Yöntem makalesi

Biyomoleküllerde Yerel Esnekliği Karakterize Etmek için Tek Moleküllerden Zamanla Çözülen Floresan Anizotropisi

DOI:

10.3791/67802

⸱

25 Nisan 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, TU Dortmund University, 3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, konfokal mikroskopi modunda tek molekül seviyesinde zamanla çözülen floresan anizotropi kullanarak biyomoleküllerin yerel esnekliğini ve dinamiklerini incelemek için protokolü sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FoxP1 transkripsiyon faktörünün deoksiribonükleik asit (DNA) bağlayıcı çatal başlı (FKH) alanının yerel esnekliğini ve dinamiklerini araştırmak için konfokal mikroskopi kullanarak tek molekül seviyesinde zamana bağlı floresan anizotropisi yürütmek için bir protokol açıklıyoruz. FoxP1, üç boyutlu bir alan değiştirme (3D-DS) mekanizması yoluyla dimerleşir ve DNA ile veya DNA olmadan düzensiz bir ara ürün oluşturur. 3D-DS, doğası gereği düzensiz bir bölgeyi içerdiğinden, davranışını anlamak, FoxP1'in yapısal ve işlevsel özelliklerini aydınlatmak için çok önemlidir. Tek sistein etiketli bir FoxP1 kullanarak, yerel esnekliği ve dinamikleri araştırmak için dinamik anizotropi Foton Dağılım Analizi (daPDA) ve zaman çözümlü anizotropi Patlama Varyans Analizi (traBVA) yaklaşımları uygulayarak tek moleküllü floresan anizotropi (smFA) deneyleri gerçekleştirdik. Bu protokol, farklı zaman ölçeklerinde yapısal dinamikleri yakalamak için zaman çözümlü analizleri, varyansı ve olasılık dağılımı tekniklerini vurgulayarak smFA ölçümleri için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlar. Bu yaklaşım, dinamikleri ve heterojenliği FoxP1 dimerizasyonu ve DNA bağlanması ile ilişkilendirmemizi sağladı ve bu transkripsiyon faktörünü karakterize eden karmaşık eylem mekanizmasını vurguladı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyomoleküllerin fonksiyonel aktivitesi, moleküler esnekliklerine ve yapısal dinamiklerinebağlıdır 1,2,3. Doğal olarak, biyomoleküller hızlı hareketlerden işlevlerini etkileyen uzun vadeli konformasyonel değişikliklere kadar değişen sürekli termal dalgalanmalar yaşarlar (Şekil 1)4. Biyomoleküllerde, yerel omurga hareketleri, enzimlerde menteşe bükülmesi ve motor proteinlerde önemli konformasyonel değişiklikler dahil olmak üzere daha büyük ölçekli küresel hareketlere katkıda bulunur. Nükleer manyetik rezonans (NMR)5, X-ışını kristalografisi6 ve kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM)7 gibi yapı belirleme yöntemleri, çeşitli biyomoleküllerde çoklu konformasyonları ortaya çıkarmıştır. Bununla birlikte, yerel dalgalanmaları biyomoleküllerin büyük konformasyonel dinamiklerine bağlamak ve bunların işlevdeki rolü çoğunlukla keşfedilmemiştir. Dinamikleri ve yapıyı ilişkilendirmek, özellikle içsel olarak düzensiz proteinler (IDP'ler) için zor olabilir8,9,10. Yapılandırılmış proteinlerin aksine, IDP'ler stabil bir üçüncül yapıyı korumazlar. Bunun yerine, benzer serbest enerji seviyelerine sahip kapsamlı konformasyonel değişikliklere uğrarlar ve bu da çok çeşitli biyolojik aktiviteleri mümkün kılar11,12.

Moleküler esnekliklerini araştırarak proteinlerin konformasyonel dinamiklerini araştırmak için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanılmıştır 1,13,14,15,16. Bunlar arasında NMR, onlarca pikosaniyeden birkaç saate kadar çeşitli zaman ölçeklerinde atomik düzeyde çözünürlük sağlama yeteneği ile öne çıkıyor12. Bununla birlikte, yüksek serbestlik dereceleri ve büyük boyutlu proteinler nedeniyle makromoleküler esnekliğin belirlenmesi zor olmaya devam etmektedir; bu nedenle, NMR genellikle yaklaşık 100 kDa'lık biyomolekülleri incelemekle sınırlıdır17.

IDP'ler gibi oldukça dinamik proteinlerin yapısal karmaşıklığı göz önüne alındığında, işlevlerini anlamak için yerel ve uzun vadeli konformasyonel alanı keşfetmek için ek metodolojik ilerlemeler geliştirilmiştir11. Tek moleküllü çok parametreli Floresan Spektroskopisi (smMFS)18,19,20,21,22, biyomoleküller hakkında kapsamlı bilgiler sunarak işlevleri, konformasyonel dinamikleri, bağlanma durumları ve stokiyometri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bununla birlikte, biyomoleküllerden elde edilen büyük miktarda yapısal veriyi yorumlamak zordur ve moleküler dinamikler, florofor davranışı ve moleküllerin karmaşık davranışı gibi faktörler veri analizini daha da karmaşık hale getirebilir 23,24,25,26,27,28.

Biyomoleküllerin omurgası boyunca yerel ve küresel dinamikleri değerlendirmek için sağlam bir yöntem olarak tek moleküllü floresan anizotropisini (smFA) kullanıyoruz (Şekil 1A). İlk olarak Perrin29 tarafından tanımlanan ve Weber30,31 tarafından biyoanalitik bir araç32 olarak tanıtılan floresan anizotropisi, daha sonra zamana bağlı floresan tekniklerinin ortaya çıkması ve dedektörlerin hassasiyetinin artmasıyla tek moleküllü çalışmalar için uyarlandı 33,34,35,36,37. smFA, pikosaniyelerden birkaç saate kadar geniş bir zaman ölçeğini kapsar ve tek moleküllü Förster Rezonans Enerji Transferi (smFRET) deneylerinden elde edilen verileri tamamlar38.

smFA, biyomoleküler dinamikler hakkında kritik bilgileri çıkarmak için çeşitli formatlarda görselleştirilebilir (Şekil 1B). Zamanla çözülen floresan anizotropi bozunumları, pikosaniye ila nanosaniye zaman ölçeği 39,40'taki dinamikleri yakalayan tek boyutlu histogramlardır. Tek tek moleküller için floresan ömrünü anizotropi ile ilişkilendiren iki boyutlu tek moleküllü histogramlar, anizotropi durumu heterojenliğini ortaya çıkarabilir ve konfokal deneylerde gözlem süresi içindeki potansiyel dinamikler hakkında görsel bilgiler sağlayabilir (~ms)41,42. Milisaniye altı dinamikleri incelemek için, dinamik anizotropi foton dağılım analizi (daPDA) kullanılabilirken, zaman çözümlü anizotropi Patlama Varyans Analizi (traBVA), milisaniye43 civarında spesifik dinamikleri doğrulamak için sağlam bir yöntem sunar (Şekil 1B).

Bu yöntemler, daha geniş bir spektrumasahip olan polarizasyonla çözülmüş floresan korelasyon spektroskopisi (pFCS) gibi daha geleneksel araçları tamamlar 44,45,46,47. Genel olarak, smFA için çoklu veri analiz araçları, uygun kalibrasyonun dikkate alınması koşuluyla yerel ve küresel konformasyon değişikliklerinin belirlenmesini kolaylaştırır.

Burada, insan FoxP1 transkripsiyon faktörü 48,49,50,51'in DNA bağlanmasını incelemek için smFA uyguluyoruz. Bu protein, proteinin kuaterner durumuna ve DNA'nın varlığına bağlı olarak önemli ölçüde etkilenen polipeptit zincirinin içsel olarak düzensiz doğası nedeniyle alan değiştirmeli dimer'i benimser. BODIPY-FL ile etiketlemek için farklı tek sistein mutantları ürettik, smFA deneyleri yaptık ve daPDA ve trBVAa kullandık. Bu yaklaşım, dinamikleri ve heterojenliği FoxP1 dimerizasyonu ve DNA bağlanması ile ilişkilendirmemize izin vererek, bu transkripsiyon faktörünü karakterize eden karmaşık etki mekanizmasını vurguladı.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: smFA deneyleri için uygun floroforun seçilmesi çok önemlidir. Biyomoleküller, mevcut reaktif gruplara bağlı olarak, proteinlerdeki amino asitleri veya nükleik asitlerdeki nükleotid bazlarını floresan belirteçlerle modifiye ederek bölgeye özgü konumlarda etiketlenebilir. Organik boyalar52 arasında, Alexa Fluor, Cy, BODIPY ve Janelia Farms aileleri, uzun floresan ömürleri, fotostabiliteleri ve yüksek kuantum verimleri sayesinde smFA için en popüler seçeneklerdir. BODIPY-FL, uzun floresan ömrü, üstün kuantum verimi ve kısa bağlantı bağlayıcısı nedeniyle sıklıkla tercih edilir. Ek olarak, alternatif floroforlar, toplu tekniklerin tercih edildiği ilaç taramasında yaygın olarak kullanılmaktadır53. Kimerik floresan proteinler, daha düşük bir dinamik aralık sınırlaması olmasına rağmen, canlı hücre anizotropi deneyleri ve görüntüleme için de kullanılabilir.

1. Tampon hazırlama

NOT: Laboratuvar deneyleri yaparken eldiven, göz koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü giyin.

  1. Standart tampon (20 mM 4- (2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit [HEPES], pH 7.8, 150 mM NaCl): 2.38 g HEPES, 4.38 g NaCl'yi 400 mL ultra saf suda çözün, pH'ı 7.8'e ayarlayın ve son hacmi 500 mL'ye getirin.
  2. Lizis tamponu (20 mM HEPES, pH 7.8, 150 mM NaCl, 0.1 mM fenilmetilsülfonil florür [PMSF], 10 μg/mL DNAse): 2.38 g HEPES, 4.38 g NaCl ve 8.71 mg PMSF ve 10 μg/mL DNAse nihai konsantrasyonunu 400 mL ultra saf suda çözün, pH'ı 7.8'e ayarlayın ve nihai hacmi 500 mL'ye getirin.
  3. Dengeleme tamponu (50 mM fosfat tamponlu salin [PBS], 150 mM NaCl ve 10 mM İmidazol; pH 7.4): 5.05 gNa2HPO4, 0.85 g NaH2PO4, 4.38 g NaCl ve 0.34 g İmidazol'ü 400 mL ultra saf suda çözün, pH'ı 7.4'e ayarlayın ve son hacmi 500 mL'ye getirin.
  4. Yıkama tamponu (50 mM PBS, 150 mM NaCl ve 30 mM İmidazol; pH 7.4): 5.05 gNa2HPO4, 0.85 g NaH2PO4, 4.38 g NaCl ve 1.02 g İmidazol'ü 400 mL ultra saf suda çözün, pH'ı 7.4'e ayarlayın ve son hacmi 500 mL'ye getirin.
  5. Elüsyon tamponu (50 mM PBS, 150 mM NaCl ve 250 mM İmidazol; pH 7.4): 5.05 gNa2HPO4, 0.85 g NaH2PO4, 4.38 g NaCl ve 8.5 g İmidazol'ü 400 mL ultra saf suda çözün, pH'ı 7.4'e ayarlayın ve son hacmi 500 mL'ye getirin.
  6. PBS tamponu (50 mM Sodyum Fosfat Tamponlu Salin, 150 mM NaCl, pH 7.4). 5.05 gNa2HPO4, 0.85 g NaH2PO4 ve 4.38g NaCl'yi 400 mL ultra saf suda çözün, pH'ı 7.4'e ayarlayın ve son hacmi 500 mL'ye getirin.
  7. 0,22 μm gözenek boyutu filtreleri kullanarak çözeltiyi filtreleyerek tüm tamponları sterilize edin ve tamponları oda sıcaklığında (RT) saklayın.
  8. Tek molekül alımı için bir kömür filtresi kullanarak standart tamponu filtreleyin.

2. Floresan problar

  1. BODIPY-FL: BODIPY-FL içeren 5 mg'lık şişeyi, 10 mM BODIPY-FL'nin nihai konsantrasyonunu elde etmek için 1.29 mL taze açılmış dimetil sülfoksit (DMSO) son hacmi ekleyerek çözün.
  2. Rhodamine 110: 10 mM Rhodamine 110'un nihai konsantrasyonunu elde etmek için 1 mL taze açılmış DMSO'nun son hacmini ekleyerek 3.67 mg Rhodamine 110'u çözün.
    NOT: Işığa maruz kaldığında floresan problardan kaçınılmalıdır. Daima ışığa duyarlı bir tüp (kehribar rengi) kullanın ve alüminyum folyo ile sarın. DMSO zaten açılmışsa, raf ömrünü uzatmak için kurutucuda tutulmalıdır.
  3. Hazırlanan floresan probun küçük hacimli alikotlarını hazırlayın ve daha fazla kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
    NOT: Etiketleme verimliliğini artırmak için donma-çözülme döngülerinden kaçının.

3. Kalibrasyon ölçümleri

  1. 4 algılama kanalı ve 2 darbeli lazer (mavi 485 nm ve kırmızı 640 nm) ile ev yapımı polarizasyon çözümlü bir kurulumda çok parametreli floresan algılama (MFD) deneyleri gerçekleştirin54. Bununla birlikte, anizotropi ölçümleri için mavi lazer ve iki dedektör kanalı kullanın.
  2. Dedektör kanallarını (paralel ve dik) ve mavi lazer gücünü açın.
  3. Lazer gücünün 60 μW olarak ayarlandığından emin olun ve zamanla ilişkili tek foton sayma (TCSPC) yazılımı36 kontrol panelini açın.
  4. 1 μL 100 nM Rhodamine 110 ve 49 μL damıtılmış suyu karıştırarak 2 nM Rhodamine 110'luk bir final konsantrasyonu elde edin. Kalibrasyon ölçümleri için kapak camının ortasına 50 μL 2 nM Rhodamine 110 ekleyin.
  5. Ardından, mikroskobun çözme gücünü artırmak için mikroskop objektif merceğinin üzerine bir damla daldırma sıvısı (yağ veya su, ancak aynı kırılma indisini paylaşmaya dikkat edin) ekleyin.
  6. Kapak camını objektif merceğinin üzerine yerleştirin ve su damlacığının mikroskop objektifinin merkezinde olduğundan emin olun.
  7. Görüntü düzlemini çözeltinin içinde ve cam yüzeyin üzerinde olacak şekilde ayarlayın.
  8. İkinci parlak odak noktasını bulmak için düğmeyi ayarlayın ve bir buçuk noktaya çevirin. Lazeri cam ve sıvının arayüzüne odaklayın.
  9. Foton sayım oranını izlerken iğne deliği konumunu (70 μm) ayarlayarak algılanan foton sayısını en üst düzeye çıkarın.
  10. Yazılımı, zaman etiketli zaman çözümlü (TTTR veya T3) mod panelinde açın ve Başlat düğmesine tıklayın. 120 sn için sayım hızını kaydedin ve edinme yazılımını kullanarak Rhodamine 110.ptu dosya biçimini kaydedin. Bu edinme süresi, konsantrasyon (2 nM) göz önüne alındığında yeterli olmalıdır.
  11. Arka plan ölçümleri için, kapak camının ortasına 50 μL damıtılmış su ekleyin ve 3.5-3.10 adımlarını tekrarlayın. Ancak, foton sayım oranını 300 saniye boyunca kaydedin ve water.ptu dosyasını kaydedin.
  12. Diğer arka plan ölçümleri için, kapak camının ortasına 50 μL standart tampon ekleyin ve 3.5-3.10 arasındaki adımları tekrarlayın. Foton sayım oranını 300 saniye boyunca kaydedin ve standart buffer.ptu dosyasını kaydedin. Ardından, seri çekim tümleştirme floresan ömrü (BIFL) analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin.

4. Kalibrasyon ve veri analizi

  1. BIFL yazılımını açın ve otomatik penceresinden kurulumu onaylayın seçeneğine tıklayın. Ardından, dosyadan parametreleri al'a ve ardından Tamam'a tıklayın.
  2. Ölçümün analiz etmesi için veri yolu dizisine tıklayın ve onu seçin .
  3. Ardından, Yeşil dağılım gibi diziler için su ölçümü water.ptu dosyasını yükleyin. Benzer şekilde, Yeşil arka plan için standart buffer.ptu dosyasını seçin. Yeşil kalınlık için Rhodamine 110.ptu'yu seçin.
  4. Tek molekül seçim parametreleri altında, İleri'ye ve ardından yeni bir açılır pencere görüntülemek için Ayarla'ya tıklayın. Fotonlar arası varış zamanını değiştirmek için eşiği tıklayın ve ortalama fotonlar arası varış süresi (dt) için tek molekül olay zamanını seçin. Ardından, tek molekül olayı başına minimum foton sayısını seçmek için min. # tıklayın, ardından Geri Dön'e tıklayarak açılır pencereyi kapatın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
  5. Ardından, floresan bozunma parametreleriyle oluşturulan renkler olan Yeşil için ilk floresan ömrünü ayarlamak için Renk sığdırma parametreleri'ne tıklayın. From (Kimden) ve To (Alıcı) değerlerini değiştirerek Prompt (İstemi) ve Delay (İstemi) değerlerini ayarlayın. Ardından, Return (Dön) seçeneğini tıklayarak açılır pencereyi kapatın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.
  6. ASCII dosyalarını işlemek ve seçili bir klasöre kaydetmek için Kaydet'e tıklayın. Ardından, ChiSurf22, Foton Dağılım Analizi 55,56 veya Patlama Varyans Analizi57,58 kullanarak zamana bağlı floresan anizotropi bozunması için verileri işleyin.
    NOT: ChiSurf, PDA ve BVA'nın nasıl kullanılacağına ilişkin örnek veriler ve adım adım açıklamalar sırasıyla github.com/Fluorescence-Tools/chisurf, github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib, www.mpc.hhu.de/en/software/mfd-fcs-and-mfis ve github.com/SMB-Lab/feda_tools'da mevcuttur. Deneysel veriler Zenodo'da (10.5281/zenodo.13371503) mevcuttur.

5. FoxP1 protein hazırlama

  1. Rekombinant FoxP1 bakteri aşırı ekspresyonu
    1. Hızlı değişim bölgesine yönlendirilmiş polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) mutajenezinden sonra E. coli C41 bakteri hücrelerine dönüşüm gerçekleştirin.
    2. LB ortamını hazırlayın ve sterilize etmek için otoklavlayın.
    3. 5 μL (100 μg/mL) ampisilin içeren 5 mL LB ortamına ekleyerek tek bir E. coli C41 kolonisini önceden aşılayın. Bir inkübatör çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 37 °C'de inkübe etmeye bırakın.
    4. Ertesi gün, 1:500 oranında önceden eklenmiş antibiyotik ile 500 mL LB ortamına gece boyunca ön aşılama ekleyerek büyük ölçekli bakteri kültürünü aşılayın.
    5. Kültürün emilimini 600 nm'de ölçerek kültürün büyümesini izleyin.
    6. Optik yoğunluk ~ 0.5-0.7 arasına ulaştığında, 0.5 mM izopropil-β-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) nihai konsantrasyonu ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin ve kültürü gece boyunca bir inkübatör çalkalayıcı üzerinde 15 ° C'de tutun.
    7. 1.4-1.6 aralığında bir optik yoğunluğa (600 nm) ulaştıktan sonra, bakteri hücrelerini 4 ° C'de 20 dakika boyunca 3000 g'da santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı atın ve peleti kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
  2. Rekombinant FoxP1 saflaştırma
    1. Lyse E. coli C41 hücreleri, sonikasyon, sıvı homojenizasyon, French press vb. gibi herhangi bir lizis yöntemi kullanılarak lizis tamponu eklenerek.
    2. Lizatı 14000 g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    3. 6 etiketli proteinleri için, Ni2 + -NTA afinite sütununu yıkayın ve hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) kullanarak NiSO4 ile dengeleyin.
    4. His6 etiketli FoxP1 proteinini dengelenmiş Ni2 + -NTA afinite sütununa yükleyin.
    5. Elüsyon tamponunun doğrusal bir gradyanını kullanarak Ni2 + -NTA kolonundan FoxP1 proteinini elute edin.
    6. Protein ayrıştırıldıktan sonra, tampon değişimi için diyaliz yapın. Proteini İmidazol içermeyen bir dengeleme tamponuna ekleyin ve 4 ° C'de manyetik bir karıştırıcı kullanarak gece boyunca diyalize edin.
      NOT: Protein farklı bir yöntem kullanılarak saflaştırılırsa, tampon değişimini buna göre yapın.
    7. His6 etiketini çıkarmak için, gece boyunca diyalize tütün aşındırma virüsü (TEV:FoxP1'in 1:100 oranı) ekleyin.
      NOT:6 etiketli sindirimi, kolon üzerinde TEV proteaz sindirimi eklenerek de gerçekleştirilebilir. Bu adım, ilgilenilen proteinin verimini artıracaktır.
    8. Ertesi gün, 5.2.3-5.2.5 arasındaki adımları tekrarlayın. Bununla birlikte, bu sefer, proteini elüsyon tamponu yerine yıkama tamponunda elüte edin.
    9. PBS tamponu ekleyerek proteini uygun bir hacme konsantre edin ve proteinin yok olma katsayısını göz önünde bulundurarak 280 nm'de absorbans kullanarak proteini ölçün.
  3. Rekombinant FoxP1 etiketleme
    1. 50-100 μM FoxP1 proteinini, 30 dakika boyunca RT'de 500 μL'lik bir nihai hacimle 10 kat fazla Ditiyotreitol (DTT) veya tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) ile inkübe edin.
    2. PD 10 tuz giderme kolonlarını kullanarak tampon değişimi gerçekleştirin. PD10 kolonunu bir kolon adaptörü kullanarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
    3. 5 mL PBS tamponu ekleyerek PD10 kolonunu dengeleyin ve 1000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
    4. PD10 kolonunu 50 mL'lik yeni bir tüpte tutun ve kolona 2 mL PBS tamponu ekleyin. Ardından, 1. adımdan itibaren sütuna 500 μL FoxP1 proteini ekleyin. 1000 × g'ı 2 dakika santrifüj ederek proteini elute edin ve proteini toplayın.
    5. Proteini ultra santrifüj filtrelere (10 kDa MWCO) ekleyerek konsantre edin, 7500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve elüte toplayın.
    6. Protein konsantrasyonunu ölçün, proteine %30 eşdeğer sistein konsantrasyonu ile BODIPY ekleyin ve 4 ° C'de 2 saat boyunca bir döndürücüye yerleştirin.
    7. Tampon değişimini gerçekleştirin ve proteini adım 5.3.2-5.3.5'te tartışıldığı gibi konsantre edin.
    8. Bir spektrofotometre veya Bradford veya Lowry yöntemi gibi bir kolorimetrik test kullanarak protein konsantrasyonunu ve 500 nm'de absorbans ile boya konsantrasyonunu kontrol edin.
    9. Aşağıdaki formülü kullanarak etiketleme derecesini ölçün:
      (BirBoya/εBoya)/(proteinin moleküler ağırlığı/mililitre başına miligram protein) = mol boya/mol protein
      BuradaA Boya ve εBoya , sırasıyla boyanın absorbans değeri ve maksimum absorbans dalga boyunda boyanın molar sönme katsayısıdır,59. 280 nm'de ölçüldüğünde, proteinin gerçek emilimi aşağıdaki formülle düzeltilmelidir:
      Birprotein = A280-(BirBoya· CF280)
      CF280, 280 nm'deki içsel emiciliği göz önüne alındığında, belirtilen boya için düzeltme faktörüdür59.
      NOT: Sistein ile modifiye edilmiş bir proteinin ekspresyonu ve saflaştırılmasına odaklanırken, sistein kalıntılarının proteine stratejik olarak sokulmasına dikkat edilmelidir.

6. Mikroskop numune odası hazırlığı

  1. 495 μL ultra saf su ve 5 μL (%0.01 v/v nihai konsantrasyon) Tween-20 (noniyonik yüzey aktif madde) bir hazne sürgüsünün kuyucuğuna ekleyin ve karıştırın. RT'de 30 dakikadan fazla inkübe edin.
  2. Hazneyi iki kez ultra saf suyla nazikçe yıkayın ve kurulayın.
    NOT: Hazne deney için kullanıma hazırdır.

7. Tek moleküllü floresan anizotropi deneyi

  1. İlk olarak, smFA cihazını kalibre edin. Raman saçılan ışığı ölçerek veya kısa bir kullanım ömrüne ve uygun emisyon spektrumuna (örneğin, Eritrosin veya Malakit yeşili) sahip bir boyanın floresansını ölçerek ve ayrıca doymuş bir potasyum iyodür, KI, çözeltisi ile söndürülerek cihaz yanıt fonksiyonunu belirleyin.
  2. Arka plan floresansını düzeltmek için, bir tampon çözeltisinin ölçümlerini yapın. Hızlı dönen bir boyadan veri alarak paralel ve dik dedektörlerin (G-faktörü) bağıl hassasiyetini kalibre edin. Burada, dedektörleri 60 kalibre etmek için 2 nM Rhodamine110 kullanılmıştır.
  3. Monomerik FoxP1 üzerindeki smFA deneyleri için, bir hazne slaytında 500 μL standart tampona (20 mM HEPES, 20 mM NaCl, pH 7.8) 100 pM BODIBY etiketli FoxP1 ve 100 nM etiketsiz FoxP1 ekleyin.
  4. DNA ve monomerik FoxP1 ile titrasyon testi için, 100 pM BODIPY etiketli / 100nM etiketsiz protein karışımına 400 nM DNA ekleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
  5. Dimerik FoxP1 üzerinde smFA deneyleri için, standart tampondaki 100 pM BODIPY etiketli FoxP1'e 500 nM etiketlenmemiş FoxP1 ekleyin. Daha sonra 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  6. DNA ve dimerik FoxP1 ile titrasyon testi için, 100 pM BODIPY etiketli / 500 nM etiketsiz protein karışımına 2000 nM DNA ekleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
  7. Ölçümleri başlatın ve BIFL yazılımında 30 s'lik bir kayıttaki patlama miktarının 60-90 arasında olup olmadığını kontrol edin. Numune daha konsantre ise, bu değere ulaşana kadar seyreltin. Bu adım, tek moleküllü koşulları sağlar.
  8. Monomerik FoxP1 veya dimerik FoxP1 için her ölçümü en az 4 saat boyunca DNA'nın yokluğunda veya varlığında smFA'ya başlatın.
  9. smFA ölçümlerini bölüm 4'te tartışıldığı gibi analiz edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan anizotropisi, floroforun absorpsiyonunun nispi oryantasyonundan ve emisyon dipol momentlerinden kaynaklanır. Floroforlar polarize ışığa maruz kaldığında, gelen ışığın elektrik alan vektörü ile hizalanmış absorpsiyon geçiş momentlerine sahip floroforlar tercihen uyarılır (fotoseçim). Sonuç olarak, uyarılmış durum popülasyonu kısmen yönelimli hale gelir, uyarılmış moleküllerin önemli bir kısmı geçiş momentleri polarize heyecan verici ışığın elektrik alan vektörü ile hizalanır61. Floroforlar, Brown hareketleri nedeniyle dönerler. Böylece, emisyon geçiş momenti de döner ve floresan anizotropisine zaman bağımlılığına neden olur. Bu etki, floresan moleküllerinin dönme hareketlerini ölçmek, bağlanma olaylarını tespit etmek, floroforun ortamını karakterize etmek ve moleküler dinamikleri yakalamak için kullanılabilir.

Tek moleküllü deneyler, numunenin heterojenliğini belirlemek için benzersiz bir şekilde hazırdır. Tek molekül duyarlılığı ve floresan anizotropisinden yararlanmak, çok parametreli floresan spektroskopisine başka bir boyutluluk katar. Tipik bir tek moleküllü konfokal mikroskopta (Şekil 2)20,21, floresan anizotropisi, darbeli lazerler kullanıldığında yoğunluğa dayalı veya zamana bağlı olarak belirlenebilir.

Konfokal mikroskopta62 yüksek sayısal açıklık objektifinin depolarize edici etkilerini dikkate almak için, zamanla çözülen anizotropinin 35,63 uygun formu şu şekilde verilir:

figure-results-1(1)

burada figure-results-2 ve figure-results-3 x dalga boyunda uyarılma sonrası y'inci algılama kanalındaki zamanla çözülen floresan yoğunluğu, paralel ve dik polarizasyon l1 ve l2 için ve bu ölçümlerde kullanılan yüksek sayısal açıklık (NA) objektifi nedeniyle paralel ve dik sinyaller arasındaki karışımı tanımlayan faktörlerdir 35,62, 64. Boya için paralel, figure-results-4ve dikey algılama kanalının algılama verimlerindeki farklılıklar, figure-results-5algılama verimliliklerinin figure-results-6oranı ile düzeltilir. GUV aynı zamanda G faktörü olarak da adlandırılır.

Zamanla çözülen floresan anizotropisi, floroforun daha büyük bir biyomoleküle bağlanmasını açıklamak için çok üstel bir bozunma kullanılarak modellenebilir.

figure-results-7,     (2)

R0, florofora bağımlı temel anizotropidir (tipik olarak R0 = 0.38), R∞ artık anizotropidir ve ρ1 ve ρ2, sırasıyla hızlı (floroforun yerel hareketleri) ve yavaş (makromolekülün küresel hareketi) dönme korelasyon süreleridir.

Tek moleküllü anizotropi ölçümlerinde (Şekil 2), patlamaya entegre floresan ömrü (BIFL) analizi33,35 kullanılarak tek tek yayıcıları tanımlamak için foton varış süreleri kaydedilir. Fotonlar arası varış süreleri (Δt), çalışan bir ortalama kullanılarak düzleştirilir ve ardından görselleştirmeye yardımcı olmak için çizilir. Bu zamanların histogramı, arka plandan kaynaklanan fotonların ortalama ve standart sapmasını belirlemek için yarım Gauss ile donatılmıştır. Standart sapmanın katları olarak ayarlanan keyfi bir eşik, her patlamadaki ilk ve son fotonları tanımlarken tek tek olayları filtrelemek için kullanılır. Her bir patlama içindeki fotonlar daha sonra, denklem 1 ve 2 kullanılarak veya maksimum olabilirlik tahmincisi35 aracılığıyla zamana dayalı ve yoğunluğa dayalı kararlı durum floresan anizotropisinin hesaplanmasını içeren daha fazla analiz için entegre edilir. Tek moleküllü olaylardaki sınırlı foton sayısı nedeniyle, maksimum olabilirlik tahmincisi yalnızca tek bir üstel bileşeni dikkate alır ve daha fazla tartışılmayacaktır.

Tek molekül olaylarının iki boyutlu bir histogramında, ortalama floresan ömrü (τ) ve anizotropi (rxy), ortalama bir dönme süresi olarak (ρ) elde etmek için Perrin'in denklemi29,61 ile ilişkilendirilebilir.

figure-results-8(3)

Spesifik ρ değerleri, farklı patlamaların fotonlarının, denklem 2'nin parametrelerini deneysel bozunmaya (seTRFA) optimize ederek analiz edilebilen birleşik zaman çözümlü floresan anizotropi bozunmasına entegre edildiği "alt topluluk" (se) analizi ile daha yüksek bir kesinlikle elde edilebilir. Zamanla çözülen anizotropi, ns zaman çerçevesi içinde meydana gelen floresan emisyonu içindeki biyomoleküllerin dönme hareketleriyle (yerel ve küresel) ilişkili heterojenliği ve dinamikleri çözebilir.

Tek molekül olaylarındaki dinamikleri tespit etmek için (milisaniye altı ölçekte), zamanla çözülen anizotropi Patlama Varyans Analizi'ni (traBVA)57 tanıttık. TraBVA'da, Mi ardışık foton segmentleri içeren bir foton patlaması için, patlamalar için fazla anizotropi varyansı (s2)

figure-results-9.     (4)

Tek bir anizotropik durum için, σ2 varyansı yalnızca atış gürültüsünden65 kaynaklanır (sn: √N, burada N foton sayısıdır)

figure-results-10(5)

burada m, bir patlamadaki fotonların sayısıdır. Bu nedenle, anizotropideki ek varyansı tanımlamak için, konformasyonel heterojenliğe bağlı aşırı anizotropi varyansını (S2) denklem 4 ve 5 arasındaki fark olarak tanımlayabiliriz.

figure-results-11(6)

Tek tek moleküllerin gözlemi sırasında meydana gelen dinamikleri yakalamak ve varyans yaklaşımını dikkate almak için dinamik anizotropi Foton Dağılım Analizi (daPDA)55,56 kullanılabilir. daPDA'da, floresan yoğunluğu, binom dağılımı olarak ifade edilen bir koşullu olasılık (figure-results-12) izlenerek modellenir.

figure-results-13(7)

Birlikte, bir Poisson dağılımını takip eden arka plan sayım oranının bir tahmini ile

figure-results-14(8)

burada figure-results-15 ayarlanan zaman penceresi başına ortalama arka plan foton sayısıdır. Paralel ve dik arka plan sayımları ve figure-results-16, referans olarak tampon numuneler figure-results-17 kullanılarak ölçülebilir. Deneysel olarak belirlenen floresan anizotropisi, kinetik değişiklikleri içerebilen polarizasyon kanalı başına bir floresan yoğunluğu dağılımı ile bir liyakat χ2 rakamının en aza indirilmesiyle optimize edilir.

Sağlanan analiz rutinleri ve veri temsilleri, toplanan verilerin yorumlanması için kapsamlı bir yaklaşım sunar. Bu protokol esas olarak nanosaniyelerden milisaniyelere kadar anizotropi değişikliklerini yakalamada sınırlı olan konfokal ölçümlere odaklansa da, floresan anizotropisini daha uzun zaman ölçeklerinde izlemek için bir Toplam İç Yansıma mikroskobu benimsemek mümkündür ve bu da zaman serisi analizini mümkün kılar66. Tek moleküllü konfokal ölçümler için, gözlemlenen topluluğun benzersiz bir parmak izini oluşturan çok boyutlu histogramların kullanımını vurguluyoruz. Seçilmiş popülasyonlardan yeniden yapılandırılan zamana bağlı floresan bozunumları, nanosaniye ölçeğinde floresan anizotropisinin evrimini izleyebilir (Şekil 3). Foton dağılımı analizi 55,56 ve patlama varyans analizi (BVA)57,58, zaman çözümlü bozunmalar ve çok boyutlu histogramlar arasındaki ara zaman ölçeklerindeki dinamikleri de yakalayabilir. Bu protokol, nanosaniye ile milisaniye zaman ölçekleri arasında köprü kurabilen darbeli uyarma67,68 olsun veya olmasın polarizasyon floresan korelasyon spektroskopisinin (FCS) kullanımını kapsamamakla birlikte, aynı veriler FCS69'u hesaplamak için kullanılabilir, ancak bu, sunulan protokolün kapsamı dışındadır. Bu tür deneyler yapılırsa, daha uzun numune ölçüm süresi önerilir.

Bu yaklaşım, insan FoxP proteinleri gibi karmaşık bir sisteme uygulanmış ve etki mekanizmalarında yer alan hareketler hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. FoxP proteinleri, beyin ve akciğer gelişimi gibi çeşitli fizyolojik yönlerde yer alan transkripsiyon faktörleridir; Daha da önemlisi, farklı mutasyonların bu proteinlerin işlevini bozduğu kabul edilmiştir70,71. FoxP1'in DNA bağlama alanını bir model olarak kullanarak, hareketler için bir izleyici olarak bir BODIPY-FL boyasını tanıtmak için farklı tek sistein mutantları ürettik (Şekil 4A). Aslında, dimerizasyonun ve DNA bağlanmasının etkisini bu proteinin ana yapısal düzenleyicileri olarak değerlendirdik. SmFA yaklaşımını kullanarak, 2D-smFA grafikleri oluşturduk ve monomerik ve dimerik koşullarda her mutant için traBVA ve daPDA yaptık. İncelenen tek mutantlardan birinin bir örneğini gösteriyoruz (Şekil 4). Anizotropi davranışı, yüksek ve düşük dönme korelasyon sürelerini ve dolayısıyla muhtemel, düzensiz ve katlanmış toplulukları belirleme açısından tüm mutantlarda benzerdir. Yine de, her bir topluluğun fraksiyonu ve kinetiği açısından tüm mutantlarda oldukça heterojendir, dimerizasyon ve DNA bağlanmasından etkilenen farklı düzenden bozukluğa geçiş değişikliklerini kanıtlar ve zincir boyunca yapısal dinamiklerin yüksek çözünürlükte tanımını gösterir (Şekil 5).

figure-results-18
Şekil 1: Dinamik biyomolekül aralığı ve floresan anizotropi yöntemleri. (A) İlgilenilen biyomolekülün omurgası boyunca çeşitli konumlara bağlı küçük floroforların anizotropisi, yerel yapısal dinamikleri bilgilendirir. (B) Floresan yoğunluğu bozunmaları (zamana bağlı floresan anizotropisi, FA) ve konfokal tek moleküllü mikroskop verilerinin tek moleküllü histogramları ile incelenen zaman ölçekleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-19
Şekil 2: Tek moleküllü floresan anizotropi veri kaydı ve işlenmesi. (A) Serbestçe yayılan moleküller, tek bir doğrusal polarize uyarma lazeri (bizim durumumuzda mavi) ile donatılmış konfokal tek moleküllü bir mikroskop kullanılarak analiz edilir. Floresan emisyonu (bizim durumumuzda yeşil), bir ışın polarizörü sinyali iki polarizasyona (uyarma kaynağına paralel, figure-results-20ve dikey) figure-results-21böldükten sonra iki dedektör tarafından tespit edilir. (B) Tespit edilen her foton üç parametre ile karakterize edilir: mikro zaman, makro zaman ve kanal tipi. Veriler, Zaman Etiketli Zaman Çözümlü (TTTR) biçiminde saklanır72. (C) Gözlemlenen her molekül için floresan anizotropisi dahil olmak üzere floresan parametrelerini çıkarmak için tek tek moleküllerin patlamaları seçilir ve işlenir. (D) Veriler, floresan ömrüne karşı floresan anizotropisinin iki boyutlu grafikleri ve zamanla çözülen anizotropi bozunmaları dahil olmak üzere çeşitli şekillerde temsil edilir. Bu temsiller, floresan ömürlerinin, dönme korelasyon sürelerinin ve sistem heterojenliğinin hem görsel hem de nicel olarak belirlenmesine izin verir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-22
Şekil 3: FoxP1 alan adı değiştirilmiş dimer için temsili veriler. (A) Floresan anizotropisinin (rsaçılması) bir kontur grafiği olarak molekül başına ortalama floresan ömrüne karşı korelasyonu. Sırasıyla 0.2 ns ve 8.5 ns'nin ρ 1 ve ρ2'si dikkate alınarak, molekülün topluluk ortalamasının bir temsilcisi olarak iki dönme bileşeni için tek bir Perrin denkleminin üst üste bindirilmesi. (B) Alt topluluk zaman çözümlü floresan bozunmaları, numunenin zaman çözümlü floresan anizotropisini hesaplamak için kullanılır. Denklem 2 ile uyum, floresan anizotropisinin yerel ve küresel bileşenlerini çözdü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-23
Şekil 4: Tek moleküllü floresan anizotropisi (smFA) kullanılarak izlenen milisaniye altı FoxP1 dinamikleri. (A) Monomerik FoxP1 yapısının karikatür temsili. (B) İki boyutlu bir histogram, dinamik heterojenliği gösterir ve zamanla çözülen floresan anizotropisi ile tanımlanan iki farklı dönme korelasyon süresini ortaya çıkarır. Zamanla çözülen anizotropi Patlama Varyans Analizi (traBVA), büyük anizotropi sergileyen aşırı varyansa (Eşitlik 6) sahip küçük bir olay alt kümesini ortaya çıkarır. Foton Dağılım Analizi (PDA) kullanan kantitatif dinamik anizotropi analizi, bu işlem için döviz kurlarını daha da çıkarır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-24
Şekil 5: Dimerizasyon sırasında FoxP1'in yerel ve küresel hareketlerinin taranması. (A) Bir çizgi film temsili, monomerik FoxP1'i dimerik formuyla karşılaştırır. (B) Monomerik ve dimerik koşullar altında konum başına ortalama aşırı varyans gösterilir ve daha büyük aşırı varyans anizotropide daha önemli değişiklikleri gösterir. (C) Foton Dağılım Analizi (PDA) kullanan dinamik anizotropi analizi, DNA'nın yokluğunda (yeşil) ve varlığında (sarı) popülasyon fraksiyonlarının (koyu renklerde yüksek anizotropi ve açık renkte düşük anizotropi) belirlenmesine yardımcı olur. Bu yaklaşımda, yerel ve küresel davranışlar arasındaki geçişler için oranlar (gösterilmemiştir) tahmin edildi ve bu da FoxP1'in kısmi açılmaya uğradığını ortaya koydu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek moleküllü floresan anizotropi deneyleri için, seçilen floroforun fotofiziksel özelliklerini dikkatli bir şekilde dikkate almak çok önemlidir. Bu özellikler, algılama sistemi ile uyumlu olması gereken emisyon dalga boyunu ve mevcut darbeli lazerlerle uyumlu olması gereken uyarma dalga boyunu içerir. Dinamik aralığı optimize etmek için, floroforun molekülün dönme difüzyon süresine göre uzun bir floresan ömrüne sahip olması gerekir. Bu, dönme dinamiklerini ve floroforun dipolünün ilgilenilen biyomoleküle göre bağlantısını/yönelimini izlemek için kritik öneme sahiptir. Ek olarak, parlaklık, fotokararlılık ve kuantum verimi, kararlı bir sinyal-gürültü oranına sahip güçlü sinyaller üretmek için gereklidir. Bu nedenlerden dolayı, BODIPY-FL çeşitli çalışmalarda florofor olarak seçilmiştir 39,40,42.

Biyomoleküllerin omurga dinamiklerinin taranması genellikle bölgeye özgü etiketleme yoluyla elde edilen protein etiketlemesini gerektirir. Bu genellikle hedeflenen kimyasal modifikasyon için bir kalıntı eklenerek yapılır. En yaygın yaklaşım, sisteinlerin, tiyol yan zincirlerinin maleimidler veya iyodoasetamidler gibi reaktiflerle seçici olarak değiştirilebildiği ilgili pozisyonlara sokulmasıdır. Daha az yaygın olarak, benzilik halojenürler ve bromometil ketonlar, tiyoeter bağları oluşturmak için kullanılır. Diğer amino asit yan zincirleri de hedeflenebilir, ancak proteinlerdeki bollukları daha az yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, doğal olmayan amino asitler gibi alternatif yaklaşımlar da kullanılabilir73. Etiketleme için uygun yer seçimi, incelenen biyomolekül ile etkileşimi en aza indirmek için çok önemlidir ve uygun kontroller yerinde olmalıdır. Örneğin, etiketli molekül bağlanma deneylerinde kullanılıyorsa, tamamlayıcı etiketsiz yöntemler, floroforların bağlanma afinitesini etkilemediğini doğrulamalıdır.

Uygun numuneyi belirledikten ve en uygun etiketleme stratejisini uyguladıktan sonra, bir sonraki adım, konfokal mikroskobun tek moleküllü deneyler için uygun şekilde hizalandığından ve kalibre edildiğinden emin olmaktır. Protokol, daha fazla analiz için gerekli faktörün nasıl belirleneceğini açıklar. Cihaz kalibre edildikten sonra, bir sonraki adım, numuneyi ölçmek ve tespit edilen fotonlardan mümkün olduğunca fazla bilgi elde etmek için verileri işlemektir. Şekil 2'de gösterildiği gibi mikro zaman, makro zaman ve kanal türü gibi temel parametreler, tipik TCSPC elektroniği kullanılarak daha fazla analiz ve görselleştirme için kullanılabilir.

Tek moleküllü floresan spektroskopisindeki son gelişmeler, heterojen biyomolekül topluluklarından yapısal bilgileri incelemek için yaygın olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, nispeten az sayıda çalışma, floresan anizotropisi tarafından sağlanan içgörülerden yararlanır ve biyomoleküllerin yapısal dinamiklerini elde etmek için eksiksiz bir protein modeli gereklidir. Bu nedenle, çeşitli transkripsiyon faktörlerinin alanlar arası ve protein-protein etkileşimlerinin dinamiklerini çözmek zordur.

Sonuç olarak, tek moleküllü floresan anizotropi deneyleri, biyomoleküler omurganın işlevini anlamak için kritik olan yerel ve küresel hareketleri hakkında tamamlayıcı bilgiler sunar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar, bu makalenin içeriği ile rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, FONDECYT hibeleri 11200729 ve FONDEQUIP EQM200202 tarafından EM, NIH R15CA280699 R01GM151334 ve NSF KARİYER MCB 1749778 ödülleri HS'ye verilmiştir. NK, Clemson Üniversitesi Doktora Sonrası burs programından destek aldığını kabul etti.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 488ThermoFisher ScienctificA20100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100
Amicon Ultra Santrifüj Filtre, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC901008https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010
Ampisilin sodyum tuzuMillipore SigmaA0166-5Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166
BODIP FL Maleimide (BODIPY FL N-(2-Aminoetil))Maleimid))ThermoFisher ScienctificB10250
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250 Tek Kullanımlık PD 10 Tuzdan Arındırma KolonlarıMillipore SigmaGE17-0851-01https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101
DithiothreitolMillipore Sigma10197777001 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro
DMSO, SusuzThermoFisher ScienctificD12345https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345
DNAseMillipore Sigma10104159001 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001
E. coli C41 bakteri hücreleri Invitrogen
Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, 5 mL kolonBio-Rad12004037https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037
HEPESMillipore Sigma7365-45-9https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375
İmidazolMillipore Sigma288-32-4https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513
IPTGMillipore SigmaI6758-1Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758
MCE Membran Filtre, 0.22 & mu; m Gözenek BoyutuMillipore SigmaGSWP02500https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500
NaClMillipore Sigma7647-14-5https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014
Nunc Lab-Tek II Hazneli Kızak SistemiThermoFisher Scienctific154534
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534 OverExpress C41(DE3) Kimyasal Olarak Yetkili HücrelerMillipore SigmaCMC0017-20X40ULhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017
PMSFMillipore Sigma329-98-6https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830
Rhodamine 110ThermoFisher Scienctific419075000https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000
Sodyum fosfat dibazikMillipore Sigma7558-79-4https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264
Sodyum fosfat monobazik dihidratMillipore Sigma13472-35-0https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505
TCEP, Hidroklorür, Reaktif SınıfıMillipore Sigma580567-5GMhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567
Tween 20Millipore Sigma11332465001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooper, A. Thermodynamic fluctuations in protein molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (8), 2740-2741 (1976).
  2. Volozhin, S. I. Inguinal hernia in cryptorchism. Khirurgiia (Mosk). 450 (7), 69-71 (1975).
  3. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838-844 (2007).
  4. Karplus, M., Mccammon, J. A. The internal dynamics of globular-proteins. CRC Crit Rev Biochem. 9 (4), 293-349 (1981).
  5. Ishima, R., Torchia, D. A. Protein dynamics from nmr. Nat Struct Biol. 7 (9), 740-743 (2000).
  6. Fernandez, F. J., Querol-Garcia, J., Navas-Yuste, S., Martino, F., Vega, M. C. X-ray crystallography for macromolecular complexes. Adv Exp Med Biol. 3234, 125-140 (2024).
  7. Bai, X. C., Mcmullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  8. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically unstructured proteins: Re-assessing the protein structure-function paradigm. J Mol Biol. 293 (2), 321-331 (1999).
  9. Tompa, P. Intrinsically unstructured proteins. Trends Biochem Sci. 27 (10), 527-533 (2002).
  10. Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (3), 197-208 (2005).
  11. Csermely, P., Palotai, R., Nussinov, R. Induced fit, conformational selection and independent dynamic segments: An extended view of binding events. Trends Biochem Sci. 35 (10), 539-546 (2010).
  12. Camacho-Zarco, A. R., et al. NMR provides unique insight into the functional dynamics and interactions of intrinsically disordered proteins. Chem Rev. 122 (10), 9331-9356 (2022).
  13. Drenth, J. Principles of Protein X-Ray Crystallography. , Springer, Verlag. New York, NY. (2007).
  14. Loeb, H. Systematic diagnosis of chronic diarrhea in infants and small children. Kinderarztl Prax. 44 (1), 36-41 (1976).
  15. Ellaway, J. I. J., et al. Identifying protein conformational states in the protein data bank: Toward unlocking the potential of integrative dynamics studies. Struct Dyn. 11 (3), 034701(2024).
  16. Berjanskii, M. V., Wishart, D. S. A simple method to predict protein flexibility using secondary chemical shifts. J Am Chem Soc. 127 (43), 14970-14971 (2005).
  17. Puthenveetil, R., Vinogradova, O. Solution NMR: A powerful tool for structural and functional studies of membrane proteins in reconstituted environments. J Biol Chem. 294 (44), 15914-15931 (2019).
  18. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule fret measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  19. Weidtkamp-Peters, S., et al. Multiparameter fluorescence image spectroscopy to study molecular interactions. Photochem Photobiol Sci. 8 (4), 470-480 (2009).
  20. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. M. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  21. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for fret-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  22. Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. aM. Combining graphical and analytical methods with molecular simulations to analyze time-resolved fret measurements of labeled macromolecules accurately. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
  23. Hamilton, G. L., Sanabria, H. Multiparameter Fluorescence Spectroscopy of Single Molecules. Spectroscopy and Dynamics of Single Molecules. , Elsevier. Cambridge, MA. (2019).
  24. Kolimi, N., et al. Out-of-equilibrium biophysical chemistry: The case for multidimensional, integrated single-molecule approaches. J Phys Chem B. 125 (37), 10404-10418 (2021).
  25. Felekyan, S., Sanabria, H., Kalinin, S., Kuhnemuth, R., Seidel, C. A. Analyzing forster resonance energy transfer with fluctuation algorithms. Methods Enzymol. 519, 39-85 (2013).
  26. Medina, E. D. R. L., Sanabria, H. Unraveling protein's structural dynamics: From configurational dynamics to ensemble switching guides functional mesoscale assemblies. Curr Opin Struct Biol. 66, 129-138 (2021).
  27. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (37), E5389-E5398 (2016).
  28. Gomes, G. W., et al. Conformational ensembles of an intrinsically disordered protein consistent with NMR, SAXS, and single-molecule fret. J Am Chem Soc. 142 (37), 15697-15710 (2020).
  29. Perrin, F. Polarisation de la lumière de fluorescence. Vie moyenne des molécules dans l'etat excité. J phys radium. 7 (12), 390-401 (1926).
  30. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules. I. Theory and experimental method. Biochem J. 51 (2), 145-155 (1952).
  31. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules. II. Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochem J. 51 (2), 155-167 (1952).
  32. Jameson, D. M., Ross, J. A. Fluorescence polarization/anisotropy in diagnostics and imaging. Chem Rev. 110 (5), 2685-2708 (2010).
  33. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Gunther, R., Seidel, C. A. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  34. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. aM. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  35. Schaffer, J., et al. Identification of single molecules in aqueous solution by time-resolved fluorescence anisotropy. Journal of Physical Chemistry A. 103 (3), 331-336 (1999).
  36. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  37. Gradinaru, C. C., Marushchak, D. O., Samim, M., Krull, U. J. Fluorescence anisotropy: From single molecules to live cells. Analyst. 135 (3), 452-459 (2010).
  38. Mazal, H., Haran, G. Single-molecule fret methods to study the dynamics of proteins at work. Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).
  39. Tsytlonok, M., et al. Specific conformational dynamics and expansion underpin a multi-step mechanism for specific binding of p27 with cdk2/cyclin a. J Mol Biol. 432 (9), 2998-3017 (2020).
  40. Tsytlonok, M., et al. Dynamic anticipation by cdk2/cyclin a-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nat Commun. 10 (1), 1676(2019).
  41. Cruz, P., et al. Domain tethering impacts dimerization and DNA-mediated allostery in the human transcription factor foxp1. J Chem Phys. 158 (19), (2023).
  42. Kolimi, N., et al. DNA controls the dimerization of the human foxp1 forkhead domain. Cell Rep Phys Sci. 5 (3), 101854(2024).
  43. Yanez Orozco, I. S., et al. Identifying weak interdomain interactions that stabilize the supertertiary structure of the n-terminal tandem PDZ domains of PSD-95. Nat Commun. 9 (1), 3724(2018).
  44. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  45. Rigler, R., Elson, E. S. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Theory and Applications. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2012).
  46. Aragon, S. R., Pecora, R. Fluorescence correlation spectroscopy as a probe of molecular-dynamics. J Chem Phys. 64 (4), 1791-1803 (1976).
  47. Mockel, C., et al. Integrated NMR, fluorescence, and molecular dynamics benchmark study of protein mechanics and hydrodynamics. J Phys Chem B. 123 (7), 1453-1480 (2019).
  48. Shu, W., Yang, H., Zhang, L., Lu, M. M., Morrisey, E. E. Characterization of a new subfamily of winged-helix/forkhead (Fox) genes that are expressed in the lung and act as transcriptional repressors. J Biol Chem. 276 (29), 27488-27497 (2001).
  49. Co, M., Anderson, A. G., Konopka, G. Foxp transcription factors in vertebrate brain development, function, and disorders. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (5), e375(2020).
  50. Takahashi, H., Takahashi, K., Liu, F. -C. FOXP Genes, Neural Development, Speech and Language Disorders. Forkhead Transcription Factors: Vital Elements in Biology and Medicine. , Springer. New York, NY. (2009).
  51. Wang, B., Lin, D., Li, C., Tucker, P. Multiple domains define the expression and regulatory properties of foxp1 forkhead transcriptional repressors. J Biol Chem. 278 (27), 24259-24268 (2003).
  52. Leake, M. C., Quinn, S. D. A guide to small fluorescent probes for single-molecule biophysics. Chem Phys Rev. 4 (1), 011302(2023).
  53. Zhang, H., Wu, Q., Berezin, M. Y. Fluorescence anisotropy (polarization): From drug screening to precision medicine. Expert Opin Drug Discov. 10 (11), 1145-1161 (2015).
  54. Ma, J., et al. High precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination. J Vis Exp. (123), e55623(2017).
  55. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. J Phys Chem B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  56. Mcgeer, P. L., Mcgeer, E. G. Enzymes associated with the metabolism of catecholamines, acetylcholine and gaba in human controls and patients with parkinson's disease and huntington's chorea. J Neurochem. 26 (1), 65-76 (1976).
  57. Terterov, I., Nettels, D., Makarov, D. E., Hofmann, H. Time-resolved burst variance analysis. Biophys Rep (N Y). 3 (3), 100116(2023).
  58. Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. Identifying molecular dynamics in single-molecule fret experiments with burst variance analysis. Biophys J. 100 (6), 1568-1577 (2011).
  59. Haugland, R. P. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Molecular Probes. , (2005).
  60. Medina, E., et al. Intrinsically disordered regions of the DNA-binding domain of human foxp1 facilitate domain swapping. J Mol Biol. 432 (19), 5411-5429 (2020).
  61. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York, NY. (2007).
  62. Koshioka, M., Sasaki, K., Masuhara, H. Time-dependent fluorescence depolarization analysis in three-dimensional microspectroscopy. Appl Spectrosc. 49 (2), 224-228 (1995).
  63. Kudryavtsev, V., et al. Combining mfd and pie for accurate single-pair forster resonance energy transfer measurements. Chemphyschem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  64. Van Zanten, T. S., Greeshma, P. S., Mayor, S. Quantitative fluorescence emission anisotropy microscopy for implementing homo-fluorescence resonance energy transfer measurements in living cells. Mol Biol Cell. 34 (6), tp1(2023).
  65. Laine, R. F., Jacquemet, G., Krull, A. Imaging in focus: An introduction to denoising bioimages in the era of deep learning. Int J Biochem Cell Biol. 140, 106077(2021).
  66. Strohl, F., Wong, H. H. W., Holt, C. E., Kaminski, C. F. Total internal reflection fluorescence anisotropy imaging microscopy: Setup, calibration, and data processing for protein polymerization measurements in living cells. Methods Appl Fluoresc. 6 (1), 014004(2017).
  67. Loman, A., Gregor, I., Stutz, C., Mund, M., Enderlein, J. Measuring rotational diffusion of macromolecules by fluorescence correlation spectroscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (5), 627-636 (2010).
  68. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem Phys Lett. 353 (5-6), 439-445 (2002).
  69. Peulen, T. -O., et al. Tttrlib: Modular software for integrating fluorescence spectroscopy, imaging, and molecular modeling. arXiv. , (2024).
  70. Le Fevre, A. K., et al. Foxp1 mutations cause intellectual disability and a recognizable phenotype. Am J Med Genet A. 161A (12), 3166-3175 (2013).
  71. Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in foxp1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87 (5), 671-678 (2010).
  72. Wahl, M., Orthaus-Müller, S. Time tagged time-resolved fluorescence data collection in life sciences. , https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2014).
  73. Lemke, E. A. Site-specific labeling of proteins for single-molecule fret measurements using genetically encoded ketone functionalities. Methods Mol Biol. 751, 3-15 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Single Molecule AnalysisConfocal MicroscopyFoxP1 DimerizationDNA Binding DynamicsBurst Variance AnalysisPhoton Distribution AnalysisProtein LabelingStructural DynamicsTime Resolved Measurements

İlgili makaleler