Method Article

Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

DOI:

10.3791/67787

⸱

March 28th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Cell and Molecular Therapy NUCEL Group, School of Medicine, University of São Paulo, 2Biochemistry Department, Chemistry Institute, University of São Paulo, 3Department of Polymers, Faculty of Technology of the State of São Paulo – Zona Leste (FATEC ZL), 4Technical Division for Teaching, Research and Innovation Support - DTAPEPI Biotechnology and Innovation Facility, School of Medicine, University of São Paulo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistem kullanarak 3D hücre yapıları oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir metodoloji sunmaktadır. Sistem, tek tip sferoidlerin/organoidlerin oluşumunu teşvik eder, böylece hücre etkileşimlerini iyileştirir. Bu yaklaşım deneysel değişkenliği azaltır ve ilaç testi ve doku mühendisliğindeki uygulamaları destekler.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç boyutlu (3D) hücre kültürleri, hücreler ve hücre dışı matris arasında gelişmiş etkileşimleri teşvik ettikleri için, in vivo mikro ortamın geleneksel iki boyutlu (2D) kültürlere göre daha doğru bir temsilini sağlar. Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için yenilikçi bir damga tabanlı sistem kullanarak 3D hücre yapıları (sferoidler/organoidler) oluşturmak için verimli, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir metodoloji geliştirmeyi amaçlamıştır. 6 oyuklu bir plakanın oyuklu başına 663 mikro kuyu üretmek için yeni bir damga kullanıldı ve hücre agregasyonu için ideal bir ortam sağlandı. Birincil domuz pankreas adacık hücreleri, bu mikro kuyulara ekildi ve burada sferoidler/organoidler oluşturmak üzere toplandılar. Kültürler 37 ° C'de% 5 CO2 altında inkübe edildi ve ortam her 3 günde bir değiştirildi. Sferoid oluşumu periyodik olarak izlendi ve karakterizasyon için örnekler toplandı. Yöntem, deneysel değişkenliği azaltarak, manipülasyonu en aza indirerek ve hücre etkileşimlerini geliştirerek başarılı bir şekilde tek tip ve yüksek kaliteli sferoidler üretti. Agaroz bazlı mikro model kalıpların kullanımı, 3D kültürler için basitleştirilmiş, kontrollü bir ortam sağlayarak standartlaştırılmış ve uygun maliyetli bir çözüm sundu. Bu metodoloji, ilaç testi ve doku mühendisliği uygulamalarını destekleyerek, çeşitli laboratuvar ortamlarında kolayca uygulanabilen 3D hücre kültürü modelleri için pratik ve ölçeklenebilir bir platform sunar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son 50 yılda, çok sayıda hücre biyolojisi araştırması, iki boyutlu (2D) kültürlerin, hayvan modellerinde gözlemlenen in vivo koşulları doğru bir şekilde kopyalayamadığını göstermiştir1. Yapısal olarak, 2D hücre kültürleri, hücrelerin üç boyutlu olarak düzenlenmesine ve in vivo sistemlerde gözlemlenen durumu kopyalamasına izin vermez. Ayrıca, hücresel sinyal yolakları, üç boyutlu (3D) kültürlere kıyasla 2D kültürlerde değiştirilir, bu da 2D kültürleri kullanan belirli ilaç taraması türlerinin neden bu kadar tutarsız olduğunu açıklayabilir2. 3D kültür sistemlerinin tanıtı....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Kurumumuz CEUA-FMUSP: 1699/2021 İnsan Araştırmaları Etik Kurulu'nun 8 Eylül 2021'de onaylanan - "Domuz Pankreas adacıklarının İzolasyonu ve Kapsüllenmesi" yönergelerini takip eder ve Hücre ve Moleküler Terapi NUCEL Grubumuzun (www.usp.br/nucel), FAPESP Hibe No. 2016/05311-2, "Kronik-dejeneratif hastalıkların (kanser ve diyabet) tedavisini amaçlayan Rejeneratif Tıp" başlıklı Tematik Projesinin bir parçasıdır.

1. Damga cihazının imalatı

NOT: Bu Damga, NUCEL grubu (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/) tarafından özel olarak üretilmiştir. Damga cihazı, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Literatürde çeşitli 3D kültür protokolleri bulunmasına rağmen, Wassmer ve ark.13 tarafından yapılan bir çalışmada, pankreas adacıkları kullanılarak 3D yapılar oluşturmak için çeşitli metodolojiler test edilmiştir. Yazarlar, yerli adacıkların ve kendi kendine toplanan sferoidlerin boyut ve şekil açısından önemli ölçüde heterojenlik sergilediğini ve diğer yöntemler kullanılarak elde edilenlerden daha büyük olduğunu gözlemlediler. Bulgularına dayanarak, sferoidlerin .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zizi de Mendonça (Tıp Fakültesi, São Paulo Üniversitesi, Brezilya) tarafından sağlanan mükemmel teknik yardım için özellikle minnettarız. Bu çalışma, aşağıdaki Brezilya araştırma kuruluşlarından alınan hibelerle desteklenmiştir: BNDES 09.2.1066.1, CAPES (PVE süreç numarası 88881.068070/2014-01), CNPq (hibe numaraları 457601/2013-2, 401430/2013-8 ve INCT-Regenera numarası 465656/2014-5), FAPESP (Tematik proje numarası 2016/05311-2), FINEP 01.08.06.05 ve Bilim ve Teknoloji Bakanlıkları (MCTI) ve Sağlık (MS-DECIT).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
31LMikrodalga Electrolux78965840 6699 9Agaroz çözeltisini ısıtmak, çözünmesini kolaylaştırmak ve daha fazla homojenlik sağlamak için kullanılan ekipman. Kuyuların oluşumu için çözeltinin ideal sıvı hale ulaşmasını sağlar.
3DFila Gri Opak Işığa Duyarlı 3D ReçineUV ile kürlenebilen polimer reçine
3D Yazıcı - Creality Halot Damgacihazını yazdırmak için kullanılanCrealityN/A
AgaroseUNISCIENCEUNI-R10111Jeli oluşturmak için, Tuzlu Fosfat Tamponu (PBS) veya uygun ortamda %1 ila 2 oranında çözün.
Autodesk Fusion 3603D modelleme
BB15 CO2 İnkübatörThermo Fisher51023121Kültürlenmiş hücreleri uygun ve kontrollü bir ortamda inkübe etmek için kullanılan ekipman.
ChituboxChituboxN/ABaskı için parçayı dilimlemek için kullanılan yazılım
Sınıf II Biyolojik Güvenlik KabiniGrupo VECO N/ABelirlenmiş parametreler ve protokoller dahilinde hücre kültürü gerçekleştirmek için steril bir ortam sağlar.
Kültür ortamıUSBiological/Life SciencesC5900-03AUygun hücre yetiştiriciliği için katkı maddeleri içerir.
Kültür plakaları (P6)SARSTEDT1023221Agarozu şekillendirmek ve hücreleri kültürlemek için kullanılır.
Erlenmeyer Şişesi (25 mL)Laborglas91 216 141&ndash çözmek için kullanılan bir kap; Fosfat Tamponlu Salin (PBS) veya tipik olarak bir mikrodalgada ısıtılan başka bir uygun ortamda% 2 agaroz.
Falcon 15 mL Polistiren Santrifüj TüpüCorning352099Hücreleri süspansiyon halinde tutmak ve olası seyreltmeleri gerçekleştirmek için kullanılır.
Fetal sığır serumu (FBS)Vitrocell Embriolife005/19Kültür ortamı için katkı maddesi.
PBS çözeltisi (Tuzlu Fosfat Tamponu)Laboratuvarda MiliQultra saf su ile 1x Seyreltilmiş N / A yapılmıştır. Agarozu% 1 ila 2 oranında çözmek ve önceden üretilmiş kuyuları yıkamak için kullanılır.
Mavi kapaklı reaktif şişesi - SchottLaborglas21801545Kültür ortamının hazırlanması ve saklanması için kullanılır.
Damga aygıtıNUCEL GroupN/ABağlantısı- Bu bağlantı, damga aygıtının .stl dosyasına erişim sağlar. Uygun yazılımı kullanarak dilimleyin ve uyumlu bir 3D yazıcı ile yazdırın. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK
EChKS3Qns0rOA?usp=paylaşım
Filtreli işlenmiş kültür şişesi 25 cm²Corning430639Yapışık hücrelerin yetiştirilmesi ve bakımı için kullanılır.
TripsinMerck07-07-9002Tohumlamadan önce hücrelerin ayrışması için.
Ultraviyole ışık (UV)N/AN/ADamga ve plakaları sterilize etmek için kullanılır.
3D yazıcı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lian, J., Yue, Y., Yu, W., Zhang, Y. Immunosenescence: a key player in cancer development. J Hematol Oncol. 13 (1), 151(2020).
  2. Wang, F., et al. Reciprocal....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three Dimensional Cell CultureSpheroid FormationOrganoid GenerationAgarose MicrowellsStamp DevicePorcine Pancreatic IsletsCell AggregationDrug Testing PlatformTissue EngineeringCell Viability

Related Articles