Method Article

Kriyo-elektron tomografi verilerinin sürükleyici segmentasyonu ve analizi için sanal gerçeklikten yararlanma

DOI:

10.3791/67849

⸱

January 24th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Stony Brook University, 2Simons Electron Microscopy Center, New York Structural Biology Center, 3Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), hücresel üst yapının nanometre çözünürlükte 3D görselleştirilmesini sağlar, ancak manuel segmentasyon zaman alıcı ve karmaşık olmaya devam etmektedir. Kriyo-ET tomogramlarını segmentlere ayırmak için gelişmiş sanal gerçeklik yazılımını entegre eden ve memeli hücrelerinde mitokondrinin segmentasyonu yoluyla etkinliğini gösteren yeni bir iş akışı sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), hücrelerin üst yapısını nanometre çözünürlükte üç boyutlu (3D) görselleştirmek için güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, kriyo-ET verilerindeki hücresel bileşenlerin manuel segmentasyonu, karmaşıklığı ve zaman alıcı doğası nedeniyle önemli bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada, cryo-ET veri kümelerini segmentlere ayırmanın hem verimliliğini hem de doğruluğunu artırmak için gelişmiş sanal gerçeklik (VR) yazılımını entegre eden yeni bir segmentasyon iş akışı sunuyoruz. Bu iş akışı, sezgisel 3D etkileşime sahip sürükleyici bir VR aracından yararlanarak kullanıcıların karmaşık hücresel yapılarda daha doğal ve etkileşimli bir ortamda gezinmesine ve açıklama eklemesine olanak tanır. İş akışının etkinliğini değerlendirmek için, retina pigment epitel (RPE1) hücrelerinde mitokondri segmentasyonuna uyguladık. Hücresel enerji üretimi ve sinyalizasyonu için gerekli olan mitokondri, dinamik morfolojik değişiklikler sergiler ve bu da onları ideal bir test numunesi haline getirir. VR yazılımı, mitokondriyal membranların ve iç yapıların hassas bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştırarak, segmentli membran yapılarının aşağı akış analizini mümkün kıldı. Bu VR tabanlı segmentasyon iş akışının, kriyo-ET verilerindeki karmaşık hücresel yapıların doğru segmentasyonunu korurken kullanıcı deneyimini önemli ölçüde iyileştirdiğini gösteriyoruz. Bu yaklaşım, yapısal hücre biyolojisi ve fen eğitimindeki geniş uygulamalar için umut vaat ediyor ve ayrıntılı hücresel analizle uğraşan araştırmacılar için dönüştürücü bir araç sunuyor.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), hücresel bileşenleri yüksek çözünürlükte doğal durumlarına yakın hallerinde görselleştirme yeteneğimizdedevrim yarattı 1,2. Bu güçlü teknik, araştırmacıların hücresel üst yapıyı karakterize etmelerine olanak tanıyarak hücresel mimari ve işlev hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sağlar. Bununla birlikte, kriyo-ET'nin sınırlamaları da vardır, bunların başında, standart kriyo özellikli transmisyon elektron mikroskoplarında görüntüleme için numunelerin elektron saydam olacak kadar ince (tipik olarak <0,5 μm) olması gerekliliği gelir. Kriyo odaklı iyon ışını frezelemedeki son gelişmeler, kriyo-ET analizi 3,4 için kalın numunelerin inceltilmesini sağlamıştır.

Tipik cryo-ET iş akışları, numunenin +60° ila -60° arasında değişen çeşitli açılarda görüntülendiği bir eğim serisinin toplanmasıyla başlar. Bu görüntüler daha sonra üç boyutlu (3D) bir hacim veya tomogram 5,6,7 oluşturmak için hesaplamalı olarak hizalanır ve geri yansıtılır. Bu tomogram, hücresel yapılar hakkında hem mekansal hem de zamansal bilgiler sunan, hücresel manzaranın ayrıntılı bir 3B haritası görevi görür. Aynı yapının birden fazla kopyasının hizalandığı ve ortalamasının alındığı subtomogram ortalaması yoluyla daha fazla iyileştirme, çözünürlük sınırlarını daha da zorlayabilir ve bazen nanometre altı çözünürlük 7,8,9,10'a ulaşabilir.

Bu tomogramlardan anlamlı biyolojik bilgi çıkarmanın çok önemli bir adımı segmentasyondur. Bu işlem, 3B hacim içinde zarlar gibi belirli hücresel yapılara açıklama eklemeyi içerir. Segmentasyon, zarlar arası mesafelerin ve zar eğriliğinin hesaplanması da dahil olmak üzere gelişmiş analizlere olanak tanıyarak hücresel süreçler hakkında değerli bilgiler sağlar11,12. Bu görev için Dragonfly, Amira, MemBrain, EMAN2 ve tomomemsegtv 13,14,15,16,17 dahil olmak üzere çeşitli yazılım paketleri mevcut olsa da, segmentasyon süreci kriyo-ET veri analizinde önemli bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Genellikle emek yoğun ve zaman alıcı bir manuel süreçtir ve tamamlanması potansiyel olarak haftalar ila aylar alır. Bu paketlerin çoğu otomatik segmentasyon özellikleri sunar, ancak dilim dilim veya 3D olarak gerçekleştirildiğinde zahmetli ve sezgisel olmayan bir süreç olan yanlış pozitifleri kaldırmak için sık sık kapsamlı manuel düzeltme gerektirir.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için sanal gerçeklik (VR) teknolojisinden yararlanarak alternatif bir yaklaşım öneriyoruz. VR, veri görselleştirme için sürükleyici ve etkileşimli bir yöntem sunarak, kullanıcıların hücresel ortamın içindeymiş gibi tomografik hacimde gezinmelerine olanak tanır. Bu yaklaşım aynı zamanda, sürükleyici ve benzersiz bir şekilde ilgi çekici bir deneyim sağlayarak bilim eğitimi ve yerinde kriyo-ET verilerinin bilimsel olarak araştırılması ve keşfedilmesi için değerli bir platform sağlar. Bu çalışmada, bilimsel görselleştirme için tasarlanmış VR yazılımı olan syGlass18'i kullanarak kriyo-ET veri segmentasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yazılım, manuel segmentasyon, otomatik olarak oluşturulan segmentasyonların iyileştirilmesi ve hatta tomogramlar içinde partikül toplama dahil olmak üzere cryo-ET veri analizi için kapsamlı bir araç seti sağlar. Çalışmamız, kriyo-ET veri analizinde temizleme segmentasyonları, partikül toplama ve manuel segmentasyon için güçlü bir araç olarak VR'nin uygulanabilirliğini göstermektedir.

Kriyo-ET segmentasyonu için VR yazılımının faydasını göstermek için, retina pigment epitel (RPE1) hücrelerinde mitokondriyal morfolojinin analizine odaklanıyoruz. Mitokondri, karmaşık yapıları ve dış ve iç mitokondriyal zarlar arasındaki mesafe gibi kolayca ölçülebilir özelliklerin varlığı nedeniyle segmentasyon için mükemmel bir test durumu görevi görür. Bu özellikler, segmentasyon kalitesini değerlendirmek için sağlam metrikler sağlayan yüzey morfometrik analiz araçları12 kullanılarak doğru bir şekilde ölçülebilir. Bu protokol, syGlass kullanarak cryo-ET verilerini segmentlere ayırmak için adım adım talimatlar sağlar ve cryo-ET segmentasyon boru hattı içindeki faydasını gösterir. VR tabanlı segmentasyonu cryo-ET iş akışına dahil ederek, hücresel biyolojide manuel yapısal analizin hem verimliliğini hem de doğruluğunu artırmayı amaçlıyoruz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Segmentasyon için cryo-ET verilerinin hazırlanması

  1. Ham Cryo-ET tomogramlarını TIFF yığınları gibi syGlass ile uyumlu bir veri formatına dönüştürün. Sinyali, parçacıklar siyah üzerine beyaz olacak şekilde ayarlayın ve ImageJ19 ile histogram eşitlemesi gerçekleştirin.
    NOT: Sinyal-gürültü oranını artırmak için, tomogramların yazılıma aktarılmadan önce Warp20, Topaz Denoise21, cryoCARE22,23 veya IsoNet24 gibi yazılımlarla gürültüden arındırılması önerilir.
  2. Bilgisayarda VR yazılımını başlatın. Dosya menüsüne gidin ve Proje Oluştur'u seçin.
  3. Yeni Proje Oluştur'a tıklayın | Dosya Ekle'yi tıklayın. TIFF dosyalarının kaydedildiği konuma gidin ve bunları yazılıma aktarın.
  4. Dosyaların bir zaman serisi olup olmadığını onaylamanız istendiğinde, Hayır'ı tıklatın.
  5. Projeye bir ad verin, ardından proje listesinin altında yeni bir proje oluşturmak için Kaydet'e tıklayın.
  6. Tomogramı açmak için projeye çift tıklayın ve yazılım etkileşimli sanal gerçeklik ortamına yükleyin.

2. Sanal gerçekliğin (VR) kurulması

  1. VR gözlüğünü ve el kumandalarını bilgisayara bağlayın.
  2. VR ortamını kalibre etmek için ekrandaki talimatları izleyin.
    NOT: Kalibrasyon, segmentasyonun yapılacağı üç boyutlu uzayı ifade eder. VR projeksiyonu görüntülenmeden önce çalışma alanının parametrelerinin (Uzunluk, genişlik ve yükseklik) tanımlanması gerekir. VR projeksiyonu yalnızca bu parametrelerde görünür olacaktır.
  3. Segmentasyon sadece tanımlanan çalışan üç boyutlu alan içinde yapılacaktır. Görüş alanının, VR ortamında üzerinde çalışılmak istenen alanı içerdiğinden emin olun.

3. 3D görselleştirmeyi optimize etme

  1. Yazılım arayüzündeki Görselleştirme düğmesine tıklayın. Sinyali geliştirmek ve gürültüyü en aza indirmek için kontrast, pencereleme, parlaklık ve eşik kaydırıcıları gibi çeşitli görselleştirme seçeneklerini ayarlayın.
  2. Tommogramı gerektiği gibi yaklaştırmak veya uzaklaştırmak için el kumandalarını kullanın.
  3. Tommogram içindeki farklı dilimleri görsel olarak incelemek için sol taraftaki kumandayı kullanarak Kesme aracını etkinleştirin.

4. Segmentasyon süreci

  1. Tomogramda, segmentasyonun başlayacağı istediğiniz dilime gidin.
  2. El kumandalarını kullanarak açıklama menüsü altındaki İlgi Bölgesi (ROI) seçeneğini etkinleştirin. Tomogramın içinde yeşil bir kutu görünecektir.
  3. Yeşil kutunun boyutunu ve konumunu, bölümlere ayrılacak alana hareket ettirerek ayarlayın.
  4. Sol taraftaki denetleyiciyi kullanarak ROI'yi kilitleyin ve segmentasyonu başlatın. ROI'yi kilitledikten sonra, araç otomatik olarak hacimsel verilerin segmentasyonuna izin veren bir boyama moduna geçer.
  5. Hassas segmentasyon için tomogramı yakınlaştırın veya uzaklaştırın.
  6. Optimum kontrol için saat yönünde veya saat yönünün tersine çevirerek boya fırçası boyutunu ayarlayın.
  7. ROI'yi (örneğin, mitokondriyal zarlar) seçilen 3B alan içinde dikkatlice bölümlere ayırın. Segmentasyon sırasında bir hata oluşursa, silme modunu devreye almak için ikincil denetleyici tetiğine basın ve basılı tutun, ardından segmentleme ile aynı hareketi kullanarak hatayı silin.
  8. Tüm tomografi bölümlere ayrılana kadar bu işlemi bölge bölge tekrarlayın.

5. Segmentlere ayrılmış verileri ve analizleri dışa aktarma

  1. Segmentasyonu tamamladıktan sonra, vurgulandığından emin olmak için üzerine tıklayarak projeyi seçin.
  2. Sol üst köşedeki Projeler sekmesine tıklayın ve ardından YG'ler'i seçin.
  3. Tüm hacmi veya belirli bir yatırım getirisini dışa aktarmayı seçin. Segmentlere ayrılmış veriler için dışa aktarma konumunu belirtin.
  4. Tercih edilen yazılımı kullanarak segmentlere ayrılmış verileri yükleyin ve analiz edin ve yayın için rakamlar oluşturun.

6. Temizleme için ikili maskeyi yazılıma aktarma

  1. 1.1-1.6 adımlarını gerçekleştirin.
  2. Projeye sağ tıklayın ve Maske verileri ekle'ye tıklayın. Ardından, ilk segmentasyonun kaydedildiği yere gidin ve aynı proje altında içe aktarın.
  3. İlk segmentasyonda düzenlemeler yapmak için ROI ek açıklamasını kullanın.
  4. İlk segmentasyonu temizlemek için segmentasyon ekleyin/silin.
  5. Maskeler sekmesindeki ROI seçeneğinin altında Maske ROI'lerini ayarlayın. Maske ROI'sini birinden diğerine değiştirmek için, yalnızca üzerine yazma maskesi seçeneğini açın ve el kumandasıyla boyama moduna gidin. Bu mod, yalnızca görünür olan maske verilerinin üzerine yazar.
  6. Adım 5.1-5.3'te açıklanan adımları kullanarak ayarlanan maske ROI'lerini dışa aktarın.

7. VR yazılımını kullanarak parçacık koordinatlarını toplama

  1. Bölüm 1'de açıklanan adımları kullanarak tomogram (TIFF yığını) kullanarak bir proje oluşturun.
  2. Ek Açıklamaya Tıklayın | Sayım, manuel veya otomatik seçeneklerin bulunduğu bir pencere açar.
    1. Manuel seçenek için, sayımlar için bir renk seçin ve koordinatları işaretlemeye başlayın.
    2. Otomatik seçenek için bir hücre boyutu seçin ve çözünürlüğü girin. Otomatik saymayı çalıştır'a tıklayın, sayımları düzenleyin (iyi tahminleri saklayın ve kötü olanları atın) ve ilerlemeyi kaydedin.
  3. Proje sekmesine tıklayarak sayım koordinatlarını dışa aktarın | ek açıklamalar.
    1. Ek açıklama kaynağı için Sol Alt Köşe'yi seçin ve Açıklama Birimleri için Voxels'i seçin.
    2. Hücreyi vurgulamak için sayma noktaları hücresine tıklayın.
    3. Seçimin koordinatlarını .csv bir dosyaya kaydetmek için Seçileni dışa aktar'a tıklayın.
      NOT: Bu dosya, subtomogram ortalaması için tomogramdan subtomogramları çıkarmak için kullanılabilir

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, mitokondri ve ek membranöz organeller (örn. veziküller, endoplazmik retikulum) içeren tomogramları syGlass kullanarak segmentlere ayırdık. Tomogramlar ilk olarak Warp'ta 16.00 Å/piksel'de ağırlıklı geri projeksiyon kullanılarak yeniden oluşturuldu ve IsoNet yazılımı kullanılarak eksik kama düzeltmesine ve gürültü gidermeye tabi tutuldu. Aşağıdaki tomogramlar, Şekil 1A'da gösterildiği gibi içe aktarma için ek işleme tabi tutulmuştur (ayrıca bkz. Ek Video S1, Ek Video S2, Ek Video S3 ve Ek Video S4).

Ön işlemenin ardından, MRC formatındaki tomogramlar, zarların siyah bir arka plan üzerinde beyaz görünmesini sağlamak için kontrast ters çevirme uygulanarak ImageJ kullanılarak TIFF yığınlarına dönüştürüldü. Daha sonra kontrastı daha da artırmak için histogram eşitlemesi yapıldı; Bu aynı zamanda daha etkili eşiklemeye de olanak tanır. TIFF yığınları, sürükleyici bir VR ortamında 3D olarak içe aktarıldı ve görselleştirildi, böylece Şekil 1B'de gösterilen yazılımdaki kesme aleti kullanılarak zarlı yapıların ayrıntılı incelemesi sağlandı.

Yazılımda manuel segmentasyon gerçekleştirildi, pencereleme otomatik olarak ayarlandı ve hücresel özellik görünürlüğünü optimize etmek için parlaklık/eşik ayarlamaları yapıldı. Mitokondri ve diğer yapıların etrafındaki ROI'ler, VR denetleyicileri kullanılarak tanımlandı. Segmentasyon aracı, membran sınırlarının hassas bir şekilde tanımlanmasına izin verdi ve hatalar silme işlevi kullanılarak düzeltildi. Ayarlanabilir boya fırçası aracıyla birlikte tomogram boyunca bölgeleri kutulamak için ROI aracını kullanarak dilim dilim gezinme veya 3D olarak, mitokondriyal zarların ve diğer organellerin Şekil 1C'de gösterildiği gibi doğru segmentasyonunu sağladı.

Segmentlere ayrılmış veriler, ROI aracının yüzeyler seçeneği kullanılarak, yumuşatma yinelemeleri 12'ye ve çözünürlük düzeyi 3'e ayarlanmış bir ağ oluşturularak görselleştirildi. Son 3B görüntüler, Şekil 1D'de gösterildiği gibi dış ve iç zarlar, krista ve kalsiyum fosfat birikintileri dahil olmak üzere mitokondriyal yapıları açıkça göstermektedir (ayrıca bkz. Ek Video S5, Ek Video S6, Ek Video S7 ve Ek Video S8).

figure-results-1
Şekil 1: Syglass kullanarak tomogram görselleştirme, segmentasyon ve 3D oluşturma iş akışı. (A) İnce kenarlı RPE1 hücrelerinin tomografik dilimleri. Warp'ta yeniden yapılandırılan ve syGlass ile segmentasyon için kullanılan IsoNet düzeltmeli tomogramlar, IMOD25 ile görselleştirildi. Tomogramlar, bir K3 dedektörü ile donatılmış 300 keV Titan-Krios mikroskobunda toplandı ve retina epitel hücrelerinin ince kenarlarına odaklandı. Her tomogram, diğer çeşitli zara bağlı organellerle birlikte en az bir mitokondri içerir. Bu görüntüler, Tamamlayıcı Video S1, Tamamlayıcı Video S2, Tamamlayıcı Video S3 ve Tamamlayıcı Video S4'te gösterilen videolardan alınan hareketsiz görüntülerdir. (B) Yazılımda görselleştirilen karşılık gelen tomogramlar. Eşikleme, parlaklık ve pencerelemeyi optimize ettikten sonra VR yazılımındaki kesme aracı kullanılarak oluşturulan tomografik dilim, farklı hücresel yapıları ortaya çıkarır. (C) Yazılımda segmentli zarlarla görselleştirilen tomogramlar. VR yazılımında kesme aracıyla oluşturulan ve ilgili segmentasyon ile kaplanmış tomografik dilim. Kalsiyum fosfat birikintileri sarı renkte, mitokondriyal zarlar camgöbeği ve veziküller ve plazma zarı gibi diğer zarlar mor renkte gösterilir. (D) syGlass'ta segmentli membranların 3D görüntüsü. Krista, dış ve iç mitokondriyal zarlar dahil olmak üzere mitokondriyal zarlar camgöbeği ile gösterilmiştir. Kalsiyum fosfat birikintileri sarı veya yeşil renktedir, veziküller ve plazma zarı mor renktedir ve endoplazmik retikulum ten rengindedir. Bu görüntüler, Ek Videolar S5, Tamamlayıcı Video S6, Tamamlayıcı Video S7 ve Tamamlayıcı Video S8'de gösterilen videolardan alınan hareketsiz görüntülerdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: Bu çalışmada segmentasyon için kullanılan örnek RPE-1_1'in tomogramı. Bu tomogram, Warp kullanılarak 16 Å/pikselde yeniden yapılandırılır, daha sonra gürültüden arındırılır ve IsoNet ile eksik kama için düzeltilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S2: Bu çalışmada segmentasyon için kullanılan örnek RPE-1_2'nin tomogramı. Bu tomogram, Warp kullanılarak 16 Å/pikselde yeniden yapılandırılır, daha sonra gürültüden arındırılır ve IsoNet ile eksik kama için düzeltilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S3: Bu çalışmada segmentasyon için kullanılan örnek RPE-1_3'ün tomogramı. Bu tomogram, Warp kullanılarak 16 Å/pikselde yeniden yapılandırılır, daha sonra gürültüden arındırılır ve IsoNet ile eksik kama için düzeltilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S4: Bu çalışmada segmentasyon için kullanılan örnek RPE-1_4'ün tomogramı. Bu tomogram, Warp kullanılarak 16 Å/pikselde yeniden yapılandırılır, daha sonra gürültüden arındırılır ve IsoNet ile eksik kama için düzeltilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S5: Yüzeyler oluşturulduktan sonra numune RPE-1_1'in elde edilen segmentasyonu. Mitokondriyal zarlar camgöbeği ile gösterilmiştir; Mitokondri içindeki kalsiyum fosfatlar sarı renkle gösterilmiştir; endoplazmik retikulum bronz renkte gösterilir; ve diğer zarlar mor renkte gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S6: Yüzeyler oluşturulduktan sonra örnek RPE-1_2'nin elde edilen segmentasyonu. Mitokondriyal zarlar camgöbeği ile gösterilmiştir; Mitokondri içindeki kalsiyum fosfatlar sarı renkle gösterilmiştir; endoplazmik retikulum bronz renkte gösterilir; ve diğer zarlar mor renkte gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S7: Yüzeyler oluşturulduktan sonra numune RPE-1_3'ün elde edilen segmentasyonu. Mitokondriyal zarlar camgöbeği ile gösterilmiştir; Mitokondri içindeki kalsiyum fosfatlar sarı renkle gösterilmiştir; endoplazmik retikulum bronz renkte gösterilir; ve diğer zarlar mor renkte gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S8: Yüzeyler oluşturulduktan sonra örnek RPE-1_4'ün elde edilen segmentasyonu. Mitokondriyal zarlar camgöbeği ile gösterilmiştir; Mitokondri içindeki kalsiyum fosfatlar sarı renkle gösterilmiştir; endoplazmik retikulum bronz renkte gösterilir; ve diğer zarlar mor renkte gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, özellikle syGlass kullanan VR'nin, hücresel yapıları etkili bir şekilde segmentlere ayırmak için kriyo-ET boru hattına nasıl entegre edilebileceğini gösterdik. Odak noktamız öncelikle zarlar üzerinde olmasına rağmen, filamentler veya ribozomlar gibi diğer hücresel yapıların segmentasyonunu engelleyen doğal bir sınırlama yoktur, çünkü fırça şekli ve boyutu ayarlanabilir ve yalnızca istenen hücresel nesnelere karşılık gelen voksellerin işaretlenmesini sağlamak için eşikleme yapılabilir. Segmentasyonda VR'nin en büyük avantajlarından biri, verilerle sezgisel, uygulamalı etkileşimdir, böylece kullanıcıların hacimleri fiziksel olarak içlerindeymiş gibi görselleştirmelerine ve manipüle etmelerine olanak tanır. Geleneksel manuel segmentasyon veya ilk segmentasyon maskelerini temizleme yöntemleri genellikle doğrudan bir bilgisayarda çalışmayı içerir, bu da daha az sürükleyici ve açıklama eklemek için daha yavaş olabilir.

VR'yi cryo-ET iş akışına dahil ederek, kullanıcılar yalnızca diğer yazılımlar tarafından oluşturulan segmentasyon maskeleriyle hızlı bir şekilde etkileşime girmekle kalmaz, aynı zamanda kısmen segmentlere ayrılmış yapıların segmentasyonunu yönlendirmek ve yanlış pozitifleri verimli bir şekilde temizlemek için VR'yi kullanabilir. Şu anda, çoğu ek açıklama kullanım durumu için manuel segmentasyon hala gereklidir ve sunulan iş akışı, kullanıcıların gelişmiş kolaylık ve hız ile aşağı akış analizi için uygun segmentasyonlar oluşturmasına olanak tanır. Bu çalışma için HTC Vive VR kulaklığını kullandık, ancak yazılım SteamVR veya OculusVR desteği olan cihazlarla uyumlu.

Bu protokolün en iyi şekilde uygulanması için, kriyo-ET verileri, yüksek sinyal-gürültü oranına (SNR) sahip yüksek kaliteli tomogramlar gibi belirli kriterleri karşılamalıdır. Yapısal özelliklerin netliği, VR'de manuel segmentasyonun etkinliğini doğrudan etkilediği için SNR önemli bir parametredir. Eksik kama düzeltmesi ve gürültü giderme gibi ön işleme adımları, iş akışının önemli parçalarıdır; Bu protokolde IsoNet'i bu amaçlar için kullandık. Tomogramlar, VR görselleştirme için yönetilebilir veri boyutlarını daha da korurken, yapılar arasında etkili segmentasyonu sağlamak için yeterli yapısal ayrıntı ve hücresel yapılar arasında yeterli ayrım sağlayan bir voksel boyutu kullanılarak uygun bir çözünürlükte yeniden yapılandırılmalıdır. Ek olarak, syGlass ortamındaki membranların ve diğer yapıların görünürlüğünü artırmak için siyah bir arka plan üzerinde beyaz görünen hücresel yapılarla ters kontrast ve histogram eşitleme uygulanmalıdır.

Bu protokolün başarısını sağlamak için birkaç kritik nokta göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, veri ön işleme sırasında, kontrast ters çevirme ve histogram eşitlemenin doğru bir şekilde uygulanması hayati önem taşır; yanlış ayarlamalar, VR'de yetersiz görselleştirmeye neden olarak segmentasyonu zorlaştırabilir. İkincisi, VR yazılımı içinde, yapıların en iyi şekilde görselleştirilmesi için pencereleme, parlaklık ve eşik ayarlarının uygun şekilde ayarlanması çok önemlidir. Kullanıcılar, belirli veri kümeleri ve VR kurulumları için en iyi sonuçları elde etmek için bu ayarlarla denemeler yapmalıdır.

Sorun giderme söz konusu olduğunda, kullanıcılar, özellikle büyük tomogram veri kümelerini işlerken VR sistem performans sınırlamaları gibi sorunlarla karşılaşabilir. VR ortamı gecikmeli hale gelirse veya yanıt vermemeye başlarsa, syGlass'taki ROI araçlarındaki sınırlayıcı kutuyu ayarlayarak ve segmentasyon gerçekleştirilirken tomogram boyunca hareket ettirerek verileri alt örneklemeyi veya tomogramı daha küçük bölümlere ayırmayı düşünün. Görselleştirme menüsündeki performans kaydırıcısı da segmentasyon işlemi sırasında gecikmeyi azaltmak için ayarlanabilir. Ek olarak, hareket hastalığını azaltmak için kullanıcılar, hareket efektlerini azaltmak veya segmentasyon oturumları sırasında düzenli molalar vermek için VR ayarlarını yapabilir.

VR tabanlı segmentasyon protokolümüz, mevcut cryo-ET segmentasyon iş akışlarına önemli avantajlar sunar. Geleneksel manuel segmentasyon yöntemleri genellikle tek tek dilimler üzerinde 2B açıklama içerir, bu da zaman alıcı olabilir ve üç boyutlu sürekliliği tam olarak yakalayamayabilir13. Ek olarak, VR tabanlı segmentasyon, görselleştirmeye yardımcı olarak hücresel yapıların çok daha sürükleyici bir görünümünü sunar. Otomatik makine öğrenimi segmentasyonları, hücresel tomogramlardan segmentasyonlar elde etmek için güçlü bir yöntem olarak ortaya çıkmaktadır 14,16,17, ancak kriyo-ET verilerinde bulunan yüksek gürültü seviyeleri ve karmaşık yapılar, manuel müdahale gerektiren boşluklara ve yanlış pozitiflere yol açmaktadır. Bu protokol, kriyo-elektron tomogramlarını manuel olarak segmentlere ayırmak, diğer sinir ağı yazılımları için potansiyel olarak eğitim verileri olarak kullanılabilecek başlangıç segmentasyonları oluşturmak veya diğer otomatik yaklaşımlardan oluşturulan ilk segmentasyonları temizlemek için alternatif bir yaklaşım sunar.

Sonuç olarak, bu çalışma, VR tabanlı segmentasyonu, kriyo-ET veri analizi ve eğitimi için umut verici bir araç olarak vurgulamakta ve gelişmiş verimlilik ve daha sürükleyici bir kullanıcı deneyimi sunmaktadır. Daha fazla gelişme ile VR teknolojisi, kriyo-ET veri kümelerindeki karmaşık hücresel yapıların bilimsel keşiflerini yorumlama ve yayma şeklimizde devrim yaratma potansiyeline sahiptir ve geleneksel segmentasyon ve eğitim yöntemlerine değerli bir alternatif sunar.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, New York Yapısal Biyoloji Merkezi'nde bulunan Ulusal CryoEM Erişim ve Eğitim Merkezi (NCCAT) ve Simons Elektron Mikroskobu Merkezi'nde gerçekleştirildi ve NIH (Ortak Fon U24GM129539, U24GM139171 ve NIGMS R24GM154192), Simons Vakfı (SF349247) ve NY Eyalet Meclisi tarafından desteklendi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoET VeriFormatı: TIFF yığını, TIFF
HTC VIVE CosmosHTC99HARL000-00https://www.vive.com/sea/product/vive-cosmos/features/
Intel (R) Core (TM) i7-10870H CPU @ 2.20 GHz 2.21 GHzIntelhttps://ark.intel.com/content/www/us/en/ark/products/208018/intel-core-i7-10870h-processor-16m-cache-up-to-5-00-ghz.html
NVIDIA GeForce RTX 3070 Dizüstü Bilgisayar GPU'suNVIDIAhttps://www.nvidia.com/en-us/geforce/laptops/compare/30-series/
syGlass YazılımısyGlassYazılımı uyumlu bir Windows PC'de yüklü
VIVE Cosmos El KumandalarıHTC99HAFR001-00https://www.vive.com/us/accessory/cosmos-controller-right/
Windows 11 Ana SayfaMicrosoftMicrosoft Windows 11 Ana Sayfası

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Plitzko, J. M., Schuler, B., Selenko, P. Structural biology outside the box-inside the cell. Curr Opin Struct Biol. 46, 110-121 (2017).
  2. Beck, M., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail. Trends Cell Biol. 26 (11), 825-837 (2016).
  3. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. Methods Mol Biol. 2215, 49-82 (2021).
  4. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  5. Watson, A. J. I., Bartesaghi, A. Advances in cryo-ET data processing: meeting the demands of visual proteomics. Curr Opin Struct Biol. 87, 102861(2024).
  6. Pyle, E., Zanetti, G. Current data processing strategies for cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Biochem J. 478 (10), 1827-1845 (2021).
  7. Wan, W., Briggs, J. A. G. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods Enzymol. 579, 329-367 (2016).
  8. Ni, T., Liu, K., Zhang, J., Atanasov, I., Mladenov, M. G., Jiang, W. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nat Protoc. 17 (2), 421-444 (2022).
  9. Obr, M., et al. Exploring high-resolution cryo-ET and subtomogram averaging capabilities of contemporary DEDs. J Struct Biol. 214 (2), 107852(2021).
  10. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  11. Salfer, M., Collado, J. F., Baumeister, W., Fernández-Busnadiego, R., Martínez-Sánchez, A. Reliable estimation of membrane curvature for cryo-electron tomography. PLoS Comput Biol. 16 (8), e1007962(2020).
  12. Barad, B. A., et al. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. J Cell Biol. 222 (2), e202204093(2023).
  13. Martinez-Sanchez, A., Garcia, I., Asano, S., Lucic, V., Fernandez, J. J. Robust membrane detection based on tensor voting for electron tomography. J Struct Biol. 186 (1), 49-61 (2014).
  14. Heebner, J. E., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).
  15. Garza-López, E., Robles-Flores, M. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65(2021).
  16. Chen, M., et al. Convolutional neural networks for automated annotation of cellular cryo-electron tomograms. Nat Methods. 14 (10), 983-985 (2017).
  17. Lamm, L., et al. MemBrain v2: an end-to-end tool for the analysis of membranes in cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
  18. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality head-mounted displays. arXiv. , (2018).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  21. Bepler, T., Kelley, K., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nat Commun. 11, 5208(2020).
  22. Buchholz, T. -O., Berninger, L., Maurer, M., Jug, F. Cryo-CARE: content-aware image restoration for cryo-transmission electron microscopy data. Proc IEEE Int Symp Biomed Imaging. 16, 502-506 (2019).
  23. Buchholz, T. -O., Jordan, M., Pigino, G., Jug, F. Content-aware image restoration for electron microscopy. Methods Cell Biol. 152, 277-289 (2019).
  24. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13, 6482(2022).
  25. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryo Electron TomographyVirtual Reality SegmentationImmersive Data AnalysisMitochondrial Membranes3D Cell UltrastructureManual SegmentationRetinal Pigment EpitheliumROI AnnotationHistogram EqualizationMembrane Visualization

Related Articles