Yöntem makalesi

Drosophila Activity Monitor Sistemini Kullanarak Isı Toleransı Testleri: Veri Analizi için Yürütülebilir Bir Uygulama Kılavuzu

1.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67814

⸱

13 Aralık 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nebraska at Kearney, 2School of Computing, University of Nebraska-Lincoln, 3Department of Psychology, University of Nebraska at Kearney, 4School of Biological Sciences, University of Nebraska-Lincoln

Bu makalede

Özet

Bu rapor, bir inkübatör odası içindeki bir hava iletimi ısı stresörüne yanıt olarak bir Drosophila Aktivite Monitörü (DAM2) kullanarak yetişkin Drosophila melanogaster'in devrilme süresini ölçmek için bir yöntemi açıklar. DAM2, bir kızılötesi ışını geçerken bireysel sinek hareketlerini kaydederek aktiviteyi ölçer. Veri analizi, yazarlar tarafından oluşturulan yeni bir yürütülebilir dosya ile kolaylaştırılır.

Özet

Drosophila melanogaster'de ısı toleransı çalışması, onlarca yıldır araştırmacılar için özel bir ilgi alanı olmuştur ve ısı toleransını değerlendirmek için ortak bir yaklaşım, yüksek bir sıcaklığa maruz kaldıktan sonra devrilme süresini (TKD) izlemektir. Klasik olarak, sinekler ayrı şişelere yerleştirilir ve ısıtılmış bir su banyosunun içine yerleştirilir. TKD daha sonra araştırmacılar tarafından manuel olarak izlenir. Çok iyi kurulmuş olsa da, bu manuel tahlilleri uygularken kas spazmları da dahil olmak üzere tüm hareketlerin durdurulmasının somut bir tanımının öznellik ve tutarlı bir şekilde uygulanması sorunları devam etmektedir. TriKinetics Drosophila Activity Monitors'ü (DAM2) kullanarak ısı toleransı testlerini otomatikleştirmek için yüksek verimli bir yöntem geliştirdik. DAM2 sistemine eşlik etmek için, oluşturulan aktivite verilerinden son hareket zamanını otomatik olarak okumak için bir program yazdık ve kullanımı kolay bir yürütülebilir dosya oluşturduk. Bu komut dosyası daha sonra bir .csv dosyasına her sinek için ısı felci (TKD) süresini yazar. Verilerimiz, bu otomatik DAM2 yönteminin tutarlı ve güvenilir olduğunu göstermektedir. Bu arada, etkinlik sayısı verilerinden oluşturulan etkinlik profilleri ilgi çekicidir. Bu aktivite profilleri derlenebilir ve ısı toleransı tahlillerini, ısı toleransının nispeten çalışılmamış davranışsal bileşenlerini içerecek şekilde genişletme potansiyeline sahiptir. Bu protokol, DAM2 sisteminin ve HoTDAM'ın nasıl kullanılacağını ayrıntılı olarak açıklayacaktır! D. melanogaster'de ısı toleransını tahmin etmek için yazılım.

Giriş

Ektotermler tipik olarak artan lokomotor aktivite ile ısı stresine yanıt verir. Bu fenomen, 1944'te Cowles ve Bogert tarafından tanımlanan karakteristik davranışsal tepki ile araştırmacılar tarafından onlarca yıldır görülmektedir1. Isı stresi altındaki bir organizmanın ilk olarak nasıl artan lokomotor hareket göstereceğini açıkladılar. Isı stresi arttıkça, kısa süreli aktivite patlamaları, hareketsizlik dönemleri ile serpiştirilir. Organizmanın artık koordineli hareket gösteremediği sıcaklık, kritik termal maksimumdur (CTmax). Bunu kas spam'leri takip eder ve sonuçta organizmaçöker 1,2. Bu çöküşü tanımlamak zordur ve "ısı sertliği, koma veya ölüm"2 gibi bir şeyi temsil eder. Burada, fizyolojik çöküş terimini, teorik olarak ısı stresinin bu bulanık son noktasına atıfta bulunmak için kullanacağız.

Drosophila melanogaster ve diğer küçük böcekler, ısı stresini incelemek için değerli modeller olmuştur. Isı toleransını oluşturan karmaşık özellikler koleksiyonunun en azından bir kısmını tahmin etmek için, birçok araştırmacı, sırasıyla devrilme süresini (TKD) ve CTmax'ı temsil eden fizyolojik çöküşün meydana geldiği zamanı ve sıcaklığı manuel olarak gözlemlemiştir. Çok iyi kurulmuş olmasına rağmen, bu manuel tahlil yöntemleri bazı dezavantajlara sahiptir. Fizyolojik çöküşün operasyonel bir tanımını oluşturmak ve tüm vakalara uygun şekilde uygulamak, özellikle gözlemciler daha az deneyimli olduğunda, zor olabilir. Örneğin, organizma hangi noktada kas spazmlarından çökmeye başlar? Çökmeden önceki kas spazmları ve nöbet aktivitesinin paterni tahmin edilemez olabilir ve doğru gözlemikarmaşıklaştırabilir 2,3, doğruluk ve hassasiyeti tehdit edebilir. Bu arada, gözlemdeki zorluk, bir kerede test edilebilecek organizma sayısını da sınırlayarak ölçeklenebilirliği sınırlar.

Aktivitedeki bir artış, ısıya tutarlı bir yanıt olduğundan ve TKD ve CTmax nihayetinde aktivitenin durduğu nokta olduğundan, ısı toleransı testlerini otomatikleştirmek için TriKinetics'in Drosophila Aktivite Monitörlerini (DAM2) kullanmaya çalıştık. Kısa bir süre önce, DAM2 sistemini kullanarak kullanımı kolay bir yazılımla birlikte otomatik bir test için bir yöntem yayınladık4. Tahlil, TKD cinsinden ısı toleransı ölçümleri ile klasik manuel gözlem tabanlı TKD tahlili çeşitli faktörlerde karşılaştırılarak doğrulandı. Ayrıca, indüklenebilir termotolerans fenotipini daha fazla karakterize etmek için TKD testlerinin lokomotor aktivite bileşenini de araştırdık. Tahlil ve beraberindeki yazılıma HoTDAM adını verdik! (Drosophila Aktivite İzleme Sistemi kullanılarak Isı Toleransı testleri). Burada, DAM2 sistemini ve HoTDAM'ı kullanarak otomatik ısı toleransı test yönteminin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz! yazılım. Testin kullanımı kolaydır ve aynı anda birçok organizmanın ölçümüne izin vermek için kolayca ölçeklenebilir.

Bu yazıda, termosensoriyel mutant sinekler (geçici reseptör potansiyeli ankyrin 1; TRPA1) ve genetik kontrolleri (White1118; W1118). Bu organizmalar, tahlil için ısı stresi sırasında görülen karakteristik artan aktivitenin önemini vurgulamak için seçilmiştir. Yani, TRPA1 organizmaları bu kaçış davranışını göstermez, bu da korunmuş davranışsal tepkiler ile TKD gibi ısı toleransı tahminleri arasındaki içsel bağlantıyı gösterir. Testi hem kadınlar hem de erkekler için gerçekleştirdik ve ısıyla sertleştirici bir ön işlem uyguladık. Burada sunulan temsili sonuçlar, daha önce yayınlanan orijinal doğrulama testlerinde kullanılanlardan tamamen yeni tahlillerden elde edilen verilerdir.

Protokol

1. Sinek hayvancılığı

  1. Araştırma için uygun sinek stoğunu/hattını seçin.
    NOT: Testi göstermek için, geçici reseptör potansiyeli TRPA1 nakavt stoğunu ve genetik kontrolü olan w1118 stoğunu kullandık.
  2. Sinek stoklarını uygun şekilde tutarlı koşullar altında tutun. Bu protokolü takip etmek için, ev stokları standart gıdalarda (mısır unu, pekmez ve torula mayası) 12:12 günlük döngü altında 25 °C'de stoklar.
  3. Hafif anestezi ile erkekleri ve kadınları ayırın.
    NOT: Deneye bağlı olarak, bakire veya çiftleşmiş sinekler kullanılabilir.
    1. Yetişkin erkek ve dişilerin (her iki stok için ayrı ayrı) 5 gün boyunca çiftleşmesine ve yumurtlamasına izin verin. Yetişkinleri şişelerden temizleyin.
    2. Yetişkinler birkaç gün sonra kapanmaya başladığında, şişeleri tekrar temizleyin. 2 gün sonra, hafif eter anestezisi kullanarak erkekleri ve dişileri ayırın ve flakon başına 25 sinek yoğunluğunda ayrı ayrı olgunlaşmalarına izin verin.

2. Ön arıtma

  1. Deney gruplarını (genetik, çevresel, farmakolojik veya başka türlü) tanımlayacak ön tedavi veya bağımsız değişkeni uygulayın.
    1. Bu protokolü takip etmek için, yetişkinleri cinsiyete göre ayırın ve 5 gün sonra, organizmaları içeren kapalı bir şişeyi 1 saat boyunca 37 ° C'de bir su banyosuna batırarak yetişkinlerin yarısını ön işleme tabi tutun. Kontrolleri inkübatörde 25 °C'de tutun. Isı toleransı testinden önce, ön işlemden sonra sineklerin 24 saat iyileşmesine izin verin.

3. DAM2 sistem kurulumu

  1. Sinekleri DAM2 monitör tüplerine yükleyin ve tüplerin her iki ucunu da pamukla kapatın. Sinekler hemen ısı toleransı açısından değerlendirilecekse, anesteziye maruz kalmayla ilişkili olası karıştırıcı etkilerden kaçınmak için organizmaları monitör tüplerine yüklerken herhangi bir anestezi kullanmayın. Bunun yerine, tutma şişelerinden tek tek sinekleri monitör tüplerine aspire edin.
  2. Tahlil tüplerini aktivite monitörlerine yerleştirin ve farklı grupların hangi yuva numaralarının yüklendiğine dikkat edin.
    NOT: Monitördeki konum kafa karıştırıcı bir değişken olarak kabul edilebilirse, bunlar deneye bağlı olarak rastgele hale getirilebilir.
  3. DAM2 veri toplama yazılımı
    NOT: DAM2 sistemi ve yazılımı, şirketin web sitesinde bulunan DAMSystem3 Yazılım Veri Sayfasında ayrıntılı olarak açıklanmıştır (bkz. Malzeme Tablosu). Özel sorun giderme ve genel işlevler için DAM2 talimatlarına bakın. Burada, sistemin ısı toleransı analizimiz bağlamında kullanılması için rehberlik sağlıyoruz.
    1. DAM2 sistemi, her bir tüp içindeki tek bir sineğin bir kızılötesi ışını kaç kez kırdığını izler. Veri toplama yazılımı daha sonra bu sayıyı tanımlanan her zaman aralığında indeksler ve sıfırlar. Tercihler altında, tahlilde kullanılacak okuma aralığını seçin. Çözünürlük ve okuma hataları arasında iyi bir denge sağlamak için 15 s'lik bir okuma aralığı bulduk.
      NOT: Okuma aralığının saniye cinsinden kullanılan monitör sayısından daha kısa olmaması önerilir. Daha kısa bir okuma aralığı, tahlillere daha iyi zamansal çözünürlük sağlayacaktır, ancak aynı zamanda okuma hatası örneklerini de potansiyel olarak artıracaktır. Yazılım, okumaları dizine eklemeye çalışırken geride kalabilir. Ek olarak, daha yeni ve daha hızlı bir bilgisayar, okuma hatalarını önlemede uzun bir yol kat eder.
    2. Okuma hatalarını göz önünde bulundururken, DAM2 veri toplama yazılımını çalıştırmak için kullanılan bilgisayarın, testi kesintiye uğratmamak için asla uyku veya hazırda bekletme moduna geçmeyecek şekilde ayarlandığından emin olun. Ayrıca, veri toplanırken otomatik güncellemelerin (kurum tarafından kontrol edilen ağ güncellemeleri dahil) kapalı olarak ayarlandığından emin olun.
    3. Tüm monitörlerin bağlı olduğunu ve yazılımla iletişim kurduğunu kontrol edin. Geçerli veri sekmesi altında her monitörün durumunun yeşil olduğunu onaylayın.
      NOT: Farklı renk kodlarının hangi sorunlara işaret ettiğiyle ilgili ayrıntılar için DAMSystem3 Yazılım Veri Sayfasına bakın.
    4. Veri toplama yazılımı, etkinlik sayılarını otomatik olarak sistem dosyaları içindeki Veri klasöründeki metin dosyalarına yazacaktır. Veri analizini kolaylaştırmak için, herhangi bir tahlil için veri toplama yazılımını başlatmadan önce bu Veri klasöründeki tüm metin dosyalarını silin.
      NOT: Metin dosyaları otomatik olarak doldurulur, bu nedenle programı engellemeden eski verileri temizlemek için bunları bu klasörden kaldırmanıza izin verilir.

4. Isı toleransı deneyi

  1. Monitörleri tahlil inkübatörüne yükleyin.
  2. Toplama yazılımını başlatın ve ısı stresini uygulamadan önce yazılımın belirli bir süre boyunca indekslenmesine izin verin (örneğin, 40 indeks veya okuma aralığı 15 s'ye ayarlanmışsa 10 dakika).
    NOT: Bu, tüplere bir miktar alışmaya ve monitörleri kurarken monitörlerin hareketinden toparlanmaya izin verir. Özellikle tahlil sırasındaki aktivite analiz ediliyorsa, bu alışma süresi, ısı stresinin indüksiyonundan önce bir temel aktivite oluşturacaktır. Gerçekleştirilen testin spesifik doğasına bağlı olarak, bu iklimlendirme aşaması, monitörler zaten stres sıcaklığında olan inkübatöre doğrudan yerleştirilerek atlanabilir.
  3. Statik (TKD) bir test yapıyorsanız, inkübatörü, alışma süresinden sonra ayarlanan zararlı sıcaklığa mümkün olduğunca çabuk rampa yapacak şekilde ayarlayın. Yanıt değişkeni, TKD'yi tahmin etmek için en son kaydedilen hareket zamanı (yani sıfır olmayan son endeks) olarak işlevselleştirilecektir.
    1. Dinamik bir tahlil yapıyorsanız, alışma süresinden sonra sıcaklığın artacağı hızı belirleyin. Burada ölçülen yanıt değişkeni teknik olarak tekrar zamandır. Son hareketin kaydedildiği zaman, rampa hızına bağlı olarak bir sıcaklık (CTmax) ile çakışacaktır.
    2. Toplama yazılımındaki DAM sistem ekranında etkinlik sayılarını gerçek zamanlı olarak izleyin veya DAMSystem3 program dosyalarındaki veri klasöründeki metin dosyalarını doğrudan inceleyin. Canlı veri kaydında herhangi bir soruna neden olmamak için metin dosyalarını kopyalayın ve veri klasöründeki orijinal dosyanın aksine kopyayı açın.
    3. Birkaç dakika boyunca sineklerin hiçbirinde hareket görülmediğinde, edinme yazılımını durdurun.
      NOT: Tahlillerimizde, birkaç ila birkaç dakikalık hareketsizliğin, klasik manuel TKD tahlillerinde görülene benzer ısı stresi nedeniyle fizyolojik çöküşün göstergesi olduğunu bulduk. Ancak bu, kendiliğinden kaçış davranışına bağlıdır. Bu nedenle, araştırmadaki spesifik tedavinin bu davranışsal yanıtı değiştirip değiştiremeyeceği olası kafa karıştırıcı değişkenleri göz önünde bulundurun. Ayrıca, tahlilin spesifik parametrelerine (örn. sıcaklık, tedavi) bağlı olarak, tahlilin uzunluğu açıkça değişecektir.

5. Veri organizasyonu ve analizi

NOT: Yürütülebilir uygulamanın GitHub'dan nasıl indirileceği ve yazılımın temel işlevleri hakkında bilgi için Ek Video S1'e bakın.

  1. Veriler elde edildikten sonra, referans verilen yazılımı kullanarak metin dosyalarını hatalara karşı tarayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve etkinlik verilerini gruplamak için belirli başlangıç ve bitiş noktalarını seçin. 10 dakikalık bir alışma aralığı uygulandıysa, etkinlik kaydına 10 dakika sonra gruplamayı başlatın. Gruplama hakkında daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın.
  2. HoTDAM'ı açın! analiz yazılımı ve taranan monitör veri dosyalarını Dosya | monitör verilerini yükle'ye tıklayarak içe aktarın.
    NOT: Yazılım ve yürütülebilir uygulama GitHub'dan (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) veya şirketin web sitesinden Analiz Yazılımı bölümünden edinilebilir. Yürütülebilir uygulamanın şu anda yalnızca Windows işletim sistemleriyle uyumlu olduğunu unutmayın.
  3. DAM2 monitörlerinde hangi tedavi gruplarının hangi hücreye karşılık geldiğini belirtmek için grup tanımları ekleyin.
    NOT: Yazılım arabiriminin düzeni, monitörlerin düzenine karşılık gelir.
  4. Birden çok hücreye uygulanacak bir grup ataması eklemek üzere bir iletişim kutusu açmak için Çoklu Grup Tanımını Başlat'ı tıklatın. Grup ataması kabul edildikten sonra, grup atamasını uygulamak için hücrelere tıklayın, ardından Çoklu Grup Atamasını Durdur'a tıklayın.
    NOT: Yazılım, DAMSystem3 verilerini düzenler ve istatistik yazılımında analiz edilecek .csv dosyalarına aktarır.
  5. Monitörlerdeki her uçuş için TKD'yi (yani, sıfır olmayan son indeksi) bir .csv dosyasına aktarın. Knockdown Verilerini Dışa Aktar | Tüm monitörleri dışa aktarın veya seçili monitörleri dışa aktarın. Her sinek için TKD, çıktıda grup tanımına göre düzenlenecektir.
  6. Dosya'ya tıklayarak her uçuş için etkinlik verilerini dışa aktarın | Etkinlik Verilerini Dışa Aktar | Tüm Monitörleri Dışa Aktar veya Seçili Monitörleri .csv bir dosyaya Dışa Aktar, yalnızca zaman damgası ve sayım verilerini koruyarak veri dosyasıyla çalışmayı kolaylaştırır ve aynı zamanda her uçuş için belirlenmiş grup etiketleri atayın.
    NOT: DAMSystem3 veri dosyalarındaki ilk birkaç sütun, edinme sırasında monitörler için dahili verilere (örn. ışık izleme veya hata mesajları) karşılık gelir. Sayım verileri 11-42 sütunlarındadır (ayrıntılar için DamSystem3 Veri Sayfasına bakın). Etkinlik verilerinin analiz yazılımıyla dışa aktarılması, zaman damgası ve sayım verileri sütunları dışındaki tüm sütunları kaldırır.
  7. Bir CTmax deneyi yapıyorsanız, sıcaklık rampası oranını kullanarak CTmax'ı belirlemek için TKD'yi kullanın.
    figure-protocol-1
    NOT: Analiz yazılımı, C# dilinde nesne yönelimli bir şekilde yazılmıştır (kaynak kodu GitHub'da mevcuttur; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM), böylece programın yönleri, belirli amaçları karşılamak için özelleştirmeye izin vermek için kolayca değiştirilebilir.

6. İstatistik

NOT: Deney düzeneğinin özelliklerine bağlı olarak TKD verilerini analiz etmek için birçok farklı test kullanılabilir.

  1. Hayatta kalma analizini (örneğin, Cox regresyonu, Kaplan-Meier) kullanarak tahlil içindeki her sineğin deneyimleyeceği bir olay olarak knockdown'ı kavramsallaştırın.
    NOT: Ayrıntılı bir inceleme için, Bradburn ve Clark'ın hayatta kalma analizini ve uygulanmasını tartışan 4 makalelik serisinebakın 5,6,7,8.
  2. Özellikle belirli koşullar için otomatik testi doğrularken, grup farklılıklarını değerlendirmek ve modaliteleri karşılaştırmak için ANOVA'yı kullanın.
  3. Kaplan-Meier sağkalım analizini kullanarak TKD verilerini analiz edin. Dosyayı, analiz ayrı ayrı gerçekleştirilecek şekilde stoklara göre bölün (örneğin, TRPA1 ve w1118 hisse senedi satırları için). Zaman değişkenini TKD (dakika olarak), olay olarak knockdown, faktör olarak ön tedavi ve tabaka olarak cinsiyet olarak seçin.
  4. Her bir tabaka için ön tedaviyi karşılaştırmak için log-rank, Breslow ve Tarone-Ware testlerini gerçekleştirin (ör., cinsiyet), çeşitli yöntemleri göstermek amacıyla.
  5. Hayatta kalma planları oluşturun.

Sonuçlar

TRPA1 ve w1118 hisseleri için analizler ayrı ayrı gerçekleştirilmiştir. Yüzdelik TKD süreleri ve diğer tanımlayıcılar Tablo 1'de bulunabilir.

Yüzdelikdilimler a
SeksMuamele25.00%50.00%75.00%
NTahminStd. HatasıTahminStd. HatasıTahminStd. Hatası
W1118 Serisi
DişiKontrol1642.500.4340.752.0038.750.43
Sert -leştirilmiş1648.754.5543.252.5038.501.95
ErkekKontrol1643.251.8839.750.2537.002.38
Sert -leştirilmiş1646.505.6335.502.0030.753.03
TRPA1
DişiKontrol1634.252.1729.257.5021.500.72
Sert -leştirilmiş1537.254.8428.751.7725.750.86
ErkekKontrol1538.253.2932.001.2924.507.92
Sert -leştirilmiş1627.500.7225.751.0022.756.06

Tablo 1: w1118 ve TRPA1 sineklerinin Kaplan-Meier sağkalım analizleri için tanımlayıcı istatistikler. Yüzdelik TKD değerleri dakika cinsinden verilmiştir. Sertleştirilmiş, 37 °C'lik ön işlemi ve ardından 39 °C'de ısı şokundan 24 saat önce geri kazanımı ifade eder. Kontroller ön işlem süresince 25 °C'de tutuldu. NOT: Sağkalım analizlerinde, 75. persentil, numunenin u'inin aktivite göstermeye devam ettiği en son zamandır.

W1118 sinekleri için, kütük sıralama testi, sertleşmiş ve kontrol dişileri arasında devrilme olasılığında önemli bir fark buldu (p = 0.026), öyle ki sertleşmiş dişilerin test süresince ısı stresörü tarafından devrilme olasılığı daha düşüktü. Bu arada, log-rank testi, sertleşmiş ve kontrol w1118 erkek arasında devrilme olasılığında anlamlı bir fark bulamadı (p = 0.798). TRPA1 dişileri için, log rank testi kullanılarak sertleşmiş ve kontrol organizmaları arasında devrilme olasılığında anlamlı bir fark bulunmadı (p = 0.547). Son olarak, TRPA1 erkekleri için, log-rank testi, sertleşmiş ve kontrol organizmaları arasında devrilme olasılığında önemli bir fark buldu (p = 0.014), öyle ki kontrol organizmalarının ısı stresörü tarafından devrilme olasılığı daha düşüktü. Sağkalım analizlerinin tüm sonuçları için Tablo 2'ye (genelleştirilmiş Wilcoxon ve Tarone-Ware testleri dahil) ve sağkalım eğrileri için Şekil 1'e bakınız.

Seksχ2Dfp-değeri
W1118 Serisi
DişiGünlük Sıralaması (Mantel-Cox)4.9610.026
Breslow (Genelleştirilmiş Wilcoxon)1.7210.190
Tarone-Eşya3.0710.080
ErkekGünlük Sıralaması (Mantel-Cox)0.0710.798
Breslow (Genelleştirilmiş Wilcoxon)0.8610.353
Tarone-Eşya0.3210.572
TRPA1
DişiGünlük Sıralaması (Mantel-Cox)0.3610.547
Breslow (Genelleştirilmiş Wilcoxon)0.4510.503
Tarone-Eşya0.3610.549
ErkekGünlük Sıralaması (Mantel-Cox)6.0110.014
Breslow (Genelleştirilmiş Wilcoxon)4.1910.041
Tarone-Eşya5.2010.023

Tablo 2: Ön işlem görmüş ve kontrol w1118 ve TRPA1 dişi ve erkek sinekler arasında aktif kalma olasılığını karşılaştıran anlamlılık testi. Sertleştirilmiş, 37 °C'lik ön işlemi ve ardından 39 °C'de ısı şokundan 24 saat önce geri kazanımı ifade eder. Kontrol organizmaları ön işlem süresince 25 ° C'de tutuldu.

figure-results-1
Şekil 1: w1118 ve TRPA1 sinekleri için TKD testi boyunca kalan aktiviteye sahip organizmaların oranını gösteren hayatta kalma eğrileri. Sertleştirilmiş, 37 °C'lik ön işlemi ve ardından 39 °C'de ısı şokundan 24 saat önce geri kazanımı ifade eder. Kontrol organizmaları ön işlem süresince 25 ° C'de tutuldu. TKD, 39 °C'lik ısı stres cihazının piyasaya sürülmesinden bu yana dakikalar içinde gerçekleşti. Kısaltmalar: TKD = yıkma zamanı; TRPA1 = geçici reseptör potansiyeli ankirin 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sertleşmiş ve kontrol TRPA1 ve w1118 erkek ve dişiler için zamana karşı çizilen ortalama aktivite Şekil 2'de görülebilir.

figure-results-2
Şekil 2: TKD testi süresince w1118 ve TRPA1 uçuşları için zamana karşı ortalama aktivite. Kısaltmalar: TKD = yıkma zamanı; TRPA1 = geçici reseptör potansiyeli ankirin 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Özellikle grup etkilerini göz önünde bulundururken ve TKD'yi dahil ederken, aktivite verilerini analiz etmenin muhtemelen sayısız ve yeni yolları vardır. Isı toleransı sırasında aktivite analizi nispeten çalışılmamış olduğundan, aktivite verilerini analiz etmek için potansiyel olarak yeni istatistiksel yaklaşımları keşfetmedik. Bu tür istatistiksel testler, burada uygun olandan çok daha kapsamlı bir literatür taraması ve tartışması gerektirecektir. Bunun yerine, her grup için (ön tedavi veya kontrol) zamana karşı ortalama aktivitenin grafiğini çıkardık, çünkü bu yöntemi daha önce uygun bir literatür taraması ile aktiviteyi göstermek için yayınladık.

Ek Video S1: GitHub'dan yürütülebilir uygulamayı indirmek ve yazılımın temel işlevleri için izlenecek yol. En son sürüm (şu anda yalnızca Windows ile uyumludur) başvurulan GitHub'da (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) veya şirketin web sitesinin Analiz Yazılımı bölümündeki dizine eklenmiş bir bağlantı aracılığıyla bulunabilir. Sürüm indirildikten sonra, dosyaların çıkarılması ve HoTDAM! uygulama açılabilir. Virüsten koruma yazılımı uygulamanın çalışmasını engelleyebilir; Uygulamaya izin verilmesi gerekebilir. Arayüz çalıştıktan sonra, taranan DAM2 (Dosya Tarama Yazılımı) yüklenebilir (Dosya | İzleyici Verilerini Yükle). Grup Tanımlama arayüzü, aktivite monitörü düzenini temsil eder ve kullanıcının, Çoklu Seçim Grup Tanımı özelliği ile tedavi gruplarını tüplere tek tek, birer birer veya aynı anda birden fazla olarak belirlemesine olanak tanır. Tüm monitörler, Grup Atama işlevselliği açısından birbirini dışlar ve ayrı olarak tanımlanmalıdır. TKD ve etkinlik verileri daha sonra .csv dosyalarına (Dosya | knockdown verilerini veya dosyasını dışa aktarma | Etkinlik Verilerini Dışa Aktar) seçilen bir monitör için tek tek veya tüm monitörler için aynı anda. Tüm monitörler aynı anda dışa aktarılırsa, TKD veya etkinlik verileri tek bir .csv dosyasına aktarılır, ancak her monitöre ait veriler dosya içinde ayrılır. Dışa aktarılan TKD dosyaları, sinekleri gruplara ayıracak ve her tüp için sıfır olmayan son aktivite indeksini görüntüleyecektir. Etkinlik dosyaları tüm tüpleri ayrı tutacak, ancak grup atamalarını ilişkilendirecek ve dosyalardan tüm bilgileri kaldıracak, ancak her tüp için zaman damgası ve sayım verileri olacaktır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada tanımladığımız ısı toleransı tahlil yöntemi çok yönlü ve ölçeklenebilirdir. Daha önce HoTDAM'ı karşılaştırdığımız bir doğrulama çalışması yayınlamıştık! Klasik, gözleme dayalı bir TKD testine yöntem ve otomatik tahlilin birkaç faktörde aynı genel eğilimi gösterdiği bulundu4 (Şekil 3). Başka bir deyişle, klasik manuel TKD tahlili ile aynı şekilde, DAM2 otomatik tahlili, organizmaları cinsiyete, tahlil sıcaklığına, sertleşme ön işlemine ve testten önce sertleşme ön işlemine takiben geri kazanım süresine göre ayırt edebildi. Otomatik tahlilin, TKD'nin araştırmacı gözlemine bağlı olmadığı için daha objektif olduğu varsayılsa da, verilerimiz bunun DAM2 tahlilini, bir etki keşfetme açısından manuel tahlilden önemli ölçüde üstün kıldığını göstermez. Tahlillerin hassasiyet açısından oldukça benzer olduğunu bulduk ve eğer bir şey varsa, otomatik tahlil içindeki etki boyutları biraz daha küçüktür (hem otomatik DAM2 hem de doğrulama çalışmalarımızdan elde edilen manuel gözlem tabanlı tahliller için ayrıntılı tanımlayıcı istatistiksel ve ANOVA verileri için Rokusek ve ark.4 ek materyaline bakınız). Bunun nedeni muhtemelen, aşağıda ayrıntılı olarak tartışılan, tahlillerin TKD açısından ölçtüğü şeydeki doğal farkla ilgilidir.

figure-discussion-1
Şekil 3: Otomatik DAM2 testinin klasik gözleme dayalı bir TKD testi ile karşılaştırılması. Grafikler ortalama TKD'yi dakika cinsinden gösterir ve hata çubukları ortalamanın standart hatasıdır. Karşılaştırılan bağımsız faktörler şunlardır: (A) tahlil sıcaklığına göre cinsiyet, (B) tahlil sıcaklığına göre sertleşme, (C) toparlanma süresine göre cinsiyet, (D) cinsiyete göre sertleşme, (E) toparlanma süresine göre tahlil sıcaklığı ve (F) toparlanma süresine göre sertleşme. Mutlak TKD, otomatik tahlilde daha uzun olma eğilimindedir, ancak faktörler arasındaki genel eğilimler tahliller arasında tutarlıdır. Bu rakam Rokusek ve ark. 4'ten alınmıştır. Kısaltma: TKD = yıkma zamanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada sunulan açıklayıcı veriler, farklı uçuş hatlarının da kullanıldığı orijinal doğrulama denemelerimizden tamamen ayrı deneyleri temsil etmektedir. Tahlil (TKD ve aktivite), w1118 stoğunda (orijinal deneylerde bir Kanton S vahşi tip suşu kullandık) sertleştirme ön işleminin etkilerine duyarlıydı ve testin temel işlevselliğinin değişken koşullar altında stabil olduğuna dair destek sağladı, ancak şimdiye kadar sadece birkaç satır test edildi. Tahlil, TKD ölçümü ile sınırlı olmadığı için çok yönlüdür. Tahlilimüzde TKD, lokomotor aktivitenin durması olarak tanımlandığından, sıcaklık rampa hızı biliniyorsa CTmax belirlenebilir. Son olarak, tahlil tamamen otomatiktir ve daha fazla aktivite monitörü eklenerek kolayca ölçeklendirilebilir, bu da manuel bir gözlem yöntemi kullanılarak mümkün olandan çok daha büyük örnekleme boyutlarına izin verir.

Tahlil ve analiz yapılırken göz önünde bulundurulması gereken bazı önemli noktalar aşağıdaki gibidir. Ayarlanan bir sıcaklığa hızla ulaşabilen bir inkübatör kullanın, böylece monitörler yetiştirme sıcaklığında inkübatöre yüklenebilir ve ısı stresörü uygulanmadan önce yeni ortama alışmak için sessizce oturmasına izin verilebilir. Sıcaklık çok yavaş yükselirse, tahlil, statik bir TKD testinin aksine dinamik bir CTmax testine daha çok benzemeye başlar. Örneğin, bir temel oluşturmak için ısı stresinin indüksiyonundan önce yazılımın 40x indekslemesine izin verildiyse, yazılım, TKD'nin belirlenmesi ve veri analizi için indeks 40'tan başlayarak veri dosyasının çıktısını alabilir. Başlangıç noktası, yazılım tarafından kaydedilen zaman damgası cinsindendir, bu nedenle indeks aralığına dikkat edin (örneğin, indeks aralığı 15 s ise 40 indeks 10 dakikadır).

Dosya Tarama Yazılımı, dizinleri "bölmek" için de kullanılabilir ve sayımların toplamını veya ortalamasını alabilir. Örneğin, etkinlik verilerinin grafiğini çıkardığımızda (aşağıya bakın) her dört dizini bir araya getirerek sayıları topladık (yani, etkinliği her 15 saniyede bir değil, her dakika dışarı aktardık). Dosya Tarama Yazılımının, zaman damgası açısından gruplama sırasında kısmi dakikalık başlangıç sürelerine izin vermeyeceğini unutmayın. Örneğin, ilk dizin 12:10:15'te ise ve dizin aralığı 15 sn olarak ayarlanmışsa, 1 dakikada gruplama bir sonraki en yakın dakikada başlar (ör. 12:11:00). Bu nedenle, analiz için küçük artışlarla aktivite kullanılacaksa ancak TKD için 15 s'lik aralıkların çözünürlüğü isteniyorsa, alım yazılımını en yakın tam dakikadan 15 s içinde başlatın (örneğin, 12:09:45'ten sonra ve 12:10:00'dan önce). Bu karmaşıklık, veri toplama yazılımının zaman damgası olarak bilgisayar sistem saatini kullanmasından kaynaklanmaktadır, çünkü DAMSystem3 muhtemelen uyku çalışmaları göz önünde bulundurularak oluşturulmuştur.

TKD karşılaştırmasına yönelik istatistiksel yaklaşımlar açısından, sağkalım analizinin gruplar arasındaki ortalama veya medyan nakavt sürelerini karşılaştırmaktan daha fazla bilgi sunduğunu savunuyoruz. Hayatta kalma eğrileri, tahlil sırasında popülasyonlar için yıkımın zaman seyri hakkında görsel bir fikir verebilir. Benzer şekilde, istatistiksel testler, çalışma içinde sorulan belirli bir soruya göre uyarlanabilir. Örneğin, genelleştirilmiş Wilcoxon testleri erken olaylara daha fazla ağırlık verirken, log-rank testleri tüm zaman noktalarına eşit ağırlık verir ve daha sonraki zaman noktalarındaki farklılıklara daha duyarlıdır. Tehlike oranları orantılı değilse (yani, hayatta kalma eğrileri çaprazsa) Tarone-Ware daha titizdir. Tüm organizmalar olayı deneyimlemiş olacağı için verilerin sansürlenmesi gerekmediğinden (knockdown), Mann-Whitney U ve Kruskal-Wallis gibi parametrik olmayan, sıralama testlerinin yanı sıra Kapan-Meier hayatta kalma eğrilerinin kullanımı için bir argüman yapılabilir9. Bir araştırma, tüm organizmalar yere serildikten sonra TKD yerine belirli bir süre sonra yıkımla ilgileniyorsa, hayatta kalma analizinin ve log-rank veya genelleştirilmiş Wilcoxon testlerinin kullanılması, sansürlenmiş veriler için sağlam olacaktır (yani, testin sonunda tüm organizmaların hareket etmeyi bırakmayacağı veya çökmeyeceği bir senaryo). Göstermek için log-rank, genelleştirilmiş Wilcoxon ve Tarone-Ware'den elde edilen sonuçları Tablo 2'de sağladık.

Isı stresi sırasında ve CTmax'tan önce, davranış değişiklikleri (örneğin, kaçış davranışı) başa çıkma mekanizmaları olarak işlev görür. Bu doğuştan gelen davranışsal stratejiler hayvanlar aleminde korunur, ancak metabolik termoregülasyon için daha düşük kapasiteleri göz önüne alındığında ektotermler için özellikle önemlidir10,11. Açıkçası, davranış, ektotermik ısı stresi fenotipinin önemli bir yönüdür, ancak nispeten seyrek araştırmalar, ısı toleransının bu davranışsal yönlerini incelemiştir. Tanımladığımız tahlilin, ısı stresine yanıt olarak lokomotor aktivitedeki karakteristik artışa dayandığı göz önüne alındığında, ısı stresi tepkilerinin lokomotor yönlerini keşfetmek için çok uygundur. Aynı zamanda, spontan aktiviteye olan bu güven, beraberinde bazı sınırlamalar getirir. Özellikle ısı stresine lokomotor tepkilerin bileşenlerini keşfederken, hem TKD'nin hem de aktivitenin içsel olarak ilişkili olduğunu hatırlamak önemlidir. Bunun tahlilimiz için sınırlayıcı olacağı bir durumu göstermek için, burada termosensasyon eksikliği olan TRPA1 organizmalarından veri sağladık. Organizmalar TRPA1 reseptörü için yetersiz olduğunda, sinekler ısıya12 karakteristik lokomotor tepkiyi göstermezler. Burada gösterilen temsili verilerde, TRPA1 organizmalarındaki aktivite tepkisi körelmiştir. TKD ölçümleri, farklı bir lokomotor tepkiyi temsil ettiği için vahşi tip organizmalarla kolayca karşılaştırılamaz.

Genelleştirilebilirlik ve sonuçların, özellikle klasik ısı toleransı deneyleriyle doğrudan karşılaştırılması da potansiyel bir sınırlamadır (Şekil 3). Genellikle, gözleme dayalı tahliller, hareketsiz bir organizmanın gerçekten fizyolojik çöküş yaşadığından ve sadece spontan aktivite eksikliği göstermediğinden emin olmak için mekanik veya başka bir uyaran içerecektir 3,13. Tahlilimiz spontan aktiviteye dayandığından, TKD'nin operasyonel tanımında karşılaştırmayı karmaşıklaştırabilecek doğal bir fark vardır. Başka bir deyişle, TKD'yi lokomotor aktivitenin durması olarak tanımlarken, klasik tahliller TKD'yi genellikle fizyolojik çöküş olarak tanımlar. Ayrıca, tarif ettiğimiz gibi otomatik tahliller ısıtılmış havaya dayanırken, manuel tahliller genellikle bir su banyosu ve dolayısıyla daha verimli ısı transferi içerir. Tahlil modaliteleri arasındaki karşılaştırmaya yönelik tüm bu sınırlamalar, otomatik yöntemin genelleştirilebilirliğinin olumsuz yanlarını temsil etmektedir. Aynı zamanda, gözleme dayalı yöntemlerin de araştırmalar arasında doğrudan karşılaştırmalar yapılarak komplikasyonlardan muzdarip olduğu bildirilmiştir 2,14,15. Sınırlamalara rağmen, otomatik tahlillerin TKD veya CTmax cinsinden ısı toleransını tahmin etmek için uygun bir araç olduğunu savunuyoruz.

TKD ve CTmax için diğer otomatik ısı tolerans testleri daha önce literatürde 16,17,18,19 uygulanmış ve açıklanmıştır, bazıları DAM2 aktivite monitörlerini18,19 kullanmaktadır. Ayrıca, en az birkaç araştırma, akut ısı stresi bağlamında ısı toleransı ile ilgili olarak meyve sineği aktivite profillerini incelemek için video tabanlı yöntemler 16,20,21 ve DAM2 aktivite monitörleri20'yi kullanmıştır. Bu nedenle, DAM2 sistemi de dahil olmak üzere ısı toleransı tahlillerinin otomatikleştirilmesi yeni bir fikir değildir. Tahlililimizde yeni ve değerli olan şey, HoTDAM tarafından kolaylaştırılan veri yönetiminin kolaylığıdır! (analiz) yazılımı. Etkinlik verileriyle çalışmak zordur ve her senaryo için özel olarak hazırlanması gereken yazılım veya komut dosyaları kullanılmadan büyük veri kümelerinden en basit önlemleri (örneğin, TKD) almak zaman alıcı ve hantal olabilir. Merhaba! ücretsizdir ve basit ve kullanımı kolay bir arayüze sahip tamamen işlevsel bir yürütülebilir uygulama olarak mevcuttur. Kodlama konusunda önceden deneyim gerekli değildir. Ayrıca, yazılım, değişikliği kolaylaştırmak için belgelerle nesne yönelimli bir şekilde yazılmıştır. Hal böyle olunca, HoTDAM! belirli ihtiyaçlara uyacak şekilde kolayca özelleştirilebilir. Kaynak kodu, yürütülebilir uygulamanın yanında bulunur. Umudumuz odur ki HoTDAM! TKD ve CTmax'ı ölçmek için kolay bir yol sunarak ısı toleransı testlerinde yeni olan laboratuvarlara hizmet verebilir ve ayrıca veri yönetimini kolaylaştırmak için özelleştirilebilir yazılımlar sunarak ısı toleransı tahlilleri konusunda deneyimli laboratuvarlara hizmet verebilir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Açıklanan proje, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden (5P20GM103427 ve 1U54GM115458) Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) hibeleri ile desteklenmiştir. UNK Lisans Araştırma Görevlileri Programı ve UNMC Tıp Öğrencisi Yaz Araştırma Programı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
14 mL polistiren test tüpleriFalcon352057
30 galonluk akvaryumWal-mart
8 oz şişelerGenesee32-129F
Sabit İklim OdasıMemmertHPP750eco
mısır unuLaboratuvarı BilimselFLY801010
DAM2  Drosophila Aktivite MonitörüTriKineticsDAM2(DAMSystem3 Veri Sayfası) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf
DAMSystem veri toplama yazılımıTriKineticsücretsiz indir
Drosophila agarLab ScientificFLY80201
etanolFisher ScientificBP82011
EtherFisher ScientificE134-4
Metin hatalarını taramak, verileri gruplamak ve çıktı almak içinFileScan yazılımıTriKinetics
Şişeler için FlyStuff FlugsGenesee49-100
Şişeler için FlyStuff FlugsGenesee49-102
FlyStuff şişeleriGenesee32-113RL
HoTDAM yazılımıGithub veya Trikinetikhttps://github.com/MatthewR47/HoTDAM
Daldırma sirkülasyonlu ısıtıcıPolyScienceMX-CA11B
pekmezLab ScientificFLY80084
propiyonik asitFisher ScientificA258-500
Pyrex Cam tüpler DAM2TriKineticsPGT 5x65için 5 x 65 mmhttps://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf
küçük boya fırçasıWal-mart
SPSS İstatistikleriIBM
tegoseptLab BilimselFLY55015
torula mayasıMP Biyomedikaller290308505
TRPA1 mutant hisse senediBloomington Stok merkezi26504w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1]
w1118 stockBloomington Stok merkezi3605

Kaynaklar

  1. Cowles, R. B., Bogert, C. M. A preliminary study of the thermal requirements of desert reptiles. Bull Am Mus Nat Hist. 83, 261-296 (1944).
  2. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Can J Zool. 75, 1561-1574 (1997).
  3. Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Funct Ecol. 33 (4), 629-642 (2019).
  4. Rokusek, B., et al. HoTDAM! An easy-to-use automated assay expands the inducible thermotolerance phenotype in Drosophila melanogaster: Heat hardening reduces motility. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 286, 111522(2023).
  5. Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part III: Multivariate data analysis - Choosing a model and assessing its adequacy and fit. Br J Cancer. 89 (4), 605-611 (2003).
  6. Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part II: Multivariate data analysis- An introduction to concepts and methods. Br J Cancer. 89 (3), 431-436 (2003).
  7. Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part IV: Further concepts and methods in survival analysis. Br J Cancer. 89 (5), 781-786 (2003).
  8. Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part I: Basic concepts and first analyses. Br J Cancer. 89 (2), 232-238 (2003).
  9. Hazra, A., Gogtay, N. Biostatistics series module 9: survival analysis. Indian J Dermatol. 62 (3), 251-257 (2017).
  10. Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am Nat. 126 (3), 362-386 (1985).
  11. Grigg, G. C., Beard, L. A., Augee, M. L. The evolution of endothermy and its diversity in mammals and birds. Physiol Biochem Zool. 77 (6), 982-997 (2004).
  12. Soto-Padilla, A., et al. Thermosensory perception regulates speed of movement in response to temperature changes in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 221 (10), jeb174151(2018).
  13. Hoffmann, A. A., Sørensen, J. G., Loeschcke, V. Adaptation of Drosophila to temperature extremes: bringing together quantitative and molecular approaches. J Therm Biol. 28 (3), 175-216 (2003).
  14. Terblanche, J. S., et al. Ecologically relevant measures of tolerance to potentially lethal temperatures. J Exp Biol. 214 (22), 3713-3725 (2011).
  15. Rezende, E. L., Castaneda, L. E., Santos, M. Tolerance landscapes in thermal ecology. Funct Ecol. 28 (4), 799-809 (2014).
  16. MacLean, H. J., Hjort Hansen, J., Sørensen, J. G. Validating the automation of different measures of high temperature tolerance of small terrestrial insects. J Insect Physiol. 137, 104362(2022).
  17. Gioia, A., Zars, T. Thermotolerance and place memory in adult Drosophila are independent of natural variation at the foraging locus. J Comp Physiol A. 195, 777-782 (2009).
  18. Kjærsgaard, A., et al. The effect of developmental temperature fluctuation on wing traits and stressed locomotor performance in Drosophila melanogaster, and its dependence on heterozygosity. Evol Ecol Res. 14 (7), 803-819 (2012).
  19. Bak, N. K., Rohde, P. D., Kristensen, T. N. Strong sex-dependent effects of malnutrition on life- and healthspan in Drosophila melanogaster. Insects. 15 (1), 9(2023).
  20. Bettencourt, B. R., et al. Natural variation in Drosophila stressed locomotion meets or exceeds variation caused by Hsp70 mutation: analysis of behavior and performance. Behav Genet. 393, 306-320 (2009).
  21. Kjærsgaard, A., et al. Locomotor activity of Drosophila melanogaster in high temperature environments: plastic and evolutionary responses. Clim Res. 43 (1-2), 127-134 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Knockdown SüresiDavranışsal TermoregülasyonOtomatik Isı AnaliziAktivite Veri AnaliziTermal DüzenlemeHoTDAM YazılımıKnockdown OlasılığıYüksek Verimli Analiz
Drosophila Activity Monitor Sistemini Kullanarak Isı Toleransı Testleri: Veri Analizi için Yürütülebilir Bir Uygulama Kılavuzu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.