Method Article

Hipokampal Piramidal Nöronlardaki Rolleri İçin Pozisyona Özgü GABAA Reseptör Alt Birimi Yanlış Algılama Varyantlarının Tanımlanması ve Sınıflandırılması

DOI:

10.3791/67833

⸱

June 6th, 2025

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, DNA'dan protein fonksiyonuna ve nöral davranışa kadar uzanan çok ölçekli bir çerçeve sunmaktadır. GABAA reseptör alt biriminde öngörülen patojenik mutasyonları araştırmak için yeni bir yaklaşım sunar ve patojenik olarak tahmin edilen epileptojenik mutasyonların ve proksimal mutasyonların CA1 piramidal nöron modeli üzerinde benzer etkiler üretebileceğini varsaymaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epilepsi ile ilişkili genlerde fonksiyonel olarak bilinmeyen varyantların etkilerini anlamak, hastalık patofizyolojisinin aydınlatılması ve kişiselleştirilmiş terapötiklerin geliştirilmesi için çok önemlidir. DNA dizisinden protein fonksiyonuna ve nöral davranışa kadar uzanan çok ölçekli bir çerçeveyle, GABAA reseptör alt birimindeki epileptojenik mutasyonların ve yakındaki tahmin edilen mutasyonların CA1 piramidal nöron modeli üzerinde benzer etkiler üretebileceğini varsayarak, patojenik mutasyonları tahmin etmek ve araştırmak için yeni bir yaklaşım tanımlıyoruz. Çalışma, tahmin edilen patojenik mutasyonlar ile proksimal epileptojenik mutasyonlar arasındaki karakteristik ilişkileri araştırarak, epileptojenik mutasyonların hipokampal piramidal nöron simülasyonları üzerindeki etkilerine dayalı olarak tahmin edilen mutasyonların etkilerini tahmin etmeyi amaçlamaktadır.

Metodoloji, GABAA reseptörü γ2 alt birim genetik verilerinin toplanmasıyla başlar, ardından özel bir komut dosyası kullanılarak R'de gerçekleştirilen veri temizleme ve biçimlendirme ile devam eder. Daha sonra, γ2 alt biriminin patojenik yanlış anlamlı varyantlarını tanımlamak ve önceliklendirmek için topluluk tahmincileri uygulanacaktır. Epileptojenik mutasyonlar tarafından paylaşılan alt birim yapısal alanlara spesifik bir patojenik varyantın (tahmin edilen) haritalanması, etkilerinin moleküler modellemesi ve evrimsel korumanın değerlendirilmesi ile birlikte gösterilecektir. Daha sonra, varyanta özgü meta-analiz ve parametre normalizasyonu gerçekleştirilecek, ardından tahmin edilen mutasyonlar ile proksimal epileptojenik mutasyonlar arasındaki anlamlı ilişkileri belirlemek için korelasyon analizi yapılacaktır. Python tabanlı bir nöral simülatör kullanılarak, vahşi tip ve epileptojenik mutantların etkisini yansıtan çok bölmeli iletkenlik tabanlı nöron modeli açıklanacaktır. Epileptojenik GABA tarafından üretilen nöral tepkilerin simülasyonuBir reseptör alt tipi, tahmin edilen patojenik varyantların nöral yanıt üzerindeki etkisinin kaba tahmini için dikkate alınacaktır. Bildiğimiz kadarıyla, bu, epilepsi araştırmaları için çok önemli olan GABAA reseptör varyantlarının nöronal davranış üzerindeki etkilerini tahmin etmek için çok ölçekli bir çerçeveyi araştıran ilk protokoldür. Bu protokol, epilepsi ile ilişkili GABAA reseptörlerinin potansiyel olarak patojenik varyantlarının neden olduğu hücresel fenotiplerin tahminlerini geliştirmek için bir temel görevi görebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neredeyse tüm insan hastalıkları için, genetik çeşitlilik bireysel duyarlılıkta önemli bir rol oynar. Bu nedenle, dizi varyasyonlarının hastalık riski ile nasıl ilişkili olduğunu anlamak, hastalık gelişiminde yer alan temel süreçleri ortaya çıkarmak ve önleme ve tedavi için yeni yaklaşımları belirlemek için değerli bir yol sunar1. Bu aynı zamanda pediatrik birinci basamakta en yaygın kronik tıbbi durumlar arasında yer alan nörogelişimsel bozukluklar için de geçerlidir2. Otizm spektrum bozukluğu, zihinsel engellilik ve epilepsi gibi durumlar, genetik çeşitliliğin gelişim sırasında bireysel duyarlılığı nasıl önemli ölçüde etkilediğini göstermektedir3.

Gelişmekte olan beyin, uyarılma ve inhibisyon arasındaki kritik dengede genetik olarak programlanmış nörogelişimsel uyumsuzluk nedeniyle epileptik nöbetlere yetişkin beyninden daha duyarlıdır4. Yetişkin beynindeki birincil inhibitör nörotransmitter olan GABA (gama-aminobütirik asit), embriyonik ve erken doğum sonrası gelişim sırasında uyarıcı olduğundan, bu genç beyinlerde nöbetleri önlemek için gereken stabilite için uygun değildir. K-Cl ko-taşıyıcılarının5 yeterli ekspresyonunun olmamasından kaynaklanan bu geçici durum, işlevsiz GABAA reseptörlerinin varlığında nöbet aktivitesi riskinin artmasına katkıda bulunabilir. GABAA reseptörleri, Cl-ion 6'nın hücre içi konsantrasyonuna bağlı olarak GABA'nın uyarıcı ve inhibitör etkilerine aracılık eder. Bu nedenle, beyin olgunlaştıkça, GABAA reseptörü kodlayan genlerdeki ve diğer iyon kanallarındaki mutasyonlar, uyarılabilirliği bozar ve nöronal metabolizma, hücre sinyalizasyonu vesinaps oluşumu 7 ile ilgili genlerdeki mutasyonlar, çocukluk çağı epilepsisi8 gibi durumlara neden olabilir.

Klinik müdahaleler, nörogelişimsel bozuklukların tedavisinde hassasiyeti artırmak için genetik analizden giderek daha fazla yararlanmaktadır2. Pediatrik epilepside genetik testler, tedavi kararlarını yönlendirmede genetik varyantların önemini vurgulayan hassas tıp yaklaşımları9 için potansiyel hedefler sunmaktadır. Ek olarak, de novo mutasyonları olan epilepsi hastalarının ~%25'i, hassas tıp için potansiyel hedefleri belirleyen genetik tanılar alır ve bu da tedavi kararlarına rehberlik etmede genetik varyantların önemli değerinin altını çizer10. Bu, genetik keşifleri önemli ölçüde hızlandıran hedeflenen gen panelleri, tüm ekzom dizilimi ve tüm genom dizilimi gibi yeni nesil dizileme teknolojilerindeki gelişmelerle desteklenmiştir11. Bununla birlikte, artan sayıda yeni gen keşfi, sonuçlar, varyantın hastalık patogenezindeki moleküler rolüne ilişkin çelişkili kanıtları veya yetersiz bilgiyi yansıtan bir sınıflandırma olan bilinmeyen öneme sahip bir varyant (VUS) verdiğinde bir zorlukla birlikte gelir. VUS olarak sınıflandırılan varyantlar, Amerikan Tıbbi Genetik ve Genomik Koleji (ACMG) ve Moleküler Patoloji Derneği (AMP) tarafından önerilen beş katmanlı varyant sınıflandırma sistemi içinde bir kategoriye karşılık gelir12.

İşlevsel olarak bilinmeyen genetik varyantların zorluğunu ele almak, iki temel boyutta çaba gerektirir: klinik uygulama ve araştırma. Klinik olarak, VUS'u çevreleyen belirsizlik hasta yönetimini ve karar vermeyi zorlaştırabilir13. Bilimsel araştırma perspektifinden bakıldığında, önemi belirsiz artan sayıda varyant arasında patojenik varyantların tanımlanması ve bunların hastalık patofizyolojisi ve fenotipik etkilerindeki rollerinin belirlenmesi çok önemlidir1. İdeal bir senaryo, işlevsel olarak karakterize edilmemiş tüm varyantların moleküler, nöronal ve ağ düzeyindeki etkilerini doğru bir şekilde tahmin etmeyi ve böylece laboratuvar tabanlı araştırmalar için gereken kaynakları, zamanı ve çabayı en aza indirmeyi içerir. Bu hususlar, genetik epilepsilerin kesin teşhisini sağlamak, kişiselleştirilmiş tedaviyi desteklemek ve potansiyel farmakolojik hedeflerin keşfedilmesini kolaylaştırmak için genetik varyantların doğru bir şekilde sınıflandırılmasının önemini vurgulamaktadır. Mevcut öngörücü araçlar 14,15,16,17 nispeten doğrudur, ancak tipik olarak yalnızca ikili sınıflandırmalar (patojenik ve iyi huylu) sağlar ve moleküler patofizyoloji, fenotipik sonuçlar ve altta yatan mekanizmalar hakkında hastalığa özgü içgörülerden yoksundur. Seçilmiş GABAA reseptör alt birimi kodlayan genlerin bilinmeyen yanlış anlamlı varyantlarına odaklanan bu makale, moleküler, evrimsel ve yapısal yönler gibi varyantların bağlamsal faktörlerinin yanı sıra epilepsi ile ilişkili mutasyonların in vitro biyofiziksel verilerinden türetilen nöral patoloji simülasyonlarını dahil ederek araştırma rehberliğini geliştirmeyi amaçlayan bir çerçeve sunmaktadır. Metodolojimiz, epilepsi 18,19,20'nin patofizyolojisinde yer alan önemli bir alt birim olan GABA A reseptörünün γ2 alt biriminin bilinmeyen patojenik varyantlarının tanımlanmasını ele almaktadır. Bunu, bu tahmin edilen varyantların, yapısal ve elektrofizyolojik verilerle karakterize edilen epilepsi ile ilişkili mutasyonlarla pozisyona özgü eşleşmesinin araştırılması takip eder. Bu veriler daha sonra, hızlı sinaptik inhibisyondan sorumlu γ2, α1 ve β3 alt birimlerinden (γ2-GABAA reseptörleri) oluşan bir GABAA reseptör alt tipini eksprese eden bir hipokampal piramidal nöron modeli üzerindeki varyant etkisini tahmin etmek için kullanılır6. GABAA reseptörlerinin büyük bir alt birim havuzundan (α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π ve ρ1-ρ3) bir araya geldiğini ve alt birim bileşimine bağlı olarak, GABAA reseptörlerinin modülasyonları, biyofiziksel özellikleri ve ayrıca bölgesel, hücresel ve hücre altı ekspresyon modellerinde farklılık gösterdiğini ve belirli işlevlerle birleştiğini not etmek önemlidir 6,21,22,23, 24,25. Bu nedenle, bu çalışma sadece γ2-GABAA reseptörlerine veya γ2 içeren GABAA reseptörlerine odaklanmaktadır.

GABAA reseptör alt birimleri, karakteristik yapısal özelliklerden oluşur - uzun bir N-terminal hücre dışı alan (ECD), dört transmembran yayılma alanı (TM1 ila TM4), TM1 ve TM2'yi bağlayan bir hücre içi bağlayıcı, TM2 ve TM3'ü bağlayan bir hücre dışı bağlayıcı, TM3 ve TM4 arasında büyük bir hücre içi döngü (TM3-TM4 döngüsü) ve kısa bir hücre dışı C terminali 6,26, 27. GABAA reseptörünün, GABA bağlanmasının β ve α alt birimlerini kilitlediği karmaşık bir "kilitleme ve çekme" mekanizması yoluyla işlev gördüğü, alt birimlerin hücre dışı alanlarını (ECD'ler) çekmelerine ve onları saat yönünün tersine döndürmelerine neden olduğu öne sürülmektedir27. Bu hareket, transmembran alanlarını (TMD'ler) bükerek iyon kanalını27 açar. Bu nedenle, kanal aktivitesinin GABAA reseptörleri içindeki yapısal kasetlerle birlikte koordine edildiği görülmektedir. Epilepsi mutasyonlarının bu yapısal kasetlerin bozulması yoluyla kanal aktivitesinde işlev bozukluğuna neden olduğu ortaya çıkmıştır28. Sonuç olarak, çalışmamız, GABAA reseptör alt birimlerinin spesifik yapısal kasetlerinde fonksiyonel olarak tanımlanmış epileptojenik mutasyonlara yakın olarak tahmin edilen patojenik varyantların, bu epileptojenik mutasyonlarda gözlemlendiği gibi, kanal fonksiyonunda benzer elektrofizyolojik veya biyofiziksel bozulma paternleri sergileyebileceği fikrine dayanmaktadır. GABAA reseptör alt birimlerinde28 epileptojenik yapısal kasetlerin varlığı bu görüşü dolaylı olarak desteklerken, çalışmamız epileptojenik mutasyonların biyofiziksel parametrelerini tahmin edilen patojenik mutasyonlarınkilerle ilişkilendirmenin karmaşıklığını ve zorluğunu göstermektedir. Bu karmaşık ilişkilerin maskesini düşürmek için, çerçevemiz DNA'dan protein fonksiyonuna ve epilepsi araştırmaları için kritik olan nöral davranışa kadar çok ölçekli bir yaklaşımı vurguladığı için önemlidir. Bu yaklaşım, hesaplamalı genetiği moleküler modelleme ve nöral simülasyonlarla bütünleştirirken, aynı zamanda mutasyonların kanal yapısı, aktivitesi ve nöral uyarılabilirlik üzerindeki etkilerini yakalayabilecek büyük veri kümeleri üzerinde eğitilmiş makine öğrenimi gibi tamamlayıcı yöntemlerin önemini vurgular. Ek olarak, hipokampal piramidal nöron modeli üzerinde epileptojenik γ2-GABAA reseptör aktivitesinin simülasyonu, GABAA reseptör kanalopatisi ile ilişkili in vitro hücresel fenotipin replikasyonuna ve ağ disfonksiyonunun merkezinde değişmiş tek nöron yanıtlarının gösterilmesine izin verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Patojenik varyantların in silico tahmini

  1. Varyant veri toplama
    1. ClinVar veri tabanını29 kullanarak, ilgilenilen genin kodlama bölgesinde belirsiz öneme sahip varyantları (VUS) web sitesi aracılığıyla arayın: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. Arama çubuğuna gen sembolünü (örneğin, GABRG2) girin ve sonuçları, yalnızca tek nükleotid, belirsiz öneme sahip yanlış anlamlı varyantlar gibi istenen varyant türlerini içerecek şekilde filtreleyin. Verileri data.xlxs olarak indirin ve kaydedin (Ek Dosya 4: Ek Tablo S1). İndirilen verilerin tarihini kaydedin.
      NOT: Mevcut protokolde, GABAA reseptörünün insan γ2 alt birimi, özellikle Homo sapiens gama-aminobütirik asit tip A reseptör alt birimi gama2 (GABRG2), transkript varyantı 1, γ2L olarak da bilinen mRNA (NCBI Ref. sırası: NM_198904.4) analiz edilecektir. Farklı hesaplama yöntemleri farklı tanımlayıcılar gerektirebileceğinden, ilgilenilen genin referans transkriptinin yanı sıra diğer karşılık gelen tanımlayıcıların farklı veritabanlarına (UniProt, ENSEMBL, PDB) kaydedilmesi önemlidir (Ek Dosya 4: Ek Tablo S2). Veritabanının veya hesaplama aracının dizi tanımlayıcılarının sürüm numaralarını tanımaması durumunda, hem sürüm numarasıyla (NM_198904.4) hem de sürüm numarası olmadan (NM_198904) kimliği deneyin.
    2. Referans protein temel bilgileri
      1. NCBI veritabanı https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, arama seçeneklerinde Nucleotide'ı seçin ve ilgilenilen genin NCBI Ref. devamı ID'sini girin (NM_198904.4). Ardından, sağ sütunu aşağı kaydırarak, transkript NM_198904.4 tarafından kodlanan proteini (NP_944494.1) bulmak için İlgili bilgiler kategorisi altındaki Protein'e tıklayın. Protein NP_944494.1 için verilen bilgileri kullanarak, belirli bölgelerin dizi konumlarını bir tablo şeklinde kaydedin (Ek Dosya 4: Ek Tablo S3).
        NOT: Protein alanları, fosforilasyon bölgeleri, ligand bağlanma bölgeleri ve moleküler etkileşim arayüzleri gibi işlevsel ve yapısal olarak kritik bölgelerin, motiflerin veya kalıntıların dizi konumu için bilinen ön bilgilerin belirlenmesi önemlidir. Bu, veri tabanı (NCBI, ENSEMBL, UniProt...) ve literatür taramalarının birleştirilmesiyle başarılabilir.
  2. Varyant veri organizasyonu
    1. Verileri, seçilen tahminciler için giriş gereksinimlerini karşılayacak şekilde düzenleyin. Alınan verilerin biçiminin, dbNSFP sunucu http://database.liulab.science/dbNSFP gereksinimlerine uyacak şekilde düzenlendiğinden emin olun. Bunu yapmak için, data.xlsx dosyasından gereksiz sütunları kaldırın (Ek Dosya 4: Adım 1.1.1'deki Ek Tablo S1), yalnızca aşağıdaki sütunları belirtilen sırada tutun:
      "GRCh38Kromozom", "GRCh38Konum", "İsim", "Protein değişimi".
    2. Dosyayı yeni bir dosya adı altında kaydedin: "data1.xlsx" (Ek Tablo S4). Kodu çalıştırarak data1.xlsx dosyasını R'de biçimlendirin (Ek Dosya 1: Data_GABAA. R), biçimlendirilmiş verileri R projesiyle ilgili çalışma dizininde data1_output.xlsx (Ek Dosya 4: Ek Tablo S5) olarak kaydeder.
      NOT: Farklı hesaplama yöntemleri, farklı veri türleri ve biçimleri gerektirir. Bir düzine varyant için bile belirli biçim gereksinimlerine göre veri toplamak ve düzenlemek hatalara açık ve zaman alıcı olabilir, bu nedenle varyant havuzu yalnızca birkaç varyanttan oluşmadığı sürece bu adım önemlidir. Ardından, manuel veri organizasyonu mümkün olabilir.
  3. Patojenite tahmini
    1. data1_output.xlsx dosyasının içeriğini, http://database.liulab.science/dbNSFP aracılığıyla erişilen dbNSFP sunucusu 30,31'in akademik sürümüne aktarın. Bunu yapmak için dosyayı kopyalayın/yapıştırın veya doğrudan .txt biçiminde yükleyin.
    2. Aşağıdaki seçeneklerin sunucuda önceden seçildiğinden ve onaylandığından emin olun: Göndermeden önce HG38 (genom oluşturma), ClinPred32 ve BayesDEL33 . Birkaç dakika içinde sunucu sonuçları oluşturacaktır.
      NOT: Mevcut protokolde, yüksek doğruluk34 ve pratiklik için BayesDEL33 ve ClinPred32 olmak üzere iki topluluk tahmincisi seçilmiştir. Bununla birlikte, dbNSFP veritabanında30,31 bulunan AlphaMissense gibi diğer öngörücüler de seçilebilir. In silico araçların seçimi, güçlü tahmin12 için yeterli sayıda hesaplama kanıtının oluşturulması da dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Çoklu tahmine dayalı algoritmaların analizini entegre eden topluluk tahmincileri bu amaca hizmet edebilir.
    3. Çıktı dosyasını (.txt bir formatta) indirin ve data2.xlsx olarak kaydedin (Ek Dosya 4: Ek Tablo S6).
    4. Menüdeki filtre seçeneğine tıklayarak ve D için filtreleme yaparak her iki sütundaki konsensüs varyantlarını belirleyerek filtreleri data2.xlsx (Ek Dosya 4: Ek Tablo S6) ayarlayın. Bu, en patojenik varyantların listesini verecektir; kaydedin (Ek Tablo S6'daki Konsensüs sekmesine bakın [ Ek Dosya 4]).
  4. Varyant seçimi
    1. Konsensüs patojenik tahminleri arasında, literatürden elde edilen epileptojenik mutasyonların yakınlığındaki varyantları belirleyin. İkincisinin nöron modellemesi için uygun yapısal ve biyofiziksel parametrelere sahip olduğundan emin olun.
      NOT: Bu adım keşif amaçlıdır ve aynı zamanda ilgilenilen proteinin yapısal, fizikokimyasal ve biyofiziksel parametreleri açısından araştırılmasıyla da ilgilidir. Bu çalışmada bu veriler Brünger ve ark.35 ve Guo ve ark.36'dan elde edilmiş ve epilepsi ile ilişkili mutasyonlar ile ilgili bir anket yapılmıştır. Ayrıca, bir seçenek olarak, AlphaMissense37 puanlarına dbNSFP veri tabanından30,31 tekrar eden adım 1.3'ten erişilmiştir (Ek Dosya 4: Ek Tablo S7). Daha fazla ayrıntı protokol bölümleri 2.1.1 ve 2.1.2'de ve Sonuçlarda verilmiştir (bakınız "Yapısal ve Biyofiziksel Parametreler için Kümeleme Varyantları").
    2. Temel görselleştirme için, seçilen GABRG2 gen mutasyonları bağlamında önceki adımdaki varyantları incelemek için Protter38 ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/) ve HOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) sunucularını kullanın: P302L40 ve K328M (veya 39 kalıntı sinyal peptidi hariç tutulduğunda K289M41).
      NOT: Muazzam karmaşıklık nedeniyle, varyant etkilerinin yapısal değerlendirmesi birden fazla analiz düzeyinde yapılmalıdır. Protter38 gibi araçlar, proteinin topolojik özellikleri bağlamında varyantların net bir şekilde görselleştirilmesine izin verecek ve HOPE39 gibi kullanıcı dostu sunucular, moleküler modelleme yoluyla varyant etkisi hakkında fikir verecektir. Ek olarak, ilgilenilen proteinin kapsamlı bir literatür taraması, epilepsi ile ilişkili mutasyonlar hakkındaki bilgileri tanımlamak ve entegre etmek için kritik öneme sahiptir.
    3. Evrimsel koruma ve yapısal içgörülerin analizi
      1. Proteinlerin düzenlenmesi, görselleştirilmesi ve analizi için açık kaynaklı bir program olan Jalview 42,43,44'ü açın.
      2. Hizalama için dizileri içe aktarın. Üst menüdeki Dosya'ya tıklayın | Dizileri getirme; iletişim kutusunda veritabanını seçin (UniProt gibi); kimlikleri al sekmesine tıklayın; ve iletişim kutusunda açıklandığı gibi, insan ve diğer omurgalı türlerinden ilgilenilen genin (GABRG2) UniProt erişim kimliklerini girin: P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2, A0A8M1P4D6. Tamam'a tıklayın.
        NOT: GABRG2 tarafından kodlanan proteinlerin UniProt erişim sayıları aşağıdaki gibidir: Homo sapiens için P18507 (P18507-2), Mus musculus için P22723, Pan troglodytes için A0A2I3TKX0, Sus scrofa için F1RR72, Canis familiaris için A0A8I3MDZ2 ve Danio rerio için A0A8M1P4D6.
      3. İlgilenilen gene bağlı olarak, bazı diziler açıklanmayabilir; bu nedenle, daha iyi bir bağlamsal anlayış için ilgili bilgileri ve potansiyel homologları belirlemek için bir BLAST araması yapın. Bu durumda, istenen dizilerin birden çok dizi hizalamasını oluşturmak için Dosya menüsü altındaki Dizi Ekle/Buradan metin kutusu seçeneği aracılığıyla protein dizilerinin FASTA formatını yükleyin.
      4. Hizalama yüklendikten sonra, çoklu dizi karşılaştırması için görüntülenen dizileri gözlemleyin. Her satır bir diziyi temsil eder ve her sütun hizalamadaki bir konumu temsil eder. En iyi hizalama yöntemini belirlemek için farklı yaklaşımlar kullanın; örneğin, Sıra menüsündeki Web hizmetlerine tıklayın ve optimum hizalamaya izin veren T-Coffee'yi önceden ayarlanmış olarak çalıştır seçeneğini seçin.
      5. P18507 Homo sapiens (mevcut çalışmadaki referans dizisi) dizisine sağ tıklayın ve bunu referans dizisi olarak ayarlayın. Üst menüden Format'ı seçin ve ekrandaki tam hizalamanın görselleştirilmesi için Wrap'e tıklayın. Aynı Biçim menüsünde, belirli kalıntı numaralarının görselleştirmesini geliştirmek için yukarıdaki ölçeğe tıklayın. Görselleştirmeyi daha da geliştirmek için, Renk'e gidip farklı seçenekler belirleyerek renk şemalarını ayarlayın (örneğin, Renkli Renk, Kimyasal Özellik); Gerekirse yazı tipi boyutunu değiştirin.
      6. Menü çubuğunda Hesapla'ya tıklayın ve korunan bölgeleri vurgulamak için Konsensüsü otomatik hesapla'yı seçin.
      7. In-silico tahmin adımında tanımlanan ilgilenilen varyantların konumuna odaklanın ve belirli varyant pozisyonlarını inceleyin. Belirli kalıntılara sağ tıklayarak ve Ek Açıklama Ekle'yi seçerek açıklama ekleyin. Etiketi (ör. varyant kimliği) uygun renk koduyla yazın ve kaydedin.
        NOT: Mevcut analizde, P302L (mor) ve A303T (kırmızı), bunları yapısal verilerle birlikte çoklu dizi hizalamasında görselleştirmek için seçilmiştir (bir sonraki bölüme bakın).
    4. Seçilen korunmuş kalıntıları gösteren tam proteinin üç boyutlu rekonstrüksiyonu
      1. Önceki adımdan elde edilen dosyada, referans dizisine (GABRG2 insan) sağ tıklayın ve 3B yapı verilerini seçin.
      2. Açılır menüden uygun yapısal verileri (7QNE, Chain C)26 belirleyin ve Jmol ile yeni yapı görünümü aç'ı seçin.
        NOT: Bu, çoklu dizi hizalamasında seçilen kalıntıların, 3B kimyasal yapılar için açık kaynaklı Java tabanlı bir görüntüleyici olan Jmol tarafından yapısal verilere dahil edilmesine izin verecektir.

2. Parametre seçimi ve biyofiziksel modelleme

  1. Varyanta özgü meta-analiz ve parametre normalizasyonu
    1. Elektrofizyolojik veri kanalı iletkenliği (gGABAA), deaktivasyon süresi (τdeaktivasyon), yükselme süresi (τyükselme) ve maksimum akım genliği (Imaks.) ile tanımlanmış alt birim varyantlarını toplamak için mevcut literatürü araştırın. Her durum için alt birim bileşimlerini, hücre tipini ve vahşi tip ölçümlerini sağlayın. Varyantları ve kontrollerini buna göre etiketleyin (örneğin, tanımlanmış biyofiziksel özelliklere sahip varyantlar için bilinir ve her varyant için vahşi tip ölçümler için bilinen kontrol).
    2. Tanımlanmış biyofiziksel özelliklere sahip varyantlar için AlphaMissense patojenite skorları elde edin.
      NOT: Daha fazla ayrıntı için protokol bölüm 1.3'e bakın.
    3. Her varyant için alt birim ve amino asit pozisyonu, orijinal ve değiştirilmiş amino asitler, patojenite skoru ve literatürden elde edilen biyofiziksel parametreleri içeren bir veri çerçevesi oluşturun. Deneysel tutarsızlıkları önlemek için, tanımlanan varyantlar için biyofiziksel parametreleri, vahşi tip ölçümlerde x kat değişiklikleri olarak normalleştirin.
  2. Yapısal ve fonksiyonel özelliklere göre karşılaştırmalı varyant analizi
    1. Tahmin edilen varyantları bir veri çerçevesi üzerinde düzenleyin; buna göre etiketleyin (örneğin, biyofiziksel özellikleri hakkında literatür bulunmayan varyantlar için tahmin edilir).
    2. Varyantları amino asit dizisindeki konumlarına ve üçüncül yapıya göre sınıflandırın. Veri çerçevesine yapısal sınıflandırma parametreleri (örneğin, alfa sarmallarında, bobinlerde, beta tabakalarında, hücre dışı, hücre içi veya transmembran alanlarda, gözenek astarında, agonist bağlanmasında, protein-protein etkileşimlerinde lokalizasyon) ekleyin ve her varyant için amino asit konumlarına göre bilgi sağlayın.
    3. Varyantları membran merkezine ve gözenek eksenine olan mesafelerine göre sınıflandırın. Veri çerçevesindeki gözenek eksenine olan mesafeyi ve membran merkezi parametrelerine olan mesafeyi ekleyin.
    4. Bilinen varyantlar üzerinden yapısal ve biyofiziksel parametreler arasındaki korelasyonu analiz edin. Mümkünse, elde edilen korelasyonlara göre tahmin edilen varyantları değerlendirin.
  3. Sinaps ve nöron modeli yapımı
    1. Çok bölmeli iletkenlik tabanlı hipokampal piramidal nöron üzerinde GABAerjik sinapsın çok bölmeli bir biyofiziksel modelini oluşturmak için Python'da sivri sinir ağlarını modellemek ve simüle etmek için geliştirilen açık kaynaklı bir sinir simülatörü olan Brian245'i kullanın.
    2. İyon kanalı geçit kinetiğini, pasif ve aktif parametreleri ve postsinaptik iletkenlikleri tanımlayarak iletkenlik tabanlı modeli tasarlayın. Modelde kullanılan denklemleri açıklayan Ek Dosya 2'de verildiği gibi iletkenlik tabanlı modeli tanımlayın.
      1. Membran kapasitansını (Cm) 1 μF/cm2 ve hücre içi direnci (Ra) 200 Ω.cm olarak ayarlayın.
      2. gL= 0.0003 S/cm2, gK= 0.036 S/cm2, EL = -76.5 mV, ENa = 50 mV ve EK = -90 mV olan hipokampal piramidal nöronlar39 için modifiye edilmiş Hodgkin-Huxley tipi iletkenlikleri kullanın.
      3. NaV kanallarının gNa üzerindeki yoğunluk dağılımını soma için 0.05 S/cm2 , akson başlangıç segmenti (AIS) ve Ranvier (NR) düğümü için 0.5 S/cm2 ve dendritler için 0.005 S/cm2 olarak ayarlayın. Miyelinli segmentlerde gK ve gNa'yı 0 olarak ayarlayın.
      4. Ek Dosya 2'de açıklandığıgibi Na V ve KV için iyon kanalı geçit kinetiği oluşturun.
      5. Bir bölmedeki tüm glutamaterjik ve GABAerjik sinapsların toplamı olarak sinaptik akımları (Isyn) tanıtın. Glutamaterjik akımda (I glu) hem hızlı AMPA reseptörü aracılı akımı (IAMPA) hem de yavaş NMDA reseptörü aracılı akımı (INMDA) dahil edin. GABAerjik akımda (IGABA) yalnızca hızlı GABAA reseptör aracılı akımı dahil edin. Her presinaptik sivri uç için sinapsa sabit miktarda glutamat salındığını varsayalım; bu nedenle, reseptörlerin aktivasyonu spike-time'a bağlıdır (sAMPA ve sNMDA) ve toplam reseptör iletkenlikleri (gAMPA ve gNMDA) her olay tarafından salınan glutamat miktarını yansıtır.
      6. Ek Dosya 2'de açıklandığı gibi sinaptik modeli kullanın.
        NOT: Denklemlerin ayrıntılı bir açıklaması için, modelde kullanılan denklemleri açıklayan Ek Dosya 2'ye bakın.
    3. Soma ve nöritler için deneysel olarak ölçülen çapı ve her bir nörit bölmesinin uzunluğunu ve dallanma modellerini önceki literatürdenelde edin 46,47. Hücreyi birden fazla bölmeye bölerek, ana dallanma yapısını doğru bir şekilde koruyan ve iki taraflı simetriyi koruyan gerçek nöron morfolojisini çok bölmeli bir modele indirgeyin.
    4. Morfolojik (segment uzunluğu ve çapı; yani d_soma: 30 μm; l_AH: 5 μm; d_AH_i: 1,5 μm; d_AH_f: 1,3 μm; l_AIS: 40 μm; d_axon: 1 μm; l_myseg: 100 μm; l_NR: 2 μm; l_AxTer: 4 μm; d_AxTer: 2 μm; l_approx: 100 μm; l_apmed: 100 μm; l_apdis: 200 μm; d_approx_i: 4 μm; d_approx_f: 3 μm; d_apmed : 2 μm; d_apdis: 2 μm; l_apLM: 70 μm; d_apLM: 2 μm; l_nAcDbasal: 400 μm; d_nAcDbasal: 1,4 μm; l_nAcDbasal_stem: 20 μm; d_nAcDbasal_stem: 1.5 μm) ve piramidal nöron modelinin46,47 her bir bölmesi için biyofiziksel parametreler (bölüm 2.3.2'de verildiği gibi) Python betiğinde de ayrıntılı olarak açıklanmıştır (Ek Dosya 3: GABAAvar.py).
    5. Adım 2.1.1'de elde edilen vahşi tip kontrol ölçümlerini değerlendirerek GABAerjik sinaps modeli için biyofiziksel parametreleri belirleyin.
  4. Nöron modelinin topolojisini tasarlayın ve daha önce elde edilen morfolojik ve dallanma bilgilerine dayanarak bölmelerin uzamsal düzenlemesini ve ara bağlantılarını belirlemeyi içeren morfolojik ve biyofiziksel parametreleri atayın. Ek Dosya 3: GABAAvar.py'da belirtildiği gibi, modelin her bir bölmesine uygun morfolojik (örneğin, segment uzunluğu ve çapı) ve biyofiziksel parametreleri (Bölüm 2.3.2) atayın.
  5. Sinapsların oluşturulması ve akım enjeksiyonu
    1. "GABAAvar.py" (Ek Dosya 3) bölümünde verildiği gibi SpikeGeneratorGroup (Brian2 kitaplığından bir sınıf) kullanarak presynaptic aktiviteyi oluşturun. Sinaptik bağlantıları modellemek için Synapses sınıfını kullanarak spike üretecini model nöronun hedef bölmesine bağlayın.
    2. Sürekli bir sabit akımı (Iinj) 0.85 nA olarak ayarlayın ve Ek Dosya 3: GABAAvar.py'da belirtildiği gibi belirli bir zamanda temel iyonik akım yükü tarafından yönlendirilen eşik altı aktiviteyi taklit etmek için soma'ya yerleştirin.
  6. Kayıt monitörleri oluşturmak için, StateMonitor kullanarak hedef bölmelerden voltaj izlerini kaydedin.
  7. Ağı oluşturun ve çalıştırın.
    1. Network'ü kullanarak model nöron, bağlantılar ve monitörlerle ağı oluşturun.
    2. Simülasyonun zaman adımını defaultclock.dt ile ayarlayın (örneğin, 0,01 ms).
    3. Örnekte T'nin 1.000 ms olarak ayarlandığı network.run(T*ms) ile simülasyonu ağ üzerinde çalıştırın.
  8. GABAA reseptörü yanlış algılama mutasyonlarının etkisinin test edilmesi
    1. Adım 2.1.1'de toplanan biyofiziksel parametreler aracılığıyla her bir yanlış anlamlı mutasyonun kanal kinetiği üzerindeki etkisini tanımlayın.
    2. Bu parametreleri değiştirerek stimülasyonu çalıştırın ve sonuçları "GABAAvar.py" da verildiği gibi "matplotlib.pyplot" kullanarak çizin (Ek Dosya 3).
  9. Ateşleme modellerindeki ve hızlarındaki değişiklikleri analiz etmek için parametre kombinasyonlarını test edin. Karşılaştırmalar için sonuçları çizin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, epilepsinin patofizyolojisinde önemli bir bileşen olan GABAA reseptörünün γ2 alt birimindeki patojenik varyantları tahmin etmek ve karakterize etmek için çok ölçekli bir yaklaşım kullanmaktadır. Öngörücü modeller, moleküler modelleme, evrimsel koruma, yapısal inceleme, korelasyon analizi ve nöral simülasyonların kullanılması yoluyla bu yaklaşım, epilepsi araştırmaları ve muhtemelen klinik kullanım için önemli bir önemi olan varyantların sınıflandırılmasını geliştiri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hesaplamalı genetik, moleküler modelleme ve nöral simülasyonların bir kombinasyonunu uygulayarak, bu yazıda sunulan yaklaşım, hem epilepsi araştırmaları hem de klinik uygulamalar için değerli bilgiler sunan GABAA reseptör varyantlarının sınıflandırılmasını iyileştirme potansiyeline sahiptir. Tahmin edilen patojenik mutasyonların tanımlanması ve önceliklendirilmesi için kapsamlı bir analiz sunulur ve protein ve hücresel fenotip üzerindeki varyant etkileri arasındaki boşluğu pot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar bu çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model nöronun yapımındaki yardımları için Çağla Koca'ya teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Brian2 Sorbonne Üniversitesi, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, Fransa; Imperial College London, Birleşik Krallık2.8.0.4Stimberg ve diğerleri, 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
dbNSFP sunucusu   Genos Biyoinformatik LLC, ABDsürüm 3.0Liu ve diğerleri, 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
UMUT   Moleküler ve Biyomoleküler Bilişim Merkezi CMBI, Radboud Üniversitesi, Hollanda 1.1.1Venselaar ve diğerleri, 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
Jalview   Dundee Üniversitesi, Birleşik KrallıkJV2Waterhouse ve diğerleri, 2009 (https://www.jalview.org/)
Jupyter NotebookJupyter Projesi, ABDhttps://jupyter.org/install 
FitonPython Yazılım Vakfı, ABD3.13https://www.python.org/downloads/
Protter   ETH Zürih, İsviçreSürüm 1.0Omasitler ve diğerleri, 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R R İstatistiksel Hesaplama Vakfı, ABDR sürüm 4.3.2   https://www.r-project.org/ 
RStudioPozit yazılımı, PBC, ABDRStudio 2023.12.1+402 "Okyanus Fırtınası" Sürümühttps://posit.co/downloads/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claussnitzer, M., et al. A brief history of human disease genetics. Nature. 577 (7789), 179-189 (2020).
  2. Savatt, J. M., Myers, S. M. Genetic testing in neurodevelopmental disorders. Front Pediatr. 9, 526779(2021).
  3. Hoischen, A., Krumm, N., Eichler, E. Prioritization of neurodevelopmental disease genes by discovery of new mutations. Nat Neurosci. 17, 764-772 (2014).
  4. Holmes, G., Ben-Ari, Y. The neurobiology and consequences of epilepsy in the developing brain. Pediatr Res. 49, 320-325 (2001).
  5. Rivera, C., Voipio, J., Kaila, K. Developmental switches in GABAergic signalling: the K+-Cl- cotransporter KCC2 and carbonic anhydrase CAVII. J Physiol. 562, 27-36 (2005).
  6. Goetz, T., et al. GABA(A) receptors: structure and function in the basal ganglia. Prog Brain Res. 160, 21-41 (2007).
  7. Guerrini, R., et al. Monogenic epilepsies: disease mechanisms, clinical phenotypes, and targeted therapies. Neurology. 97 (17), 817-831 (2021).
  8. Matricardi, S., et al. Current advances in childhood absence epilepsy. Pediatr Neurol. 50 (3), 205-212 (2014).
  9. Sands, T. T., Choi, H. Genetic testing in pediatric epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 17 (5), 45(2017).
  10. Møller, R. S., et al. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1531-1538 (2015).
  11. Møller, R. S., et al. From next-generation sequencing to targeted treatment of non-acquired epilepsies. Expert Rev Mol Diagn. 19 (3), 217-228 (2019).
  12. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 17 (5), 405-424 (2015).
  13. Rehm, H. L., et al. The landscape of reported VUS in multi-gene panel and genomic testing: time for a change. Genet Med. 25 (12), 100947(2023).
  14. Katsonis, P., et al. Genome interpretation using in silico predictors of variant impact. Hum Genet. 141 (10), 1549-1577 (2022).
  15. Arslan, A. Pathogenic variants of human GABRA1 gene associated with epilepsy: a computational approach. Heliyon. 9 (9), e20218(2023).
  16. Abdullah, N. K., Arslan, A. Integrated bioinformatic approach for precision medicine: prediction of human GABRG2 gene pathogenic variants, characterized with cellular pathology and epilepsy phenotype severity. SDU J Nat Appl Sci. 28 (33), 300-315 (2024).
  17. Arslan, A. Algorithmic assessment reveals functional implications of GABRD gene variants linked to idiopathic generalized epilepsy. Int J Neurosci. 135 (5), 533-543 (2025).
  18. Kang, J. Q., Macdonald, R. L. Molecular pathogenic basis for GABRG2 mutations associated with a spectrum of epilepsy syndromes, from generalized absence epilepsy to Dravet syndrome. JAMA Neurol. 73 (8), 1009-1016 (2016).
  19. Komulainen-Ebrahim, J., et al. Novel variants and phenotypes widen the phenotypic spectrum of GABRG2-related disorders. Seizure. 69, 99-104 (2019).
  20. Lorenz-Guertin, J. M., et al. γ2 GABA(A)R trafficking and the consequences of human genetic variation. Front Cell Neurosci. 12, 265(2018).
  21. Korpi, E. R., Gründer, G., Luddens, H. Drug interactions at GABA(A) receptors. Prog Neurobiol. 67 (2), 113-159 (2002).
  22. Rudolph, U., Möhler, H. GABA-based therapeutic approaches: GABAA receptor subtype functions. Curr Opin Pharmacol. 6, 18-23 (2006).
  23. Whiting, P. J. GABAA receptors: a viable target for novel anxiolytics. Curr Opin Pharmacol. 6, 24-29 (2006).
  24. Arslan, A. Extrasynaptic δ-subunit containing GABAA receptors. J Integr Neurosci. 20 (1), 173-184 (2021).
  25. Arslan, A. Distinct roles of gamma-aminobutyric acid type A receptor subtypes: a focus on phasic and tonic inhibition. J Neurobehav Sci. 2, 72-76 (2015).
  26. Sente, A., et al. Differential assembly diversifies GABAA receptor structures and signalling. Nature. 604 (7904), 190-194 (2022).
  27. Masiulis, S., et al. GABAA receptor signalling mechanisms revealed by structural pharmacology. Nature. 565 (7740), 454-459 (2019).
  28. Hernandez, C. C., Macdonald, R. L. A structural look at GABAA receptor mutations linked to epilepsy syndromes. Brain Res. 1714, 234-247 (2019).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 46 (D1), 1062-1067 (2018).
  30. Liu, X., Jian, X., Boerwinkle, E. dbNSFP: a lightweight database of human non-synonymous SNPs and their functional predictions. Hum Mutat. 32 (8), 894-899 (2011).
  31. Liu, X., et al. dbNSFP v4: a comprehensive database of transcript-specific functional predictions and annotations for human nonsynonymous and splice-site SNVs. Genome Med. 12 (1), 103(2020).
  32. Alirezaie, N., et al. ClinPred: prediction tool to identify disease-relevant nonsynonymous single-nucleotide variants. Am J Hum Genet. 103 (4), 474-483 (2018).
  33. Feng, B. J. PERCH: a unified framework for disease gene prioritization. Hum Mutat. 38 (3), 243-251 (2017).
  34. Tian, Y., et al. REVEL and BayesDel outperform other in silico meta-predictors for clinical variant classification. Sci Rep. 9 (1), 2204(2019).
  35. Brünger, T., et al. Conserved patterns across ion channels correlate with variant pathogenicity and clinical phenotypes. Brain. 146 (3), 923-934 (2023).
  36. Guo, F., et al. Identifying protein-protein interface via a novel multi-scale local sequence and structural representation. BMC Bioinformatics. 20 (Suppl 15), 483(2019).
  37. Cheng, J., et al. Accurate proteome-wide missense variant effect prediction with AlphaMissense. Science. 381 (6664), eadg7492(2023).
  38. Omasits, U., et al. Protter: interactive protein feature visualization and integration with experimental proteomic data. Bioinformatics. 30 (6), 884-886 (2014).
  39. Venselaar, H., et al. Protein structure analysis of mutations causing inheritable diseases: an e-Science approach with life scientist friendly interfaces. BMC Bioinformatics. 11 (548), 548(2010).
  40. Hernandez, C. C., et al. Altered channel conductance states and gating of GABAA receptors by a pore mutation linked to Dravet syndrome. eNeuro. 4 (1), (2017).
  41. Baulac, S., Huberfeld, G., Gourfinkel-An, I. First genetic evidence of GABA(A) receptor dysfunction in epilepsy: a mutation in the γ2-subunit gene. Nat Genet. 28 (1), 46-48 (2001).
  42. Waterhouse, A. M., et al. Jalview version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  43. Troshin, P. V., et al. Java bioinformatics analysis web services for multiple sequence alignment-JABAWS:MSA. Bioinformatics. 27 (14), 2001-2002 (2011).
  44. Troshin, P. V., et al. JABAWS 2.2 distributed web services for bioinformatics: protein disorder, conservation and RNA secondary structure. Bioinformatics. 34 (11), 1939-1940 (2018).
  45. Stimberg, M., Brette, R., Goodman, D. F. M. Brian 2, an intuitive and efficient neural simulator. eLife. 8, e47314(2019).
  46. Traub, R. D., et al. A model of a CA3 hippocampal pyramidal neuron incorporating voltage-clamp data on intrinsic conductances. J Neurophysiol. 66 (2), 635-650 (1991).
  47. Hodapp, A., et al. Dendritic axon origin enables information gating by perisomatic inhibition in pyramidal neurons. Science. 377 (6613), 1448-1452 (2022).
  48. Abdulzahir, A., et al. Changes in memory, sedation, and receptor kinetics imparted by the β2-N265M and β3-N265M GABAA receptor point mutations. Int J Mol Sci. 24 (6), 5637(2023).
  49. Fisher, J. L. A mutation in the GABAA receptor alpha1 subunit linked to human epilepsy affects channel gating properties. Neuropharmacology. 46 (5), 629-637 (2004).
  50. Gallagher, M. J., et al. The juvenile myoclonic epilepsy GABAA receptor alpha1 subunit mutation A322D produces asymmetrical, subunit position-dependent reduction of heterozygous receptor currents and α1 subunit protein expression. J Neurosci. 24 (24), 5570-5578 (2004).
  51. Hernandez, C. C., et al. Dravet syndrome-associated mutations in GABRA1, GABRB2 and GABRG2 define the genetic landscape of defects of GABAA receptors. Brain Commun. 3 (2), fcab033(2021).
  52. Lin, S. X. N., et al. Correlations of receptor desensitization of gain-of-function GABRB3 variants with clinical severity. Brain. 147 (1), 224-239 (2024).
  53. Krampfl, K., et al. Molecular analysis of the A322D mutation in the GABA receptor α-subunit causing juvenile myoclonic epilepsy. Eur J Neurosci. 22 (1), 10-20 (2005).
  54. Shen, D., et al. De novo GABRG2 mutations associated with epileptic encephalopathies. Brain. 140 (1), 49-67 (2017).
  55. Janve, V. S., et al. Epileptic encephalopathy de novo GABRB mutations impair γ-aminobutyric acid type A receptor function. Ann Neurol. 79 (5), 806-825 (2016).
  56. Scheller, M., Forman, S. A. Coupled and uncoupled gating and desensitization effects by pore domain mutations in GABAA receptors. J Neurosci. 22 (19), 8411-8421 (2002).
  57. Hernandez, C. C., et al. GABAA receptor coupling junction and pore GABRB3 mutations are linked to early-onset epileptic encephalopathy. Sci Rep. 7 (1), 15903(2017).
  58. Homanics, G. E., et al. A gain-of-function mutation in the GABA receptor produces synaptic and behavioral abnormalities in the mouse. Genes Brain Behav. 4 (1), 10-19 (2005).
  59. Jatczak-Śliwa, M., et al. GABAA receptor β2E155 residue located at the agonist-binding site is involved in the receptor gating. Front Cell Neurosci. 14 (2), 2(2020).
  60. Đurišić, N., et al. SAHA (vorinostat) corrects inhibitory synaptic deficits caused by missense epilepsy mutations to the GABAA receptor γ2 subunit. Front Mol Neurosci. 11, 89(2018).
  61. Bai, Y. F., et al. Pathophysiology of and therapeutic options for a GABRA1 variant linked to epileptic encephalopathy. Mol Brain. 12 (1), 92(2019).
  62. Macdonald, R. L., et al. Mutations linked to generalized epilepsy in humans reduce GABA(A) receptor current. Exp Neurol. 184 (Suppl 1), S58-S67 (2003).
  63. Buhr, A., et al. Functional characterization of the new human GABA(A) receptor mutation β3(R192H). Hum Genet. 111 (2), 154-160 (2002).
  64. Jumper, J. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  65. Sperk, G., et al. GABA(A) receptor subunits in the rat hippocampus I: immunocytochemical distribution of 13 subunits. Neuroscience. 80 (4), 987-1000 (1997).
  66. Connor, J. X., et al. A GABAA receptor α1 subunit tagged with green fluorescent protein requires a β subunit for functional surface expression. J Biol Chem. 273 (44), 28906-28911 (1998).
  67. Kittler, J. T., et al. Analysis of GABAA receptor assembly in mammalian cell lines and hippocampal neurons using γ2 subunit green fluorescent protein chimeras. Mol Cell Neurosci. 16 (4), 440-452 (2000).
  68. Oflaz, F. E., Son, ÇD., Arslan, A. Oligomerization and cell surface expression of recombinant GABAA receptors tagged in the δ subunit. J Integr Neurosci. 18 (4), 341-350 (2019).
  69. Arslan, A., et al. Cytoplasmic domain of δ subunit is important for the extra-synaptic targeting of GABAA receptor subtypes. J Integr Neurosci. 13, 617-631 (2014).
  70. Lombardi, J. P., et al. Visualizing GABAA receptor trafficking dynamics with fluorogenic protein labeling. Curr Protoc Neurosci. 92 (1), 97(2020).
  71. Gadhia, A., et al. Functional analysis of epilepsy-associated GABAA receptor mutations using Caenorhabditis elegans. Epilepsia Open. 9 (4), 1458-1466 (2024).
  72. Ritter, D. M., et al. In silico predictions of KCNQ variant pathogenicity in epilepsy. Pediatr Neurol. 118, 48-54 (2021).
  73. Holland, K. D., et al. Comparison and optimization of in silico algorithms for predicting the pathogenicity of sodium channel variants in epilepsy. Epilepsia. 58 (7), 1190-1198 (2017).
  74. Leong, I. U., et al. Assessment of the predictive accuracy of five in silico prediction tools, alone or in combination, and two metaservers to classify long QT syndrome gene mutations. BMC Med Genet. 16, 34(2015).
  75. Tang, B. Optimization of in silico tools for predicting genetic variants: individualizing for genes with molecular sub-regional stratification. Brief Bioinform. 21 (5), 1776-1786 (2020).
  76. Dong, C., et al. Comparison and integration of deleteriousness prediction methods for nonsynonymous SNVs in whole exome sequencing studies. Hum Mol Genet. 24 (8), 2125-2137 (2015).
  77. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nat Genet. 46 (3), 310-315 (2014).
  78. Anderson, D., Lassmann, T. An expanded phenotype centric benchmark of variant prioritisation tools. Hum Mutat. 43 (5), 539-546 (2022).
  79. Roy, R., Al-Hashimi, H. M. AlphaFold3 takes a step toward decoding molecular behavior and biological computation. Nat Struct Mol Biol. 31, 997-1000 (2024).
  80. Hollingsworth, S. A., Dror, R. O. Molecular dynamics simulation for all. Neuron. 99 (6), 1129-1143 (2018).
  81. Imrie, F., et al. AutoPrognosis 2.0: democratizing diagnostic and prognostic modeling in healthcare with automated machine learning. PLOS Digit Health. 2 (6), e0000276(2023).
  82. Zhu, S., et al. Structure of a human synaptic GABAA receptor. Nature. 559 (7712), 67-72 (2018).
  83. Sun, C., Zhu, H., Clark, S. Cryo-EM structures reveal native GABAA receptor assemblies and pharmacology. Nature. 622, 195-201 (2023).
  84. Scott, S., Aricescu, A. R. A structural perspective on GABAA receptor pharmacology. Curr Opin Struct Biol. 54, 189-197 (2019).
  85. Kim, J. J., et al. Shared structural mechanisms of general anaesthetics and benzodiazepines. Nature. 585 (7824), 303-308 (2020).
  86. Stimberg, M., et al. Equation-oriented specification of neural models for simulations. Front Neuroinform. 8, 6(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

GABAa Receptor VariantsMissense VariantsEpileptogenic MutationsHippocampal Pyramidal NeuronsPathogenic Mutation PredictionMolecular ModelingNeural SimulationEnsemble PredictorsEvolutionary ConservationConductance Based Model

Related Articles