Sıçanlar İçin Doğrudan Vagus Sinir Enjeksiyon Protokolü

Özet

Sıçanlarda doğrudan vagus siniri enjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz ve enjeksiyon sonrası komplikasyonlar olmadan doğrudan sinir içine ilaç verilmesini sağlıyoruz. Bu yöntem, otonom sinir sistemi manipülasyonunu içeren klinik öncesi nörolojik çalışmalar için geçerlidir. Sıçanlarda ve diğer türlerde diğer sinirler için gerekli modifikasyonlarla doğrudan sinir enjeksiyonu için kullanılabilir.

Özet

Merkezi sinir sistemine ilaç dağıtımını kolaylaştırmak için göreceli bir strateji ve metodoloji bolluğu vardır. Bununla birlikte, doğrudan periferik sinir sistemine ilaç verilmesi daha az yaygındır ve araştırmacılara yardımcı olmak için daha az ayrıntılı yöntem yayını mevcuttur. Burada, vagus sinirini model sinir olarak kullanarak, periferik sinir sistemi ilaç dağıtımı için doğrudan bir sinir enjeksiyonu yöntemini tarif ediyoruz. Bu yöntem, otonom sinir sistemi bozukluklarının tedavisinde sol vagus sinirinin hedeflenmesi yoluyla kullanılabilir, ancak bu genel enjeksiyon yöntemi, küçük modifikasyonlarla diğer sinirlerin enjeksiyonuna tahmin edilebilir. Bu yöntem, diseksiyon mikroskobu altında anestezi uygulanmış yetişkin sıçanlarda mikrocerrahiyi içeren prosedürde yer alan tüm kritik adımları açıklar. Enjeksiyon doğruluğunun gerçek zamanlı olarak izlenmesini kolaylaştırmak için bir izleme boyasının kullanımı açıklanmaktadır. Başarılı ve başarısız enjeksiyonların çizimleri verilmiştir. Düzgün bir şekilde yapılırsa, doğrudan vagus sinir enjeksiyonları, doğum sonrası komplikasyonlar olmaksızın sıçan tarafından iyi tolere edilen güvenli bir şekilde gerçekleştirilebilir. Örneğin, cerrahlar bu yöntemde eğitildikten sonra, altı fareden altısı herhangi bir komplikasyon olmadan başarılı bir şekilde enjekte edildi. Klinik öncesi sıçan çalışmaları için bu doğrudan sinir enjeksiyonu yöntemi, periferik sinirlere ajanlar (gen terapisi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere) verme yeteneğine sahiptir.

Giriş

Doğru ilaç uygulama yönteminin uygulanması, başarılı terapötik sonuçların elde edilmesinde kritik faktörlerden biridir. Santral sinir sistemine (MSS) terapötik ajan iletimi için yöntemlerin bolluğuna rağmen, doğrudan sinir enjeksiyonu ile periferik sinir sistemi (PNS) iletimi için sadece birkaç yöntem bildirilmiştir. Sıçanlarda dorsal kök gangliyonlarına (DRG) enjeksiyon gibi doğrudan sinir enjeksiyonu, ağrı mekanizmalarının, ilaç toksisitesinin, gen transferinin ^1,2,3 ve genel yöntem geliştirmenin ^1,4 daha iyi anlaşılması için klinik öncesi çalışmalarda denenmiştir. Doğrudan sinir enjeksiyonu ile ilgili ek raporlar arasında spinal sinir enjeksiyonu⁴, siyatik sinir enjeksiyonu¹ ve sıçanlarda⁵ ve farelerde^vagus sinir enjeksiyonu 6 bulunur. Son zamanlarda, tavşanlarda terapötiklerin optik sinir kafasına daha iyi dağıtılması için suprakondriyal enjeksiyon için bir yöntem önerilmiştir⁷.

DRG, DRG^2'deki hücre cisimlerinin duyusal işlevi nedeniyle adeno-ilişkili virüs (AAV) gibi transgen yüklü vektörlerin doğrudan enjeksiyonu için ideal yer olarak kabul edilir. DRG enjeksiyonlarının hem cerrahi hem de cerrahi olmayan yöntemleri tanımlanmıştır ^1,8. Bununla birlikte, DRG enjeksiyonunun^cerrahi olmayan yöntemi 1 ile sonuçların tutarlılığı hakkında tartışmalı sonuçlar bulunmuştur. Kısmi laminektomi içeren bir cerrahi yöntemin, davranış sonuçlarında herhangi bir değişiklik olmaksızın^{sıçanlarda DRG} enjeksiyonu için% 100 başarılı olduğu öne sürülmüştür 3 ve ayrıca farelerde kısmi osteotomi içeren bir yöntem⁹. Birkaç çalışma, sıçanlarda ve farelerde^klinik öncesi gen terapisi araştırmalarında kullanılan DRG ilaç dağıtım enjeksiyon yöntemlerini bildirmektedir ^1,2,10. Lokalize enjeksiyonları içeren vektör bazlı gen tedavisi çalışmaları aşağıdaki faydaları içerebilir: hedef dışı ekspresyonun azalması, sistemik toksisitede azalma ve daha küçük viral yükler ve enjeksiyon hacimleri, immünojenik komplikasyon riskinin azalması^11,12.

Vücudun en uzun siniri olan siyatik sinirine direkt enjeksiyon yöntemi, bir sıçanın uyluk ortası hizasında sağ siyatik siniri açığa çıkarılarak denenmiştir. Yöntemde, 1,2 μL/dk akış hızına sahip toplam 10 μL boya hacmini enjekte etmek için mikro işlemci kontrollü bir enjeksiyon sistemi ile donatılmış çekilmiş bir cam pipet kullanıldı¹. Bu deney, DRG seviyesine kadar boya dağılımının olmadığını gösterdi ve dağılım çoğunlukla enjeksiyon bölgesi çevresinde sınırlıydı. Benzer şekilde, spinal sinir enjeksiyonları gibi diğer doğrudan sinir enjeksiyonu yöntemleri, sıçanlarda uygun enjeksiyon hacmini ve boya dağılım modelini değerlendirmek için boya ile denenmiştir. Spinal sinir enjeksiyonu için 2 μL'nin optimum olduğu öne sürülürken, DRG enjeksiyonu ile 3 μL boya, sıçanlarda hem dorsal hem de ventral kök gangliyonlarındaki dağılımı gösterdi¹. Farelerde DRG enjeksiyonu hacminin, suş ve vücut büyüklüğü^2,9'a bağlı olarak 1,0 μL ila ^1,5 μL arasında optimum olduğu bildirilmiştir.

Sıçanlarda⁵ ve farelerde⁶ nolu direkt vagus sinir enjeksiyon yöntemi, insan α-sinükleinin transferinde nöral hasar veya hücresel bütünlüğün rolünü değerlendirmek için kullanıldı. Aynı araştırmacı grubu tarafından yürütülen bu iki çalışma, AAV vektörlerinin servikal bölgedeki sol vagus sinirine doğrudan enjekte edilmesinin kısa bir yöntemini tanımlamaktadır. Sıçanlarda yöntem, 5 μL'lik bir Hamilton şırınga ile 0.5 μL / dak'lık bir akış hızında 2 μL vektör enjekte etmek için 60 μm uç çapına sahip bir cam kılcal damar içeriyordu. Farelerde, 10 μL'lik bir NanoFil şırıngaya⁶ takılan 36 G künt çelik iğne kullanılarak 160 nL / dak'lık bir akış hızında toplam hacimde 750 nL vektör çözeltisi enjekte edildi. Bu deneyler, transgenin, sıçanların ve farelerin pons ve orta beynindeki aksonlarda verildiğini ve ifade edildiğini gösterdi. Benzer şekilde, sol vagus sinirinin dorsal motor çekirdeği transgen ile pozitif immünoreaksiyon gösterdi. Bu kanıtlar, doğrudan vagus siniri enjeksiyon yönteminin, hücresel transdüksiyonun beynin çeşitli bölgelerine genişletildiği ve bu da aksonları vagus siniri boyunca yansıttığı gen terapisinde güvenilir bir yöntem olabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu yöntemler, enjeksiyon doğruluğunu izlemek için herhangi bir boyanın kullanılmasından bahsetmez.

Burada, klinik öncesi çalışmalarda araştırmacılar için büyük ölçüde geçerli olan toksik olmayan izleme boyaları kullanılarak sol vagus sinirine doğrudan enjeksiyon için bir yöntem açıklanmaktadır. İlaç dağıtımında zorluklara neden olabilecek potansiyel tuzaklar ve bunların üstesinden gelmenin yolları tartışılmaktadır. Bu durumlar, teslimatı neyin başarısız kıldığını ve başarılı hale getirmenin yolunu göstermek için resimlerle gösterilmiştir.

Protokol

Aşağıdaki protokol, kurumsal etik yönergelere ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) onayına uygun olarak yürütülmektedir.

1. Konut hazırlığı

NOT: Bu protokol en az 2 aylık yetişkin sıçanlar içindir. Daha küçük hayvanlar (fareler ve genç sıçanlar dahil) mümkündür, ancak tavsiye edilmez ve çok daha zor olacaktır.

1. Vagus sinir ameliyatından 48 saat önce nemli yemek veya başka bir yumuşak yiyecek (veteriner kurtarma jeli) sağlayın. Hayvanlar işlemden sonra yemek yemekte zorluk çekebileceğinden, bu öğelerin tadına aşina olmalarına ve yeme motivasyonu oluşturmalarına yardımcı olmak için ameliyattan önce bu öğeleri hayvanlara tanıtın.
2. Ev fareleri ameliyattan en az 1 hafta önce ve ameliyattan 1 hafta sonra bir kafeste bireysel olarak. Bu, yalnız kalmanın stresine alışmalarını ve ameliyattan sonra yaraların bir çöp arkadaşı tarafından çizilmesini önlemelerini sağlayacaktır.

2. Cerrahi öğelerin ve boşluğun hazırlanması

1. Gerekli tüm öğelerin bir listesini önceden yapın ve tüm öğelerin ameliyat için uygun olup olmadığını iki kez kontrol edin.
2. Ameliyattan önce tüm öğeleri uygun sterilizasyon yöntemleriyle sterilize edin.
3. Diseksiyon mikroskobu altında steril cerrahi alanı ayarlayın. Ameliyat sırasında fareyi sıcak tutmak için mikroskobun altına bir ısıtma yastığı yerleştirin.
4. Tüm cerrahi malzemeleri steril bir örtü üzerine ameliyat masasına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında ameliyat için yeterli alan bırakın. Mikroskobun odağının optimum olduğundan ve siniri görselleştirmek için cerrahi alanı kapsadığından emin olun.
5. Şırınga pompasını cerrahi aşamaya yakın bir yere yerleştirin, böylece borunun uzunluğu enjeksiyon bölgesine ulaşmak için yeterli olur.
6. Cerrahi aletleri cerrahın baskın elinin yanına doğru yerleştirin.

3. Aday ilaç ve izleme boyasının bir karışımının hazırlanması

1. Önerilen seyrelticide gerekli konsantrasyonu elde etmek için aday ilacın seyreltildiğinden emin olun, böylece boya ile karıştırılmış ilacın 5 μL'si verilecek aday ilacın gerekli miktarını verir. Direkt vagus siniri yöntemi ile maksimum enjeksiyon hacminin 5 μL olması önerilir (izleme boyası dahil, bkz. adım 3.2).
2. Enjeksiyon doğruluğunun gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlamak için aday ilaçla uyumlu bir boya karıştırın. Örneğin, %1 Luxol Fast Blue veya %0.002 floresein nihai konsantrasyonu, kullanılacak uyumlu boyalardır.
   DİKKAT: Boyayı, boya ve aday ilaç karışımında optimum konsantrasyonda kullanın. Karışımdaki boya konsantrasyonu çok düşük olduğunda, enjeksiyonu izlemek için görünür olmayabilir. Boya konsantrasyonu çok yüksek olduğunda, enjeksiyon iğnesini tıkayacak çok kalın ve yüksek viskoziteye sahip bir karışımla sonuçlanabilir.

4. Aday ilaç ve boya karışımının tüpe yüklenmesi

1. 100 μL'lik bir cam şırıngayı, piston çıkarılmış halde 27 G'lik bir iğneye bağlayın.
2. Yaklaşık 45 cm sterilize polietilen borunun bir ucunu 27 G iğneye bağlayın.
3. 3 mL'lik plastik bir şırınga alın ve 27 G'lik bir iğne ile takın. Şırıngayı yaklaşık 0,5 mL% 0,9 normal salin ile yükleyin.
4. Polietilen boruyu, borunun tüm uzunluğunu ve cam şırınganın tüm namlusunu taşana kadar doldurmak için açık uçtan% 0.9 normal tuzlu su ile doldurun.
   NOT: Borunun içinde hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek çok önemlidir.
5. 3 mL şırınga ve iğneyi çıkarın ve atın.
6. Şırınga pistonunu cam şırınganın namlusuna yerleştirin ve namlunun ortasına kadar hafifçe ileri doğru itin.
7. Cam şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin.
8. Borunun uzunluğunun açık ucunda yaklaşık 1,5 cm'lik bir hava boşluğu oluşturmak için şırınga pompasını kullanarak pistonu hafifçe geri çekin.
9. En az 5 μL boya ve aday ilaç karışımını 10 μL'lik bir mikropipet ile pipetleyin ve sterilize edilmiş bir parafilm parçasının üzerine bırakın.
10. Pistonu şırınga pompası aracılığıyla geri çekerek aday ilaç karışımını tüpe çekin. %0,9 tuzlu su ile enjeksiyon solüsyonu arasındaki hava kabarcığını koruyun, aksi takdirde enjeksiyon solüsyonu içinde herhangi bir hava kabarcığı sıkışmasını önleyin. Borudaki enjeksiyon karışımının seviyesini bir işaretleyici ile işaretleyin.
    NOT: Aday ilaç-boya karışımı ile boru içindeki steril salin arasındaki hava boşluğu, iki çözeltinin karışmasını önlemek için kritik öneme sahiptir.
11. 35 G iğneyi boruya takın. İğneyi cerrahi aşamanın temiz yüzeyine bantla sabitleyin, böylece iğne gevşek olmaz, hareket etmez ve başka bir şeye dokunmaz ve steril kalır.

5. Enjeksiyon iğnesinin astarlanması

1. Şırınga pompası programını 0,5 μL/dk dağıtacak şekilde ayarlayın.
2. Şırınga pompasını, enjeksiyon çözeltisi iğnenin ucundan çıkmaya başlayana kadar yaklaşık 10-15 saniye çalıştırın. Boru ve enjeksiyon iğnesinin birleşim yerinde (veya şırınga, boru veya iğnenin uzunluğu boyunca herhangi bir yerde) sızıntı olmadan iğnenin ucundaki karışımın küçük bir miktarı, kurulumun doğru olduğunu gösterir.
   NOT: İğnenin ucunda küçük bir damlacık görünmüyorsa, bu iğnenin tıkandığını gösterir. Aday ilacın ve boya karışımının yüksek viskozitesi, sistem içinde sıkışan fazla hava ve cam şırınganın şırınga pompası içine düzgün şekilde oturmaması nedeniyle iğne tıkanması meydana gelebilir. İğne ve boru arasındaki bağlantı noktasındaki sızıntı örneği için Şekil 1'e bakın. Astarlama kritiktir, çünkü iğnenin tıkalı olup olmadığını ve sinir içindeki enjeksiyonun sorunsuz bir şekilde geçip geçmeyeceğini belirlemeye yardımcı olur.

6. Sıçanın ameliyat için hazırlanması

1. Gerekli analjezik dozunu hesaplamak için sıçanın vücut ağırlığını elde edin. Örneğin, carprofen, sıçanlarda deri altında 5 mg / kg doz oranında kullanılır.
   NOT: Carprofen'in enjeksiyondan önce 4 °C'de saklanması önerilir.
2. Anestezi indüksiyonu için yaklaşık 2-3 dakika boyunca% 3 -% 4'lük bir akış hızı kullanarak sıçanı bir izofluran buharlaştırıcı ile uyuşturun. Anestezinin sürdürülmesi için izofluran akış hızını yaklaşık% 1.75 -% 2'ye düşürün.
3. Fareyi, epilasyon ve saha hazırlığı için bir kurulum ile ayrı bir masaya aktarın. Bu masanın cerrahi boşluğa yakın olduğundan emin olun.
4. Aşırı kuruluğu önlemek için farenin her iki gözüne de suni yırtma merhemi sürün.
5. Sıçan bilinci yerine geldiğinde ağrıyı kontrol etmek için onaylanmış kurumsal hayvan protokolüne göre analjezikler uygulayın.
6. Cerrahi bölgeyi boynun ventral tarafında, servikal bölgede bir saç kesme makinesi ile tıraş edin. Çeneden göğüs kemiğine kadar her iki tarafta orta hattan yaklaşık 2 cm dik mesafeye kadar tıraş edin.
7. Alanı %70 etil alkol ve %10 betadin ile sterilize edin, alanı alternatif olarak alkollü çubuk ve povidon-iyot ile üç kez silin. Alanın ortasından dışa doğru dairesel bir şekilde silin.
8. Sıçanı mikroskop altında sırtüstü pozisyonda cerrahi aşamaya aktarın. Servikal bölgedeki cerrahi alanı görselleştirmek için mikroskobun odağını ayarlayın.

7. Aday ilacı doğrudan sol vagus sinirine enjekte etmek için sıçan ameliyatı yapılması (Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4)

NOT: Yöntemin bu kısmı, cerraha yardımcı olması için ikinci bir kişi gerektirecektir.

1. Fareyi, monte edilmiş bir ışıkla ilişkili diseksiyon mikroskobu altında sırtüstü pozisyonda bir ısıtma yastığına yerleştirin.
2. Sıçanın ön üst çene dişlerini emilmeyen bir dikiş parçasıyla asın ve sütürün açık ucunu burun konisinin içine sabitleyin, böylece sıçanın burun deliği anestezi boyunca her zaman burun konisinin içinde olur.
3. Fareyi, başı sağ elini kullanan cerrahın sol tarafında (veya solak bir cerrahın sağ tarafında) olacak şekilde konumlandırın. Bu pozisyonda, cerrahın ön tarafı farenin vücuduna diktir. Boynun altına sterilize edilmiş bir ölçü yastığı yerleştirin ve sıçanın servikal bölgesinin açısını, servikal bölge düz hale gelecek şekilde ayarlayın. Bu, sol vagus sinirinin yerini tespit etmeyi ve enjeksiyonu gerçekleştirmeyi kolaylaştıracaktır.
4. Farenin tüm vücudunu sterilize edilmiş bir örtü ile örtün ve cerrahi alanı açık tutun.
5. Dört ekartör pimini elastomerli 4 manyetik fiksatör ile ayrı ayrı sabitleyin ve fiksatörleri cerrahi aşamanın dört köşesine yerleştirin.
6. Lokal anestezikleri, insizyonun yapıldığı servikal bölgenin orta hattına epidermal olarak enjekte edin. Örneğin, genellikle bir lidokain ve bupivakain karışımı kullanılır.
7. Boynun ventral tarafında servikal bölgede neşter bıçağı ile çene ile sternum arasındaki orta hatta yaklaşık 2 cm uzunluğunda uzunlamasına bir cilt kesisi yapın (Şekil 3A).
8. Sterilize edilmiş pamuklu uçlarla cildin kesik kenarlarını künt bir şekilde ayırın.
9. Ekartör uçları yardımıyla cilt kenarlarını insizyon bölgesinden zıt yönlerde geri çekin.
10. Daha derine inmek için ön cepheyi pamuklu uçlarla ayırın. Tükürük bezlerini yan tarafa doğru itin.
11. Sternomastoid kasları pamuk uçlarla ayırın ve pimlerle bir kenara çekin. Sternomastoid kas ayrımı genişledikçe, trakea ortada sternohoid kas ile kaplı olarak görünür (Şekil 3B).
    NOT: Soluk borusuna baskı uygulamamaya dikkat edin.
12. Sol vagus siniri ile birlikte çalışan ortak karotis arteri içeren karotis kılıfı görünene kadar sıçanın trakeanın sol tarafındaki doku ayrımını ilerletin.
13. Mikroskop altında karotis artere zarar vermemeye dikkat ederek, ince forseps ile karotis kılıfına dikkatlice küçük bir nokta deliği açın. Sol vagus sinirini ince forseps ile ortak karotis arterden ayırın.
    NOT: Ameliyat bölgesi anatomik olarak kritiktir. Karotis arterin duvarı kalın, kaygandır ve kolayca yaralanmaz, ancak ince forsepslerin keskin ucu onu yaralayabilir ve kanama olabilir. Aynı zamanda, sinire zarar vermemek için dikkat edin.
14. Sinir forseps ile arterden ayrıldıktan sonra, bu delikten 1 mL'lik bir şırıngaya takılan 25 G kavisli bir iğne kullanarak "kanca" yapın ve siniri baskın olmayan el ile tutun (Şekil 4A).
    NOT: Kavisli iğnenin ucu, sinire ve atardamara zarar vermeyecek şekilde köreltilmiştir. İğne ucunun eğrilik açısı, bir kanama durdurucu kullanılarak yaklaşık 90°'ye kadar özel olarak yapılır (Şekil 2).
15. Baskın eliyle, aday ilaç-boya karışımının yüklü olduğu iğneyi tutun ve siniri, iğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde sinirin çalıştığı yönde nazikçe delin.
    1. Kolay bir iğne için, 25 G kancayı kullanarak hafifçe çekerek siniri düz tutun. İğneyi sinirin içine sokun ve iğneyi vagus sinirine paralel tutarken 0,5 cm'den daha ileri ilerleyin. Daha sonra sinirin içinde yaklaşık 0.4-0.5 cm'lik iğne kalacak şekilde hafifçe geriye doğru çekin.
       NOT: İğnenin açısı, diğer tarafa geçmeden sinirin içine girecek kadar sığ olmalıdır.
16. Astarlama sırasında iğnenin sinirin dışında tıkanmadığı durumlar olabilir, ancak aday ilaç-boya karışımı sinirin içinden düzgün bir şekilde geçmez. Bu durumu önlemek için, sinir iğnelerinin sayısını tek bir iğne ile en fazla 3 kez sınırlayın. İğne körelirse, tıkanma veya başka bir şekilde zayıf enjeksiyon şansı artacaktır.
17. İğnenin tamamen sinirin içinde olduğundan emin olun. Hareketsiz pozisyonu koruyun ve şırınga pompasını açın.
    NOT: Aday ilaç-boya karışımının sinirden geri akmadığını görmek için enjeksiyon bölgesinde dikkatlice kontrol edin.
18. Enjeksiyon devam ederken, infüzyonun sinirin içinde kaldığını ve düzgün bir şekilde aktığını sürekli olarak inceleyin. İlaç-boya karışımının hareketini başlangıç noktasından izlemek için infüzyon tüpü üzerinde yapılan işareti kullanın.
    1. Aday ilaç-boya karışımı düzgün bir şekilde akmıyorsa, iğneyi dışarı çekin ve astarlama adımını tekrarlayın (adım 5.2). Sonra iğneyi sinire tekrar yerleştirin ve infüzyona devam edin.
19. Sinir, boyanın rengini geliştirmeye başlar (Şekil 4B). Aday ilaç-boya karışımının 5 μL'sinin tamamını infüze etmek için infüzyona 10 dakika boyunca 0.5 μL / dk'da devam edin.
    NOT: Aşırı kuruluğu ve hasarı önlemek için açıkta kalan dokuların gerektiğinde az miktarda ılık% 0.9 steril tuzlu su ile yıkanması önerilir.
20. 5 μL infüze edildikten ve şırınga pompası durduktan sonra, aday ilaç-boya karışımının tamamının enjeksiyon bölgesinden yayılmasını sağlamak için iğneyi 1 dakika daha yerinde tutun. İğneyi çıkarın.
21. 25 G kavisli iğneyi çıkarın. Mendilleri nazikçe orijinal konumlarına geri taşımak için steril pamuklu uçlar kullanın. Ekartör uçlarını çıkarın.
22. Yarayı emilmeyen bir dikişle kapatın (emilebilir dikiş de kullanılabilir). Yarayı mükemmel bir şekilde kapatmak için gerekirse dikişler arasına küçük bir miktar doku yapıştırıcısı sürün.

8. Bir farenin ameliyat sonrası bakımı

1. Yara kapandıktan sonra deri altına yaklaşık 3 mL% 0.9 ılık salin infüzyonu. Bu, farelerin hemen rehidre olmasına yardımcı olur.
2. Fareyi anesteziden normal duruma tamamen dönene kadar bir ısı kaynağına yerleştirin. İyileşme sürecinde anormal olan gözlemlenen herhangi bir şeyi not edin.
   NOT: Sinir enjeksiyonu işlemi uzun sürerse iyileşme süresi daha uzun olabilir.
3. Fareyi, kafesin zemininde nemli bir yemek ile ev kafesine aktarın. Suyun her zaman mevcut olduğundan emin olun. Sıçanın üşümediğinden emin olmak için ameliyat sonrası yaklaşık 2 saat boyunca fareyi gözlemleyin.
   NOT: Fareyi üşüürse ek saatler boyunca bir ısı kaynağına koyun.
4. Ameliyat sonrası 12 saat, 24 saat, 36 saat, 48 saat ve 72 saat sonra fareyi yazılı gözlem notlarıyla izleyin. Ağrıyı kontrol etmek için onaylanmış kurumsal hayvan protokolüne göre analjezikleri tekrarlayın. Örneğin, carprofen, 24 saat aralıklarla iki kez deri altında 5 mg / kg oranında dozlanır. Sıçanda ağrı 48 saatten fazla kalırsa bir veterinere danışın.
5. Sıçanın koşullarına bağlı olarak yaklaşık 3 mL% 0.9 ılık salin deri altı enjeksiyonunu 24 saatte tekrarlayın.
6. Yarayı değerlendirmeye devam edin. Yaranın kuru olduğundan ve iyileşme sürecinde olduğundan emin olun.
   NOT: Sıçanın hareketsizliği ve donukluğu ile yaranın kızarıklığı, şişmesi ve ağrılı durumu, yara iltihabının bir göstergesi olabilir ve ek veteriner konsültasyonu gerektirebilir. Ağrılı bir sıçan, kambur bir sırt, fırfırlı bir ceket, kırmızı gözler ve hareketsiz bir durum gösterecektir. Genellikle kafesin bir köşesinde bulunur.
7. Yara iyileştikten sonra emilmeyen dikişleri 2 hafta içinde çıkarın.

Sonuçlar

Bu çalışmada altı erişkin sıçan (3 erkek ve 3 dişi) kullanıldı. Altı fareden, bir sıçan, enjeksiyon bölgesi etrafında bir boya difüzyonunu gösteren bir başarısızlık enjeksiyonu durumunu göstermek için birden çok kez enjekte edildi Şekil 5A. Diğer tüm sıçanlar, Şekil 4B ve Şekil 5B'de gösterildiği gibi düzgün enjeksiyon ve sinir boyaması gösterdi.

Tartışma

Sol vagus sinirine doğrudan enjeksiyon yöntemi, sıçanlarda güvenli bir şekilde ve ameliyat sonrası komplikasyonlar olmadan yapılabilir. Vagus sinirine ilaç verilmesi, otonom sinir sistemini (ANS) hedeflemek için kullanılabilir. Bu, pratik ve orta ila yüksek derecede cerrahi beceri gerektiren bazı kritik adımları içerir.

Bu cerrahi işlem sıçanlarda dengeli genel anestezi gerektirir. Cerrah, özellikle yaşlı sıçanlarda daha iyi bir iyileşme için anesteziklerin m...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mL BD  Çıkarılabilir 25 G x 5/8 "Tüberkülin Şırıngası. İğne	Becton, Dickinson ve Şirketi	SKU: 309626	Vagus sinirini çekmek ve enjeksiyon sırasında tutmak için kavisli iğne ile bağlantı kurmak için kullanılır.
% 0.5 Bupivakain Hidroklorür Enjeksiyonu	Hospira	NDC 0409-1162-19	Lokal dokuyu uyuşturmak için kullanılan lokal anestezikler.
100 mL %0.9 Sodyum Klorür Sulama USP	Stericare Çözeltileri	Ürün #6240	Normal salin, sıçan ve dokuyu yeniden sulandırmak için kullanılır.
20 Künt, Ekartör Uçları, 7,5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	Ameliyat sırasında dokuları ayırmak ve tutmak için kullanılır.
3 mL BD-Luer-Lok Şırınga, Steril, Tek Kullanımlık	Becton, Dickinson ve Şirket	SKU # 309657	Sıçanlara salin enjekte etmek ve salini Polietilen boruya doldurmak için kullanılır.
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	Sinir içinde görülebilen floresein boyası. Enjeksiyon doğruluğunu izlemek için kullanılır.
Hayvan Tartı Kantarı	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	Sıçanın vücut ağırlığını ölçmek için kullanılır.
Ansell ENCORE Perry Style 42 PF Cerrahi Eldiven	Ansell	ASTM D3577	Sterilie eldiven, ameliyat sırasında bir cerrah tarafından kullanılır.
Suni Gözyaşı Merhem 3.5g	Pivetal	NDC 46066-753-55	Göz kuruluğunu önlemek için göz nezdinde kullanılır.
Bebek-Myxter Kanama Durdurucu	Güzel Bilim Araçları	13013-14	Acil durumlarda kanamayı durdurmak için kullanılır. Ayrıca 25 G x 5/8 "iğneyi bükmek için kullanılır.
BD Intramedic PE Boru	Becton, Dickinson ve Company	14-170-12A	Hamilton iğnesi ve NanoFil İğneleri ile bağlantı kurmak için enjeksiyon kurulum sisteminde kullanılır. Aynı zamanda enjeksiyon karışımını da tutar.
BD Precison Glide İğnesi, 25 G x 5/8 "	Becton, Dickinson ve Company	REF#305122	Sıçanlara salin enjekte etmek ve kavisli bir iğne yapmak için kullanılır.
BD Precison Kayma İğnesi, 27 G x ½ "	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	BD İntradermik tüpe steril salin doldurmak için kullanılır.
Karşılaştırma Ölçütü Accuris " SonrakiPette" Değişken Hacimli Pipet Mikro Başlangıç Seti, 4 pipet içerir: 10/20/200/1000 μ L, artı stand	MilliporeSigma	BMSP7700S1	Steril çözeltiyi pippette etmek için kullanılır.
Betadine, Povidin İyot %10	Honestmed	67618015017	Cerrahi bölgeyi dezenfekte etmek için kullanılır.
Carprofen Enjekte edilebilir çözelti 50 mg / mL	Covtrus (6451506845)	SKU tarafından sağlanır 591149	Olgumuzda, Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Hayvan Kaynak Merkezi tarafından sağlanan 5 mg / kg doz oranında seyreltilmiş karprofen kullandık.
Kavisli iğne (ısmarlama)	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" iğne, hemostat yardımıyla 90 dereceye kadar kavislidir. İğnenin ucu kör hale getirilir. Kullanmadan önce sterilize edilmesi gerekir. Vagus sinirini kancalamak ve ayırma ve enjeksiyon sırasında tutmak için kullanılır.
Diseksiyon mikroskobu	Motic	SMZ-171-BLED (Işıklı Dürbün)	Vagus siniri ayrılması, enjeksiyon sırasında kritik anatomik alanı büyütmek ve enjeksiyon sızıntısını kontrol etmek için kullanılır.
Örtü levhası	Dynarex	Reorder#8122	Sterilizasyondan sonra örtü olarak kullanılır.
Dukal Pamuk Uçlu Aplikatörler, Steril Olmayan	Dukal	Ürün 9003	Dokunun ayrılmasını köreltmek için kullanılır, kullanmadan önce sterilize edilmesi gerekir.
Dumont #7 - İnce Forseps	Güzel Bilim Araçları	11274-20	Sol vagus sinirini ortak karotis arterden ayırmak için kullanılır. Kavislidir, kullanımı çok kolaydır.
Ethicon PDS II Boyasız Monofilament Sütür - SÜTÜR, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	Yaranın dikilmesinde kullanılır.
Ethilon Naylon Sütür Siyah Monofilament	Ethicon	1856G	Emici olmayan sütür kullanılıyorsa yaranın dikilmesinde kullanılır. Ayrıca burun konisinin içindeki burnu sabitlemek için sıçan dişini asmak için kullanılır.
İnce Forseps - Ayna Kaplama	Güzel Bilim Araçları	11412-11	Vagus sinirinin ortak karotis arterden ayrılması sırasında kullanılır. Bu doğru.
İnce Makas - Keskin	İnce Bilim Araçları	14060-09	Dokuyu kesmek için kullanılır.
Hamilton temizleme solüsyonu	Hamilton	HT18311	Kullanımdan sonra Hamilton'u temizlemek için kullanılır.
Hamilton İğnesi, 27G, Küçük Hub RN İğnesi, 2", PT3, 6/PK	Hamilton	7762-01	BD Intramedic&trade'i bağlamak için kullanılır; PE Boru.
Hamilton Şırınga, 710RN	Hamilton	7638-01	Vagus sinir enjeksiyonu sırasında ilacı tutmak için kullanılır.
İnsülin Şırıngası	EXEL INT, Konfor noktası	REF 26027	Carprofen ve lokal anestezik enjekte etmek için kullanılır.
Lidokain% 2 Enjeksiyon	Covetrus	Yeniden Sipariş # 002468	Bupivakain ile karıştırmak ve insizyon bölgesine enjekte etmek için kullanılır.
Luxol Fast Blue MBSN	Acros Organics	212170250	Sinir içinde görülebilen boya, ilaçla karıştırılarak enjeksiyon karışımının görünür hale getirilmesini sağlar.
Cam Boncuklu Mikro Boncuk Sterilizatörü	Güzel Bilim Aletleri	Ürün No. 18090-46	Sıçan cerrahisi arasında cerrahi aletleri sterilize etmek için kullanılır.
NanoFil İğneler-NF35BV-2	Dünya Hassas Alet	NC9708956	Vagus siniri içine ilaç - boya karışımı enjekte etmek için kullanılır.
Olsen-Hegar İğne Tutucular, Sütür Kesiciler	ile İnce Bilim Araçları	12002-12	Yara dikişinde kullanılır.
Parafilm M Laboratuvar Sarma Filmi, 4 İnç x 125 Fit, Kutu Başına 1 Rulo, 12 Sayım	Honestmed	PM # 996	İlaç-boya karışımının BDTM intradermik boruya yüklenmesi için aliquoted 5 uL ilaç-boya karışımını tutmak için kullanılır.
PDI Alkol Hazırlama Pedleri	Honestmed	NDC 10819-3914-2	Cerrahi alanı dezenfekte etmek için kullanılır.
Premium Care Steril Tip VII Gazlı Bez Süngerler, 8 Katlı, 2" x 2"	Dukal	Ürün C5119	Ameliyat sırasında sıçanın boynunun altında cushon olarak kullanılır.
Basın' n Mühür Streç Film	Glad		Ameliyat sırasında bir fareyi örtü gibi örtmek için kullanılır.
Sıçan Ekartör Seti	Kent Scientific Corporation	Surgi 5002	Vagus sinirini karotis arterden ayırmanın kolay olması için kesiği açık tutmak için kullanılır.
Doğru Sıcaklık Jr.	Kent Scientific Corporation		20,3 cm G x 25,4 cm L (8 inç G x 10 inç U), fareleri sıcak tutmak için kullanılır.
S & T Forseps - SuperGrip İpuçları	Güzel Bilim Araçları	00632-11	Dokuyu zarar görmeden tutmak için dikiş sırasında kullanılır.
S & T Sütür Bağlama Forseps	Güzel Bilim Araçları	00272-13	Sütürü sıkılaştırmak için kullanılır.
Neşter bıçağı #15	Güzel Bilim Araçları	10015-00	Boynun ventral tarafındaki deride bir kesi yapmak için kullanılır.
Neşter Sapı-#7	Güzel Bilim Araçları	10007-12	Neşter bıçağını tutmak için kullanılır.
Şırınga Pompası	KD Bilimsel	78-81-8052GL	Seri #D107034, Model # LEGATO-180, bir program altında küçük hacimli karışımları pompalayabilen programlanabilir bir pompadır.
TipOne Filtre Ucu Dolum Başlangıç Sistemleri	ABD Bilimsel	Ürün #1120-3510	İlaç ve boya karışımını pipetlemek için kullanılır.
İzofluran için Buharlaştırıcı, Huni Dolgulu	Kent Scientific Corporation	Vetflow 1231	Sıçanları uyuşturmak için kullanılır.
Vetbond Doku Yapıştırıcıları	3M Science Life ID B00016067'a Uygulandı		Dikiş mükemmel değilse, kesilen yara bölgesinde dokuyu kapatmak için kullanılır.
Wahl BravMini+ Profesyonel Kablosuz Kesme Kiti	Kent Scientific Corporation	CL7300-Kit	Sıçan tüylerini kesmek için kullanılır.