Polikaprolakton İskelelerinin ve hiPSC'den Türetilmiş Kardiyak Hücrelerin Eriyik Elektrospinning Yazımı Kullanılarak 3D İnsan Miyokard Dokusu Üretimi

Fonksiyonel insan kardiyak mühendislik dokularının üretimi, yüksek etkili uygulamalar için büyük umut vaat ediyor. Bunlar, modelleme ilacı kardiyotoksisitesinin ve insan kalp hastalığının geliştirilmesinden, ilgili boyutlarda terapötik dokuların üretilmesine kadar uzanır¹. Her ne kadar son 15 yıl bu alanda önemli ilerlemelere tanık olmuş olsa da, son derece mimetik insan miyokardının üretimi, doğal muadili^2'nin karmaşık yapısal ve mekanik organizasyonunu yeniden üretmedeki zorluklar nedeniyle şu anda engellenmektedir.

Biyolojik açıdan, devrim niteliğindeki hücre yeniden programlama teknolojisi, hastaya özgü terapötik hücreler geliştirme olasılığını ortaya çıkardı. Şu anda, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler), kişiselleştirilmiş bir bağlamda insan kardiyomiyositlerinin tek kaynağıdır. Sağlam diferansiyasyon protokolleri ^3,4 izlenerek yüksek bir kardiyomiyosit verimi elde edilebilir. Önemli bir konu, şu anda kullanılan insan hiPSC'den türetilmiş kardiyomiyositlerin (hiPSC-CM'ler) geleneksel 2D farklılaşma koşulları altında olgunlaşmamış bir fenotip göstermesi nedeniyle olgunlaşma derecesidir⁵. Bu, kalp dokusunun yapısal organizasyonunun çok karmaşık olduğu ve geleneksel 2D kültürlerden kesinlikle farklı olduğu gerçeğine bağlıdır. Ayrıca miyokard, kardiyak fibroblastlar, düz kas ve endotel hücreleri gibi miyosit olmayanlar da dahil olmak üzere farklı kardiyovasküler hücrelerden oluşur ve belirli bir 3D yapı ile düzenli olarak düzenlenir ve verimli kan pompalamaya izin verir ^6,7. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili biyomimetik dokular oluşturmak için tüm ana hücre tiplerinden oluşan yüksek düzeyde yapılandırılmış insan kardiyak mini dokularına ihtiyaç vardır.

Yeni biyo-fabrikasyon yaklaşımlarının uygulanması bu çıkmazı kırabilir. Bunlar arasında, gelişmiş bir 3D baskı teknolojisi olan eriyik elektrospinning yazma (MEW), yüksek hassasiyet ve çözünürlük sağlayabilmektedir. MEW'de, erimiş bir polimeri hücrenin boyut aralığında lifler şeklinde biriktirmek için bir elektrik alanı kullanılır, bu da geleneksel kaynaşmış biriktirme modelleme (FDM) 3D baskıdan daha küçük bir büyüklük sırasıdır ve bu da yüksek düzeyde tanımlanmış iskele yapılarıyla sonuçlanır ^8,9. MEW'in bir kompleksi in silico tasarımla basılı bir matrise çevirebildiği ve fiziksel özellikleri 3D olarak kalp dokusununkilerle eşleşecek şekilde ayarlayabildiği^{gösterilmiştir 10}. MEW teknolojisini kullanarak, yumuşak hücre dostu hidrojellerle birleştirildiğinde, doğal yetişkin miyokard^11,12'nin mikro ve makro-mekanik ortamını taklit eden kompozit dokular oluşturan farklı şekil ve yapılara sahip polimerik ağlar basmak mümkündür. MEW 3D iskelesinin tasarımını değiştirmenin, ortaya çıkan işlevselliği (kalsiyum geçişleri)¹⁰ değiştirdiği ve bu umut verici 3D mühendislik sistemindeki form-işlev ilişkisini anlamak için temelleri oluşturduğu gösterilmiştir.

Burada, hiPSC-CM'lerden ve insan iPSC'den türetilmiş kardiyak fibroblastlardan (hiPSC-CF'ler) kontraktil insan kardiyak mini dokularının üretimi ve bunların 3D MEW baskılı yapılarla güçlendirilmiş bir fibrin hidrojel içinde kombinasyonu için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Fibroblastların eklenmesi, hiPSC-CM'lerin sağkalımını artırmak ve doku yapısını korumak için farklı 3D mühendislik sistemlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak 3D-MEW sistemlerinde kullanımı henüz araştırılmamıştır¹³. Burada açıklanan teknoloji, hastalık mekanizmalarını anlama, klinik öncesi toksikoloji ve ilaç taraması gibi uygulamalarla doğru kalp dokusu modelleri geliştirmeyi amaçlayan araştırmacılar için çok yönlü bir platform sağlar. Bu model, antrasiklinler (ör., doksorubisin), tirozin kinaz inhibitörleri ve kardiyak disfonksiyon¹⁴ ile ilişkili olan kimerik antijen reseptörü T (CAR-T) hücreleri gibi ortaya çıkan tedaviler gibi yerleşik ilaçların kardiyotoksisitesini değerlendirmek için uygundur. Ayrıca model, miyokard enfarktüsü gibi durumlarda kardiyak fonksiyonu iyileştirmeyi ve miyokard dokusunu eski haline getirmeyi amaçlayan biyomalzemelerin, biyomürekkeplerin ve hücre bazlı tedavilerin test edilmesini sağlayarak rejeneratif tıbbı ilerletmede önemli bir potansiyele sahiptir.

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Ortam ve reaktif kurulumu

1. Hücre kültürü plakalarının ön kaplaması
   1. Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (MGFr) stok alikotlarını hazırlayın. Bir şişe MGFr'yi gece boyunca buzdolabında buz üzerinde çözün. Steril bir davlumbazda, soğutmalı uçlar kullanarak ve stoğu ve tüpleri her zaman buz üzerinde tutarak, stoğu soğuk RPMI 1640 L-glutamin (RPMI) içinde 1:1 oranında seyrelterek uygun hacimde alikotlar yapın.
      NOT: hiPSC kültürü ve hiPSC-kardiyomiyositlerin (hiPSC-CM'ler) tohumlanması için, farklı MGFr dilüsyonları kullanılır. hiPSC'ler için MGFr kaplama seyreltmesi, spesifik hücre hattına bağlı olarak değişir. Bununla birlikte, kardiyomiyosit aşamasına ulaşıldığında, hücre hattından bağımsız olarak 1:80 seyreltme kullanılır.
   2. Hücre kültürü plakalarını kaplamak için, gerekli sayıda MGFr alikotunu buz üzerinde yavaşça çözün ve bunları soğuk RPM'de, hiPSC kültürü için 1:180'de (9 mL RPM'de 100 μL MGFr) ve hiPSC-CM'lerin yeniden kaplanması için 1:80'de (4 mL RPMI'de 100 μL MGFr) daha da seyreltin.
      1. Seyreltilmiş MGFr'yi hemen 6 oyuklu plakalar için oyuk başına 1 mL (hiPSC bakımı) ve 12 oyuklu plakalar (hiPSC-CM'lerin yeniden kaplaması) için oyuk başına 0,5 mL'lik bir hacimde ekleyin. Plakaları kullanmadan önce 4 °C'de saklayın (1 haftaya kadar).
         NOT: MGFr kaplı plakalar, hücre tohumlamadan önce 30 dakika boyunca 37 °C'de ısıtılmalıdır. Hücreleri kaplamadan önce, sıvıyı MGFr kaplı plakadan aspire edin.
   3. HiPSC-CF kültürü için, T75 veya T175 şişelerini kullanmadan önce oda sıcaklığında (RT) en az 15 dakika boyunca, T75 için 5 mL veya T175 şişeleri için 10 mL hacimde% 0.1 jelatin ile kaplayın. İnkübasyondan sonra, hücre tohumlamadan önce sıvıyı aspire edin.
2. Hücre kültürü ortamı
   1. HiPSC kültürü için, Essential 8 Bazal Medium'a Essential 8 Supplement (50x) ekleyerek Complete Essential 8 Medium (E8 medium) kullanın.
   2. Kardiyomiyosit farklılaşması için hazırlanın:
      1. İnsülin olmadan RPMI/B27 (-INS ortamı): İnsülin takviyesi olmadan 500 mL RPMI ve 10 mL B27'yi karıştırın; RPMI/B27 (B27 orta): 500 mL RPMI ve 10 mL B27 takviyesini karıştırın.
   3. Kardiyomiyosit saflaştırması (Laktat ortamı) için, 500 mL glikozsuz RPMI 1640'a 2 mL 1 M laktat ekleyin. Besiyeri 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
   4. Kardiyomiyosit yeniden kaplaması (Yeniden Kaplama Ortamı) için,% 10 Nakavt serum replasmanı (KSR) ve 10 μM Y27 ile B27 ortamını destekleyin.
      NOT: KSR, ESC ve iPSC kültür protokollerinde FBS'nin yerini alan tanımlanmış, serumsuz bir formülasyondur.
   5. Fibroblast farklılaşması ve bakımı için (11. günden itibaren), üretici tarafından belirtildiği gibi tam Fibroblast Growth Medium 3'ü (FGM3) hazırlayın. FGM3 bazal ortamına ek paketini (0.1 mL/mL fetal buzağı serumu, 5 μg/mL rekombinant insan insülini ve 1 ng/mL insan bazik fibroblast büyüme faktörü, FGF2) ekleyin.
      NOT: Fibroblast proliferasyonunu teşvik etmek için FGF2 konsantrasyonunun 10 ng / mL'ye çıkarılması önerilir.
   6. 3D kardiyak doku üretimi ve bakım kullanımı için hazırlanın:
      1. Doku Oluşturma Ortamı: B27 ortamını %1 Penisilin / Streptomisin (P / S),% 10 KSR ve 10 μM Y27 ile destekleyin. Doku Bakım Ortamı: B27 ortamını %1 P/S ve aprotinin (%0,1 (ağırlıkça/hacim); 33 μg/mL) ile hazırlayın.
         NOT: Aprotinin, kültürde geçirilen süre boyunca fibrin jel bütünlüğüne izin verir, bozulmasını önler ve hidrojel içindeki hücreleri korur. Bu nedenle, dokunun oluşturulduğu gün ortama eklenmesi şiddetle tavsiye edilir.
3. Küçük molekül ve büyüme faktörü stok çözeltileri
   1. CHIR-99021 (CHIR): GSK3 inhibitörü ve Wnt sinyal aktivatörü için, DMSO'da çözerek 10 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
      NOT: hiPSC çizgileri CHIR tedavisine farklı yanıt verebilir. CHIR konsantrasyonunun optimizasyonu gerekebilir. 6-10 μM CHIR testi önerilir.
   2. C59, Wnt inhibitörü: DMSO'da çözerek 10 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
   3. Y-27632, ROCK inhibitörü (Y27): DMSO'da çözerek 10 mM'lik bir stok hazırlayın. Alikotları -20 °C'de 1 aya kadar saklayın. Nihai konsantrasyon, hedef hücre tipine bağlıdır. hiPSC'ler için 2 μM (1/5000) ve hiPSC-CM'ler, hiPSC-CF'ler ve doku üretimi için 10 μM (1/1000) kullanın.
      NOT: Y27, ayrılma sırasında süspansiyonda hücre ölümünü baskılayarak hücre sağkalımını destekler. Aşırı hücre ölümünü önlemek için hasat sırasında kullanın.
   4. Retinoik asit: Kloroform içinde çözdürerek 30 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 °C'de 2 yıla kadar saklayın.
   5. FGF2 (Rekombinant İnsan Fibroblast Büyüme Faktörü, ayrıca FGF-b, fibroblast proliferasyonunu destekler): Steril suda çözdürerek 50 μg/mL'lik bir stok solüsyonu hazırlayın. Alikotları -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
   6. SB431542 (SB), TGFß1 sinyal inhibitörü: DMSO'da çözerek 10 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
      NOT: 2D kültürde CF durumunu korumak ve miyofibroblast geçişini (fibroz sırasında ortaya çıkan patolojik fenotip) önlemek için fibroblast ortamına ekleyin.
4. Fibrin hidrojel için stok çözeltileri
   1. Fibrinojen: 200 mg / mL'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. İlk olarak, fibrinojen topaklarını bir hücre başlığı içindeki steril aletler kullanarak ince bir toz haline getirin. Ilık% 0.9 (ağırlıkça / hacimce) NaCl çözeltisi ekleyin ve tamamen eriyene kadar 37 ° C'de tutun. Alikotları -80 ° C'de bir yıla kadar saklayın; 1 hafta boyunca 4 °C'de.
      NOT: 4 °C'deki viskozitesi nedeniyle, doğru bir şekilde pipetlenebilmesi için doku oluşturma adımından bir süre önce buzunu çözün ve RT'de tutun. Bir alikot yeniden kullanıldığında kolayca pipetlenemiyorsa, atılması ve yenisinin kullanılması önerilir.
   2. Trombin: Trombini steril %60 PBS + %40 su içinde çözerek 100 U/mL'lik bir stok solüsyonu hazırlayın. Alikotları -20 °C'de bir yıla kadar, 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.
      NOT: Kullanmadan önce buzunu çözün ve doku oluşturma adımı tamamlanana kadar buz üzerinde tutun.
   3. Aprotinin: Aprotinini steril suda (3.04 mL suda 100 mg toz) çözerek 33 mg / mL'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 °C'de bir yıla kadar saklayın.
5. Analiz için çözümler
   1. FACS tamponu (hücre sitometrisi): Bir PBS çözeltisi (Mg^{2 +} ve Ca^{2 +} içermeyen) artı 2.5 mM EDTA ve% 5 (h / h) FBS hazırlayın.

2. İnsan iPSC kültürü ve geçişi

NOT: Burada bildirilen prosedürler, UCSFi001-A (erkek, Profesör Bruce Conklin'in nazik hediyesi, David J. Gladstone Enstitüleri), ESi044-A (erkek), ESi007-A (dişi) ve ESi044-C (dişi) sağlıklı hatlar ve ESi107-A (kardiyak amiloidoz kadın hastalıklı hat) dahil olmak üzere çeşitli hiPSC hatları ile gerçekleştirilmiştir. Bunun protokolü, UCSFi001-A'nın kullanımına özgü ayrıntıları içerir. Bu protokoldeki tüm hücre kültürü inkübasyonları 37 °C, %5_CO2 ve %96 nem koşullarında gerçekleştirilir.

1. 1:180 MGFr önceden kaplanmış 6 oyuklu plakalarda kültür hiPSC hattı. Pluripotentliği sağlamak için bunları E8 ortamında tutun.
   NOT: Kendiliğinden farklılaşmayı önlemek için, kültürlerin aşırı büyümesini önlemek çok önemlidir. Bu nedenle, hücreler %80-90 oranında birleştiğinde hiPSC geçişi gerçekleştirin.
2. Hücre geçişi için, eski ortamı aspire edin, kuyucuk başına PBS (Mg^{2 + -} ve Ca^{2 +} - içermeyen) içinde seyreltilmiş 1 mL 0.5 mM EDTA çözeltisi ile iki kez yıkayın ve hücreler arası yapışmaları bozmak için RT'de EDTA / PBS'de 7 dakika inkübe edin.
3. EDTA/PBS'yi aspire edin ve hücreleri hasat edin, hücreler ayrılana kadar kuyu yüzeyi üzerinde 1 mL E8 ortamı ile 1000 μL'lik bir mikropipet ile kuvvetli pipetleme yaparak ayırın. Bunları steril bir santrifüj tüpünde toplayın.
   NOT: hiPSC ölümünü artıracağı için 10-15 defadan fazla pipetlemekten kaçının.
4. Bu hacimden 1:15-1:20 seyreltme yapın ve hücreleri E8 ortamı + 2 μM Y27'de MGF kaplı 6 oyuklu plakalar üzerine tohumlayın. Aşırı maruz kalma nedeniyle toksisiteyi önlemek için Y27'yi tohumlamadan sonraki ilk 24 saat koruyun.
   NOT: Hücreleri farklılaşmamış ve 4-5 gün boyunca sağlıklı bir morfolojide tutmak için diğer hiPSC hatları için bölme oranını ayarlayın.
5. 24 saat sonra, eski besiyerini aspire edin ve iki gün yetecek kadar taze oda sıcaklığında E8 besiyerini ekleyin (genellikle 3-4 mL). Bundan sonra, ortamı 3-4 gün boyunca her gün değiştirin.
   NOT: Geçiş frekansı her hücre hattına bağlıdır; İzdihamın %100'üne ulaşmaktan kaçının. hiPSC'ler, poligonal geometriye, düzleştirilmiş kenarlara ve yüksek çekirdek/sitoplazma oranına sahip büyük, düz ve kompakt koloniler halinde büyümelidir.

3. İnsan kardiyomiyosit farklılaşması

NOT: hiPSC'lerden (hiPSC-CM'ler) kardiyomiyosit üretimi için tarif edilen protokol, Lian ve ^ark.3,15 ve Burridge ve ^ark.4 tarafından kullanılan tek katmanlı farklılaşma metodolojisine dayanmaktadır. Yeterli bakım ile hiPSC, yüksek farklılaşma verimliliği ile 30'dan fazla ardışık geçişte ayırt edilebilir. Anormal davranış belirtileri, kendiliğinden farklılaşma veya 4'ten fazla farklılaşmanın ardışık başarısızlığı ile tespit edilir. Mikoplazma testi de dahil olmak üzere düzenli kontroller önerilir.

1. Kardiyak farklılaşmayı başlatmak için, hiPSC'leri yukarıdaki hücre geçiş adımında açıklandığı gibi %80-90 birleşmede hasat edin (adım 2). 1:180 MGFr kaplı 12 oyuklu plakalardaki tohum hücreleri, 48-72 saatlik tohumlamadan sonra birleşmenin %90'ında kompakt hücre tek katmanları elde etmek için bölünmüş seyreltmeleri ayarlar. Bu hücre hattı için 1:10 seyreltme yapın ve hücreler 72 saatte birleşme elde edecektir. E8 ortamını günlük olarak değiştirin.
   NOT: Bu protokolde, kullanıcıya bağlı değişkenliği önlemek için seyreltmeler hücre sayısına göre değil, hacme göre ayarlanmıştır. Kaplamadan sonraki 72 saat içinde tek tabaka durumuna ulaşılmazsa, farklılaşma işleminin başarılı olmaması kuvvetle muhtemeldir. Böyle bir durumda, denemeyi atmanız ve yeniden başlatmanız tavsiye edilir, bu da optimum geçiş verimliliği sağlar.
2. Tek tabakalar stabilize edildiğinde, bundan böyle 0. gün olarak kabul edilen farklılaşma süreci başlar. Ardından, ortamı Wnt sinyal aktivatörü olan 8 μM CHIR ile desteklenmiş -INS ortamına değiştirin ve plakayı 37 ° C'de 24 saat (kuyu başına 1 mL) inkübe edin.
   NOT: Verimli mezoderm indüksiyonu için her iPSC hattı için CHIR konsantrasyonunu 6-12 μM arasında titre edin. Bu adımda, optimal bir sürecin işareti olan yüksek düzeyde hücre ölümü beklenir.
3. 1. Gün: Ertesi gün, ortamı her bir oyuktan aspire edin ve hücreleri takviyeleri olmayan RPMI ile yıkayın (kuyu başına 0,5 mL). Daha sonra 1.5 mL taze -INS ortamı ekleyin ve hücreleri 2 gün boyunca inkübe edin.
   NOT: Yıkama adımları, kalıntıları, ölü hücreleri temizlemek ve kalıntıları tamamlamak için tüm ortam değişiklikleri sırasında gerçekleştirilir.
4. 3. Gün: Kardiyak soy spesifikasyonunu indüklemek için, ortamı 48 saat boyunca 5 μM Wnt inhibitörü C59 ile desteklenmiş 1.5 mL -INS ortamı ile değiştirin.
   NOT: Burada GSK3 kompleksi oluşur ve ß-katenin bozularak kardiyak mezodermal soya yol açar. Bu adımdan sonra bazı hücre ölümleri de gözlemlenebilir.
5. 5. Gün: Kardiyak progenitörlerin genişlemesini teşvik etmek için oyuk başına 1.5 mL hacimde 48 saat boyunca taze -INS ortamı ile yıkayın ve değiştirin.
6. 7. Gün: Bu günden itibaren hücreler B27 ortamında tutulur ve her 2-3 günde bir ortam değişimi yapılır.
   NOT: Hafta sonu boyunca ortam değiştirmeyi atlamak için ortam miktarlarını kuyu başına 2.5 mL'ye ayarlayın, ancak yalnızca bu duruma ulaşıldığında ayarlayın. Normalde, hiPSC-CM'ler 7-9. günlerde kendiliğinden atmaya başlar. İlk olarak, kasılma izole edilmiş ve koordine edilmemiş kümeler olarak gözlenecektir, ancak birkaç gün içinde, yüksek saflıkta kültürler düzgün bir dayak tek tabakası oluşturmalıdır.
7. Bir kez elde edildikten sonra, bu kasılma tek tabakaları (genellikle 10. günde), kardiyomiyosit olmayan hücreleri ortadan kaldırmak ve kültürün saflığını zenginleştirmek için bir yeniden kaplama aşaması ile ayrılmış Laktat ortamında 72 saatlik 2 döngüden oluşan bir metabolik seçim işlemine tabi tutulur.
8. 10. Gün, ilk saflaştırma adımı (1. Laktat): Dayak hücrelerini Laktat ortamı ile yıkayın (kuyu başına 0.5 mL) ve 72 saat boyunca Laktat ortamı kuyusu başına 1 mL ile inkübe edin.
   NOT: Yıkama adımı, önceki glikoz ortamının (B1640) tüm izlerini tamamen gidermek için Laktat ortamı veya bazal glikoz içermeyen RPMI 27 ile yapılmalıdır.
9. 13. Gün: Hücrelerin 2 gün boyunca B27 ortamının oyuğu başına 1.5 mL ile ilk saflaştırma turundan sonra iyileşmesine izin verin ve geri dönün.
10. 15. Gün (yeniden kaplama adımı): İki saflaştırma döngüsü arasında, EDTA / PBS ile yıkayarak ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca TrypLE ile inkübe ederek (kuyu başına 0,5 mL) tek katmanları ayırın.
    NOT: Kuluçka süresi her hücre hattına bağlıdır.
11. Hücreleri 1000 μL'lik bir mikropipet kullanarak ayırın ve steril bir santrifüj tüpünde% 10 KSR (h / v) ile desteklenmiş B27 ortamının oyuğu başına 0,5 mL ile geri kazanın.
    NOT: Kardiyomiyositler kayma gerilimine ve güçlü pipetlemeye karşı hassastır, bu nedenle tekrarlanan pipetleme adımlarından kaçınmaya çalışın. Daha düşük hasarlı bir hiPSC-CM ayrışması için diğer seçenekler, TrypLE 10x veya DNaz ile kollajenaz kullanmak olabilir. Hücresel hasara neden olmadan veya hücre bütünlüğünü tehlikeye atabilecek aşırı pipetleme gerektirmeden hücre ayrılması için yeterli olduğundan emin olmak için inkübasyon süresini optimize edin.
12. RT'de 100 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve bunları Yeniden Kaplama Ortamı ile 1:80 MGFr kaplı 12 oyuklu plakalarda yeniden plakalayın. Onları kuyu başına 1 mL tohumlayın.
    NOT: Bu, farklılaşma sırasında biriken fazla ölü hücreleri ve matrisi ortadan kaldıracaktır, çünkü bunlar daha sonra doku oluşumu üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir.
13. 16. Gün: 24 saatlik yeniden kaplamadan sonra, Y27 ve KSR'yi çıkarın ve bir sonraki saflaştırma adımından önce (genellikle 48-72 saat) hücreleri B27 ortamında tutun.
14. 18. Gün: İkinci saflaştırma aşaması (2. Laktat). İlk döngüde olduğu gibi, hücreleri 72 saat (kuyu başına 1 mL) Laktat ortamı ile yıkayın ve inkübe edin.
    NOT: Saflaştırma döngüleri, kardiyomiyosit belirteci cTNT'nin (kardiyak troponin T) (gösterilmemiştir) akış sitometrisi analizinde gözlemlendiği gibi kültür saflığını %30'a kadar artırabilir. Bu işlem öncelikle fibroblast ve kalan hiPSC kontaminasyonunu azaltır. Verimden ödün vermeden doku üretimine devam etmek için gereken minimum kabul edilebilir saflık seviyesi belirlenmemiş olsa da, en az %85-90 saflıkta kültürlerin kullanılması önerilir. Bu saflık seviyesi, gelişmiş kardiyomiyosit bağlanmasını destekler, nihai dokunun kasılma gücünü arttırır ve deneyler arasında tekrarlanabilirliği destekler.
15. 21. Gün: Laktat saflaştırması tamamlandığında, saflaştırılmış kardiyomiyositleri B27 besiyerinde kullanımlarına kadar sık sık besiyeri değişiklikleriyle (her 2-3 günde bir) koruyun.
    NOT: Kullanımdaki gecikme, çıkarılması daha zor olacağından hücre verimini azaltacaktır. Bu nedenle, ikinci laktat saflaştırmasının bittiği gün ile ek bir haftadan daha kısa bir süre arasında kullanılması tavsiye edilir.

4. İnsan kardiyak fibroblast farklılaşması

NOT: hiPSC'lerden insan kardiyak fibroblastlarını (hiPSC-CF'ler) elde etmek için, aşağıdaki protokol Zhang ve ^ark.16 tarafından kullanılan iki fazlı metodolojiye dayanmaktadır. İlk adım, kardiyojenik mezoderm indüksiyonundan sonra Wnt sinyal yolunu yeniden aktive ederek epikardiyal hücreler (hiPSC-EpiC'ler) elde etmektir. Daha sonra, hiPSC-EpiC'ler 18 gün içinde kardiyak fibroblastlar elde etmek için vasküler gelişim inhibitörlerine ve FGF2'ye maruz bırakılır.

1. hiPSC-CM farklılaşma protokolünde açıklandığı gibi hiPSC bakımı, hasat ve tohumlama yoğunluğunu sağlayın. Farklılaşmayı başlatmak için 1:180 MGFr kaplı 12 oyuklu plakalarda hiPSC'leri kültürleyin.
2. Kompakt hiPSC tek katmanları elde edildiğinde (Gün 0), 48 saat boyunca 5 μM CHIR (kuyu başına 1,5 mL) ile desteklenmiş -INS ortamı ekleyin.
   NOT: Verimli mezoderm indüksiyonu için her hiPSC hattı için CHIR konsantrasyonunu titre edin.
3. 2. Gün: Ortamı aspire edin ve atın, hücreleri RPMI ile yıkayın ve 24 saat boyunca 1.5 mL taze -INS ortamı ile değiştirin.
   NOT: hiPSC-CMs protokolünde olduğu gibi, herhangi bir ortam değişikliği sırasında hücreleri durulayın; Her adıma bağlı olarak, karşılık gelen takviyesiz bazal ortamı kullanın.
4. 3. Gün: Hücreleri 5 μM C59 (Wnt inhibitörü) içeren -INS ortamı ile 48 saat (kuyu başına 1.5 mL) inkübe edin.
5. 5. Gün: Kardiyak mezodermal hücrelerin yeniden kaplanması için, EDTA / PBS ile yıkayarak ve TrypLE ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe ederek (kuyu başına 0.5 mL) hücreleri ayırın. Hücreleri Gelişmiş DMEM bazal ortamının (ADMEM) oyuğu başına 0.5 mL'de toplayın ve RT'de 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
6. Bunları 20.000 hücre /^cm2 yoğunlukta 1:180 MGFr önceden kaplanmış 12 oyuklu plakalara (kuyu başına 1 mL) tohumlayın. Yeniden kaplama için 5 μM CHIR, 2 μM retinoik asit, %10 KSR (h/h) ve 10 μM Y27 ile takviye edilmiş ADMEM kullanın.
7. 6. Gün: Yeniden kaplamadan 24 saat sonra, Y27'yi çıkarmak ve KSR'yi %2'ye düşürmek için ortamı yenileyin. Epikardiyal fenotipin gelişmesini sağlamak için aynı CHIR ve retinoik asit konsantrasyonlarını 48 saat daha koruyun.
8. 8. Gün: Epikardiyal tek tabakaların oluşumunu teşvik etmek için ADMEM takviyesi artı 72 saat boyunca KSR'nin% 2'si olan kültür hücreleri.
   NOT: hiPSC-EpiC'ler, tek koloniler halinde gruplanmış düz veya kübik şekilli büyük hücreler gibi görünmektedir. Bu zaman noktasında, ilk farklılaşma turlarını gerçekleştirirken, WT1 (nükleer antijen), ZO1 (sitoplazmik membran antijeni) ve TCF21 (sitoplazmik antijen) gibi tipik epikardiyal hücre belirteçleri FACS (akış hücresi sitometrisi) veya IF (immünofloresan boyama) (gösterilmemiştir) ile analiz edilebilir.
9. 11. Gün: Epikardiyal hücrelerin yeniden kaplanması için, hiPSC-EpiC'leri EDTA / PBS ile yıkayarak ayırın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca TrypLE ile inkübe edin (kuyu başına 0.5 mL). Hücreleri FGM3 ortamında (kuyu başına 0.5 mL) toplayın ve RT'de 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
10. hiPSC-EpiC'leri 10.000 hücre /^cm2 hücre yoğunluğunda% 0.1 jelatin kaplı 12 oyuklu plakalarda yeniden plakalayın. 10 μM SB (genellikle plastik kültür sırasında miyofibroblast geçişini önlemek için bir TGFß1 sinyal inhibitörü) ve 10 μM Y27 (sadece ilk 24 saat için) ile desteklenmiş FGM3 ortamını kullanın.
11. Ertesi gün, hiPSC-CF'ler elde edilene kadar her 2 günde bir fibroblast ortamını (FGM3 + 10 μM SB) yenileyin, bu da tüm süreç için toplam yaklaşık 18 gün yapar.
    NOT: hiPSC-CF'ler mil şeklinde bir morfoloji sunmalıdır. Burada, fibroblast markörü DDR2'nin ekspresyonu FACS ve IF teknikleri ile analiz edilmelidir (bkz. adım 7.1-7.2).
12. HiPSC-CF kültürü birleştiğinde, jelatin önceden kaplanmış T75 veya T175 şişelerinde 1: 3 hücre geçişleri gerçekleştirin. Hücreler yaklaşık 4-6 gün içinde% 90 birleşmeye ulaşır. hiPSC-CF'leri ayırmak için, hiPSC-EpiC'lerin yeniden kaplanması için açıklanan TrypLE hasat protokolünü kullanın; burada, geçiş için Y27 gerekli değildir.
13. HiPSC-CF'leri kullanılana kadar FGM3 ortamında + 10 μM SB'de tutun veya kriyotüp başına 1-3 milyon hücrelik bir hücre yoğunluğunda düşük geçişte dondurun.
    NOT: Yeni hücreler çözülmeden önce hiPSC-CF'lerin en fazla 6 pasaj boyunca muhafaza edilmesi önerilir, çünkü plastik şişelerde uzun süreli kültürlendiğinde, hücreler daha kasılmalı bir miyofibroblast fenotipine farklılaşmaya başlar.

5. Eriyik Elektrospinning Yazma (MEW) iskelelerinin imalatı

NOT: Bu protokol, QUT tarafından bu amaç için özel olarak tasarlanmış bir MEW yazıcı kullanarak fibriller iskeleleri yazdırmak için tıbbi sınıf poli ε-kaprolakton (PCL) homopolimer kullanır, Queensland University of Technology¹⁰.

1. Baskı için bir PCL polimer stoğu hazırlayın. PCL granüllerini 23 G'lik bir iğneye bağlı 3 mL'lik plastik Luer kilitli bir şırıngaya doldurun ve bunları 80 °C'de 2 saat fırında eritin, polimer erirken kabarcıkları gidermek için pistona hafifçe bastırın. Birkaç şırınga hazırlayın ve PCL hızlı bir şekilde katılaştığı için bunları RT'de saklayın.
2. Baskı gününde, şırıngayı ısıtma odasının içine sokun ve basınçlı bir N₂ besleme borusuna bağlayın. MEW ekipmanını açın, sıcaklık regülatörlerini 80/65 °C'ye (hazne/nozul) ayarlayın ve polimerin uygun şekilde erimesini sağlamak için şırıngayı 30 dakika tutun.
3. Şırınganın altında, uyumlu (Mach3) yazılım ile XY yönlerinde motorlu ve hareketli kolektör plakası bulunmaktadır. Yazıcı kafası plakanın bir kenarına veya istenen herhangi bir yere yerleştirilene kadar kolektör plakasını (bilgisayar imleçleri kontrolü) hareket ettirin ve ısıtma haznesi ile kolektör plakası arasındaki mesafeyi (kolektör mesafesi) manuel olarak 10 mm'ye (Z düzlemi) ayarlayın.
   NOT: Bu mesafe, belirli bir lif çapına ulaşmak için deneysel olarak test edilmelidir. Kollektör mesafesi ne kadar kısa olursa, lif o kadar kalın olur ve bunun tersi de geçerlidir.
4. Elektrik alan beslemesini otomatik olarak bağlayan ekipmanın kapısını kapatın. Yazdırma sırasında 23 G uçtan dışarı çıkabilmesi için voltajı 7 kV'a ve N₂ basıncını 2 bar'a ayarlayın.
   NOT: Yüksek bir voltaj sağlayarak, şırınganın ucu ile kolektör plakası (paslanmaz çelikten yapılmış) arasında potansiyel bir fark oluşturulur. Daha sonra, sağlanan basınçla nozulda biriken damla elektrostatik olarak yüklenir ve kolektör plakasına doğru hareket eden Taylor konisini oluşturur. Nihai fiber boyutlarını değiştirmek için voltaj ve basınç ayarlanabilir. Yüksek basınç parametreleri, daha kalın lifleri ekstrüde eder ve lifi stabilize etmek için daha yüksek voltaj gerektirir. Yazılım, bilgisayarlı sayısal kontrole (CNC) dayanmaktadır, bu nedenle iskele geometrileri bir G kodu olarak yazılır ve X-Y hareketini ve kollektör plakası motorunun hızını kontrol eden programa beslenir. Bu nedenle, kesin iskeleleri yazdırmadan önce, herhangi bir sarma veya çırpma görünümü olmadan tanımlanmış lifler oluşturan kararlı bir jet elde etmek için önceki adım olarak herhangi bir G kodunun yazdırılması önerilir. Bunun için, parametreleri her seferinde küçük değişikliklerle optimize edin, yani hava basıncı için 0,1 bar, voltaj için 0,1 kV ve kollektör hızı için 60-100 mm/dak; bu, jetin Taylor konisi davranışını sağlayacaktır.
5. Kare desen geometrisine sahip iskeleleri yazdırmak için yazılımda tasarlanan G kodunu seçin. Bu örnek G kodu, 0,5 mm x 0,5 mm kare şeklinde gözeneklere sahip 6 cm x 6 cm'lik 15 katmanlı kare ağlar yazdırır.
6. Hassas bir şekilde birikmiş lifleri (yani üst üste binen lifleri) yazdırmak için toplayıcı hızını 1080 mm/dak'ya ayarlayın.
   NOT: Hassas fiber çaplarını (μm) tanımlamak için her MEW ekipmanında voltaj, basınç, kolektör hızı ve kolektör mesafesi parametrelerini ayarlayın. Daha önce bahsedilen parametrelerin etkisinin ötesinde, kolektör hızının arttırılması daha ince lifler ile sonuçlanırken, azaltılması daha kalın lifler üretir. Bu protokoldeki parametre ayarları, 10-15 mikron çapındaki liflerin basılmasını sağlar.
7. Yazdırmayı başlatmak için yazılımdaki BAŞLAT düğmesine basın. Baskı bittikten sonra iskeleyi kollektörden dikkatlice çıkarın.
   NOT: Baskıdan sonra iskelenin daha kolay taşınması için, iskeleden daha büyük, kollektör tabanına yapışkan bant ile sabitlenmiş bir cam parçasına basılması önerilir.
8. Doku üretimi için son iskeleleri elde etmek için baskılı ağı 6 mm çapında bir zımba ile kesin.
9. PCL ağları oldukça hidrofobik olduğundan, hidrofilikliklerini artırmak ve fibrin ve hücrelerle etkileşimi teşvik etmek için 5 dakika boyunca O₂ / Argon plazması ile muamele edin.
   NOT: İsteğe bağlı olarak, 15 dakika boyunca 0.1 N NaOH tedavisi ve ardından kapsamlı PBS yıkamaları da işe yarar.
10. Kafesleri 30 dakika boyunca% 70 etanole batırarak sterilize edin, 30 dakika boyunca steril damıtılmış su ile yoğun bir şekilde yıkayın ve kurumaya bırakın.
    NOT: Bu işlemi steril bir Petri kabında ve steril bir başlık içinde yapın. Plakaya yapışmalarını ve bunun sonucunda deformasyonu önlemek için ağları kullanılana kadar tamamen kurutmayın.

6. Fibrin mini doku üretimi ve bakımı

NOT: İnsan miyokardiyal 3D mini dokularının oluşturulması, fibriler destek sağlayan MEW iskeleleri ile birleştirilmiş fibrin hidrojeller içinde hiPSC'den türetilmiş kalp hücrelerinin kapsüllenmesine dayanır. Aşağıdaki protokol, Breckwoldt ve ^ark.17 ve Ronaldson-Bouchard ve ^ark.18 tarafından kullanılan mühendislik tasarım yaklaşımlarından uyarlanmıştır.

1. hiPSC-CM'leri, hiPSC-CM'lerin farklılaşma protokolünün (TrypLE hasadı) yeniden kaplama adımında (3.10-3.11) yukarıda açıklandığı gibi ayırın. Neubauer Odasındaki hücreleri saymak için Doku Oluşturma Ortamındaki hücre peletini yeniden süspanse edin.
2. TrypLE ile hiPSC-CM hasat adımında olduğu gibi hiPSC-CF'leri ayırın. T75 için 3 mL TrypLE, T175 şişeleri için 5 mL ve TrypLE inkübasyonunu inaktive etmek için aynı hacmi kullanın. Son olarak, aynı ortamda karıştırılacakları ve kültürlenecekleri için, CM'lerde olduğu gibi, Doku Oluşturma Ortamında hücre peletini yeniden süspanse edin.
3. Bir Neubauer Odası'ndaki hücreleri sayın. Tüm dokuları tohumlamak için gereken toplam hücre sayısını tam olarak hesaplayın.
   NOT: Bu protokol, doku başına %80 CM ve %20 CF'den, yani 800.000 CM ve 200.000 CF'den oluşan 1 milyon hücre kullanır. Doku başına toplam 1,5 ve 3 milyon gibi diğer miktarlar da pratikle elde edilebilir.
4. İhtiyaç duyulan toplam hücreleri yeni bir tüpte (Hücre Karışımı), RT'de 300 x g'da 5 dakika karıştırın ve peletleyin. Peletin tamamen kuru olduğundan emin olun ve tohumlanana kadar buz üzerinde tutun. Tüm dokuları tohumlamak için gereken toplam hidrojel hacmini hesaplayın.
   NOT: Bu protokol, doku başına 35 μL (6 mm çapında bir iskele boyutu için) 30 milyon hücre / mL'ye yakın bir nihai yoğunluğa gerektirir, ancak yukarıdaki adım 6.4'te belirtildiği gibi artırılabilir. Her fibrin hidrojel, hücrelerin yeniden süspanse edildiği Doku Oluşturma Ortamı ile birlikte 6 mg / mL fibrinojen artı 5 U / mL trombinden oluşur. 35 μL'lik bir hidrojel için Fibrinojen/Trombin oranı 1,05 μL/1,8 μL'dir. Pipetleme hatalarından kaynaklanan hacim kaybını önlemek için %10'luk ekstra nihai hacimde hidrojel önerilir. Örnek: 10 doku için, hücreleri 350 μL +% 10, yani toplam son hacim olarak 385 μL'de yeniden süspanse edin.
5. Hücre Karışımını gerekli hacimde Doku Oluşturma Ortamında yeniden süspanse edin. Kabarcık oluşumunu önleyerek dikkatlice karıştırın.
   NOT: 10 doku için, 374.5 μL Doku Üretim Ortamında (toplam hidrojel hacmi eksi toplam dokular için gereken toplam fibrinojen miktarı, yani 10.5 μL) 10 milyon hücreyi (80 CM: 20 CF) yeniden süspanse edin.
6. Gerekli miktarda fibrinojen ekleyin ve dikkatlice karıştırın. 10 doku için, Hücre Karışımına 10.5 μL fibrinojen ekleyin ve Hidrojel Karışımını oluşturun. RT'de tutun.
   NOT: Kesme kuvvetlerinin hiPSC-CM'lerin canlılığını etkilememesi için aşırı tekrarlanan pipetlemeden kaçınmak önemlidir. Kesme hasarını azaltmak için pipet ucunun ucundan steril bir neşter ile bir parça kesilmesi ve ardından Hidrojel Karışımını bununla yeniden süspanse etmeniz önerilir.
7. Fibrinin plakaya yapışmasını önlemek için, bir politetrafloroetilen (PTFE) yüzeyde tohum Hidrojel Karışımı . Bir damla olarak kalacak olan bir dokunun hacminin yarısını (17.5 μL) pipetleyin ve bunu toplam doku sayısı için yapın.
   NOT: Kuruyabilecekleri için bir seferde 10'dan fazla doku yapmayın.
8. Her damlanın üzerine bir PCL iskelesi yerleştirin ve kalan hacmi (17,5 μL) ekleyin. İskelenin tamamen suya daldırıldığından emin olun.
   NOT: Reaksiyon çok hızlı olduğu için her iki elinizle pipetlemeye hazırlıklı olun. Her seferinde bir doku.
9. Baskın olmayan elinizle gerekli miktarda trombin (1,8 μL) ekleyin ve hidrojeli baskın elinizle hızlıca karıştırın (en az 2-3 kez pipetleyin).
   NOT: Kabarcık oluşumunu (30 μL) önlemek için tercihen toplam hacimden daha az pipetleme yaparak karıştırın. Bir hava kabarcığı oluşursa, bir iğne ile hızlı bir şekilde delin.
10. Her doku için önceki adımı tekrarlayın.
    NOT: İyi bir kullanım sağlanana kadar bu tekniğin hücreler olmadan uygulanması tavsiye edilir.
11. Fibrin polimerizasyonunu tamamlamak için dokuları 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
12. Her bir dokuyu steril cımbızla kenarından nazikçe alın ve bunları 33 μg / mL aprotinin ile desteklenmiş Doku Oluşturma Ortamının oyuğu başına 2 mL olan 12 oyuklu plakalara yerleştirin. Kuyucuk başına bir doku yerleştirin.
    NOT: Hücrelerin mekanik kuvvetten zarar görebilmesi için bunları hidrojelin merkezinden tutmayın. Gerekirse, bir spatula kullanın.
13. Dokuları 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
    NOT: Aprotininin oluşturulduğu günden itibaren doku kültürü ortamında tutulması çok önemlidir, çünkü ilk 24 saat boyunca aprotinin ihmal edilmesinin, daha sonra eklense bile, ağ ve hidrojelden kısmi hücre ayrılmasına yol açtığı gözlemlenmiştir. Bu, son dokunun bütünlüğü için gerekli olan tam hücre kapsamını tehlikeye atar.
14. Ertesi gün, KSR ve Y27 kalıntılarını gidererek ortamı 2 mL Doku Bakım Ortamı ile yenileyin. Ortamı o andan itibaren her gün değiştirin.

7. HiPSC ve mini doku fonksiyonunun kardiyak farklılaşma potansiyelinin sistematik analizi

1. Akış sitometrisi analizi
   NOT: Hücreler, hiPSC farklılaşmasının etkinliğini belirlemek için "Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralama" (FACS) sitometri modalitesi kullanılarak analiz edilir. Tüm adımlar oda sıcaklığı koşullarında gerçekleştirilir.
   1. Hücre kültürlerini tek hücreli süspansiyona (TrypLE hasadı), hem hiPSC-CM'lere hem de CF'lere ayrı ayrı ayırın.
   2. Peletleri FACS tamponunda 250.000 hücre / mL'de yeniden süspanse edin ve tüp başına en az 1 mL dağıtın. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için 30 dakika inkübe edin.
   3. Hücreleri RT'de 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
      NOT: Tüm santrifüjleme adımları bu koşullar altında gerçekleştirilir.
   4. Hücre içi antijenleri tespit etmek için, hücre zarlarını bir hücre geçirgenleştirme kiti ile sabitleyin ve geçirgenleştirin. İlk olarak, hücreleri Reaktif A (Fix) ile 30 dakika inkübe edin ve santrifüjleyin (adım 7.1.3'teki gibi).
   5. Daha sonra, hücreleri Reaktif B (Perm) artı birincil antikor ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Tüp başına 100 μL reaktif kullanın.
      1. HiPSC-CM'ler için, 1/200 seyreltmede fare cTNT antikoru (kardiyak T troponin, CM belirteci) kullanın. HiPSC-CF'ler için, 1/500 seyreltmede fare DDR2 antikoru (kollajen reseptörü, CF belirteci) kullanın.
         NOT: Tüm reaksiyonları durdurmak için, santrifüjlemeden önce her tüpe 1 mL FACS tamponu ekleyin.
   6. FACS tamponunda 1/100 oranında seyreltilmiş anti-fare Alexa-Fluor 488 ikincil antikor ile 15 dakika inkübe edin.
   7. PBS ile 3 kez yıkayın, yıkamalar arasında santrifüjleyin (adım 7.1.3'teki ile aynı koşulları izleyerek) ve son olarak hücre peletini 400 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Bir sitometre veya benzeri bir cihazda analiz edin.
2. İmmünofloresan boyama analizi (IF)
   1. 2D kardiyak hücre kültürleri için, her iki hücre tipini de 1:80 MGFr veya %0.1 jelatin önceden kaplanmış slayt bazlı kültür odası kuyusu sistemine ayrı ayrı tohumlayın. Analiz için yeterli hücre birleşmesine ulaşmak için yaklaşık 80.000 hücre /^cm2 plakalayın. 3D mini dokular için, bunları cımbızla nazikçe 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. Hücre ortamını atın ve hücreleri veya dokuları PBS ile iki kez yıkayın. Numuneleri RT'de %10 formalin (h/v) ile sabitleyin; Slayt odası için 15 dakika ve mini dokular için 1 saat.
      DİKKAT: Formalin solunduğunda tehlikelidir ve çeker ocakta kullanılmalıdır.
   3. Sabitleme tamponunu atın ve 5 dakika PBS ile üç kez yıkayın. Numuneleri kullanılıncaya kadar PBS'de 4 °C'de saklayın.
   4. Hücre zarına nüfuz etmek için, hücreleri RT'de 10 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 (h / v) ile veya% 1 Tween-20 ile% 1 Tween-20 ile RT'de inkübe edin. Ardından, PBS ile 5 dakika üç kez yıkayın.
   5. Spesifik olmayan antikor bağlanmalarını azaltmak için, numuneleri RT'de 30 dakika boyunca% 3 (h / h) sığır serum albümini (BSA) çözeltisi ile tedavi edin.
   6. Spesifik olmayan bağlanmaları bloke etmek için PBS artı% 1 BSA'da birincil antikor çözeltileri hazırlayın ve bunları gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
      1. 2D hiPSC-CM'ler için, Anti-kardiyak α-ACTN (sarkomerik aktinin) fare antikorunun 1/400 seyreltmesini kullanın. 2D hiPSC-CF'ler için 1/500 seyreltme Anti-DDR2 fare antikoru kullanın. 3D dokular için, iki CM ve CF'ye özgü antikoru birleştirin.
   7. Ertesi gün, antikor solüsyonunu aspire edin ve her biri 5 dakika olmak üzere RT'de PBS ile 3 yıkama yapın.
   8. İkincil antikorları (Alexa-Fluor 488 ve Alexa-Fluor 594) 1/200 oranında seyreltin ve sırasıyla fare ve tavşan birincil antikorlarını tanımlamak için karanlıkta RT'de 1 saat inkübe edin. PBS yıkamasını üç kez tekrarlayın.
   9. Çekirdekleri lekelemek için, numuneleri karanlıkta RT'de 20 dakika boyunca 1/500 oranında 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) seyreltme ile inkübe edin. PBS yıkamasını üç kez tekrarlayın ve numuneleri 4 °C'de PBS'de saklayın.
   10. Numuneleri konfokal mikroskop ile inceleyin, görüntü elde edin ve Fiji gibi uygun yazılımlarla işleyin.
   11. 3D mini dokular için, iyi bir görüntüleme sağlamak için bunları PBS ile iki cam lamel arasına dikkatlice aktarın.
       NOT: Yüksek çözünürlükte Z yığını görüntüleri elde etmek için 40x yağa daldırma veya daha yüksek bir objektif önerilir.
3. Hücre canlılık analizi
   NOT: Alamar Blue testi (AB), 3D kardiyak mini dokularda hücre canlılığı ile doğrudan ilişkili olan hücre metabolik aktivitesini ölçmek için kullanılır. Numuneleri ışıktan ve steril koşullardan koruyarak tüm işlemi gerçekleştirin.
   1. Fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ortamında% 10 (h / h) AB çözeltisi hazırlayın (kolorimetrik ölçüme müdahale edebileceğinden).
   2. Kardiyak mini dokuları steril cımbızla 48 oyuklu bir plakaya dikkatlice aktarın. Yapıları doku başına 300 μL AB çözeltisi ile 37 ° C'de 1 saat 30 dakika (deneysel olarak ayarlayın) inkübe edin.
      NOT: Hücreler metabolik enzimlerin etkisiyle resazurini azalttığından, kültür ortamında 570 nm ve 600 nm'de spektrofotometri ile ölçülecek bir renk değişikliği oluşacaktır.
   3. Ölçüm için, 96 oyuklu bir plakada metabolize AB çözeltisinin dokusu başına 100 μL toplayın ve absorbansları okuyun.
      NOT: Bu analizden sonra numuneler, ortamı bir kez daha Doku Bakım Ortamı olarak değiştirerek kültürlenebilir.
4. Kasılma analizi
   NOT: Kardiyak mini dokular, genellikle doku oluşumundan 1-2 gün sonra kendiliğinden atmaya başlar.
   1. Optik mikroskop altında dokuları gözlemleyerek (atım/dk) atma frekansını manuel olarak ölçün. Aynı anda birçok doku ölçülüyorsa, her okumadan önce plakaları sıcak tutun.
      NOT: Sıcaklık düştükçe çırpma hızı da düşmeye başlar.
   2. Genişletilmiş kardiyak kasılma değerlendirmesi için, atan dokuların optik mikroskopi videolarını alın. Daha büyük bir düzlemi yakalamak için 4x'te veya farklı doku alanlarından 10x'te. Video başına yaklaşık 30 sn kaydedin (en az 3 vuruş).
   3. En az 30 kare/sn'lik bir kare hızı kullanın ve videoyu .AVI formatında kaydedin.
      NOT: Burada videolar, MATLAB¹⁰ için geliştirilen özel yapım bir izleme noktası algoritması ile analiz edilmiştir. Bu yöntemle her video için kasılma hızı, kasılma maksimum yer değiştirmesi (genlik) ve kasılma yönü elde edilebilir.
   4. Analiz klasöründe bulunan videolar için algoritmayı doğrudan MATLAB'da çalıştırın. Çerçeve başına kasılma hızı, çerçeve başına kasılma genliği, kasılma açısı (yön) ve ilgili standart sapmaları¹⁰ değerlerini içeren bir Sonuçlar Excel belgesini otomatik olarak sağlayacaktır.
   5. 'Kare başına daralma hızı'nı kamera çözünürlüğü (μm/piksel) ve kamera kare hızıyla (kare/sn) çarpın. Bu, kasılma hızına nihai değeri (μm/s) verecektir.
   6. 'Kare başına kasılma genliğini' kamera çözünürlüğü (μm/piksel) ile çarpın ve bu, kasılma genliği nihai değerini (μm) verecektir.
      NOT:^19,20 başka bir yerde tartışıldığı gibi, kasılma kinetiğini MUSCLEMOTION gibi bir yazılım kullanarak daha derinlemesine analiz etmek mümkün olacaktır. Görüntüleme kurulumu, yazılımla analiz için en az 60 kare/sn yakalamalıdır.

2D hiPSC türevi kardiyak hücrelerin karakterizasyonu
Multi-fenotipik kardiyak dokular oluşturmak için, hiPSC-CM'ler ve hiPSC-CF'ler bağımsız olarak ayırt edilir ve in vitro olarak

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.