal logaritma (ln) kullanılmıştır. Dağılımın tepe konumu (μ) ve standart sapma (σ) bu uyumdan çıkarıldı ve daha sonra aşağıdaki denklem kullanılarak EBM olarak gösterilen temsili Young modülünü elde etmek için yeniden dönüştürüldü:

figure-results-1

Yeniden dönüşümün ardından, standart sapma aralığının artık tepe değeri etrafında simetrik olmadığını unutmayın. Standart sapma aralığının negatif (σ-) ve pozitif (σ+) kenarları aşağıdaki ifadeler kullanılarak hesaplanabilir:

figure-results-2

figure-results-3

Bu denklemler, üstel fonksiyonun doğal logaritma62'nin ters fonksiyonu olmasının bir sonucudur.

Şekil 4A'daki histogramdan belirlenen tepe değeri μ = 9.31 ve standart sapma σ = 0.18 yeniden dönüştürüldükten sonra, temsili Young modül değeri EBM = 11.05 kPa'dır ve standart sapma aralığı [-1.82 kPa, +2.18 kPa]'dır. Alternatif olarak, dağılımın karakteristik parametrelerini belirlemek için dönüştürülmemiş Young modülü (E) değerlerinin histogramına bir log-normal dağılım takılabilir.

Hartmann ve ark.59'da ayrıntılı olarak gösterdiğimiz gibi, sağlam bir temsili sonuç elde etmek için fare başına en az dört duvarın analiz edilmesi önerilir. Bir fare için temsili Young modülü EBM'yi belirlemek için, dört duvarın tümünün log-dönüştürülmüş değerleri tek bir birleşik histogramda çizildi ve μ ve σ normal bir dağılıma uydurularak belirlendi. Daha sonra, μ ve σ, EBM'yi ve denek faresi için standart sapma aralığını almak için daha önce açıklandığı gibi yeniden dönüştürülür.

figure-results-4
Şekil 1: Bir murin pulmoner bazal membranının Young modülünü belirlemek için ana protokol adımlarına genel bakış. İlk adım, murin akciğerlerinin elde edilmesini ve hazırlanmasını ve ardından bunların gömülmesini içerir. Bu nedenle, akciğere OCT ortamı ve PBS'nin bir kombinasyonu enjekte edilir ve daha sonra tamamen OCT bileşiğine daldırılır. Daha sonra kriyotom ile kriyoseksiyon yoluyla 15 μm kalınlığında akciğer dokusu kesitleri elde edilir. Bu protokolde, kesme işlemi sırasında numuneleri yerinde sabitlemek için tek taraflı ve iki taraflı yapışkan bantların kullanılması sürecini detaylandırıyoruz. Daha sonra, BM'nin Young modülü değerleri, doku kesitleri üzerindeki AFM kuvvet haritası ölçümleri ile belirlenir. Kuvvet eğrisi analiz sürecinin tamamlanmasının ardından, ilgilenilen yapının, özellikle BM'nin (kuvvet haritasında yeşil renkle gösterilir ve log-dönüştürülmüş Young modül dağılımında nicelleştirilir) Young modülü sonuçlarını izole etmek için uzamsal ve R² filtreleme uygulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 2: Bir murin akciğer dokusu kesiti üzerinde gerçekleştirilen örnek bir kuvvet haritası AFM deneyi. (A) İki alveol arasında yer alan uygun sağlam alveol duvarlarının tanımlanmasını sağlayan bir murin akciğer dokusu kesitinin parlak alan mikroskobu genel bakış görüntüsü. Görüntünün sağ tarafında, AFM'nin üçgen şeklindeki MLCT konsolu F görülebilir. (B) Doku kesiti içinde seçilen bir duvarın büyütülmüş görünümü. (C) Alveol duvarının 50 x 50 kuvvet eğrisini içeren 15 x 15 μm'lik bir genel bakışın eğim ve (D) yükseklik kanalı. Eğim kanalında, BM, duvar içinde artan sertliğe sahip bir yapıyı gösteren parlak bir çizgi (beyaz ok) olarak tanımlanabilir. Yükseklik kanalı, duvarın bütünlüğünü doğrular ve herhangi bir yırtılma belirtisi göstermez. Genel bakış 15 x 15 μm haritasında BM'nin tanımlanmasının ardından, 50 x 50 kuvvet eğrilerine sahip daha küçük bir 4 x 4 μm harita (E: eğim kanalı, F: yükseklik kanalı) kaydedilir. Ölçek çubukları: (A) 200 μm ve (B-D) 25 μm. Gösterilen AFM görüntülerinin renk ölçeklerinin aralıkları şunlardır: (C) 2,36 - 9,29 nN/μm, (D) 0 - 3,38 μm, (E) 2,36 - 9,29 nN/μm (genel bakış görüntüsü) ve 2,42 - 8,37 nN/μm (daha küçük görüntü), (F) 0 - 3,38 μm (genel bakış görüntüsü) ve 0 - 1,99 μm (daha küçük görüntü), karanlıktan aydınlığa. Tüm AFM görüntüleri için doğrusal renk ölçekleri kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 3: Uzamsal filtreleme prosedürünün görselleştirilmesi. (A) Sonuçların uzamsal filtrelenmesini sağlamak için Sonuç Filtreleme Aracında gösterildiği gibi, kuvvet eğrisi analizinden elde edilen Young modülü haritası. BM, daha yumuşak doku bölmeleri ile çevrili parlak (yüksek Young modül değerleri) bir şerit olarak tanımlanabilir. (B) Filtrelenmemiş haritaya (A) karşılık gelen Young modül değerlerinin histogramı. (C) uzamsal filtre maskesinin (yeşil alan) uygulanmasından sonra, (D) histogram yalnızca BM olarak tanımlanan yeşil vurgulanan bölgeden Young modül değerlerini içerir. Histogramın sol tarafında gözlemlenebilen artık yumuşak değerlerin, sonraki R² filtreleme adımında elimine edilecek olan zayıf yakınsak uyumlara atfedilebileceğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 4: Bu protokol izlenerek alınan bir murin pulmoner BM'nin Young modül dağılımı. (A) Elde edilen BM Young modül değerlerinin log-normalize histogramı (N = 325). Normal bir dağılım (siyah düz çizgi) uydurularak, σ = 0.18 standart sapma ile μ = 9.31 ortalama değeri belirlenir. Yeniden dönüşümü takiben, bu, [-1.82 kPa, +2.18 kPa] asimetrik standart sapma aralığı ile EBM = 11.05 kPa'nın BM'sinin bir Young modülüne karşılık gelir. (B) QQ Logaritmize edilmiş BM Young modül değerlerinin kuantillerinin standart bir normal dağılımın kuantillerine karşı grafiği. Bu grafik, dağılımın sol ve sağ kuyruklarındaki bazı değerler dışında, elde edilen Young modül değerlerinin esas olarak log-normal dağılım gösterdiğini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BM'lerin mekanik özellikleri, tümör tomurcuklanması, hücresel farklılaşma, hücre hareketi ve kromatinin erişilebilirliği gibi çeşitli hücresel fonksiyonlar üzerindeki etkileri nedeniyle büyük ilgi görmüştür 53,63,64,65,66,67,68. Sonuç olarak, BM mekaniğini tutarlı ve ölçülebilir bir şekilde değerlendirme yeteneğinde karşılanmamış bir boşluk vardır. Bu protokol, AFM kullanıcılarının, vahşi tip veya genetiği değiştirilmiş farelerden elde edilen sağlıklı veya patolojik murin akciğer örneklerinden pulmoner BM'lerin Young modülünü belirlemelerini sağlamayı amaçlamaktadır. Kullanıcı dostu grafik kullanıcı arayüzü tabanlı MATLAB uygulaması CANTER Processing Toolbox56, AFM verilerinin aşağı akış analizini kolaylaştırır. Bu protokolün, akciğer bozuklukları için klinik tanı, yönetim veya yeni tedavi stratejilerinde ilerlemelere yol açabilecek çalışmalar yürüten diğer araştırmacılar için yararlı olması beklenmektedir.

Protokoldeki kritik adımlar, akciğer örneğinin kriyoseksiyonu sırasında, donma-çözülme döngüleri nedeniyle mekanik özelliklerin değişmesini önlemek için doku bölümlerinin herhangi bir zamanda çözülmemesini sağlamayı içerir. Bu nedenle, bölümleri toplamak ve bunları yalnızca kriyotom odası içinde işlemek için yalnızca önceden soğutulmuş mikroskop slaytlarının kullanılması önemlidir. Bir alveolar duvar üzerindeki kuvvet haritalarının kaydedilmesi sırasındaki en önemli adım, BM'nin uygun bir ölçüm konumunu belirlemek için problanan alanın sertlik dağılımına niteliksel bir genel bakış sağlayan oluşturulan eğim görüntüsünü kullanmaktır. Elde edilen Young modül değerlerinin uzamsal olarak filtrelenmesi, protokolde kritik bir adım oluşturur ve CANTER İşleme Araç Kutusu'nun önemli bir özelliğidir. Bu filtreleme adımı, araştırmacının iki yumuşak hücre tabakası arasında yer alan BM'yi, kendine özgü daha sert ayak izi ile tanımlamasını ve daha fazla analiz için BM'nin karşılık gelen Young modül değerlerini çıkarmasını sağlar.

Bu gelişmiş analiz iş akışı, netrin-4 nakavt farelerinin, vahşi tip çöp farelerine kıyasla pulmoner bazal membranlarında önemli ölçüde (yaklaşık iki kat) daha yüksek bir Young modülü sergilediğini ortaya koydu53. Bu nedenle, mevcut protokol, çeşitli koşulların veya grupların karşılaştırmalı analizini kolaylaştırır.

AFM'ye ek olarak, biyomalzemelerin mekanik özelliklerini incelemek için, moleküler düzeyde optik veya manyetik cımbız 69,70,71, orta ölçekte mikro girinti teknikleri72,73 ve makroskopik düzeyde sınırlı veya sınırsız sıkıştırma testi 74,75 kapsayan çok sayıda metodoloji mevcuttur. Spesifik olarak, vasküler örneklerin ve yeniden yapılandırılmış BM matrislerinin BM sertliğini değerlendirmek için basınç miyografisi, çekme testi76,77 ve reoloji78 kullanılmıştır. Bununla birlikte, basınç miyografisi ve çekme testi gibi teknikler, yalnızca çeşitli hücre katmanlarını ve yapısal elemanları içeren tüm kan damarları gibi tam dokuların veya tüm doku yapılarının mekanik özelliklerini değerlendirebilir. Sonuç olarak, BM biyomekaniğini değerlendirmek için bu yöntemler kullanılırken, hücresel bileşenler gibi BM olmayanların mekanik özellikleri her zaman BM sonuçlarının üzerine bindirilir ve bu da BM'nin kendisinin spesifik özelliklerini izole etmeyi zorlaştırır.

Bu protokolde, ilgilenilen özellik (BM), kuvvet haritası sonuçlarının uzamsal filtrelemesi yoluyla çıkarılır. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, ilgilenilen özelliğin, elde edilen Young modülü haritalarında veya mevcut başka herhangi bir harita kanalında belirgin bir model olarak ayırt edilebilir ve tanımlanabilir olması gerekliliğidir. Örneğin, alveolar dokudaki BM, yalnızca çevredeki hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir Young modülü sergileyen birbirine bağlı yapısı nedeniyle tanımlanabilir. Sonuç olarak, BM, elde edilen Young modül haritalarında sürekli parlak bir şerit olarak kendini gösterir. Bununla birlikte, diğer biyolojik yapılar, harita sonuçlarında uzamsal filtrelemeyi mümkün kılmak için çevredeki dokunun özelliklerinden yeterince farklı olmayan mekanik özellikler sergiler. Protokol, kaydedilen kuvvet haritalarındaki yapıları tanımlamak için immünofloresan boyama gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilse de, bu yaklaşım yorumlanması zor sonuçlar verebilir. Bu komplikasyon, boyama prosedürlerinin dokuların mekanik özelliklerini değiştirebilmesi nedeniyle ortaya çıkabilir. Sonuç olarak, AFM ölçümlerinden önce dokunun herhangi bir işlenmesi veya boyanması, yalnızca ilgilenilen özelliği tanımlamak için alternatif bir yöntem mevcut olmadığında yapılmalıdır. Ayrıca, lekeli ve lekesiz numunelerin biyomekanik özelliklerini karşılaştıran uygun kontrol deneylerinin yapılması önemlidir.

Protokol, Young modülü kontrastına dayalı olarak hedef yapıları tanımlamak için bir yöntem sunar. Sonuç olarak, tiroid bezi, kolon ve prostat dahil olmak üzere akciğerinkine benzer bir anatomik BM'ye sahip dokulara uygulanabilir. (Hartmann ve ark.59'daki Genişletilmiş Veri Rakamına bakınız). Başlangıçta BM mekaniğini analiz etmek için geliştirilmiş olsa da, bu protokol ve CANTER İşleme AraçKutusu 56 , AFM kuvvet haritaları içindeki mekanik olarak farklı ve bağlantılı herhangi bir bölgeyi incelemek için yeterince çok yönlüdür (www.github.com/CANTERhm/CANTER_Processing_Tool/wiki'daki talimatlara bakın). Bu geniş uygulanabilirlik, bu aracı AFM alanında değerli kılar ve daha geniş bilimsel toplulukta mekanobiyolojiye artan odaklanmayı destekler.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.H. ve H.C.-S. Bavyera Araştırma Odağı Herstellung und biophysikalische Charakterisierung von dreidimensionalen Geweben (CANTER) ve Bavyera Akademik Forumu (BayWISS)-Doktora Konsorsiyumu Sağlık Araştırmaları aracılığıyla Bavyera Eyaleti Bilim ve Sanat Bakanlığı'ndan fon sağlandığını kabul edin. Veri analiz yazılımı CANTER Processing Toolbox'ın geliştirilmesi, Osteoartritte eklem kıkırdağı ve subkondral kemik dejenerasyonu ve rejenerasyonunun araştırılması - ExCarBon (FOR2407-1/2) araştırma konsorsiyumunun 1. alt projesinin (CL 409/4-1/2) bir parçası olarak Alman Araştırma Vakfı tarafından finanse edilmiştir. B.H. ve H.C.-S. GGA-HAW (INST 99/38-1) adlı büyük enstrümantasyon kampanyası aracılığıyla Alman Araştırma Vakfı'ndan sağlanan finansmanı kabul edin. Bu çalışma, Danimarka Kanser Derneği (R204-A12454 (R.R.)) ve Alman Araştırma Vakfı (539446614 to R.R.) tarafından da desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL ŞırıngaB Braun9166017VInjekt-F
10 mL ŞırıngaB Braun4606108VInjekt Luer Solo
15 mL Falcon tüpSarstedt62.554.002vidalı kapaklı tüp
Konsol - MLCTBruker AFM Probları3444AFM piramidal uç şekilli
Kriyotom bıçaklarıLeica Biosystems14035843496Düşük profilli tek kullanımlık bıçaklar DB80LX
Kriyotom numune tutucuLeica Biosystems14047740044Numune diski 30
CyotomeLeica BiosystemsCM1950Leica Cryostat
Direct Overlay ExtensionBrukerTers çevrilmiş mikroskobun optik görüntüsünü SPM yazılımının Veri Görüntüleyicisine aktarmayı sağlayan JPK SPM Yazılımı için yazılım uzantısı.
Tek kullanımlık taban kalıbıBilim HizmetleriSA62534-15Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm
Çift taraflı banttesa Film56661-00002Fotoğraf Filmi Bant
Sabit Yaylı Konsol TutucuBruker
Ters Mikroskop - Leica DMi8Leica Microsystems
JPK MotorluSahne Bruker
JPK NanoWizard 4XP BioScienceBruker
JPK SPM YazılımıBruker
K5 CMOS Mikroskop KameraLeica Microsystems
MATLABMathworksSürüm R2024a veya üstü
MATLAB - Eğri Uydurma Araç Kutusu Mathworks
MATLAB - Görüntü İşleme Araç KutusuMathworks
MATLAB - Sinyal İşleme Araç Kutusu Mathworks
MATLAB - İstatistik ve Makine Öğrenimi Araç KutusuMathworks
Mikroskop slaytlarıCarl RothH869.1Konsol kalibrasyonu için düz mikroskop slaytları
Mikroskop slaytları - buzlu kenarCarl RothH870.1Kriyoseksiyon için buzlu kenarlı mikroskop slaytları
İğne ve oslash; 0,9 mm ve süreler; 25 mmB Braun4657500OCT enjeksiyonu  akciğer örneğine
İğne ø 0,9 mm ve süreler; 70 mmB Braun4665791altında PBS uygulamak için uzun iğne
Sakura Finetek4583Tissue-Tek O.C.T. Bileşiği
Fosfat Tamponlu SalinBio& Ca2+, Mg2+, 500 mL QIBS.L1825
JPK SPM Yazılımı için kaydedilen her görüntü pikseli için tüm temel kuvvet eğrisini sağlayan Bruker
NeşterB Braun5518083Cerrahi Tek Kullanımlık Neşter
MakasıKaut-BullingerM681700Hassas Makas 13 cm 
Tek taraflı banttesa Film57330-00000kristal berraklığında bant, 33 m x 19 mm
Slayt kutusuGWL Depolama SistemleriK50W 50slayt için
Slidebox Stereo Mikroskop - Stemi DR1663Zeiss
Cımbız - Vomm SS-SA-ESDEleshopELE002121
konsol AFM OCT bileşiği Gelişmiş Görüntüleme Uzantısı olmadan PBS çözümü satın, Yazılım uzantısı.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsteens, D., et al. Atomic force microscopy-based characterization and design of biointerfaces. Nat Rev Mater. 2 (5), 17008(2017).
  2. Aro, E., et al. Severe extracellular matrix abnormalities and chondrodysplasia in mice lacking collagen prolyl 4-hydroxylase isoenzyme II in combination with a reduced amount of isoenzyme I. J Biol Chem. 290 (27), 16964-16978 (2015).
  3. Domke, J., Radmacher, M. Measuring the elastic properties of thin polymer films with the atomic force microscope. Langmuir. 14 (12), 3320-3325 (1998).
  4. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), e0220281(2019).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nat Rev Phys. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: validation with a gel-microfiber composite. Biophys J. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  7. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nat Nanotechnol. 7 (11), 757-765 (2012).
  8. Prein, C., et al. Structural and mechanical properties of the proliferative zone of the developing murine growth plate cartilage assessed by atomic force microscopy. Matrix Biol. 50, 1-15 (2016).
  9. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophys J. 70 (1), 556-567 (1996).
  10. Radmacher, M., Tillamnn, R. W., Fritz, M., Gaub, H. E. From molecules to cells: imaging soft samples with the atomic force microscope. Science. 257 (5078), 1900-1905 (1992).
  11. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nat Nanotechnol. 4, 186-192 (2009).
  12. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophys J. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  13. Florin, E. L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  14. Hansma, P. K., et al. Tapping mode atomic force microscopy in liquids. Appl Phys Lett. 64 (13), 1738-1740 (1994).
  15. Moy, V. T., Florin, E. L., Gaub, H. E. Intermolecular forces and energies between ligands and receptors. Science. 266 (5183), 257-259 (1994).
  16. Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, H. G., Hansma, P. K. Direct observation of enzyme activity with the atomic force microscope. Science. 265 (5178), 1577-1579 (1994).
  17. Radmacher, M., Fritz, M., Hansma, P. K. Imaging soft samples with the atomic force microscope: gelatin in water and propanol. Biophys J. 69 (1), 264-270 (1995).
  18. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat Struct Biol. 6 (4), 346-349 (1999).
  19. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  20. Drake, B., et al. Imaging crystals, polymers, and processes in water with the atomic force microscope. Science. 243 (4898), 1586-1589 (1989).
  21. Clausen-Schaumann, H., Rief, M., Tolksdorf, C., Gaub, H. E. Mechanical stability of single DNA molecules. Biophys J. 78 (4), 1997-2007 (2000).
  22. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophys J. 78 (1), 520-535 (2000).
  23. Lekka, M., et al. Elasticity of normal and cancerous human bladder cells studied by scanning force microscopy. Eur Biophys J. 28 (4), 312-316 (1999).
  24. Weisenhorn, A. L., Khorsandi, M., Kasas, S., Gotzos, V., Butt, H. J. Deformation and height anomaly of soft surfaces studied with an AFM. Nanotechnology. 4 (2), 106(1993).
  25. Rotsch, C., Jacobson, K., Radmacher, M. Dimensional and mechanical dynamics of active and stable edges in motile fibroblasts investigated by using atomic force microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (3), 921-926 (1999).
  26. Goldmann, W. H., Ezzell, R. M. Viscoelasticity in wild-type and vinculin-deficient (5.51) mouse F9 embryonic carcinoma cells examined by atomic force microscopy and rheology. Exp Cell Res. 226 (1), 234-237 (1996).
  27. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomater. 126, 315-325 (2021).
  28. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthr Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  29. Kinney, J. H., Balooch, M., Marshall, S. J., Marshall, G. W. Jr, Weihs, T. P. Atomic force microscope measurements of the hardness and elasticity of peritubular and intertubular human dentin. J Biomech Eng. 118 (1), 133-135 (1996).
  30. Symposium on Thin Films - Stresses and Mechanical Properties VI,. 1996 MRS Spring Meeting. Lundkvist, A., et al. , 353-358 (1997).
  31. Tao, N. J., Lindsay, S. M., Lees, S. Measuring the microelastic properties of biological material. Biophys J. 63 (4), 1165-1169 (1992).
  32. Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Eng Med Biol Mag. 16 (2), 47-57 (1997).
  33. Becke, T. D., et al. Pilus-1 backbone protein RrgB of Streptococcus pneumoniae binds collagen I in a force-dependent way. ACS Nano. 13 (6), 7155-7165 (2019).
  34. Becke, T. D., et al. Single molecule force spectroscopy reveals two-domain binding mode of Pilus-1 tip protein RrgA of Streptococcus pneumoniae to fibronectin. ACS Nano. 12 (1), 549-558 (2018).
  35. Pill, M. F., East, A. L. L., Marx, D., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Mechanical activation drastically accelerates amide bond hydrolysis, matching enzyme activity. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (29), 9787-9790 (2019).
  36. Schmidt, S. W., Filippov, P., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. Single-molecule force-clamp experiments reveal kinetics of mechanically activated silyl ester hydrolysis. ACS Nano. 6 (2), 1314-1321 (2012).
  37. Docheva, D., et al. Researching into the cellular shape, volume and elasticity of mesenchymal stem cells, osteoblasts and osteosarcoma cells by atomic force microscopy. J Cell Mol Med. 12 (2), 537-552 (2008).
  38. Docheva, D., Padula, D., Schieker, M., Clausen-Schaumann, H. Effect of collagen I and fibronectin on the adhesion, elasticity and cytoskeletal organization of prostate cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 361-366 (2010).
  39. Kiderlen, S., et al. Age related changes in cell stiffness of tendon stem/progenitor cells and a rejuvenating effect of ROCK-inhibition. Biochem Biophys Res Commun. 509 (3), 839-844 (2019).
  40. Reuten, R., et al. Structural decoding of netrin-4 reveals a regulatory function towards mature basement membranes. Nat Commun. 7, 13515(2016).
  41. Fleischhauer, L., et al. Nano-scale mechanical properties of the articular cartilage zones in a mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Appl Sci. 12 (5), 2596(2022).
  42. Alberton, P., et al. Aggrecan hypomorphism compromises articular cartilage biomechanical properties and is associated with increased incidence of spontaneous osteoarthritis. Int J Mol Sci. 20 (5), 1-16 (2019).
  43. Alberton, P., et al. Aggrecan is critical in maintaining the cartilage matrix biomechanics which in turn influences the correct development of the growth plate. Osteoarthr Cartilage. 27, S178-S178 (2019).
  44. Gronau, T., et al. Forced exercise-induced osteoarthritis is attenuated in mice lacking the small leucine-rich proteoglycan decorin. Ann Rheum Dis. 76 (2), 442-449 (2017).
  45. Hartmann, B., et al. Early detection of cartilage degeneration: A comparison of histology, fiber Bragg grating-based micro-indentation, and atomic force microscopy-based nano-indentation. Int J Mol Sci. 21 (19), 7384-7398 (2020).
  46. Rellmann, Y., et al. ER stress in ERp57 knockout knee joint chondrocytes induces osteoarthritic cartilage degradation and osteophyte formation. Int J Mol Sci. 23 (1), 182(2021).
  47. Kamper, M., et al. Early changes in morphology, bone mineral density and matrix composition of vertebrae lead to disc degeneration in aged collagen IX -/- mice. Matrix Biol. 49, 132-143 (2016).
  48. Akhtar, R., Sherratt, M. J., Cruickshank, J. K., Derby, B. Characterizing the elastic properties of tissues. Mater Today. 14 (3), 96-105 (2011).
  49. Junior, C., et al. Baseline stiffness modulates the non-linear response to stretch of the extracellular matrix in pulmonary fibrosis. Int J Mol Sci. 22 (23), 12928(2021).
  50. Junior, C., et al. Multi-step extracellular matrix remodelling and stiffening in the development of idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Mol Sci. 24 (2), 1708(2023).
  51. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. J Mech Behav Biomed Mater. 74, 118-127 (2017).
  52. Zemla, J., et al. AFM-based nanomechanical characterization of bronchoscopic samples in asthma patients. J Mol Recognit. 31 (12), e2752(2018).
  53. Reuten, R., et al. Basement membrane stiffness determines metastases formation. Nat Mater. 20 (6), 892-903 (2021).
  54. Johnstone, A. H. CRC Handbook of Chemistry and Physics. J Chem Technol Biotechnol. 50 (2), 294-295 (1991).
  55. Rico, F., et al. Probing mechanical properties of living cells by atomic force microscopy with blunted pyramidal cantilever tips. Phys Rev E. 72 (2), 1-10 (2005).
  56. CANTER Processing Toolbox v.5.7.0. , GitHub. (2022).
  57. Hutter, J. L. J. B. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev Sci Instrum. 64 (7), 1868-1873 (1993).
  58. Schillers, H., et al. Standardized nanomechanical atomic force microscopy procedure (SNAP) for measuring soft and biological samples. Sci Rep. 7 (1), 5117(2017).
  59. Hartmann, B., et al. Profiling native pulmonary basement membrane stiffness using atomic force microscopy. Nat Protoc. 19 (5), 1498-1528 (2024).
  60. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophys J. 82 (5), 2798-2810 (2002).
  61. Jolicoeur, P. Introduction to Biometry. , Springer US. Boston, MA. (1999).
  62. Bronshtein, I. N., Semendyayev, K. A., Musiol, G., Mühlig, H. Handbook of Mathematics. , 6th Edition, Springer. Berlin. (2015).
  63. Fiore, V. F., et al. Mechanics of a multilayer epithelium instruct tumour architecture and function. Nature. 585 (7825), 433-439 (2020).
  64. Koester, J., et al. Niche stiffening compromises hair follicle stem cell potential during ageing by reducing bivalent promoter accessibility. Nat Cell Biol. 23 (7), 771-781 (2021).
  65. Bedzhov, I., Zernicka-Goetz, M. Self-organizing properties of mouse pluripotent cells initiate morphogenesis upon implantation. Cell. 156 (5), 1032-1044 (2014).
  66. Kyprianou, C., et al. Basement membrane remodelling regulates mouse embryogenesis. Nature. 582 (7811), 253-258 (2020).
  67. Saraswathibhatla, A., Indana, D., Chaudhuri, O. Cell-extracellular matrix mechanotransduction in 3D. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 495-516 (2023).
  68. Sherwood, D. R. Basement membrane remodeling guides cell migration and cell morphogenesis during development. Curr Opin Cell Biol. 72, 19-27 (2021).
  69. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Opt Lett. 11 (5), 288(1986).
  70. Marago, O. M., Jones, P. H., Gucciardi, P. G., Volpe, G., Ferrari, A. C. Optical trapping and manipulation of nanostructures. Nat Nanotechnol. 8 (11), 807-819 (2013).
  71. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  72. Marchi, G., et al. Microindentation sensor system based on an optical fiber Bragg grating for the mechanical characterization of articular cartilage by stress-relaxation. Sens Actuators B. 252, 440-449 (2017).
  73. Wakitani, S., et al. Repair of large full-thickness articular cartilage defects with allograft articular chondrocytes embedded in a collagen gel. Tissue Eng. 4 (4), 429-444 (1998).
  74. Moutos, F. T., Freed, L. E., Guilak, F. A biomimetic three-dimensional woven composite scaffold for functional tissue engineering of cartilage. Nat Mater. 6 (2), 162-167 (2007).
  75. Schwarz, S., et al. Contactless vibrational analysis of transparent hydrogel structures using laser-Doppler vibrometry. Exp Mech. 60 (8), 1067-1078 (2020).
  76. Bhave, G., Colon, S., Ferrell, N. The sulfilimine cross-link of collagen IV contributes to kidney tubular basement membrane stiffness. Am J Physiol Renal Physiol. 313 (3), F596-F602 (2017).
  77. Fisher, R. F., Wakely, J. The elastic constants and ultrastructural organization of a basement membrane (lens capsule). Proc R Soc Lond B Biol Sci. 193 (1113), 335-358 (1976).
  78. Wisdom, K. M., et al. Covalent cross-linking of basement membrane-like matrices physically restricts invasive protrusions in breast cancer cells. Matrix Biol. 85-86, 94-111 (2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Pulmoner Bazal MembranKuvvet HaritalamaBazal Membran Mekani iKriyoseksiyonEkstrasel ler MatriksAkci er DokusuKuvvet ndentasyon E rileriCANTER leme Ara Seti

İlgili makaleler