Yöntem makalesi

DNA Gerilim Problarının Hücrelere Yırtılmasına ve İletilmesine Dayalı Hücresel Mekanotipin Yüksek Verimli Akış-Sitometri Ölçümü

DOI:

10.3791/67852

⸱

13 Haziran 2025

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, göreceli hücresel çekiş kuvvetlerini raporlamak için bir hücrenin ligand sunan hareketsizleştirilmiş DNA duplekslerini yırtma eğilimini ölçer. Yırtılmış floresan oligolar hücreye verilir ve akış sitometrisi ile analiz edilerek hücrenin mekanik geçmişi kaydedilir. Bu, hücresel mekanofenotip bağlamında hücresel kuvvet üretiminin yüksek verimli ölçümüne izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekanik kuvvetler birçok kritik hücresel sürece rehberlik eder ve hücresel mekanik fenotip veya mekanotip birçok hastalıkta bozulur. Hücresel kuvvetleri ölçmek için en yaygın kullanılan yöntem, geleneksel olarak, floresan boncuklar içeren elastik substratları deforme eden, mikrodirekleri saptıran veya hareketsizleştirilmiş moleküler gerilim sensörlerinin konformasyonunu değiştiren hücrelerin yüksek çözünürlüklü mikroskobu ile hücrelerin çevrelerine uyguladığı kuvvetleri yakalayan çekiş kuvveti mikroskobudur. Burada, yerleşik DNA gerilim problarını kullanarak ve akış sitometrisi ile nicelleştirilen nispi hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için yüksek verimli bir yöntem sunuyoruz. Aşağıda açıklanan bu yöntemde yer alan beş genel adım vardır. İlk olarak, DNA bağlayıcı bir HUH etiketine kaynaşmış yüksek afiniteli integrin ligand echistatin'in ekspresyonu ve saflaştırılması; ikincisi, raportörler ve ligand içeren DNA dupleks problarının hazırlanması; üçüncüsü, probların yüzey hazırlığı ve immobilizasyonu; dördüncüsü, "Kopma ve Teslim" gerginlik ölçer-bağlama deneyinin yürütülmesi ve akış okuması. Son olarak, veri analizini ve deneysel sonuçların yorumlanmasını açıklayacağız.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekanik kuvvetler, göç1'den kök hücre farklılaşması2'ye, bir T hücresinin doğru antijen sunan hücre3'e bağlanma ve onun tarafından aktive edilme yeteneğine kadar birçok kritik hücresel sürece rehberlik eder. Mekanik değişkenler hastalıkta düzensizdir ve bu da hücrelerin hücresel mekanik fenotipinde veya mekanotipinde ölçülebilir farklılıklara neden olur 4,5. Mekanotip, hücrelerin ve dokuların mekanik özellikleri için kullanılan bir şemsiye terimdir ve kasılma, migrasyon, yapışma ve deforme olabilirlik gibi parametreleri içerebilir. Hücre veya doku sertliği, yüksek verimde ölçülebildiği için ölçülen mekanotipin en yaygın yönüdür. Örneğin, kanser hücreleri genellikle normal hücrelerden daha sertken, metastatik hücreler genellikle daha uyumludur 6,7. Hücreler tarafından kuvvet üretimi, hastalık8'de değiştirilen mekanotipin önemli bir yönüdür, çünkü belirli hücre-çevre etkileşimlerini araştırır. Çekiş kuvveti mikroskobu, hücresel kuvvet üretimini ölçmek için en yaygın yöntemdir ve hücrelerin floresan boncuklarla gömülü deforme olabilen elastik substratlar veya mikro direk dizileri üzerine kaplanmasını ve hücreler tarafından uygulanan kuvvetleri hesaplamak için boncuk hareketindeki veya post sapmasındaki değişikliklerin izlenmesini içerir. Moleküler gerilim sensörleri ayrıca çekiş kuvvetlerini ölçmek için kullanılmıştır ve belirli ligand-reseptör çiftleri 9,10 tarafından üretilen daha küçük büyüklükteki kuvvet ve ölçüm kuvvetlerine karşı hassasiyet avantajı sunar. Bununla birlikte, geleneksel TFM ve moleküler gerilim sensörleriyle hücresel kuvvetlerin ölçülmesi, yüksek çözünürlüklü görüntülemeye dayanır ve bu da ölçüm verimini sınırlar.

Yakın zamanda DNA dubleks gerilim problarını, hücresel mekanofenotipleme11 bağlamında hücresel kuvvet üretiminin yüksek verimli bir okumasına uyarladık (Şekil 1). Kısaca, yaygın olarak kullanılan gerilim ölçer-bağlama (TGT) problarından12 uyarlanan DNA dupleksleri, "çapa" ipliğinin13 biyotin-nötravidin kimyası yoluyla 96 oyuklu plakaların kuyularında hareketsiz hale getirilir. TGT dublekslerinin gerekli kopma kuvveti, biyotinin ankraj teli üzerindeki konumu değiştirilerek ayarlanabilir, bu da dubleksin geometrisini değiştirir ve bu da ya düşük bir kopma kuvveti açma konformasyonu (Şekil 2A) ya da yüksek bir kopma kuvveti kesme konformasyonu (Şekil 2B) ile sonuçlanır. Çapa ipliği biyotin ve bir floresan söndürücü içerirken, DNA'nın "ligand" ipliği bir floresan probu ve bir integrin gibi mekanosegasyonda yer alan bir hücre yüzeyi reseptörünü tanıyan bir ligand içerir. Ligand, liganda14,15 kaynaşmış bir HUH etiketi adı verilen bir DNA bağlayıcı füzyon etiketinin kullanılması yoluyla DNA'ya kovalent olarak bağlanır (Şekil 3). HUH etiketleri, viral replikasyon ve tek sarmallı DNA'nın 9 bp'lik bir dizisini / yapısını tanıyan, onu çentikleyen ve çentikli DNA'nın 5' ucuna kovalent bir fosfotirozin eklentisi oluşturan diğer işlemlerde yer alan küçük HUH endonükleaz alanlarıdır.

Bu probların üzerine kaplanmış hücreler ligand'a bağlanır ve ürettikleri kuvvetlerle orantılı olarak probların bir yüzdesini koparır. Reseptörüne bağlanan floresan ligand ipliği daha sonra hücreye iletilir. Böylece, hücrelerin mekanik geçmişi, floresanslarının büyüklüğü ile ilgilenilen hücrelerde kaydedilir. Floresan, akış sitometrisi kullanılarak ölçülebilir. Bu yönteme Rupture and Deliver-TGTS veya RAD-TGT'ler diyoruz. Bu yöntem sadece floresansı ve dolayısıyla aynı anda binlerce hücre tarafından üretilen nispi kuvveti ölçmekle kalmaz, aynı zamanda akış sitometrisi okuması, hücreleri mekanotiplerine göre sıralama potansiyeli sunar, bu da aşağı akış -omik okumalarına izin verir, ayrıca CRISPR-KO veya hücresel mekanotipi değiştiren genleri veya ilaçları tanımlayabilen ilaç ekranları.

Aşağıdaki protokolde, bir RAD-TGT deneyinin nasıl hazırlanacağını ve yürütüleceğini gösteriyoruz. WDV (buğday cüce virüsünden) olarak bilinen bir HUH tipinin, negatif bir kontrol olarak hizmet etmek için kendi başına ekspresyonunu ve saflaştırılmasını vurgulayacağız ve deneysel bir koşul olarak hizmet etmek için hücre ve çevre arasında kuvveti ileten bir yapışma reseptörleri ailesi olan echistatine kaynaştırılacak. Bundan sonra, RAD-TGT'lerin deneysel kullanım için nasıl hazırlanacağını göstereceğiz. Deneylere nasıl devam edileceğini ve elde edilen verilerin nasıl analiz edileceğini açıklayacağız. Ayrıca, bir ROCK inhibitörünün CHO-K1 hücrelerinde integrin aracılı kuvvetleri nasıl değiştirdiğini ölçerek RAD-TGT'lerin bir uygulamasını vurgulayacağız (Şekil 4). Özetle, bu protokolün önceki deneyimlerden bağımsız olarak mekanobiyolojiye bir giriş görevi görmesini umuyoruz; Alan henüz başlangıç aşamasındadır ve daha fazla anlayış için tüm geçmişler gereklidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HUH ifadesi ve saflaştırma

  1. Escherichia coli'yi WDV (± Echistatin) plazmidi ile, dönüşüm başına yaklaşık 1.5 μL ~ 50 ng / μL plazmid ile dönüştürün ve ampisilin agar plakalarında büyütün.
  2. 5 mL LB'yi tek bir koloni ile aşılayın ve gece boyunca 37 ° C'de büyütün.
  3. 1 L LB'yi gece boyunca kültürle aşılayın ve OD600 ~ 0.8'e ulaşana kadar büyütün.
  4. Sıcaklığı 18 ° C'ye düşürün, 500 μM izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ile indükleyin ve gece boyunca inkübe edin.
  5. Hücreleri 30 dakika boyunca 3.750 × g'da santrifüjleme ile peletleyin. Peletleri 40 mL lizis tamponu (300 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA) ile yeniden süspanse edin.
  6. Hücreleri% 70 görev döngüsünde buz üzerinde 3 x 90 s sonikasyon ile parçalayın, güç 7. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 24.000 × g'da döndürün ve süpernatanı 50 mL'lik yeni bir tüpe dökün.
  7. Ni-NTA reçine bulamacını 15 mL'lik bir konik tüpe (1 mL boncuk süspansiyonu / L kültür) koyun, 2 dakika boyunca 700 × g'da döndürün ve süpernatanı çıkarın.
  8. Reçineye 6 mL su ekleyin ve yıkama işlemini adım 1.7'de tekrarlayın.
  9. Su yerine yıkama tamponu (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 7.5], 1 mM EDTA, 20 mM İmidazol) ile yıkamayı iki kez tekrarlayın. Boncukları 5 mL yıkama tamponunda tekrar süspanse edin.
  10. Boncuk bulamacını (adım 1.9) parçalanmış hücrelere (adım 1.6) ekleyin ve iyice karıştırın. Parçalanmış hücreleri ve boncukları 4 ° C'de en az 1 saat döndürün.
    NOT: Bu protokolün geri kalanında reçinenin kurumasına asla izin vermeyin ve kolondan akan tüm numuneleri toplayın.
  11. Karışımı 20 mL'lik bir sütuna dökün ve akışı toplayın. Kolonu 4 x 25 mL yıkama tamponu ile yıkayın.
  12. 1 x 10 mL elüsyon tamponu (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 7.5], 1 mM EDTA, 250 mM İmidazol) ile taze 15 mL'lik bir tüpe elute edin, erken ve geç elüsyonu ayrı ayrı toplayın (erken elüsyon ilk 1 mL'dir, geç elüsyon son 1 mL'dir).
  13. Elüsyon sırasında HUH'un toplandığından emin olmak için toplanan tüm fraksiyonları sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yoluyla analiz edin (bkz. Ek Şekil S1). En iyi sonuçlar için,% 4-20'lik bir jel yükleyin ve 35 W ve 200 V'ta 45 dakika çalıştırın.
  14. Ayrıştırılmış proteini diyaliz tüpüne ekleyin ve gece boyunca diyaliz tamponunda (liziz tamponu ile aynı) 4 ° C'de inkübe edin. HIS etiketini çıkarmak için, proteini diyaliz tüpüne koymadan önce indirgeyici madde içermeyen ULP1'i doğrudan ayrıştırılmış proteine ekleyin.
  15. Ertesi sabah, Ni-NTA reçinesini adım 1.7-1.9'da tarif edildiği gibi hazırlayın ve diyaliz proteini ile inkübe edin. Protein ve Ni-NTA reçinesinin karışımını bir sütuna dökün ve akışı toplayın. Kolonu 10 mL diyaliz tamponu ile yıkayın ve herhangi bir akışı toplayın.
  16. Proteinin mevcut olduğundan emin olmak için yukarıdaki ayarları izleyerek SDS-PAGE üzerinde toplanan fraksiyonu değerlendirin ve 10 kDa moleküler ağırlık kesme özelliğine sahip 15 mL'lik bir ultrasantrifüj filtre kullanarak istenen konsantrasyona konsantre olun (bkz. Ek Şekil S1).
    NOT: İdeal nihai protein konsantrasyonu 40 μM ile 100 μM arasındadır.

2. RAD-TGT hazırlığı

  1. Dubleksleri, 10 mM Tris (pH 7.5), 50 mM NaCl ve 1 mM EDTA'lık bir çözelti içinde 40 μM ligand ipliğinin nihai konsantrasyonunda 1.1: 1 molar ankraj ipliğine (söndürücü ile) ligand ipliğine (floroforlu) oranında birleştirin.
  2. 98 ° C'de 5 dakika inkübe ederek ve ardından oda sıcaklığında 1 saat soğutarak tavlayın; Işıktan koruyun.
    NOT: Düşük hacimli numuneler kolayca buharlaşır ve tamamen geri kazanılması zor olabilir. Gerekenden daha fazla hacim hazırlayın.
  3. Tavlanmış dubleksleri 1 mM MnCl2, 50 mM HEPES (pH 8), 50 mM NaCl içeren bir çözelti içinde 10 μM dubleks ve 20 μM HUH nihai konsantrasyonda 1: 2 molar oranda HUH ile (tavlama sırasında en az bulunan ipliğin konsantrasyonunu kullanarak; bu durumda ligand ipliği) reaksiyona sokun.
  4. Reaksiyonu bir termal döngüleyici veya ışık korumalı ısı bloğunda 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, ocaktan alın ve şimdi monte edilmiş TGT'leri döndürmek için bir tezgah üstü minifüj kullanın. TGT'leri hemen kaplayın veya karanlıkta 4 °C'de saklayın.

3. Yüzey hazırlığı

  1. 96 oyuklu bir cam alt plakayı açtıktan hemen sonra, kullanılmayan kuyuları daha sonra kullanmak üzere korumak için tüm kuyuları yapışkan PCR plaka folyosu ile kapatın. İlgilenilen kuyuların (tercihen kenarsız kuyular) üzerindeki folyoyu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın ve istenen kuyucuklara 100 μL soğuk PBS ekleyin.
    NOT: Kuyucuklara sıvı eklendikten sonra kuyuların kurumasına izin vermeyin. Kuruma meydana gelirse, biyomoleküllerin yüzeye spesifik olmayan adsorpsiyonu verileri olumsuz yönde etkileyecektir. Herhangi bir kurumayı önlemek için kuyuda sürekli olarak 100 μL fazla hacim bulundurun.
  2. Kuyucuklara 200 μL soğuk PBS ekleyin, 2-5x karışımını hafifçe pipetleyin ve 200 μL PBS'yi çıkarın. Toplam üç yıkama için tekrarlayın.
    NOT: Kuyucuklara sıvı eklerken ve çıkarırken, yüzeyi bozmamak için pipet ucunu kuyunun kenarında 45° açıyla tutun. Bunu, hücrelerin kaplanması dışında plakanın tüm işlemleri için yapın.
  3. Deneysel kuyular için, PBS'de 0.1 mg / mL Biyotinillenmiş-BSA'lık bir çözelti hazırlayın ve istenen kuyucuklara 80 μL çözelti ekleyin. Kontrol kuyuları için, 18.75 μg/mL fibronektin ilavesiyle aynı çözeltiyi hazırlayın ve ilgili kuyucuklara 80 μL ekleyin. Kullanılan tüm kuyucukları nazikçe pipetleyin, kapağı plakaya yerleştirin ve folyo ile örtün. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  4. Kuyulardan 80 μL hacim çıkarın ve adım 3.2'yi tekrarlayarak kuyuları yıkayın. PBS çözeltisine 80 μL 0.1 mg / mL nötravidin, adım 3.3 ile aynı şekilde ekleyin.
  5. İnkübasyondan sonra, kuyucuklardan 80 μL hacim çıkarın ve adım 3.2'yi tekrarlayın. Monte edilmiş TGT'leri (RAD-TGT Hazırlama aşaması 2) PBS'de 0.1 μM'ye ve kuyucuklara 80 μL çözeltiye adım 3.3'e benzer şekilde seyreltin. Ya kuyucukları yapışkan folyo ile örtün ve karanlıkta 4 °C'de saklayın ya da ışıktan koruyun ve deneylere devam etmeden önce oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    NOT: Adım 3.5'i bir durma noktası olarak ele almanızı ve deneylere devam etmek için ertesi güne kadar beklemenizi öneririz.

4. RAD-TGT deney protokolü

  1. TGT'lerin yapışması için yeterli zaman geçtikten sonra, kuyucukları (bkz. adım 3.2) 3 kez PBS ile yıkayın, ardından serumsuz ortamla iki yıkama yapın. Son yıkamadan sonra ortamı kuyularda bırakın. Herhangi bir kenar etkisini azaltmak için periferik kuyucuklara 200 μL PBS ekleyin ve plakayı önceden ısıtmak için plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın.
  2. İlgilenilen hücreleri ~% 80 birleşmede alın ve ortamı aspire edin, ardından hücreleri yıkamak için PBS'nin eklenmesi ve aspirasyonu ile devam edin. Uygun hacimde tripsin ekleyin ve plakayı, hücreler ayrışana kadar (~ 5-10 dakika) 37 ° C'lik bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
  3. Hücreler ayrıldıktan sonra, hücreleri korumak için kullanılan orijinal tam hücre ortamı hacmini plakaya ekleyin ve serolojik bir pipetle yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe ekleyin.
  4. Hücreleri 4 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin, ortamı aspire edin ve peleti PBS'de yeniden süspanse edin. Santrifüjleme ve aspirasyonu tekrarlayın, ardından 5 mL serumsuz ortamda yeniden süspanse edin ve santrifüjleme ve aspirasyonu tekrarlayın. Hücreleri ~ 2 mL serumsuz ortamda yeniden süspanse edin.
  5. Yeniden askıya alınan hücrelerin yoğunluğunu belirleyin ve konsantrasyonu istediğiniz gibi ayarlayın.
    NOT: Kuyu başına ~ 15.000 hücre plakalamayı hedefliyoruz, bu nedenle hücreleri 150.000 hücre / mL konsantrasyonda hazırlıyoruz, bu da 15.000 hücrenin 100 μL yeniden askıya alınmış hücre ile kaplanmasına izin veriyor.
    1. İsteğe bağlı: İlaçların veya diğer farmakolojik ajanların etkisi test edilecekse, hücrelere uygun ilaç konsantrasyonunu ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri koyun. Bir sonraki adıma geçmeden önce yeterli ön kuluçka süresine izin verin.
  6. Plakayı inkübatörden alın (adım 4.1) ve yıkamadan kalan ortam hacmini önceden ısıtılmış plakadaki deney kuyucuklarından çıkarın. İstenilen ortamla bir kez yıkayın. Yeniden süspanse edilmiş hücrelerin 100 μL'sini istenen kuyucuklara dikkatlice pipetleyin. Kaplanan hücreleri 90 dakika boyunca inkübatöre aktarın.
    NOT: Pipeti dikey tutmaya çalışarak hücreleri kuyucukların ortasına nazikçe pipetleyin.
  7. İnkübasyondan sonra, kuyucuklardan ~ 125-170 μL hacim çıkarın. Gerekirse, hücreleri 200 μL ısıtılmış PBS ile nazikçe yıkayın. Her oyuğa 50 μL tripsin ekleyin ve hücreler ayrışmaya başlayana kadar (5-10 dakika) plakayı inkübatöre geri koyun.
    NOT: Kuyunun asla kurumadığından ve aşırı yüklenmenin meydana gelmediğinden emin olun.
  8. Kuyucuklara 160 μL taze hazırlanmış akış tamponu (1 mM EDTA,% 2 w / v sığır serum albümini, soğuk PBS'de) ekleyin. Hücreleri ayırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin, bu hücre süspansiyonunun 196 μL'sini PCR tüplerine ve ardından 4 μL propidyum iyodür ekleyin ve yavaşça karıştırın. Canlı geçit için bir kontrol görevi görmesi için propidyum iyodür içermeyen bir kontrol numunesi hazırlayın.
  9. Tüpleri, kapağı ışığı bloke eden bir buz kovasına yerleştirin ve bir akış sitometresi ile floresan yoğunluğunu ölçmeye devam edin.

5. Veri toplama ve analizi

  1. Her numuneyi bir akış sitometresi ile analiz edin. Örnek başına en az 2.000 canlı tek hücre toplamayı hedefleyin.
    NOT: Henüz analiz edilmemiş numuneler için ışığa maruz kalmayı en aza indirin ve buz üzerinde tutun.
  2. Tüm veriler toplandıktan sonra, dosyaları tercih ettiğiniz yazılıma aktarın ve hücreleri kapatın.
    1. İleri saçılma alanına (FSC-A) karşı yan saçılma alanına (SSC-A) göre hücreler için geçit.
    2. FSC-A ve ileri saçılma yüksekliği (FSC-H) ile hücre popülasyonu içindeki tekiller için kapı.
    3. Adım 4.8'de hazırlanan propidyum iyodür içermeyen kontrol için en yüksek değerde propidyum iyodür alan yoğunluğunun histogramında dikey bir kapı ayarlayarak singlet popülasyonundan canlı hücreler için kapı. Kapıyı aşmayan herhangi bir olay canlı hücrelerdir
    4. Hücre kalıntılarının neden olduğu Cy5-A kanalındaki floresan olmayan herhangi bir olayı ortadan kaldırmak için tekillerin Cy5 alan (Cy5-A) yoğunluğunun histogramına dikey bir kapı ayarlayın. Bu dikey kapının, analiz edilen etiketlenmemiş hücrelerden daha düşük, ancak 0 floresan yoğunluğundan daha büyük bir değerde olduğundan emin olun.
    5. Hücre popülasyonlarını analiz etmek için, her bir negatif kontrolün 99. yüzdelik diliminde bir açıortay kapısı ayarlayın.
    6. Karşılık gelen deney koşullarıyla aynı yoğunlukta bir kapı uygulayın ve her koşul için negatif kontrol kapısını aşan hücrelerin yüzdesini toplayın.
      NOT: Yüzdeler, uygun istatistiksel analiz yoluyla biyolojik kopyalar arasında doğrudan karşılaştırılabilir; Temsili verilere bakın.
  3. Medyan Cy5 floresansını kullanarak, ligand-WDV'nin medyan yoğunluğunu yalnızca WDV'nin medyanına bölerek verileri analiz edin ve bu değerleri kopyalar arasında karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RAD-TGT'lerin faydasını ve kullanım kolaylığını göstermek için, Rho Kinaz (ROCK) inhibitörlerinin CHO-K1 hücrelerinin mekanotipi üzerindeki etkilerini analiz ettik. ROCK yolu, aktin organizasyonu ve miyozin aktivasyonunda rol oynar. TGT'leri kullanan önceki çalışmalar, ROCK inhibisyonunun TGT'lerin 16,17,18 kesilmesinin yırtılmasını azalttığını göstermiştir. Kesme veya yüksek kuvvetli TGT'ler, fokal yapışmalar yoluyla uygulanan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşam bilimlerindeki bilim insanlarını iş akışlarına mekanotiplemeyi dahil etmeye teşvik etmek amacıyla RAD-TGT deneylerinin nasıl kurulacağı ve gerçekleştirileceği konusunda protokoller sağladık. RAD-TGT'lerin, özellikle protein üretme kabiliyetine sahip olanlar için önemli bir avantajı, herhangi bir kimyasal çapraz bağlama ve/veya saflaştırma olmaksızın ligandları yüksek sadakatle DNA duplekslerine bağlamak için HUH endonükleazlarının kullanılmasıdır. HUH endonükleazlar, tek sarmallı D...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G., NIH R35GM119483'ndan fon sağladığını kabul ediyor. Şekil şemaları yapmak için Biorender kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL Konik TüpSarstedt62.554.205
96 kuyulu cam alt plakaCellvisP96-1.5H-N
Yapıştırıcı PCR plaka folyosuThermo Fisher ScientificAB-0626
AmpisilinApex Bioresearch Ürünleri 25-530
Bio-Rad 20 mL kolonBio-Rad7321010
Biyotinile BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) Yetkili E. coliNew England BiolabsC2527H
Sığır Serumu AlbüminThermo Fisher ScientificBP9703100
Hücre Kültürü İnkübatörüThermo Fisher Bilimsel51030284
SantrifüjThermo Fisher Scientific75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
Diyaliz TüpüThermo Fisher ScientificPI88242
DMSOThermo Fisher ScientificD12345
EDTAThermo Fisher ScientificS311-100
Akış SitometreBDAccuri C6 Plus
FlowJo BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
İmidazolThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB agarFisher ScientificBP1425-500
Ligand StandıEntegre DNA teknolojilerikullanıcı tarafından tasarlanmış oligoGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
Lizojeni Et Suyu (LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo Fisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
NeutrAvidin ProteinThermo Fisher Scientific31000
Nikel-NTA reçine Thermo Fisher Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
Petri KabıVWR25384-342
Propidyum İyodür ÇözeltisiCayman Kimyasalları10008351
SDS-PAGE jelBio-Rad4561096
Serumu İçermeyen MedyaThermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem Kullanılmış, alternatif serum içermeyen ortamların kullanımı iyidir
Kesme Ankraj İpliğiEntegre DNA teknolojilerikullanıcı tarafından tasarlanmış oligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC
SonikatörThermo Fisher Scientific15-345-139
Termal DöngüleyiciBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
ultrasantrifüj filtre, 10 kDa kesmeAmikon
Açma Ankraj İpliğiEntegre DNA teknolojilerikullanıcı tarafından tasarlanmış oligo/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV PlazmidAddGene226983
WDV-Ekistatin PlazmidAddGene226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049DMSO'da Yeniden Yapılandırıldı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Puleo, J. I., et al. Mechanosensing during directed cell migration requires dynamic actin polymerization at focal adhesions. J Cell Biol. 218 (12), 4215-4235 (2019).
  2. He, L., Ahmad, M., Perrimon, N. Mechanosensitive channels and their functions in stem cell differentiation. Exp Cell Res. 374 (2), 259-265 (2019).
  3. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (39), E8204-E8213 (2017).
  4. Kai, F., Laklai, H., Weaver, V. M. Force matters: Biomechanical regulation of cell invasion and migration in disease. Trends Cell Biol. 26 (7), 486-497 (2016).
  5. Chapman, M., Rajagopal, V., Stewart, A., Collins, D. J. Critical review of single-cell mechanotyping approaches for biomedical applications. Lab Chip. 24 (12), 3036-3063 (2024).
  6. Swaminathan, V., et al. Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines. Cancer Res. 71 (15), 5075-5080 (2011).
  7. Graybill, P. M., Bollineni, R. K., Sheng, Z., Davalos, R. V., Mirzaeifar, R. A constriction channel analysis of astrocytoma stiffness and disease progression. Biomicrofluidics. 15 (2), 024103(2021).
  8. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), e32572(2012).
  9. Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Phys Biol. 17 (1), 011001(2019).
  10. Liu, Y., Galior, K., Ma, V. P. -Y., Salaita, K. Molecular tension probes for imaging forces at the cell surface. Acc Chem Res. 50 (12), 2915-2924 (2017).
  11. Pawlak, M. R., et al. RAD-TGTs: high-throughput measurement of cellular mechanotype via rupture and delivery of DNA tension probes. Nat. Commun. 14 (1), 2468(2023).
  12. Wang, X., Ha, T. Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling. Science. 340 (6135), 991-994 (2013).
  13. Jo, M. H., Cottle, W. T., Ha, T. Real-time measurement of molecular tension during cell adhesion and migration using multiplexed differential analysis of tension gauge tethers. ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 3856-3863 (2019).
  14. Tompkins, K. J., et al. Molecular underpinnings of ssDNA specificity by Rep HUH-endonucleases and implications for HUH-tag multiplexing and engineering. Nucleic Acids Res. 49 (2), 1046-1064 (2021).
  15. Lovendahl, K. N., Hayward, A. N., Gordon, W. R. Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags. J Am Chem Soc. 139 (20), 7030-7035 (2017).
  16. Kim, K. A., Vellampatti, S., Hwang, S. H., Kim, B. C. DNA-based single molecule force sensor for characterization of α 5 β 1 integrin tension required for invadopodia formation and maturation in cancer cells. Adv Funct Mater. 32 (28), 2110637(2022).
  17. Wang, X., et al. Integrin molecular tension within motile focal adhesions. Biophys J. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  18. Ma, R., et al. Molecular mechanocytometry using tension-activated cell tagging. Nat Methods. 20 (11), 1666-1671 (2023).
  19. Pal, K., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Ubiquitous membrane-bound DNase activity in podosomes and invadopodia. J Cell Biol. 220 (7), e202008079(2021).
  20. Kim, K. A., Vellampatti, S., Kim, B. C. Characterization of integrin molecular tension of human breast cancer cells on anisotropic nanopatterns. Front Mol Biosci. 9, 825970(2022).
  21. Wang, Y., Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Optical sensor revealed abnormal nuclease spatial activity on cancer cell membrane. J Biophotonics. 12 (5), e201800351(2019).
  22. Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Peptide nucleic acid based tension sensor for cellular force imaging with strong DNase resistance. Biosens Bioelectron. 150, 111959(2020).
  23. Rashid, S. A., et al. All-covalent nuclease-resistant and hydrogel-tethered DNA hairpin probes map pN cell traction forces. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (28), 33362-33372 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Traction Force MicroscopyTension Gauge TetherIntegrin Ligand EchistatinCell Mechanical ForcesHigh Throughput MeasurementCell IsolationFluorescence Intensity

İlgili makaleler