Yöntem makalesi

Staphylococcus aureus için Hücre İçi Enfeksiyon Modellerinin Geliştirilmesi ve Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/67834

⸱

17 Ocak 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Research Institute, Southwest University, 2National Engineering Research Center of Immunological Products, Third Military Medical University, 3School of Pharmacy, University of South China

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus (S. aureus) tüm vücuda yayılma yeteneğine sahiptir, bu da kalıcı ve tekrarlayan enfeksiyonlara neden olur. Bu süreçleri daha iyi anlamak için, bu çalışma S. aureus için bir hücre içi enfeksiyon modeli oluşturmaktadır. Bu model, hücre içi enfeksiyonların arkasındaki mekanizmaları araştırmak için çok önemli bir temel sağlayacaktır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus, bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere konakçı hücreleri istila edebilir ve devam edebilir, bu da bağışıklık tespiti ve klerensinden kaçmasına izin verir. Bu hücre içi kalıcılık, kronik ve tekrarlayan enfeksiyonlara katkıda bulunur, tedaviyi zorlaştırır ve hastalığı uzatır. Sonuç olarak, S. aureus'un neden olduğu enfeksiyonları daha iyi anlamak, önlemek ve tedavi etmek için hücre içi enfeksiyon modeline kritik bir ihtiyaç vardır. Bu çalışma, antibiyotiklerin hücre dışı bakterileri etkili bir şekilde ortadan kaldırdığını, ancak hücrelere girenleri yok edemediğini gösterdi. Böylece, S. aureus ile enfekte olmuş RAW264.7 ve antibiyotiklerle birlikte kültürlenerek in vitro stabil bir hücre içi enfeksiyon oluşturulmuştur. Daha sonra, hücre içi enfeksiyonu içeren peritoneal makrofajların enjekte edilmesiyle farelerde hücre içi enfeksiyon modeli oluşturuldu. Vankomisin, planktonik S. aureus ile mücadele edilen farelerde bakteri yüklerini etkili bir şekilde temizledi; Bununla birlikte, peritoneal makrofajlar içinde eşit veya daha düşük hücre içi bakteri seviyeleri ile enfekte olmuş farelere karşı etkisizdi. Bu, S. aureus'un hücre içi enfeksiyon modelinin başarılı bir şekilde kurulduğunu ve hücre içi enfeksiyonların önlenmesi ve tedavisi için potansiyel bilgiler sunduğunu göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus , cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları, sepsis, menenjit, pnömoni ve endokardit1 dahil olmak üzere bir dizi enfeksiyona neden olabilen oldukça bulaşıcı bir patojendir. Antibiyotiklerin klinik olarak yanlış kullanımı S. aureus'ta direncin artmasına ve birçok ülkede önemli bir halk sağlığı tehdidi oluşturan metisiline dirençli Staphylococcus aureus'un (MRSA) ortaya çıkmasına yol açmıştır2.

S. aureus geleneksel olarak hücre içi bir patojen olarak sınıflandırılmasa da, ortaya çıkan kanıtlar invazyon3'ü takiben konakçı hücreleri kalıcı olarak kolonize edebileceğini düşündürmektedir. S. aureus'un konak fagositleri içinde hücre içi olarak hayatta kalma yeteneği, metastatik enfeksiyonu ve konak boyunca yayılmayı kolaylaştıran bir mekanizma olarak giderek daha fazla kabul görmektedir 4,5,6. S. aureus, hayatta kalmasını destekleyen ve konağın onu tamamen ortadan kaldırma yeteneğini zorlaştıran bir bağışıklık ortamı yaratan çeşitli virülans faktörleri salgılar7. Aksesuar gen düzenleyici (agr) ve Stafilokok yardımcı elemanları (Sae), Staphylococcus aureus'un fagositlerde hayatta kalması ile yakından ilişkili iki önemli virülans düzenleyicisidir 8,9. Agr sistemi, S. aureus'ta çok sayıda virülans faktörünün ekspresyonunu düzenleyen bir çekirdek algılama mekanizmasıdır. Bakterilerin hayatta kalmasını ve yayılmasını kolaylaştıran toksinlerin ve diğer faktörlerin üretimini kontrol eder. Hücre içi enfeksiyon sırasında, agr sistemi, bakterinin konakçı bağışıklık tepkilerinden kaçma ve konakçı hücreler içinde hayatta kalma yeteneği için gerekli olan virülans faktörlerinin düzenlenmesinde kritik bir rol oynar. Çalışmalar, agr sisteminin bakterinin fagozomlardan kaçma ve makrofajlar içinde kalma yeteneğini etkilediğini göstermiştir. Agr'nin yokluğu, konakçı hücrelerde bakteri sağkalımının azalmasına ve virülansın azalmasına neden olabilir10,11. Sae sistemi, S. aureus'ta çeşitli virülans faktörlerinin ekspresyonunu kontrol eden iki bileşenli bir düzenleyici sistemdir. Bakterinin konakçı dokuları istila etme ve zarar verme yeteneğine katkıda bulunan toksinlerin ve enzimlerin düzenlenmesinde rol oynar. Sae sistemi ayrıca S. aureus'un hücre içi sağkalımında çok önemli bir rol oynar. Bakterinin konakçı fagositler tarafından öldürülmeye direnme ve otofajik bozunmadan kaçınma yeteneğini etkiler12,13.

Patojenler istila ettiğinde, makrofajlar, yabancı patojenleri yutup öldürebilen ve adaptif bağışıklık tepkisini aktive edebilen fagositik işlevlere sahiptir14. İstilacı bakterilerin çoğu makrofajlar tarafından fagosite edilir ve daha sonra onları ortadan kaldırmak için çeşitli öldürme mekanizmalarını aktive eder. Bununla birlikte, bazı S. aureus bakterileri makrofajlar içinde hayatta kalabilir ve bu da konakçının kalıcı enfeksiyonuna yol açar. Bakteriyel proteinlere ek olarak, konakçı ayrıca sitokinleri salgılayarak makrofajlar içinde S. aureus'un hayatta kalmasını ve çoğalmasını da etkiler 15,16,17. Bazı çalışmalar, S. aureus'un otofagozomlarda yaşayarak bozulmadan kaçabileceğini ve yayılmayı teşvik eden hücre içi bir niş yaratabileceğini göstermektedir18. S. aureus, otofaj akışını bloke ederek otofajik bozulmadan kaçar (ör., LC3-II, p62) ve makrofaj istilasından sonra otolizozomlar içindeki pH'ı arttırır19. Bu bağışıklık kaçırma, S. aureus virülans faktörlerinin ve otofajinin düzenlenmesi yoluyla elde edilir ve kalıcı, gizli enfeksiyonlara yol açar.

S. aureus'un hücre içi enfeksiyonlarının temizlenmesi, klinik pratikte kalıcı ve latent enfeksiyonların yönetimi için çok önemlidir. Şu anda, antibiyotikler S. aureus enfeksiyonları için birincil tedavidir ve vankomisin MRSA enfeksiyonları için son savunma hattı olarak hizmet vermektedir20,21. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, mevcut antibiyotiklerin hem in vivo hem de in vitro hücre içi S. aureus'u ortadan kaldırmada etkisiz olduğunu göstermiştir 22,23,24.

Şu anda S. aureus25,26,27'nin çeşitli hücre içi enfeksiyon modelleri için birleşik bir standart yoktur, çünkü her modelin koşulları önemli ölçüde farklılık gösterir. Sonuç olarak, bu modellerin etkinliğini değerlendirmek için aynı kriterler uygulanamaz. Bu çalışmada, Staphylococcus aureus'un deneysel koşulları optimize edilerek evrensel bir hücre içi enfeksiyon modeli oluşturduk. Bu model, bakterilerin in vitro hücrelere ilk enfeksiyonuna ve ardından bu enfekte hücrelerin vücuda verilmesine izin verdiği için diğerlerine kıyasla daha fazla kolaylık sunar.

Hücre içi S. aureus enfeksiyonunun mekanizmalarını daha iyi anlamak ve ilgili ilaçları geliştirmek için hem in vitro hem de in vivo modeller oluşturduk. RAW264.7'yi enfekte ederek ve antibiyotiklerle birlikte kültürleyerek in vitro olarak stabil bir hücre içi enfeksiyon modeli başarıyla oluşturuldu. Daha sonra peritoneal makrofajlar ekstrakte edildi ve hücre içi enfeksiyonlara dönüştürüldü. Bu peritoneal makrofajların enjekte edilmesiyle farelerde hücre içi bir enfeksiyon modeli oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deney hayvanları, 6-8 haftalık spesifik patojen içermeyen (SPF) dişi BALB/c fareleri, Beijing HFK Bioscience Co., Ltd.'den (Pekin, Çin) satın alındı. Tüm hayvan çalışmaları, Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır ve laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin kurumsal ve ulusal politika ve kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Fareler SPF tesislerinde tutuldu ve aşılandı ve steril yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlandı. Hayvanlar rastgele gruplara ayrıldı ve deneylerin başlamasından en az 7 gün önce bir adaptasyon süresi kabul edildi.

1. S. aureus için hazırlık

  1. Suş geri kazanımı: Bir tüp donmuş MRSA252 alın, bir bakteri çözeltisi halkası elde etmek için aşılama halkasını koterize edin ve soğutun, bakterileri Triptik Soya Agar (TSA) plakalarına aşılayın (Malzeme Tablosuna bakınız) çizgi plakası yöntemi28 ile ve gece boyunca 37 ° C'de kültürleyin.
  2. Bakteriyel aktivasyon: Ertesi gün, 50 mL'lik bir çalkalayıcı şişesi alın ve 20 mL Triptik Soya Suyu (TSB) ortamı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). 10 μL'lik bir pipet ucu ile tek bir koloni seçin ve çalkalayıcıya ekleyin. Kolonileri gece boyunca 220 rpm, 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  3. İkincil aktivasyon: Ertesi gün, 15 mL TSB ortamı içeren 50 mL'lik bir çalkalayıcı şişesi alın. İlk aktive edilmiş bakterileri içeren çalkalayıcıdan 200 μL bakteri çözeltisini çıkarın, 20 mL TSB ortamı içeren yeni bir şişeye ekleyin ve 220 rpm'de, 37 ° C'de 4 saat inkübe edin.
  4. İkincil aktif bakteriyel çözeltiyi 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın, 10 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  5. Çökelmiş bakterileri 10 mL tuzlu su içinde tekrar süspanse edin ve 10 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
  6. Bakteriyel çözeltinin OD600 değerini ölçün ve tuzlu su ile 1.0'a ayarlayın. Şu anda, bu deneydeki MRSA252 bakteri miktarı 1.0 x 109 CFU / mL idi.
    NOT: Bakteri çözeltisi antibiyotiksiz bir ortama eklenir ve istenen konsantrasyona seyreltilir; Bu deneyde kullanılan tüm bakteriler yukarıdaki yöntemle hazırlanmıştır.

2. İn vitro hücre içi enfeksiyon modelinin oluşturulması

  1. RAW264.7 hücrelerinin hazırlanması
    NOT: Bu çalışmada kullanılan hücre hatları ATCC'den elde edilmiştir. Tüm hücre hatları mikoplazma kontaminasyonu için negatif test edildi. Tüm deneyler logaritmik büyüme fazındaki hücreler üzerinde yapıldı.
    1. Hücreleri sıvı nitrojenden çıkarın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda çözdürün.
    2. RAW264.7 hücrelerini 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun,% 10 fetal sığır serumu (Malzeme Tablosuna bakınız), penisilin (100 birim / mL) ve streptomisin (100 μg / mL; Malzeme Tablosuna bakınız; tam ortam)% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 2 mL Dulbecco'nun modifiye kartal ortamını (DMEM; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    3. 10 mL tam ortam içeren 100 mm'lik tabaklarda 3 x10 6 RAW264.7 hücreli tohum. %5 CO2 içinde 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe 12 saat bekletin, böylece hücrelerin birleşmesi %50-60 arasında olur.
  2. İn vitro hücre içi enfeksiyon
    1. 10 μL hücre süspansiyonu alın ve hücre konsantrasyonunu hesaplamak için hücre sayacına ekleyin. Her kuyucuk için 1 mL tam ortam kullanarak 24 oyuklu bir plakada (Malzeme Tablosuna bakınız) 2 x 105 RAW264.7 hücreyi sayın ve tohumlayın ve 10-12 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe tutun.
    2. Süpernatanı çıkarın ve her bir oyuğa 2 x 106 CFU bakteri çözeltisi (adım 1.6) içeren 1 mL tam ortam ekleyin. 2 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Enfekte MRSA252 enfeksiyon çokluğu
      (MOI) 10'dur. (Çeşitli enfeksiyon sayıları (MOI) değerleri ile bakterilerin hücreler tarafından fagositozu arasındaki ilişkiyi doğrulamak için, MOI değerleri 20, 30, 40 ve 50 olan deney grupları oluşturduk.).
      NOT: Hücreleri enfekte ederken kullanılan tam besiyeri penisilin ve streptomisin içermez.
    3. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 2x PBS ile yıkayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). 100 μg / mL gentamisin ile DMEM oyuğu başına 800 μL ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 2 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de hücre inkübatöre yerleştirin.
  3. İn vitro hücre içi enfeksiyon modelinin değerlendirilmesi
    1. Hücre içi S. aureus öldürme deneyi
      1. RAW264.7 hücrelerini (adım 2.2.2 ve 2.2.3) ayrı ayrı santrifüj tüplerine toplayın. Hücreleri 2x PBS ile yıkayın, her tüpe 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ( Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi ekleyin ve lizatı santrifüj tüplerinde toplayın.
      2. Lizatı seri olarak seyreltmek için PBS kullanın. 20 μL lizat alın ve 180 μL PBS içeren bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin, ardından pipetleme ile iyice karıştırın. Bu prosedürü izleyerek adım adım seyreltin. Lizatın her seyreltmesini TSA plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Lizat için TSA plakalarındaki kolonileri sayın (Şekil 1A).
        NOT: Ayrıca, peritoneal makrofajlarda MRSA252 hücre içi enfeksiyonu için optimal deneysel koşulları araştırdık. MRSA252 ile enfekte olmuş ve değişik konsantrasyonlarda gentamisin ile tedavi edilmiş peritoneal makrofajlardaki bakteri yükü Şekil 1B'de, farklı sürelerde 100 μg/mL gentamisin ile tedavi sonrası bakteri yükü Şekil 1C'de gösterilmiştir.
      3. Süpernatanı ve lizatı Bölüm 2.3.1.2'de tarif edildiği gibi PBS ile seri olarak seyreltin ve süpernatan ve lizat için TSA plakaları üzerindeki kolonileri gözlemleyin (Şekil 2A).
    2. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM)
      1. RAW264.7 hücrelerini (adım 2.2) bir konfokal petri kabında 2 x 105 hücre / mL'ye seyreltin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları %5 CO2 içinde 37 ° C'de gece boyunca yapışma için bir hücre inkübatöre yerleştirin. Her bir konfokal petri kabına 2 x 106 CFU ve 4 x 106 bakteriyel çözelti (adım 1.6) içeren 1 mL tam ortam ekleyin ve 2 saat boyunca hücre inkübatörüne yerleştirin, böylece MOI 10 ve 20 yapın.
      2. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 3x PBS ile yıkayın, 2 saat boyunca 100 μg / mL gentamisin DMEM ekleyin ve hücre dışı bakterileri çıkarın. Daha sonra süpernatanı çıkarın ve hücreleri 2x PBS ile yıkayın, DIL çalışma sıvısı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve karanlıkta 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      3. DIL çalışma sıvısını çıkarın ve PBS ile 3 kez yıkayın ve% 4 paraformaldehit çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile 20 dakika sabitleyin.
      4. Paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve 3x'i PBS ile yıkayın, DAPI boyası ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve karanlıkta 5 dakika inkübe edin. DAPI boya solüsyonunu çıkarın ve 5x'i PBS ile yıkayın. Hücreleri gözlemlemek için CLSM'yi kullanın (Şekil 2B).
        NOT: Bu çalışma, homolog rekombinasyon yöntemi29 kullanılarak oluşturulan yeşil bir floresan proteini (GFP) ile kullanılmış MRSA252 tasarlanmıştır.

3. İn vivo hücre içi enfeksiyon modelinin kurulması

  1. Farelerde peritoneal makrofajların edinimi
    1. % 6 nişasta suyu hazırlayın. 3:10:5 (a/a) kütle oranına göre, cam kabın içine art arda üç çeşit yardımcı madde (sığır özü tozu, tripton, sodyum klorür; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Bir cam kaba 1 L ddH2O ekleyin, eritmek için karıştırın ve mikrodalgada ısıtın. Kütle oranı 6 olan çözünür nişasta ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın), eritmek için karıştırın ve cam kabı 121 °C'de 30 dakika otoklavladığınızdan emin olun. Buzdolabında 4 °C'de macun kıvamına gelene kadar saklayınız.
    2. Aşağıda açıklanan adımları izleyerek fare peritoneal makrofajlarını toplayın.
      1. İki Balb/c faresi seçin. Farenin boynunu tutmak ve kuyruğunu kontrol etmek için sol elinizi kullanın. Fareyi çevirin ve başınızı aşağı ve karnınızı yukarı kaldırın (Şekil 3A). Fare başına 3 mL% 6 nişasta suyunun intraperitoneal enjeksiyonunu uygulayın (Şekil 3B).
        NOT: Yerçekimi nedeniyle, karın boşluğundaki organlar göğse doğru geriye doğru düşecek ve şırınganın diğer organlara zarar vermesini önleyecektir.
      2. 72 saat sonra, fareleri% 3 izofluran ile uyuşturun ve ardından servikal çıkık ile feda edin. % 75 etil alkol ile dezenfekte edin. Peritonunu tamamen ortaya çıkarmak için farenin karnını kesmek için bir oftalmik makas kullanın (Şekil 4A-C).
      3. İntraperitoneal enjeksiyon ile karın boşluğunu lavajlamak için farelere 10 mL DMEM ortamı enjekte edin (Şekil 4D). DMEM'i farelerin karın boşluğuna enjekte ettikten sonra, karnı daha iyice yıkamak için farelerin karnını yaklaşık 1 dakika hafifçe ovalayın. Lavaj sıvısını 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplamak için bir şırınga kullanın (Şekil 4E).
      4. Lavaj sıvısını 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
      5. Toplanan hücreleri üflemek ve emmek için% 10 fetal sığır serumu, penisilin (100 birim / mL) ve streptomisin (100 μg / mL; tam ortam) ile desteklenmiş 10 mL DMEM kullanın, bunları sayın ve hücre konsantrasyonunu 2 x 106 / mL'ye seyreltin ve 6 oyuklu plakalara (bkz. Malzeme Tablosu), kuyucuk başına 1 mL.
      6. 6 oyuklu plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 içine yerleştirin, 4 saat inkübe edin ve ardından süpernatanı çıkarın. Hücreleri 2x steril PBS ile yıkayın ve gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2'de kuyu başına 1 mL DMEM ile kültürleyin.
  2. Hücre içi bakteri hazırlanması
    1. Peritoneal makrofajları (adım 3.1.2) MRSA252 ile 2 saat inkübe edin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri PBS ile 2x yıkayın. 100 μg / mL gentamisin (kuyu başına 1 mL) ile DMEM tam ortamı ekleyin ve% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
    2. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri PBS ile 3x yıkayın. 50 mL santrifüj tüplerinde fare peritoneal makrofajlarını toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın, 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. MRSA252 hücre içi bakterileri peritoneal makrofajlarda başarılı bir şekilde hazırlandı.
    3. Hücre içi bakterilerin hesaplanması için, hücre içi MRSA252 ile enfekte olmuş peritoneal makrofajlara 37 ° C'de 10 dakika boyunca lizozim (10 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve ardından PBS 2x ile yıkayın. Ardından, hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL PBS ekleyin. 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ekleyerek hücreleri parçalayın.
    4. Lizisi seri seyreltmelerle seyreltin ve bir TSA plakasına bırakın. Gece boyunca 37 °C'de kültür. Bakteri kolonilerini sayarak, fare başına 1.8 x10 6 CFU olan peritoneal makrofajlardaki MRSA252 hücre içi bakterileri hesaplayın.
      NOT: Hücre kazıyıcı hücreleri topladığında, hareket yumuşak olmalıdır. Hücreler, sonraki deneyi etkileyebilecek hücre kırılmasını önlemek için bir yönde kazınır.
  3. Farelerde hücre içi bakteriyel enfeksiyon
    1. 20 Balb/c faresini rastgele dört gruba ayırın (n=5, Şekil 5A).
    2. Grup I için, intravenöz enjeksiyon ile fare başına 3 x 106 CFU planktonik MRSA252 enjekte edin. Grup II için, intravenöz enjeksiyon ile fare başına 3 x 106 CFU planktonik MRSA252 ve vankomisin (110 mg / kg; Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte edin. Grup III için, hücre içi bakterileri (adım 3.2'de hazırlanan) intravenöz enjeksiyon ile enjekte edin. Grup IV için, hücre içi bakterileri (adım 3.2'de hazırlanan) ve vankomisini (110 mg / kg) fare başına intravenöz enjeksiyon ile enjekte edin.
    3. Fareleri kuyruk damarları genişleyene kadar kızılötesi fizyoterapi lambasının altına yerleştirin.
    4. Grup I ve Grup II fare başına intravenöz olarak 3 x 106 CFU planktonik MRSA252 enjekte edin. Hücre içi bakterileri (adım 3.2'de hazırlanan) Grup III ve Grup IV fare başına intravenöz olarak enjekte edin.
      NOT: Hücre içi bakteri içeren sıvıyı toplamak için bir şırınga kullanırken, tüm farelerde tutarlı enfeksiyon seviyeleri sağlamak için önce sıvıyı bir pipetle eşit şekilde nazikçe karıştırmanız önerilir.
    5. 30 dakika sonra, fare başına Grup II ve Grup IV'e intravenöz olarak vankomisin enjekte edin.
  4. İn vivo hücre içi enfeksiyon modelinin değerlendirilmesi
    1. Böbreklerdeki bakteri kolonizasyonunu sayarak farelerin hücre içi enfeksiyon modelini değerlendirin. Enjeksiyondan 24 saat sonra, fareleri% 3 izofluran ile uyuşturun ve servikal çıkık ile feda edin. % 75 etil alkolde dezenfekte edin.
    2. Fareleri hareketsiz hale getirin, bir elinizle karın derisini cımbızla kaldırın, diğer elinizle farenin karın derisini oftalmik makasla kesin, karın boşluğundaki böbrekleri bulun ve böbrekleri tamamen soyun. Onları PBS'ye koyun.
    3. Doku öğütme tüpüne 1 mL PBS ekleyin. Her fareden böbrekleri ayrı öğütme tüplerine aktarın ve katı doku kalmayana kadar öğütün. Homojenize edilmiş dokuyu ayrı EP tüplerine dökün ve her tüpü ilgili fare tanımlaması ile etiketleyin.
    4. Doku homojenatını seri olarak seyreltmek için PBS kullanın. Her seyreltmeyi ayrı TSA plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kolonileri sayın ve verileri analiz edin (Şekil 5B).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus'un hücre içi enfeksiyon modelleri hem in vitro hem de in vivo olarak başarıyla oluşturulmuştur. Fagositoz için deneysel koşulları optimize ederek ve antibiyotik tedavisinin hem konsantrasyonunu hem de süresini uzatarak, bazı S. aureus makrofajlar içinde hayatta kaldı (Şekil 1). S. aureus'un antibiyotik direncini daha fazla değerlendirmek için, MRSA252 ile enfekte olmuş makrofajlar, hücre süpernatantı artı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus, fakültatif bir hücre içi patojen olarak, enfeksiyon sırasında antibiyotiklerden ve bağışıklık tepkilerinden kaçmak için bu yeteneği kullanarak çeşitli hücre tiplerini istila edebilir ve hayatta kalabilir30. Bu çalışma, patojenin hücre içi enfeksiyon mekanizmalarını araştırmak için bir temel sağlamak amacıyla S. aureusin vivo hücre içi enfeksiyon modelini oluşturmuştur. Çeşitli MOI değerlerinin S. aureus'un makrofaj fagositozu ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC, Hibe No.32300779, NO.32270989), Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı (CSTB2022NSCQ-MSX0156), Chongqing Eğitim Komisyonu Bilim ve Teknoloji Araştırma Projesi (KJQN202312802) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2024M754250) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 kuyulu plakaCorning Incorporated, ABD3524
%4 paraformaldehit çözeltisiBBI, İngiltereE672002-0500
6 oyuklu plakaCorning Incorporated, ABD3516
Sığır özü tozuBBI, İngiltereA600114-0500
Biyolojik tehlike güvenlik ekipmanlarıİyileştirme kuvveti, ÇinVS-1300L-u
Hücre inkübatörüESCO, SingapurCCL-170B-8
Hücre sıyırıcıYuva710001
Santrifüj M1416RRWD, ÇinM1416R
Santrifüj tüpüGuanghou Labselect, ÇinCT-002-50A
Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM)Zeiss, Almanya880
Konfokal petri kabıBiosharp, ÇinBS-20-GJM
DAPI boyaŞangay Beyotime, Çin C1006
DIL çalışma sıvısıŞangay Beyotime, Çin C1991S
Dulbecco' s Modifiye Kartal Orta ThermoGibco, ABDC11995500BT
Fetal Sığır SerumuHiklonuSV30208.02
GentamisinŞanghay Sangon, ÇinB540724-0010
Kuluçka MakinesiŞanghay Hengzi, ÇinHDPF-150
LizozimPekin Solarbio, ÇinL9070
MRSA252Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi, Çinnull
MRSA252 (GPF)Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi, Çinnull
Penisilin ve StreptomisinŞanghay Beyotime, Çin C0222
Fosfat Tampon ÇözeltisiŞangay Beyotime, Çin ST476
TuzluSichuan Kelun, Çinboş
Sodyum klorürŞangay Macklin, ÇinS805275
Nişastada çözünürŞangay Sangon, ÇinA500904-0500
Triton X-100Şangay Beyotime, Çin P0096-100ml
Triptik Soya Agar (TSA) plakalarıPekin AOBOX Biotechnology Co., LTD, Çin02-130
Triptik Soya Suyu (TSB) ortaPekin AOBOX Biotechnology Co., LTD, Çin02-102K
TriptonOXOID, İngiltereLP0042B
VankomisinŞangay Beyotime, Çin ST2807-250mg
RAW264.7 hücreliABD, ATCCboş

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutton, J. A. F., et al. Staphylococcus aureus cell wall structure and dynamics during host-pathogen interaction. PLoS Pathog. 17 (3), e1009468(2021).
  2. Yang, H., et al. Lateral flow assay of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using bacteriophage cellular wall-binding domain as recognition agent. Biosens Bioelectron. 182, 113189(2021).
  3. Howden, B. P., et al. Staphylococcus aureus host interactions and adaptation. Nat Rev Microbiol. 21 (6), 380-395 (2023).
  4. Guo, H., et al. Biofilm and small colony variants-an update on Staphylococcus aureus strategies toward drug resistance. Int J Mol Sci. 23 (3), 1241(2022).
  5. Huitema, L., et al. Intracellular escape strategies of Staphylococcus aureus in persistent cutaneous infections. Exp Dermatol. 30 (10), 1428-1439 (2021).
  6. Pidwill, G. R., et al. Clonal population expansion of Staphylococcus aureus occurs due to escape from a finite number of intraphagocyte niches. Sci Rep. 13 (1), 1188(2023).
  7. Wang, M., et al. Autophagy in Staphylococcus aureus infection. Front Cell Infect Microbiol. 11, 750222(2021).
  8. Arya, R., et al. Identification of an antivirulence agent targeting the master regulator of virulence genes in Staphylococcus aureus. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1268044(2023).
  9. Münzenmayer, L., et al. Influence of sae-regulated and agr-regulated factors on the escape of Staphylococcus aureus from human macrophages. Cell Microbiol. 18 (8), 1172-1183 (2016).
  10. Chin, D., et al. Staphylococcus lugdunensis uses the agr regulatory system to resist killing by host innate immune effectors. Infect Immun. 90 (10), e0009922(2022).
  11. Podkowik, M., et al. Quorum-sensing agr system of Staphylococcus aureus primes gene expression for protection from lethal oxidative stress. Elife. 12, RP89098(2024).
  12. Purves, J., et al. Air pollution induces Staphylococcus aureus usa300 respiratory tract colonization mediated by specific bacterial genetic responses involving the global virulence gene regulators agr and sae. Environ Microbiol. 24 (9), 4449-4465 (2022).
  13. Wittekind, M. A., et al. The novel protein scra acts through the saers two-component system to regulate virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol. 117 (5), 1196-1212 (2022).
  14. Pidwill, G. R., et al. The role of macrophages in Staphylococcus aureus infection. Front Immunol. 11, 620339(2020).
  15. Lang, J. C., et al. A photoconvertible reporter system for bacterial metabolic activity reveals that Staphylococcus aureus enters a dormant-like state to persist within macrophages. mBio. 13 (5), e0231622(2022).
  16. Li, M., et al. Interactions between macrophages and biofilm during Staphylococcus aureus-associated implant infection: Difficulties and solutions. J Innate Immun. 15 (1), 499-515 (2023).
  17. Sun, L., et al. Staphylococcal virulence factor hlgb targets the endoplasmic-reticulum-resident e3 ubiquitin ligase amfr to promote pneumonia. Nat Microbiol. 8 (1), 107-120 (2023).
  18. Mulcahy, M. E., et al. Manipulation of autophagy and apoptosis facilitates intracellular survival of Staphylococcus aureus in human neutrophils. Front Immunol. 11, 565545(2020).
  19. Cai, J., et al. Staphylococcus aureus facilitates its survival in bovine macrophages by blocking autophagic flux. J Cell Mol Med. 24 (6), 3460-3468 (2020).
  20. Ahmad-Mansour, N., et al. Staphylococcus aureus toxins: An update on their pathogenic properties and potential treatments. Toxins. 13 (10), 677(2021).
  21. Davis, J. S., et al. How I manage a patient with MRSA bacteremia. Clin Microbiol Infect. 28 (2), 190-194 (2022).
  22. Fait, A., et al. Staphylococcus aureus response and adaptation to vancomycin. Adv Microb Physiol. 85, 201-258 (2024).
  23. Kelly, J. J., et al. Measurement of accumulation of antibiotics to Staphylococcus aureus in phagosomes of live macrophages. Angew Chem Int Ed Engl. 63 (3), e202313870(2024).
  24. Rowe, S. E., et al. Recalcitrant Staphylococcus aureus infections: Obstacles and solutions. Infect Immun. 89 (4), e00694-e00720 (2021).
  25. Lehar, S. M., et al. Novel antibody-antibiotic conjugate eliminates intracellular S. aureus. Nature. 527 (7578), 323-328 (2015).
  26. Peyrusson, F., et al. Intracellular Staphylococcus aureus persisters upon antibiotic exposure. Nat Commun. 11 (1), 2200(2020).
  27. Pollitt, E. J. G., et al. Staphylococcus aureus infection dynamics. PLoS Pathog. 14 (6), e1007112(2018).
  28. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J Vis Exp. 11 (63), e3064(2012).
  29. Qin, L., et al. Antibody-antibiotic conjugate targeted therapy for orthopedic implant-associated intracellular S. aureus infections. J Adv Res. 65, 239-255 (2024).
  30. Andie, S. L., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Nat Rev Dis Primers. 31 (4), 18034(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre i Enfeksiyon ModeliPeritoneal MakrofajlarAntibiyotik TedavisiMRSA 252 EnfeksiyonuH cre K lt rFare Enfeksiyon ModeliBakteriyel PersistansFagositoz AnaliziKoloni Say m

İlgili makaleler