Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Gelişmiş beyin floresan boyaması ve immün boyama için Drosophila kafalarının doğrudan kriyoseksiyonu

2.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67791

⸱

7 Şubat 2025

 ,  , 
1Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 3UAB Nathan Shock Center

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, dekapitasyon, fiksasyon, kriyoseksiyon, floresan boyama, immün boyama ve görüntülemeyi içeren, konfokal ve multifoton görüntülemeye genişletilebilen basitleştirilmiş bir doku işleme protokolü sunmaktadır. Yöntem, gelişmiş motor becerilere olan ihtiyacı atlayarak karmaşık diseksiyonlarla karşılaştırılabilir etkinliği korur. Kantitatif görüntü analizi, kapsamlı bir araştırma potansiyeli sağlar.

Özet

Drosophila melanogaster beyinlerinin immün boyama, karmaşık davranışların, nöral devrelerin ve protein ekspresyon modellerinin arkasındaki mekanizmaları keşfetmek için gereklidir. Geleneksel yöntemler genellikle karmaşık diseksiyon yapmak, doku bütünlüğünü korumak ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sırasında belirli ifade kalıplarını görselleştirmek gibi zorlukları içerir. Kriyoseksiyonu floresan boyama ve immün boyama ile birleştiren optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, doku korumasını ve sinyal netliğini artırır ve Drosophila beyin görüntülemesi için zahmetli diseksiyon ihtiyacını azaltır. Yöntem, hızlı diseksiyon, optimal fiksasyon, kriyoproteksiyon ve kriyoseksiyon, ardından floresan boyama ve immüno-boyama gerektirir. Protokol, doku hasarını önemli ölçüde azaltır, antikor penetrasyonunu artırır ve keskin, iyi tanımlanmış görüntüler verir. Bu yaklaşımın etkinliğini, belirli nöral popülasyonları ve sinaptik proteinleri yüksek doğrulukla görselleştirerek gösteriyoruz. Bu çok yönlü yöntem, yetişkin beynindeki çeşitli protein belirteçlerinin birden fazla z-düzleminde analizine izin verir ve diğer dokular ve model organizmalar için uyarlanabilir. Protokol, Drosophila nörobiyoloji çalışmalarında yüksek kaliteli immünohistokimya yürüten araştırmacılar için güvenilir ve verimli bir araç sağlar. Bu yöntemin ayrıntılı görselleştirmesi, nöroanatomi, patoloji ve protein lokalizasyonunun kapsamlı analizini kolaylaştırır ve bu da onu sinirbilim araştırmaları için özellikle değerli kılar.

Giriş

Sosyal etkileşimler 1, duyusal algı ve işleme2, öğrenme 3, hareket 4'e kadar değişen karmaşık davranışlar beyin tarafından yönlendirilir. Nörolojik bozukluklar da giderek daha yaygın hale gelmekte ve zamanla artacağı tahmin edilmektedir 5,6. Beynin hem sağlıkta hem de hastalıkta nasıl çalıştığını incelemek çok önemlidir. Moleküler biyolojinin merkezi dogması, biyolojik birimlerin en önemli işlevlerinden birinin proteinler7 olduğunu ve hem ne kadar hem de nerede ifade edildiklerinin beynin nasıl çalıştığını anlamak için kritik öneme sahip olduğunu öne sürer.

Yaygın olarak meyve sineği olarak bilinen Drosophila melanogaster, yaşlanma ve patofizyolojik koşullar altında beyin fonksiyonlarını incelemek için oldukça değerli bir modeldir8. Drosophila'da gelişmiş genetik araçların mevcudiyeti, araştırmacıların hemen hemen her proteinin 9 işlevini keşfetmelerini sağlarve hemen hemen her gen için kapsamlı genetik kütüphaneler kolayca erişilebilir10. Kısa ömrü ve yüksek üreme oranı ile birleştiğinde, bu özellikler Drosophila'yı beyin araştırmaları için olağanüstü bir model haline getirmektedir11. Bu, sineğin12 tam bir beyin haritasının geliştirilmesi de dahil olmak üzere önemli başarılara yol açtı ve hatta sirkadiyen ritimlerin ve moleküler saatlerin 13,14,15 nöronal mekanizmalarını aydınlatmak için Nobel Ödülü'ne katkıda bulundu. Sonuç olarak, Drosophila güçlü ve çok yönlü bir sistem olmaya devam ediyor, beyin fonksiyonu anlayışımızı ilerletiyor ve nörolojik süreçler hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sağlıyor.

İmmünohistokimya ve immünofloresan, protein ekspresyonunu yerinde incelemek için temel araçlardır.Sadece yarı kantitatif analize izin veren ve tipik olarak toplu doku16'da gerçekleştirilen Western Blot gibi tekniklerin veya protein seviyesi17'yi ölçmek için kütle spektrometresi gibi karmaşık ve pahalı tekniklerin aksine, immünohistokimya nispeten basittir ve hem protein ekspresyonunun nicelleştirilmesine hem de bir doku veya hücre içindeki bir proteinin lokalizasyonunu ölçmeye izin verir. Daha da önemlisi, floresan immünohistokimya, belirli hücre tiplerini ve dokuları tanımlamak veya aynı dokudaki birden fazla soruyu yanıtlamak için birden fazla proteini ölçmek için çoğullanabilir. Ek olarak, doku fiksasyonu, farklı deneysel koşullar, genotipler, yaşlar ve sirkadiyen zaman noktaları arasında karşılaştırmalara izin verebilir. Bununla birlikte, floresan immünohistokimyası zor olabilir ve birçok faktör görüntü kalitesini etkileyebilir. Drosophila beyinleri için bu optimize edilmiş kriyoseksiyon ve immünoboyama protokolü, doku korumasını, antikor penetrasyonunu ve nöral popülasyonların ve protein belirteçlerinin görselleştirilmesini iyileştirerek yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi geliştirmeyi amaçlar. Karmaşık diseksiyon, doku hasarı ve tüm beyin montajlarıyla ilişkili sınırlı görüntüleme çözünürlüğü gibi geleneksel yöntemlerdeki zorlukları ele almak için geliştirilmiştir18. Bu protokol, birden fazla z-düzleminde yapısal bütünlük ve keskin görüntüleme sağlamak için kriyoseksiyonu floresan boyama ile birleştirir. Tam montajlı preparatlarla karşılaştırıldığında, bu yöntem distorsiyonu en aza indirir, daha derin antikor difüzyonunu kolaylaştırır ve net nöroanatomik ve protein lokalizasyon analizleri sağlar18. Çok yönlülüğü, diğer dokular ve model organizmalar için adaptasyona izin vererek sinirbilim araştırmaları için güvenilir ve verimli bir araç sunar19,20. Hemen hemen her proteine bakmak için uyarlanabilir ve herhangi bir durumu, hastalığı veya modeli incelemek için uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Ekipmanın hazırlanması

  1. Kriyostatın açık olduğundan ve -20 °C'ye ayarlandığından emin olun. Sürgü ısıtıcısını veya küçük bir inkübatörü açın ve 37 °C'ye ayarlandığından emin olun.
    NOT: Bu aşamada, etiketli slaytlar ısıtıcı veya inkübatör üzerine yerleştirilebilir ve bölümlere ayrılana kadar süresiz olarak bırakılabilir.

2. Çözeltilerin hazırlanması

  1. 10x PBS stoğundan 50 mL 1x Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 hazırlayın. PBS'de nihai hacmi 10 mL olan% 4'lük bir Paraformaldehit çözeltisi hazırlayın.
  2. Bir sprey şişesinde su içinde% 70 etanol içeren bir temizleme solüsyonu hazırlayın. Bir bloke edici çözelti hazırlayın (20x stoktan Tris tamponlu salin içinde% 3 Sığır serum albümini (BSA)). Bir birincil antikor çözeltisi hazırlayın (seyreltme deneye bağlıdır). Burada, TBS'de% 3 BSA'da 1:250 oranında bir ApoE Fare Antikoru seyreltmesi kullanılır.
  3. İkincil bir antikor çözeltisi hazırlayın (seyreltme deneye bağlıdır). Burada, TBS'de %3 BSA'da Alexa Unu 750 A21037 Keçi Anti-Fare İkincil'in 1:500 seyreltilmesi kullanılır.
  4. Floresan leke çözeltisi hazırlayın (seyreltme deneye bağlıdır). Burada, PBS'de 5 μg/mL'lik bir Nil Kırmızısı çözeltisi hazırlanır.
    NOT: Tüm çözeltiler, özellikle floresanlar, buzdolabında saklanmalı ve karanlık bir buzdolabında saklanmalıdır. Ayrıca kullanımdan hemen önce oda sıcaklığına getirilmelidirler.

3. Doku toplanması

  1. Yaşlanan şişelerde sinekleri elde ettikten sonra, CO2 matı üzerindeki valfi açın ve kaçmayı önlemek için sinekleri hızlı bir şekilde matın üzerine boşaltın. Sineklerin çoğunlukla bilinçsiz hale gelmesini ve çoğu hareketi durdurmasını bekleyin. Pozisyon, matı objektif merceğin altına hareket ettirerek SZ61 mikroskobunun altına uçar. Büyütmeyi ayarlayın ve sineklerin net bir şekilde görülebileceği ve kafalarının kesilmesi rahat olacak şekilde odaklanın.
    NOT: Bu örnek için kullanılan sinekler ELAV/+ ve ELAV>ApoE4'tür
  2. Göğüs kafesi ile kafa arasına yaylı makas sokun, sıkıca sıkın ve deney grubu başına 5 ila 10 sinek kafası ayırın. Kullanılmayan sinekleri yaşlanan şişelerine geri koyun.
    NOT: Fiksatifin penetrasyonu ile ilgili endişeler varsa, adım 4.1'de fiksatif ajanın daha fazla penetrasyonuna izin vermek için başın arka tarafında küçük bir insizyon yapılabilir.
  3. Bir fırça kullanarak, ELAV/+ ve ELAV>ApoE4 grupları toplanana kadar başlıkları buz üzerindeki etiketli 1,5 mL'lik tüplere nazikçe yerleştirin.

4. Tüm dokunun fiksasyonu

  1. Tüpleri buzdan çıkarın ve her tüpe PBS çözeltisinde 100 μL% 4 Paraformaldehit pipetleyin ve tüm kafaların çözeltiye daldırıldığından emin olun. Kafalar tüpün duvarlarına yapışıyorsa ve çözelti ile temastan kaçınıyorsa, uygun teması sağlamak için hafifçe aşağı doğru itmek için bir fırça kullanın veya yatay bir yüzeye hafifçe vurun.
  2. 15 dakika boyunca orta ayar kullanarak bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin. 15 dakika sonra Paraformaldehit çözeltisini atın ve 10 dakika boyunca 1x PBS ile değiştirin, tüm kafaların çözeltiye daldırıldığından emin olun.
  3. Her seferinde önceki solüsyonu atarak, mendili PBS 2x ile her biri 10 dakika, toplam 3 yıkama için yıkayın.
  4. Son yıkamadan sonra, kafaları PBS çözeltisinde% 10'luk bir sükroza aktarın ve kafaların tüpün içine daldırıldığından emin olun. Optimum doygunluk için bunları gece boyunca bırakın.
    NOT: Aynı gün görüntüleme istenirse, sükroz infüzyonu azaltılabilir; Bununla birlikte, kriyoprotektan etkileri de orantılı olarak azaltılacaktır.

5. Kalıp hazırlama

  1. Etiketli bir kalıbı yaklaşık %50 oranında Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurun ve kalıbın 4 köşesine de yayılmasına izin verin.
  2. Bir fırça kullanarak, kafaları kalıbın içindeki OCT yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Birden fazla deney grubunu aynı kalıba yerleştirirken, karışıklığı önlemek için bu grupların kalıp içinde ayrıldığından emin olun.
    NOT: OCT bileşiğinin, fırça yoluyla önceki sükroz çözeltisi ile kontaminasyon yoluyla seyreltilmesini önlemek önemlidir. Ek olarak, fırçayı kullanarak OCT'nin derinliklerine yerleştirmek, kafaların etrafında birçok kabarcık oluşturabilir. Daha sonra bölümleme sorunlarını önlemek için bu hatalardan kaçının.
  3. Forsepsin ucunu kullanarak, her bir kafayı, gözler dibe bakacak şekilde yavaşça kalıbın altına doğru itin. Bu oryantasyon, koronal düzlem boyunca bir kesim için seçilir.
  4. Bu işlem sırasında kafaları kalıbın dibine doğru delmekten veya ezmekten kaçının. X, Y ve Z boyutlarındaki tüm kafaları, her bölüm tüm konuları aynı anda içerecek şekilde hizalayın. Hava kabarcığı oluşumunu azaltmak için yavaş daldırdığınızdan emin olun.
  5. Tüm kafalar düzgün bir şekilde hizalandıktan sonra, kalıpları dondurmak için dikkatlice doğrudan -20 °C'ye yerleştirin.
    NOT: Kesitleme sırasında kafaların hizalanmasının önemli ölçüde kapalı olduğu not edilirse, kalıbın ilk ani donması için kuru buz veya sıvı nitrojen kullanmayı düşünün.
  6. Kalıp çoğunlukla donduktan sonra, kalanını OCT ile doldurun ve - 80 ° C'de uzun süre saklamadan önce donmasına izin verin.

6. Kalıpların kriyopeksiyonu

NOT: Deney grubu kalıpları kesmeden önce genellikle boş bir kalıp hazırlanması ve kesilmesi tavsiye edilir. Bu, dokuyu bölmeden hemen önce tekerlek, bıçak ve yuvarlanma önleyici camın düzgün çalışmasını sağlar.

  1. Kalıba bol miktarda OCT uygulayarak ve ucu üstüne yerleştirip düz bir şekilde bastırarak ayna ucunu kalıba takın. Bunun kriyostatta, genellikle 5 dakika içinde tamamen donmasına izin verin.
  2. Ucu ve OCT bloğunu kalıptan çıkarın ve kalıbın yukarıdan aşağıya doğru düzgün bir şekilde yönlendirildiğinden emin olarak aynaya yerleştirin. Uç sabitlenene kadar mandren anahtarını sıkın.
  3. Ayar düğmelerini ve ayna derinliği kontrollerini kullanarak bloğu bıçakla hizalayın.
  4. Kesit genişliğini 20 μm olarak ayarlayın. Her dilimi yavaş ama tutarlı bir hareketle kesin ve rulo önleyici camın her dilimi yakalamasına izin verin. Slaytı bölümün daha yakın kenarına dokundurarak ve bölümün slaytın üzerine yükselmesine izin vererek, ısıtılmış slaytları kullanarak bölümleri yakalayın. Uygun aralıklarla yerleştirildiğinde standart boyutlu bir kızağa (25 mm x 75 mm x 1 mm) sekiz adede kadar bölüm sığabilir.
    NOT: Hangi bölümlerin toplanacağını seçerken yapılması gereken bir seçim meselesi vardır. Gömme oryantasyonunun bir sonucu olarak, daha önceki bölümler ön kısımdan olacak ve daha sonraki bölümler başın arka kısımlarından olacaktır. Bu nedenle, ilgi belirli bir alana diğerinden daha fazla ilgi gösteriyorsa, bölüm seçimi buna göre ayarlanabilir. Alternatif olarak, tüm bölümler hiç doku kalmayana kadar birden fazla slaytta toplanabilir.
  5. Slaytların oda sıcaklığında en az 30 dakika, ancak en fazla 1 saat kurumasına izin verin.

7. Boyama ve IHC

NOT: Bu protokol için yöntem, konjuge olmayan bir primer antikor kullanarak IHC'yi detaylandıracaktır. Florokrom konjuge antikorlar veya tek bir aşamada gerçekleştirilebilen diğer floresan boyalar, her ikisi birlikte kullanılacaksa ikincil antikor ile birlikte kullanılmalıdır.

  1. Kuruma süresinin hemen ardından, bir tıraş bıçağı kullanarak sürgünün kenarlarındaki OCT'yi çıkarın ve hidrofobik bir kenarlık için yer bırakın. İşaretçiyi kullanarak her slayta hidrofobik bir kenarlık çizin. Bunun 5 dakika kurumasını bekleyin.
  2. Tüm slaytları 3 kez, her biri 5 dakika boyunca PBS ile slaytın üzerine nazikçe pipetleyerek yıkayın ve mümkünse doğrudan dokunun üzerine pipetlemekten kaçının.
    NOT: 1000 μL'lik pipet burada en kullanışlıdır. Doku ile standart boyutlu bir slayt, herhangi bir çözeltinin 750μL'si ile tamamen kaplanmalıdır. Sürgülü raflar ve kovalar da kullanılabilir.
  3. Slaytlar yıkandıktan sonra, slaytların üzerine TBS bloke edici solüsyonda% 3 BSA pipetleyin. 30 dakika inkübe edilmesine izin verin.
  4. Bloke edici solüsyonu atın ve birincil antikor solüsyonunu slaytlara pipetleyin. Bu durumda, TBS'de% 3 BSA içinde SC-13521 ApoE'nin 1:250 oranında seyreltilmesi. Antikorun gece boyunca 4 °C'de veya oda sıcaklığında 1 saat inkübe etmesine izin verin. Solüsyonun gece boyunca kurumasını önlemek için ıslak mendil veya kağıt havlu kullanın.
  5. Birincil antikoru atın ve pipeti kullanarak, her biri PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  6. İkincil antikor çözeltisini ekleyin. Bu durumda, 5 μg/mL Nil Kırmızısı konsantrasyonuna ek olarak AF 750 Keçi Anti-Faresinin 1:500 oranında seyreltilmesi, tümü TBS'de %3 BSA'da. Bunun oda sıcaklığında 1 saat inkübe etmesine izin verin.
    NOT: Aynı tamponda aynı anda bir floresan leke ve ikincil bir antikoru, TBS'de% 3 BSA'yı inkübe ediyoruz. Bu, iki reaktif arasında bilinen bir çatışma olmadığı sürece tercih edilir. Çakışmalar varsa, ayrı ayrı inkübe edin ve inkübasyonlar arasında 3 yıkama daha yapın.
  7. Slaytları PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın. Son yıkamadan sonra, slayt üzerinde az miktarda PBS bırakın.

8. Görüntüleme için montaj ve hazırlık

  1. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak, DAPI (0.9μg/ml) içeren 3-5 damla sertleştirici montaj ortamı, doku üzerine doğrudan düşmeyi önleyerek slayt boyunca eşit şekilde ekleyin.
  2. Herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önleyerek lamel slaytın üzerine yerleştirin.
    NOT: Forseps kullanımı, lamellerin nihayet serbest bırakılmadan önce lamel yüzeyine yakın kaymasına izin vererek buna yardımcı olabilir.
  3. Yeni monte edilmiş kızakları dikkatli tutun ve tamamen kuruyana kadar düz bir şekilde saklayın. Uzun süreli saklama bekleniyorsa, slaytları oje kullanarak kapatın.
  4. Floresan bozulmasını önlemek için görüntüleri mümkün olan en kısa sürede yakalayın.

9. Görüntü edinme

NOT: Görüntü yakalama için Olympus Cell Sense Dimensions yazılımının kullanımı ayrıntılı olarak açıklanacaktır.

  1. Görüntülemeden önce, slaytları inceleyin ve su çözeltisinde% 70 etanol kullanarak silin. Montajdan hemen sonra slaytlar görüntülenirse, lamel bozulmasını önlemek için temizlerken ekstra özen gösterin. Görüntülemeden önce lamel ve lamel yüzeylerinin 5 dakika kurumasını bekleyin.
  2. Yakalamak için istediğiniz her kanalı seçin, bu durumda DAPI, Nil Red ve AF 750 kanallarını seçin.
    1. Aşağıda açıklandığı gibi istediğiniz büyütmeyi seçin. Büyütme seçimi deneye bağlıdır; Burada 10x büyütme kullanın.
      NOT: Yağ bazlı lensler de dahil olmak üzere tüm büyütme oranları kullanılabilir. İstenirse, slayt yüzeyine daldırma yağı sürün.
    2. Her kanal için, bir deneydeki en parlak floresan nesnelere dayalı olarak uygun pozlama sürelerini kalibre edin. Mümkün olduğunca parlak bir görüntü oluştururken aşırı pozlamadan kaçının.
      NOT: Genel olarak, zayıf süreç yakalamanın iki ana belirleyicisi, tanım kaybına neden olan aşırı pozlama ve gerçek sinyalden ayrılması zor olan çok fazla arka plan sinyalidir. Ek olarak, kullanılan her benzersiz büyütme için pozlamalar bağımsız olarak ayarlanmalıdır.
    3. Kaydedilecek klasörü seçin ve menüde birleştirilen görüntüleri adlandırın. Çekimin ardından, tüm görüntüler bu klasörde yer alacak ve burada tanımlanan adı taşıyacaktır.
    4. Önce kanalda en iyi odak noktasını sağlayan bir konuya odaklanarak görüntü yakalayın ve ardından toplamaya başlayın. Deney boyunca tutarlılık için aynı kanaldaki her bir konuya odaklanma prosedürünü sürdürün.
    5. Karşılaştırılan gruplar arasında floresan bozulmasını önlemek için daha sonraki karşılaştırmalar için kullanılan tüm deney gruplarını aynı gün yakalayın.

10. Nicelik belirleme

NOT: Miktar tayini çeşitli yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada, Olympus CellSense Dimensions'ın kullanımına atıfta bulunulmaktadır.

  1. Koleksiyonun ardından görselleri inceleyin. Niceleme klasöründen kusurları veya kesit yapıtları içeren bölümleri kaldırın. Niceleme hedefini yansıtan görüntüleri seçin. Kusurlara örnek olarak kabarcıklar, yırtık bölümler, üst üste binen doku ve toz veya döküntüler verilebilir.
    1. Uygun görüntüleri seçmek için, beyin dokusunu içeren tüm görüntülerin, beyindeki genel ifadeyi yansıtacak şekilde niceleme için kullanıldığından emin olun. Alternatif olarak, bu alanlardaki ifade farklılıkları hakkında fikir vermek için yalnızca ön, orta veya arka beyni yansıtan görüntüleri kullanın.
  2. Sayma ve ölçme menülerinde, görüntülerin nicelleştirilmesi için ilgilenilen parametreleri ve sınırlarını belirleyin.
    1. ApoE ifadesinin ortalama yoğunluk değeri karşılaştırması ile ölçülmesi için, o kanal için tüm pikseller (0-sonsuz) olarak kabul edilecek şekilde eşik değerlerini seçin. Ek olarak, mevcut çizim araçlarını kullanarak ilgi alanlarını ana hatlarıyla belirtin.
  3. Sayımı çalıştırın ve tüm dosyalar için toplu olarak veya her görüntüde ayrı ayrı ölçün.
    1. Toplu işleme için, niceleme ayarlarını ve yürütülmesini kaydedin ve ardından niceleme yapmak için klasörü seçin. Toplu olarak işlemeye makro yöneticisi sekmesinden erişilebilir ve iş akışını büyük ölçüde hızlandırır.
  4. Veri tablosunu çizim için bir elektronik tabloya aktarın. Bunu yapmak için, bir toplu işlem gerçekleştirirken otomatik olarak bir tabloyu açarken veya dışa aktarırken sayım ve ölçüm sonuçları menüsünü kullanın. Bu veri tabloları, adım 10.2'de seçilen tüm seçili parametreleri içerecektir.
  5. İstatistiksel analiz ve çizim için, verileri doğrudan bir elektronik tablo kullanarak veya başka bir yazılım aracılığıyla çizin. Seçilen yazılıma aşinalık, deneysel sonuçların doğru bir temsilini oluşturmanın anahtarıdır. Burada, mutantın beynindeki ApoE ekspresyonunun mutlak yoğunluk değerleri kontrole normalize edildi ve daha sonra GraphPad Prism kullanılarak çizildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan yöntem, yetişkin sinek beyinlerinin güvenilir bir şekilde ve sıkıcı diseksiyon olmadan floresan görüntülemesine izin verir. Şekil 1'de basit bir şekilde gösterildiği gibi, yöntem basittir ve tüm numuneler, ekipman ve malzemeler hazırsa hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, OCT kalıp aşamasında -80 °C'lik depolama kullanılarak, numuneler daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Araştırmacıların basit diseksiyon ve gömm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, kriyoseksiyonlu Drosophila kafalarının hassas floresan görüntülemesi için bir protokol sunuyoruz. Bu, birkaç önemli pozitifi olan basit bir yaklaşımdır. Yani, yöntemler temel laboratuvar güvenliği eğitimi almış herkesin tamamlayabileceği kadar basittir, yüksek kaliteli antikorların bulunduğu herhangi bir proteinin ekspresyonunu ölçmek için uyarlanabilirler ve hem ilgilenilen bir proteinin ne kadar ifade edildiğinin hem de bu ifadenin kafa boyunca nerede gerçekleştiğinin ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Protokolün geliştirilmesi için değerli geri bildirimlerle yardımcı oldukları için Melkani laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Sinek stokları, Elav-Gal4 (BL#458) ve UAS-ApoE4 (BL#76607) Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden (Bloomington, IN, ABD) elde edildi. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibeleri AG065992 ve GCM'ye RF1NS133378 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda UAB Startup fonları 3123226 ve G.C.M.'ye 3123227 tarafından da desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1000 uL PipetEppendorf3123000063
1000 uL Pipet UçlarıOlympus Plastics23-165R
10X Fosfat Tamponlu Salin (PBS)FisherJ62036.K7ph=7.4
200 Kanıt EtanolDecon Laboratuvarları64-17-5
20X Tris Tamponlu SalinThermo ScientificJ60877.K2pH=7.4
AF750 Keçi Anti-Fare İkincil AntikoruAlexa FluorA21037
Rulo Önleyici CamIMEBAR-14047742497
ApoE Fare Birincil AntikoruSanta CruzSC13521
Sığır Serumu AlbüminiFisher9048-46-8
Santrifüj Tüpleri 1.5 mLFisher05-408-129
Şarjlı SlaytlarGlobe Scientific1415-15
Kriyoseksiyon KalıplarıFisher2363553
KriyostatLeicaCM 3050 S
CL SturkeyDT554N50
Damıtılmış Su
Kuru Buz??????
İnce ForsepsGüzel Bilim Araçları11254-20
Fly PadTritech ResearchMINJ-DROS-FP
VectashieldH-1800ile sertleştirme montaj Ortamı
Kimtech34120
MikroskopOlympusSZ61
Nil Kırmızısı SigmaN3013
Optimum Kesme Sıcaklığı BileşiğiFisher4585
Orbital ÇalkalayıcıOHAUSSHLD0415DG
Paraformaldehit %20Elektron Mikroskobu Bilimleri15713
Tıraş BıçağıGravey# 40475
Bahar MakasıGüzel Bilim Araçları15000-10
SükrozBalıkçısıS5-500
Kriyostat Bıçakları Dapi Kimwipes

Kaynaklar

  1. Fabbri-Destro, M., Rizzolatti, G. Mirror neurons and mirror systems in monkeys and humans. Physiology. 23, 171-179 (2008).
  2. Faust, T. E., Gunner, G., Schafer, D. P. Mechanisms governing activity-dependent synaptic pruning in the developing mammalian CNS. Nat Rev Neurosci. 22, 657-673 (2021).
  3. Roozendaal, B., McEwen, B. S., Chattarji, S. Stress, memory and the amygdala. Nat Rev Neurosci. 10, 423-433 (2009).
  4. Arber, S., Costa, R. M. Networking brainstem and basal ganglia circuits for movement. Nat Rev Neurosci. 23, 342-360 (2022).
  5. GBD 2019 Dementia Forecasting Collaborators. Estimation of the global prevalence of dementia in 2019 and forecasted prevalence in 2050: an analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet Public Health. 7, e105-e125 (2022).
  6. Huang, Y., Li, Y., Pan, H., Han, L. Global, regional, and national burden of neurological disorders in 204 countries and territories worldwide. J Glob Health. 13, 04160(2023).
  7. Crick, F. Central dogma of molecular biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
  8. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9, 235-244 (2016).
  9. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the Fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201, 815-842 (2015).
  10. Larkin, A., et al. FlyBase: updates to the Drosophila melanogaster knowledge base. Nucleic Acids Res. 49, D899-D907 (2021).
  11. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. Int J Mol Sci. 10, 407-440 (2009).
  12. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379, eadd9330(2023).
  13. Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312, 752-754 (1984).
  14. Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39, 369-376 (1984).
  15. Huang, R. C. The discoveries of molecular mechanisms for the circadian rhythm: The 2017 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Biomed J. 41, 5-8 (2018).
  16. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4, 429-434 (2012).
  17. Ong, S. E., Foster, L. J., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 (2003).
  18. Behnke, J. A., Ye, C., Moberg, K. H., Zheng, J. Q. A protocol to detect neurodegeneration in Drosophila melanogaster whole-brain mounts using advanced microscopy. STAR Protoc. 2, 100689(2021).
  19. Moraes, R. C. M., et al. Apolipoprotein E induces lipid accumulation through Dgat2 that is prevented with time-restricted feeding in Drosophila. Genes. 15 (11), 1376(2024).
  20. Roth, J. R., et al. Rapamycin reduces neuronal mutant huntingtin aggregation and ameliorates locomotor performance in Drosophila. Front Aging Neurosci. 15, 1223911(2023).
  21. Currier, T. A., Pang, M. M., Clandinin, T. R. Visual processing in the fly, from photoreceptors to behavior. Genetics. 224, (2023).
  22. McKellar, C. E., Siwanowicz, I., Dickson, B. J., Simpson, J. H. Controlling motor neurons of every muscle for fly proboscis reaching. Elife. 9, (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Drosophila Beyin mm nboyamaKriyoseksiyon ProtokolBeyin Dokusu KorumaN ral Devre G r nt lemeProtein LokalizasyonuAntikor PenetrasyonuOCT G mmeKonfokal G r nt lemeN roanatomi Analizi
Gelişmiş beyin floresan boyaması ve immün boyama için Drosophila kafalarının doğrudan kriyoseksiyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.