Burada, P. blakesleeanus çiftleşmesinin indüksiyonu için temel bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Burada, P. blakesleeanus çiftleşmesinin indüksiyonu için temel bir protokol sunuyoruz.
Mucoromycota filumu içindeki ipliksi bir mantar olan Phycomyces blakesleeanus, çevresel algı ve uyarlanabilir tepkiler için olağanüstü kapasitesi ile ayırt edilir. Geçmiş çalışmalar, yerçekimi, ışık, nem ve besin mevcudiyeti dahil olmak üzere çevresel uyaranların büyüme dinamiklerini ve üreme stratejilerini etkilediğini göstermiş olsa da, altta yatan mekanizmalar araştırmanın odak alanı olmaya devam etmektedir. Çevresel ipuçları eşeyli veya eşeysiz üremeyi tetikler. Eşeyli üreme, hifal kemoretraksiyonu tetikleyen feromon sinyallemesi ile başlar ve sonunda bir zigospor oluşumuyla sonuçlanan seri morfolojik geçişlere yol açar.
Laboratuvar ortamında, P. blakesleeanus'un çaprazlanması, farklı aşamalarda cinsel döngüye giren tamamlayıcı misellere neden olur. Çalışmamız, çevresel ipuçlarının P. blakesleeanus miselleri boyunca çiftleşmeyi tetikleyip tetikleyemeyeceğini test etmeyi amaçlıyor. Besin değeri sınırlı ortamlarda yetiştirilen P. blakesleeanu'nin çaprazlamaları, besin yoksunluğuna uygun bir cinsel tepkiyi tetiklemek için besin açısından sınırlı agar'a tabi tutulacaktır. P. blakesleeanus'ta çiftleşmenin başarılı bir şekilde tetiklenmesi, belirli aşamalarda büyük miktarda eşeyli üreyen misel gerektiren gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır. Bu araştırmanın sonucu, P. blakesleeanus üreme mekanizmalarının çevresel faktörlerden nasıl etkilendiğine dair anlayışımızı daha da geliştirecek ve filamentli mantarların eşeyli üremesine ilişkin daha geniş bilgi tabanına katkıda bulunacaktır.
Laboratuvar koşullarında mantar sistemlerinde çiftleşmenin indüksiyonu, ökaryotik genetik, hücre biyolojisi, evrimsel biyoloji ve biyoteknolojinin anlaşılmasını ilerletmiştir. Dikaryan mantarları, özellikle Ascomycota, laboratuvar ortamında çiftleşme indüksiyonu hakkında en kapsamlı bilgiye sahiptir1. İlginç bir şekilde, eşeyli üremenin önerildiği ilk mantar olan Syzygites megalocarpus, Ascomycota'nın bir üyesi değil, Mucoromycota2 filumunun bir üyesidir. Mucoromycota filumu, daha önce "Zygomycota" olarak sınıflandırılan, ancak şimdi Dikaryan soylarınınkardeşi olarak kabul edilen, erken ayrılan bir gruptur 3,4. Mucoromycota, Zoopagomycota ile birlikte, bu filumlar mantarların karasal ekosistemlere geçişini temsil ettiği için evrimsel olarak önemlidir 4,5. Diğer mantarlar gibi, Mucoromycetes de çevrelerine yanıt olarak eşeysiz ve eşeyli üreme stratejileri kullanır 3,6. Besin açısından sınırlı koşullar altında, mukoromisetler cinsel döngüyebaşlayacaktır 6. Mucoromysetler hem homotalik hem de heterotalik çiftleşme mekanizmaları sergilerler, burada uyumluluk, sırasıyla (-) ve (+) olarak adlandırılan çiftleşme tipi genler sexM ve sexP tarafından belirlenir 7,8,9.
Blakeslee10, mukoromiset cinsel döngüsünün dış koşullara duyarlılığını vurgulayarak, nemin oluşumları için kritik olduğunu ve substrattaki besin mevcudiyetinin önemli bir rol oynadığını belirtti. Tamamlayıcı çiftleşme türleri, öncü olarak beta-karoten kullanılarak trisporik asitlerin (TA) işbirlikçi sentezi yoluyla cinsel döngüye başlar 11,12,13. TA'nın saptanmasını takiben, yanıt veren vejetatif hifler kalınlaşır ve çok dallı zigoforlar haline gelir 14,15,16. Zigoforlar TA üretimine devam eder ve karşılıklı olarak kemoatrasyon yapar. P. blakesleeanus'ta, zigoforlar substrat içinde farklılaşır ve katı agar ortamında kolayca görülemezler17. Temas kurulduğunda, zigoforlar iç içe geçer ve hava zigoforları haline gelir.
Cinsel döngü devam ettikçe, zigoforların uçları bağlanır ve hücrelerin ortası, tabanda koralloid şişlik ile halka benzeri bir yapı oluşturmak için dışarı çıkar ve progametangiuma geçişi tamamlar. Progametangium'u oluşturan hücrelerin uçları kaynaşmaya ve gametangium'a dönüşmeye başlar. Gametangia aşamasında, zigoforlar diken benzeri süslemeler sergiler. Uçlardaki hücre duvarı çözülür ve zigosporun oluşacağı alanı sınırlayan maceracı septa ortaya çıkar ve zigoforlar maşa benzeri süspansiyonlar gibi davranır18. Zigospor, hücre duvarı kalınlaştıkça pigmentli hale gelir ve ek diken benzeri süslemeler kazanır17,18. Bir kez oluştuğunda, zigospor büyüme döngüsünü yeniden başlatmadan önce bir uyku dönemine girecektir.
Phycomyces blakesleeanus, büyük hücreleri ve çevreye duyarlı sporanjiyoforları ile dikkat çeken heterotalik bir mukoromisettir 6,8,18. Bu organizma laboratuvarda kolayca yetiştirilir ve cinsel döngünün zigospor oluşumuna yol açan kısımları 8-10 gün içinde gözlemlenebilir. Bir model olarak, P. blakesleeanus, çevresindeki ışığı algılama yeteneği açısından incelenmiştir17,19. Yetiştirme kolaylığı ve çiftleşmeyi teşvik etme kapasitesi, onu ışığı algılama yeteneğinin arkasındaki mekanizmayı incelemek için ideal bir model haline getirdi20; Bu bulgular aynı zamanda mantarlarda ışık algılama mekanizmalarının evrimsel korunumunu da vurguladı. P. blakesleeanus'ta ışığın, bu korunmuş ışık algılayıcı proteinler aracılığıyla cinsel üremeyi engellediği gösterilmiştir21. Son evrimsel gelişimsel çalışmalar, P. blakesleeanus cinsel döngüsü6 sırasında hangi genlerin hücre farklılaşmasına katkıda bulunduğunu anlamaya çalışmıştır. Morfogenezin spesifik genlerle ilişkilendirilmesi, gen ekspresyonu çalışmalarını gerçekleştirmek için aynı hücre tiplerinden yeterli dokunun izole edilmesini gerektirecektir.
Bir laboratuvar ortamında P. blakesleeanus'un çiftleşmesini indüklemek için protokoller daha önce tanımlanmış olsa da, bazıları sadece kullanılacak ortamın türünü ve ilgili suşları belirtir18. Bazı protokol açıklamaları, spesifik ortam formülasyonunu içermez, ancak varsayımsal tamamlayıcı eşleşme tiplerinin bir plaka10 üzerinde nereye yerleştirileceğini açıklar. Daha yeni protokoller, her bir çiftleşme tipinin sporlarını karıştırarak ve karışık spor süspansiyonu21 ile aşılayarak veya çiftleşme tiplerini biraz arayla yerleştirerek ve kültürün 20 gün boyunca kuluçkaya yatmasına izin vererek zigospor üretiminin artmasına izin verir22. Bu yaklaşımlar, özellikle zigosporlar olmak üzere bol miktarda farklılaşmış hücreler oluşturmak için yararlıdır, ancak gelişimsel bir zaman seyrini gözlemlemek veya tek hücreli transkriptomik için zigosporlardan önce oluşan cinsel yapıları seçmek için uygun olmayabilir. Diğer çalışmalar, cinsel döngü başladığında seri morfolojik geçişlerin gözlemlenmesine izin vermek için tamamlayıcı çiftleşme türlerini katı ortamlara birbirinden uzak tutarak bunu ele almıştır 6,22,23. Diğer mantarlarda olduğu gibi, P. blakesleeanus mycelia radyal olarak genişler24,25. Bu nedenle, tamamlayıcı çiftleşme türleri aynı plaka üzerinde yetiştirildiğinde, misellerinin farklı kısımları farklı zamanlarda temas edecektir. Miseller arasındaki temas, P. blakesleeanus cinsel döngüsünün ilk adımlarından biri olduğundan, bu, etkileşen misellerin farklı bölümlerinin cinsel döngünün farklı aşamalarında olacağı anlamına gelir. Bu eşzamansızlık, bir gen ekspresyonu çalışmasının sonucunu etkileyebilir, öyle ki farklılaşmış hücre tipleri karıştırılırsa ve farklı gen ekspresyon programlarına sahiplerse, o zaman bir genin rolünü belirli bir yapıya atfetmek zor olacaktır.
P. blakesleeanus'un cinsel döngü sırasında morfogenezde yer alan genleri incelemek için bir model olarak değerine ek olarak, güçlü büyümesi ve birkaç gün içinde farklılaşma kapasitesi, onu erken ayrılan filamentli mantarlarla ilgilenen öğrencileri eğitmek ve mantarların çeşitliliği ve gelişim süreçleri hakkında bilgi edinmek için bir lisans sınıfı ortamında kullanmak için ideal bir mantar haline getirir. Burada sunulan protokol, besin mevcudiyetinin miselyum görünümü, çiftleşmenin indüksiyonu ve belirli cinsel yapılar için zenginleştirme üzerindeki etkisini, niceliklendirme, gözlem veya potansiyel tek hücreli transkriptomik için göstermek için iki farklı ortam türünün üç konsantrasyonunu kullanır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. Medya hazırlığı
2. Mantar sporlarının veya dokularının hazırlanması
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
4 bir çaprazlamayı takiben, her bir suş, miselyum alanındaki değişiklikle belirlendiği gibi büyüme hızında biraz değişmiştir (Şekil 2). İstatistiksel olarak anlamlı olmasa da, NRRL 1555% 25 CMA,% 25 PDA veya% 100 PDA ile kaplandığında alanda daha hızlı bir değişikliğe sahipti. Benzer şekilde, NRRL 1465, P PDA veya CMA'da yetiştirildiğinde alanda daha yüksek bir değişikliğe sahipti. NRRL 1464, 0 CMA ile yetiştirildiğinde alanda en hızlı artışa sahip oldu. 24 saat (1 DPI) sonra, PDA'da büyüyen...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Laboratuvar ortamında P. blakesleeanus'ta eşeyli üremeyi indüklemek için basit bir protokol burada sunulmuştur. Bu protokol için en kritik hususlardan biri besin sınırlamasıdır. Mantarların, besin sınırlaması 6,28,29,30,31,32 gibi zorlu çevresel koşullara bir yanıt olarak eşeyli üremeyi seçtiği varsayılmaktadır.<...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Colorado Koleji Doğa Bilimleri Yürütme Komitesi'ne, Organizma Biyolojisi ve Ekoloji Bölümü'ne ve Hevey Ailesi Öğrenci Araştırmaları Fonu'na bu çalışmayı finanse ettikleri için teşekkür ederiz. Ayrıca teknik destekleri için Alice Keller ve Tia Hutchens'a da teşekkürlerimizi sunarız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agar tozu | ThermoFisher | 3453PK | |
| kloramfenikol | FisherSci | BP904-100 | |
| Mısır unu agar | Carolina | 742460 | |
| Panorama Stitcher | Apple App Store | ||
| Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1555 | Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı - Tarımsal Araştırma Servisi | 1555 | USDA-ARS yalnızca akademik araştırmacılara gönderilecektir; alternatifler için aşağıya bakınız |
| Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1564 | Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı - Tarımsal Araştırma Servisi | 1564 | USDA-ARS yalnızca akademik araştırmacılara gönderilecektir; alternatifler için aşağıya bakın |
| Phycomyces blakesleeanus (-) Tüp Kültürü | Carolina Biyolojik Tedarik | 156183 | Eğitim sınıfı kültür satın alınabilir; NRRL 1555 |
| Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1554 | Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı - Tarımsal Araştırma Servisi | 1554 | USDA-ARS yalnızca akademik araştırmacılara gönderilecektir; alternatifler için aşağıya bakın |
| Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1565 | Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı - Tarımsal Araştırma Servisi | 1565 | USDA-ARS yalnızca akademik araştırmacılara gönderilecektir; alternatifler için aşağıya bakın |
| Phycomyces blakesleeanus (+) Tüp Kültürü | Carolina | 156182 | Eğitim sınıfı kültür satın alınabilir; NRRL 1554 |
| Patates dekstroz agar | FisherSci | DF0013-17-6 | |
| Sprout Plus Mini Santrifüj | Heathrow Scientific | SKU 120610 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P6585-10ML |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.