Yöntem makalesi

Amiloid Beta 1-40 Kaplı Altın Kolloidlerin pH'a Bağlı Tersinir Kendi Kendine Montajının Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/67856

⸱

21 Mart 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, State University of New York Geneseo College

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, amiloid beta 1-40 (Aβ 1-40) kaplı 20 nm altın agregalarının yarı tersinir kendi kendine montajını tanımlayan sistematik bir yöntem sunuyoruz. Peptitler arasındaki nano boyuta bağlı yarı tersinir ağ, spesifik amino asitler veya Aβ 1-40 monomerinin bölümleri ile ilişkilendirildi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nano-altın kolloidal parçacık yüzeyleri üzerine kaplanmış Aβ 1-40'ın karakterizasyonu, yüzey plazmon rezonansı (SPR) spektroskopisi ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak gerçekleştirildi. Aβ 1-40 kaplı 20 nm altın parçacıklarının SPR bandının gözlenen pH'a bağlı kayması, TEM görüntülerinde gözlenen agregasyon ve ayrışma değişimi ile ilişkilendirildi. ~4'lük bir pH, katlanmamış bir konformasyonu indükledi ve ~10'luk bir pH, altın yüzeyinde Aβ 1-40'lık katlanmış bir konformasyonu indükledi. Bu tersinir agregasyon işlemi, pH kademeli olarak pH 4'ten pH 10'a değiştirildiği için Raman görüntüleme ile gözlemlendi. pH4'te berrak agregaların gözlendiği altın yüzeyinde Aβ 1-40'ta pH'a bağlı bir morfoloji değişikliği gözlemledik. Bununla birlikte, pH 4 ve pH 10 koşulları arasında yüzey geliştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) spektrumunda çok ince farklılıklar gözlemledik, en çarpıcı fark 250 cm-1 ve 1750 cm-1 bölgesindeki spektral yoğunluktur. Spesifik olarak, tersinir agregasyonun mod analizi, agregaların, Tirozin ve Fenilalanin'in benzen halkası bölümünü içeren Aβ 1-40'ın katlanmamış konformasyonu ile oluşturulduğunu gösterdi. Tersine, agregaların sökülmesi, Histidin, Glutamin, Metionin ve Aspartik asit içeren Aβ 1-40'ın protein katlanmasındaki konformasyonel değişikliklerle ilişkilendirildi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amiloid beta 1-40 (Aβ 1-40) veya 1-42 (Aβ 1-42) peptitlerinin fibrillogenezi, Alzheimer hastalığının bir nedeni olan amiloid plaklarının oluşumunda kritik bir bileşen olarak kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ,11. Fibrillogenezdeki anahtar mekanizma, nörotoksik bir protein agregatı oluşturmak için Aβ 1-40 veya Aβ 1-42 peptitlerinin oligomerizasyonudur ve monomerlerin oligomerleri nasıl oluşturduğunun mekanizmalarını anlamak için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır 12,13,14. Nano-altın bir yüzey üzerinde agregalar oluşturan amiloidojenik peptitleri incelemek ve altın yüzeyinden uzakta olan peptitler arasındaki ağdan sorumlu faktörleri belirlemek için bir yaklaşım benimsedik 15,16,17,18,19,20,21,22.

Aβ 1-40, asidik koşullar altında (pH ~ 4) katlanmamış bir konformasyon (A) ve bazik koşullar altında (pH ~ 10) katlanmış bir konformasyon (B) benimser. pH ~10'da dağılmış Aβ 1-40 kaplı altın kolloid partikülleri ve pH~4'te büyük Aβ 1-40 kaplı altın kolloid agregatları gözlemledik (Şekil 1)23,24. Asidik koşullarda Aβ 1-40'ın katlanmamış konformasyonu, Aβ 1-40 monomerleri arasında altın-nano parçacık yüzeyi üzerinde peptit ağını destekler ve bu da altın kolloid agregatlarının oluşumuna neden olur (Şekil 1'deki Bkz. A). Aβ 1-40 monomeri, katlanmış konformasyonu bazik veya nötr bir pH, Aβ 1-40'ta tuttuğunda, monomerler agregalara ağ oluşturmaz ve kaplanmış altın nanopartiküller ayrı ayrı dağılmış partiküller olarak kalır (Şekil 1'deki Bkz. B). Bu nedenle, Aβ 1-40 peptitlerinin, 25,26,27,28,29,30,31 pH koşullarında SPR bant kaymasını ölçerek ağa nasıl konformasyonel değişikliklere uğradığı ve agregalar oluşturduğu sürecini sorgulayabiliriz.

Birkaç farklı boyutta altın nanopartikülleri test ettik ve 20 nm altın kolloidin, pH'daki harici bir değişikliğe yanıt olarak Aβ 1-40 monomerlerinin en belirgin geri dönüşümlü kendi kendine montaj sürecini sergilediğini bulduk (Şekil 2). Bu, asidik koşulların (A) katlanmamış bir konformasyonu indüklediği, ağı arttırdığı ve altın kolloidlerin toplanmasına yol açtığı peptit konformasyonunda geri dönüşümlü bir değişikliğin açık bir göstergesidir. Temel koşulun (B) 26,27,28,29,30,31 monomerlerinin katlanmış bir konformasyonunu indüklediği bulundu.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Aβ 1-40 kaplı altın nanopartiküllerin hazırlanması

  1. Bir şırınga iğnesi kullanarak 1 mg liyofilize Aβ 1-40'a (MW: 4.2 kDa,% 98 HPLC saflığı) 1 mL hacimde damıtılmış deiyonize su ekleyin. Çözeltiyi yaklaşık 30 saniye boyunca bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın ve oda sıcaklığında (RT; ~ 20 ° C) çözelti içinde katı parçacık gözlenmediğinden emin olun.
    1. Deiyonize ve damıtılmış su (~ 18 MΩ · cm) kullanarak tüm stok çözeltilerini hazırlayın.
    2. 1390 cm'nin 275'ε moleküler sönme katsayısına sahip olan 275 nm32'de tirozin absorpsiyonunu kullanarak konsantrasyonu spektroskopik olarak tanımlayın-1· M-1 olarak adlandırılır.
    3. Aβ 1-40 stok çözeltilerini -80 °C'de saklayın. (Aβ 1-40 ticari ürünleri için Malzeme Tablosuna bakınız.)
  2. Veri toplamadan yaklaşık 5 dakika önce peptit stok çözeltisini çözün. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 8 μL'lik bir peptit çözeltisi hacmini 800 μL altın kolloidal parçacıklarla karıştırın. 4.2 mL hacimce deiyonize damıtılmış su ekleyin ve ardından numuneyi 10 s30,31,33,34 için girdaplayın.
  3. Aβ 1-40 peptitlerin konsantrasyonunu 1.8 nmol olacak şekilde sabitleyin ve Aβ 1-40 peptitlerin oranını ayarlayın. Altın kolloidlerin sayısı ~ 500: 1 ile ~2000: 1 25 arasında değişmektedir.

2. Yinelemeli pH değişimi ve karşılık gelen SPR bant kaymasının izlenmesi

  1. Ultraviyole-görünür-yakın kızılötesi (UV-Vis-NIR) spektrofotometresinin sıcaklık kontrol ünitesini kullanarak çözelti sıcaklığını belirlenen bir değere (örn. 25 °C) ayarlayın.
  2. Bir pH metre kullanarak numune çözeltisinin ilk pH'ını izleyin ve pH 7'nin biraz altına ayarlayın. Absorpsiyon spektrumunu 400 nm ile 1000 nm arasında toplayın.
  3. 10 μL'lik hacimlerde 0,1 M HCl ekleyerek numunenin pH'ını ~pH 4'e (yani pH 4,0 ± 0,3) değiştirin ve 400 nm ile 1000 nm arasındaki absorpsiyon spektrumunu toplayın.
  4. 10 μL hacimlerde 0,1 M NaOH ekleyerek numunenin pH'ını ~pH 10'a (yani pH 10 ± 0,3) değiştirin ve 400 nm ile 1000 nm arasındaki absorpsiyon spektrumunu toplayın.
  5. pH 4 ile pH 10 arasındaki pH'ı HCl ve NaOH ile 10 kez değiştirin ve absorpsiyon spektrumunu sürekli olarak 25 ± 0.2 °C'detoplayın 29,30.
    NOT: Tüm numune çözeltileri için, SPR bandının tepe noktasının optik yoğunluğu 0.2 civarında tutulmuştur. Bir çözeltideki artık tampon çözeltisinden dolayı bir tampon etkisi beklenir. Böylece, denge onaylandıktan sonra nihai pH değeri belirlendi. pH değeri, ±0.005 pH hassasiyete sahip bir mikro pH elektrodu kullanılarak bir numune küvet hücresinde doğrudan ölçülmüştür.
  6. Soğuruculuğun bir fonksiyonu olarak bilgi değişimi (ASCII) dalga boyları veri seti için Amerikan standart kodunu elde edin. Peak Fit programını kullanarak bant tepe noktalarının ortalama konumunu çıkarın.
    1. Çizim işlevini kullanarak optik yoğunluğu dalga boyunun (nm) bir fonksiyonu olarak görüntülemek için veri kümesini çizin.
    2. İlk tepe dalga boylarını λ1, λ2 ve λ3 çizilen verilerdeki yaklaşık konumlarını seçerek işaretleyin ve RUN işlevini kullanarak verileri sığdırın.
    3. Her bir bandın alanı (Ai) ile her birinin (λi), XCi'nin merkezi zirvesini içeren grafiği elde edin.
  7. Çıkarılan tepe konumlarını ve alanlarını bir elektronik tablo programına aktarın ve belirli bir pH'ta ortalama tepe konumunu hesaplayın.
    1. Bandın alanını (Ai) tüm bantların toplam alanıyla karşılaştırarak her bir tepe merkezi λi'nin ağırlık faktörü a i'yi şu şekilde belirleyin: . figure-protocol-1
    2. Denklem (1) kullanarak ortalama tepe konumunu figure-protocol-2 (pH) çıkarın.
      figure-protocol-3(1)
  8. Aşağıdaki işlemi kullanarak bir tersinirlik grafiği oluşturun:
    1. Ortalama tepe konumlarını tablo haline getirin, figure-protocol-4, her bir "işlem" sayısının bir fonksiyonu olarak, n olarak figure-protocol-5 vs. n. ~pH 7'de asit ilavesinden önce numune için işlem numarasını, n'yi 1 yapın. İşlem sayısını her seferinde 1 artırın, pH'ı HCl ile ~pH4 veya NaOH ile pH'ı ~pH 10 olacak şekilde değiştirin. n'yi asidik bir durumda (yani, ~pH 4) eşit ve bazik bir durumda (yani, pH 10) tek yapın.
    2. 30 formülünü kullanarak her n, figure-protocol-6 (n) = λ(n)'deki tepe konumunu analiz edin
      figure-protocol-7(2)
      NOT: A ile n = 1'de bir başlangıç ortalama tepe konumunu temsil edin. B ve C parametrelerini n'ye bağlı tepe konum kayması olarak ifade edin. D parametresini tekrarlama sönümleme faktörü E'nin bir genliği olarak yapın. Tepe konumunun dalgalanmasını n'nin bir fonksiyonu olarak göstermek için sinüs fonksiyonunu kullanın.
    3. (x, y) veri setini Origin yazılımına aktarın ve çizin.
    4. Analizin Doğrusal Olmayan Eğri Uydurma Fonksiyonu altında Denklem (2)'de verilen Özelleştirilmiş fonksiyonu oluşturun. İlk A, B, C, D ve E değerlerini yazın ve sığdırmayı tamamlamak için ÇALIŞTIR'a tıklayın.
  9. TEM görüntüleme
    1. Formvar kaplı bakır ızgaralı Aβ 1-40 kaplı 20 nm altın kolloidlerin TEM örneklerini yapın. Numuneleri 80 kV'da çalıştırılan bir TEM ile inceleyin.
    2. XR-40 model 4 megapiksel CCD dijital kamerada (AMT) 28.000x veya 71.000x nominal büyütmede görüntüler toplayın. N =1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 ve 10 (pH 4) ve n = 3, 5, 7 ve 9 (pH 10) işlem numaralarında Aβ 1-40 kaplamalı 20 nm altın için TEM görüntülerini toplayın.

3. Raman görüntüleme ve tersinir toplamanın araştırılması

  1. 100 μL çözeltiyi bir mika diske (1 cm çapında) n numaralı işlemde her numune için yerleştirin. Ölçümden önce numuneleri gece boyunca kurutun.
  2. Her işlem numarası n'de beyaz ışık görüntüleri toplayın. Her n numaralı işlem için pH sürekli olarak ~pH 4 ile ~pH 10 arasında değiştirildiği için ayrı numuneyi bir mika disk üzerinde hazırlayın (Şekil 3).
  3. ~200 cm-1 ile ~2.800 cm-1 arasındaki bölge için 500 ms/spektrum süresine sahip 100 ms/spektrumdan oluşan bir ızgarada 100 ×± 0,05 mW güçte ~0,43 μm uzamsal çözünürlüğe sahip 0,5 μm güçte λ = 633 nm dalga boyuna sahip bir lazerle her n işlem numarasında Raman görüntüsünü toplayın (Şekil 4).
  4. n'nin bir fonksiyonu olarak hizalanmış her n için temsili spektrumu çizin ve üç boyutlu SERS spektrumunu Aβ1-40 kaplı 20 nm altın için n'nin bir fonksiyonu olarak oluşturun (Şekil 5A). Belirli bir pH koşulu (yani, ~pH 4 ve ~pH 10) ile ilişkili spesifik modları çıkarmak için üç boyutlu SERS spektrumunun üstten görünümünü bir kontur haritası (Şekil 5B) olarak kullanın. Yalnızca nçift veya yalnızca ntek için geliştirilmiş herhangi bir spektral özelliği çıkarın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aβ 1-40'ın altın nano-kolloidal parçacıklar yüzeyine bağlanmasıyla, 530 nm absorpsiyon maksimumu etrafındaki SPR bandı, çözelti daha asidik hale getirildiğinde (pH 4) ~ 650 nm tepe konumuna önemli ölçüde kırmızıya kaymıştır.35. TEM görüntüleri ile birlikte, pH 4'te gözlemlenen spektroskopik özelliklerin, makul bir şekilde katlanmamış konformasyona sahip altın kolloid agregalarının oluşumuna karşılık geldiğini ve altın yüzey30 üzerinde adsorbe edilen çevredeki katlanmamış Aβ 1-40 monomerleri ile ağ oluşturduğunu belirledik. Aβ 1-40 monomerlerinin, bazik (pH 10) koşullar altında katlanmış konformasyona geri döndüğünü ve bunun da agregaların yarı tersinir bir şekilde deformasyonuna neden olduğunu gözlemledik. Bu yarı-tersinir süreç, daha kısa ve daha uzun bir dalga boyu arasında değişen ortalama bant tepesinin (figure-results-1(n)) değişiminden ve TEM görüntülerinde bazik (pH = 10) ve asidik (pH = 4) koşullar arasındaki dağınık ve agrega morfolojisinden belirgindi. Daha önce, Aβ 1-40 monomerinin bir kısmının, çözelti temel koşullara36 geri döndürüldükten sonra bile açılmamış kaldığı gözlemlenmişti. Video 1, Aβ 1-40 ve 20 nm çıplak altın kolloidin pH'a bağlı renk değişimini göstermektedir.

Bir karşılaştırma olarak, 20 nm çıplak altın kolloidin pH hop araştırması yapıldı (Şekil 5C ve D). PH değiştirme işlemi ilerledikçe, SPR bant shoft, TEM görüntüleri ve beyaz ışık görüntülerinde altın kolloidlerin kümelenmesinin büyümesini gösterdi. Oldukça ilginç bir şekilde, n tek ve nçifte bağlı olarak birkaç SERS spektral çizgisi vardı. Örneğin, nçiftinde (pH ~ 4), Aun (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)37 veya Au-Clligand38 modu ile ilişkili mod olarak atanan 275 cm-1'deki çizgi yoğun bir şekilde gözlendi. Öte yandan, n içinbile, 1008 cm'de 1-1 C-N str39 ve CH2 wag39, CH2 deformasyonu40, 1291 cm-1'de yoğun olarak gözlendi.

Beyaz ışık görüntüleme ile gözlemlenen net pH'a bağlı ve tersinir toplama morfolojisinin aksine, SERS spektrumundaki spektral özelliklerde ntek ve nçift arasında nispeten ince farklılıklar vardı. İlk yaklaşım olarak, 250 cm-1 ile 1750 cm-1 arasındaki bölgedeki spektral çizgi yoğunluğu, n tek için nçiftten daha yüksekti. Parmak izi bölgesindeki spektral çizgiler, 1250 cm-1 ve 1750 cm-1 (Amid I, II ve III bantları) ntuhaf için, daha az çözülmüş spektral özellikler gösterdi, bu da spektral yoğunluklarda bir genişleme veya artış anlamına geliyordu. Şekil 6'da, Şekil 5B'de (Şekil 6B) verilen bir izohips haritası, sırasıyla n tek ve nçiftteki vurguları temsil eden 761 cm-1 (kırmızı) ve 1395 cm-1 (mavi) SERS sinyalleri ile düzenlenmiştir (Şekil 6C). ntek ve nçift için temsili bir SERS spektrumu olarak, n = 7 (kırmızı) ve n = 4 (mavi) SERS spektrumu üstte gösterilmiştir (Şekil 6A). Aβ1-40 kaplamalı 20 nm altın için SPR bant kaymasına karşılık gelen değeri göstermek için Şekil 3'teki bant kayması grafiği yanda gösterilmiştir (Şekil 6D).

Gözlemlenen SERS spektrumunun tam ataması hakkında ön verilere sahip olsak da, burada birkaç dikkate değer Raman kayması özelliğine dikkat çekiyoruz. Nodd'da geliştirilmiş spektral çizgiler ve (makul atamalar) esas olarak 1000 cm-1'den daha düşük bölgededir: 394 cm-1 (Trp)41,42,43, 761 cm-1 (His, Ala)39,44,45,46,47, 875 cm-1 (indol NH yer değiştirmesi, Met'in CC gerilmesi)39, 974 cm-1 (Glu, C-COO- Asp'nin gerilmesi, sitrat ile ilişkili mod)39,48,49. N'de artan Raman kayması, parmak izi bölgesinde (Amid I, II ve III) önemli spektroskopik özellikler gösterdi: 1166 cm-1 (N-H+ Tyr deformasyonu)39,41, 1227 cm-1 (Ala-Pro-Gly, Amid III)39,50,51, 1395 cm-1 (COO- simetrik germe veya CH2- CH3- Glu'nun makaslanması)39,48, 1585 cm-1 (Phe'nin halka CC gerilmesi, karboksilat -Au'nun asimetrik gerilmesi, COO- sitratın gerilmesi, benzen halkasının deformasyonu)39,41,45,46,47,49,52, 1592 cm-1 (Phe, Tyr, Tyr'ın C=C gerilmesi, Phe'de halkanın CC gerilmesi, benzen halkasının gerilmesi ve COO- Phe ve Tyr'de gerilme ve OH'nin asimetrik gerilmesi)39,41,48,50,51 ve 1628 cm-1 (Moleküller arası β-tabaka yapıları için ayırt edici olan amid I alt tepe noktası 53, C=O ve paralel β-levha tipi yapılardan kaynaklanan protein omurgasının birleştirilmiş CN/NH titreşim modları, agrega Aβ54 birikimi, rastgele bobinler, β dönüşler, β saç tokaları48. ntek veya nçift için görünen diziler Şekil 7'de gösterilmiştir. Genel olarak, Aβ 1-40'ın tersinir agregasyonuna veya katlanmamış konformasyonuna karşılık gelen n için,benzen halkası içeren Phe/Tyr, COO-'nun simetrik gerilmesi, Glu'nun CH2- CH3- makaslama modu ve Tyr'nin -NH+ deformasyonu, peptitin konformasyonel değişiminde önemli ölçüde rol oynamıştır. Peptitler, nodd'da öne çıkan modlara karşılık gelen katlanmış konformasyonu benimsediğinde gözlemlenen agregasyonun sökülmesi sırasında, Glu, Asp, Met, His ve Ala'nın dahil olduğu ortaya çıktı.

figure-results-2
Şekil 1: pH'a bağlı absorbans ve morfoloji. Aβ 1-40 kaplamalı altın nanopartiküller (20 nm) için pH 4 (A) ve pH10 (B)'deki absorpsiyon spektrumu ve karşılık gelen TEM görüntüleri, agregasyon/dağılmış partiküllerin eskizleri ve şişelerdeki çözeltilerin resimleri gösterilmektedir. A, asidik koşullar altında Aβ 1-40 monomerlerinin katlanmamış konformasyonudur ve B, bazik koşullar altında katlanmış konformasyondur. Her konformasyon ve agregasyon/dağılma morfolojilerindeki Aβ 1-40 monomerlerinin diyagramları TEM görüntülerinin yanında gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 2: Nano boyuta bağlı kendi kendine montaj tersinirliği. Test edilen tüm altın kolloid parçacık boyutları için işlem numarasının bir fonksiyonu olarak SPR bandının figure-results-4ortalama tepe konumunun kayması, n. Şekil 1'de gösterilen agregaların yaklaşık pH değerleri ve karşılık gelen aşaması da verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 3: figure-results-6 ve her işlem numarasında TEM/beyaz ışık görüntüleri. İşlem figure-results-7 numarasının bir fonksiyonu olarak, n, Aβ 1-40 kaplı 20 nm altın (kapalı daireler) ve 20 nm altın kolloid (açık daireler) için birlikte çizildi ve temsili TEM (A ve C)/beyaz ışık görüntüleri (B ve D) ile gösterilir Aβ 1-40 kaplı 20 nm altın (A ve B) ve 20 nm altın kolloid (C için) seçilen işlem numaralarında (n = 1, 2, 3, 7 ve 8 kodu çözülmüş oklarla işaretlenmiştir) ve D). Siyah yazı tipi pH 7'yi, mavi yazı tipi pH 4'ü ve kırmızı yazı tipi pH 10'u gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 4: Temsili beyaz ışık ve Raman görüntüsü. (A) n = 2 ve (B) n = 3 için beyaz ışık görüntüsü, Raman görüntüsü ve SERS spektrumu; i) geniş bir görüş alanında beyaz ışık görüntüsü, ii) Raman görüntüsünün toplandığı alandaki beyaz ışık görüntüsü (i'de kırmızı bir kare ile etiketlenmiştir), iii) iki bileşenin birleştirildiği Raman görüntüsü, iv) bileşen 1'in Raman görüntüsü ve v) SERS spektrumu iv), vi) Bileşen 2'nin Raman görüntüsü, ve vii) SERS spektrumu vi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 5: ntek, nçift ve ntümü için SERS Spektrumunun kontur haritası. (A) Aβ1-40 için n'nin bir fonksiyonu olarak 250 cm-1 ve 1750 cm-1 bölgesindeki SERS spektrumunun üç boyutlu haritası, üstte (B)'de gösterilen bir kontur haritası ile kaplanmış 20 nm altın. (C) 250 cm-1 ve 1750 cm-1 bölgesindeki SERS spektrumunun üç boyutlu haritası, üstte (D) ile gösterilen bir kontur haritası ile 20 nm altın için n'nin bir fonksiyonu olarak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 6: SERS Spektrumunun izohips haritası. n'nin (1-10) bir fonksiyonu olarak SERS spektrumunun kontur haritası. (A) 1395 cm-1 (mavi) ve 761 cm-1 (kırmızı) emicilik. (B-D) Alt panel SERS spektrumunu gösterir ve sağ panel her n'de SERS sinyallerinin sinyal yoğunluğu değişiminin genliğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-11
Şekil 7: Aβ1-40'ın kayda değer dizileri. Ntekte (katlanmış konformasyon oluşumuna karşılık gelen) önemli katılıma sahip olmak üzere atanan diziler aşağı doğru kırmızı oklarla gösterilir ve nçiftte önemli katılıma sahip olmak üzere atananlar (katlanmamış konformasyonun oluşumuna karşılık gelir) mavi oklarla gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Aβ1-40 ve 20 nm çıplak altın kolloidin pH'a bağlı renk değişimi. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptit konformasyonu çalışmalarında kritik bir husus, numunelerin uygun olmayan şekilde saklanması durumunda bozulacağından numune bakımıdır. Peptit örnekleri liyofilize bir formda alındı ve -80 °C'de saklandıklarında bile damıtılmış deiyonize su ile rehidre edildikten sonra denatüre olmaya başladı. Altın kolloidlerin saflığı kalite kontrol analizi ile doğrulanmıştır. Kolloidlerin stabilitesini korumak için 4 °C'de saklandılar ve dondurulmadılar. Altın kolloid çözeltileri her deney için taze olarak hazırlandı, çünkü tuz tampon çözeltisi altın kolloidi kararsızlaştıracaktı. HCl ve NaOH çözeltileri her deney için taze olarak hazırlandı.

pH'ı 4 ile 10 arasında değiştirirken çözeltinin pH'ını hassas cihazlarla manuel olarak okumanın ve kaydetmenin teknik zorlukları, raporladığımız sonuçların hassasiyetini sınırlamaktadır. Bu nedenle, SERS sinyallerinin yoğunluğunda tutarlı sonuçlar gözlemlemedik. Bu büyük olasılıkla kontur grafiği için kullanılan genlikte hataya neden oldu. Nçift veya ntek ile ilişkili modları doğrulamak için gelecekteki çalışmalar, tek Tirozin veya Asparagin kalıntıları gibi proteinin konformasyonel değişiminde rol oynadığını bildirdiğimiz Aβ 1-40 dizisindeki amino asitlerin yerini alacak mutasyonları ortaya çıkarabilir.

"Aβ1-40 monomeri ile altın yüzey arasındaki etkileşim, dipol etkileşimi olarak kabul edilir ve hidrojen bağı seviyesi, H. Schmidbauer ve ark.55 tarafından yapılan çalışmada varsayılmıştır. Ayrı bir çalışmada, asidik koşul altında Aβ1-40 miktarının bir fonksiyonu olarak SERS spektroskopisini araştırdık, nano boyuta bağlı adsorpsiyon oluşumunu56 çıkardı. 20 nm altın için, histidinin (His) C=C veya -C-N bağının adsorpsiyonu başlattığı tahmin edildi; Bununla birlikte, 80 nm altın için, Fenilalanin (Phe) veya Tirozin (Tyr) içeren bir benzen halkası solunum modu, adsorpsiyonu başlatmak için altın yüzeye ulaştı. Aβ1-40'ın nötr veya bazik koşullarda (pH ~ 10) altın yüzey üzerinde adsorpsiyon işleminin, sulu durumda hiçbir çökelti oluşmadığı için Aβ1-40 kaplı altın kolloidin hidrofilik olmasını sağladığı düşünülmüştür. Bununla birlikte, çökeltiler pH 4'te gözlendi, bu da agregaların hidrofobik olduğunu ima etti.

TEM görüntüleri ve beyaz ışık görüntüleri, toplamanın kanıtını yalnızca dolaylı olarak gösterir. Tersinir agregasyonda gözlemlenen morfolojiyi ikincil yapılarla ilişkilendirmek için dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi yapmaya çalıştık. Bununla birlikte, saçılma taban çizgileri, tekrarlanabilir CD sinyalleri elde etmemizi engelledi. Bu nedenle, bunun yerine, Raman spektroskopisini kullandık ve ya agregasyon (Aβ1-40'ın katlanmamış konformasyonu) pH ~4 altında gerçekleştiğinde ya da deagregasyon (Aβ1-40'ın katlanmamış konformasyonu) pH ~10 altında gerçekleştiğinde geliştirilmiş modlara daha fazla odaklandık. Bu nedenle, bu çalışmada ikincil yapıyı tanımlamak için en iyi spekülasyon, ikincil yapılarla ilişkili düğümlerin izlenmesiyle sınırlıydı. Bu, özellikle pH 4 koşulu altında, 1628 cm-1'de β tabakasının gözlemlenmesinde gösterilmiştir.

Bu çalışma sadece 20 nm çapındaki altın kolloidler için peptit konformasyonundaki değişikliği gözlemledi ve sadece 10'a kadar n'yi araştırdı. Aβ 1-40 peptidinin konformasyon ve agregasyon özellikleri,56'ya adsorbe ettikleri partikülün boyutuna göre değiştirilebilir. Bu nedenle, monomerler ile adsorpsiyon yüzeyinin fiziksel özelliklerinden etkilenenler arasındaki ağa dayanan peptitlerin özelliklerini anlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Test ettiğimiz koşullar altında, sadece 20 nm çapındaki altın kolloidler, agregasyon morfolojisinin tersine çevrilebilirliğini sergiledi ve kolloid çapının bu özelliğin tersine çevrilebilirliğini nasıl etkilediğinin mekanizmaları bilinmemektedir. n'yi 20'ye kadar artırmak, toplama morfolojisinin tersine çevrilebilirliğinin moda bağlı derecesi hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir. Altın kolloidin boyutunun amiloid beta peptit agregasyonunu nasıl etkilediğine dair bu araştırmalar, Alzheimer Hastalığı patolojisinin moleküler mekanizmaları hakkında önemli bilgiler verecektir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışma ile açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.Y., NSF-MRI Grant #2117780 tarafından desteklenmektedir. Geneseo Vakfı bu projenin ilk aşamasını destekledi. A. I., SUNY Geneseo Kimya Bölümü Mezunları Yaz Araştırma Bursu'na ('19 Rhodes Ödülü ve '20 Lipkowitz Ödülü) ve Dreyfus Vakfı Lisans Yaz Araştırma Bursu'na destekleri için minnettardır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amiloid beta peptit 1-40 (A ve beta; 1– 40 peptit)r-Peptid (Bogart, GA, ABD)A-1156-2
CCD dijital kameraAMTXR-40 4 megapiksel CCD 
Milli-Q- su sisteminden damıtılmış deiyonize suMillipore Sigma (Burlington, MA, ABD)Milli-Q IQ 7000
Dondurucu -86 oCThermo ScientificRevco Chilly Willy  RLE Serisi Birim Kimliği 187004 Yapı Numarası 40.04
Altın Kolloid (10 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kaliforniya, ABD)15703-20
Altın Kolloid (100 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kaliforniya, ABD)15711-22
Altın Kolloid (15 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kaliforniya, ABD)15704-20
Altın Kolloid (20 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kaliforniya, ABD)15705-20
Altın Kolloid (30 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kaliforniya, ABD)15706-21
Altın Kolloid (40 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kaliforniya, ABD)15707-21
Altın Kolloid (50 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kaliforniya, ABD)15708-21
Altın Kolloid (60 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kaliforniya, ABD)15709-22
Altın Kolloid (80 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, California, ABD)15710-22
En Yüksek Sınıf V1AFM Mika Diskler 10 mmTed Pella Inc.# 50
Hidroklorik Asit Standart Çözelti, 1.0 NFlukaLot# SHBB4705V        318949-2L
Makro kuvars quvette Işık Yolu 10 mmAteş Böceği Bilimi Type1-MC-Path10mm
Mikro pH elektroduHORIBAModel 9618S (MFG No. 9Y8E0050)
Peak Fit ProgramıOrigin (Northampton, MA, ABD)OriginPro2018b (64 bit) b9.5.5.409 (Akademik)
pH 4.00 Tampon çözeltisi VWRCat No. 34170-127
pH 7.00 Tampon Çözeltisi Fisher ChemicalSB107-4 Lot 191041
pH metreHORIBAModel F-72G (MFG No. B27M0017)
Pipet Uçları   Maxi İpuçları 1– 5 mLFisher   02-707-467
Pipet Uçları 10 mLFisher02-717-135
Pipet Uçları 1000 mLFisher02-717-156
Pipet Uçları 1– 200 mLFisher02-717-143
Pipetleyici Fisher Marka Elit 0.5– 5 mLFisherQU05317
Pipetleyici Fisher Marka Elite 100– 1000 mLFisherQU01672
Pipetleyici Fisher Marka Elite 10– 100 mLFisherMU10985
Pipetleyici Fisher Marka Elite 1– 10 mLFisherMU08178
Sodyum Hidroksit Çözeltisi 1.0 MFlukaLot # 05096BPV    319511-2L
TEMFEI CoMorgagni model 268 
TempAssure PCR Tüpleri, Düz Kapaklar, Doğal ABD Bilimselpolipropilen. 0,2 mL ayrı ince duvarlı tüpler, takılı buzlu düz kapaklar
UV-Vis-NIR SpektrofotometreVarianCARY 5000 UV1106M074
WI Tec alpha300R Konfokal Raman MikroskobuWITec-Oxford InstrumentXMB3000-3001

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirschner, D. A., et al. Synthetic peptide homologous to beta protein from Alzheimer disease forms amyloid-like fibrils in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (19), 6953-6957 (1987).
  2. Lomakin, A., Chung, D. S., Benedek, G. B., Kirshner, D. A., Teplow, D. B. On the nucleation and growth of amyloid -protein fibrils: detection of nuclei and quantitation of rate constants. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1125-1129 (1996).
  3. Walsh, D. M., Lomakin, A., Benedek, G. B., Condron, M. M., Teplow, D. B. Amyloid -protein fibrillogenesis. J Biolog Chem. 272 (3), 22364-22372 (1997).
  4. Lambert, M. P., et al. nonfibrillar ligands derived from Ab1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6448-6453 (1998).
  5. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416 (6880), 507-511 (2002).
  6. Walsh, D. M., et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416 (6880), 535-539 (2002).
  7. Rocha, S., et al. Adsorption of amyloid beta-peptide at polymer surfaces: A neutron reflectivity study. ChemPhysChem. 6 (12), 2527-2534 (2005).
  8. Attanasio, F., et al. Carnosine inhibits Ab1-42 aggregation by perturbing the H-bond network in and around the central hydrophobic cluster. ChemBioChem. 14 (5), 583-592 (2013).
  9. Politi, J., Spadavecchia, J., Iodice, M., de Stefano, L. Oligopeptide-heavy metal interaction monitoring by hybrid gold nanoparticle based assay. Analyst. 140 (1), 149-155 (2015).
  10. Moshe, A., Landau, M., Eisenberg, D. Preparation of Crystalline samples of amyloid fibrils and oligomers. Methods Mol Biol. 1345, 201-210 (2016).
  11. Scarff, C. A., Ashcroft, A. E., Radford, S. E. Characterization of amyloid oligomers by electrospray ionization-ion mobility spectrometry-mass spectrometry (ESI-IMS-MS). Methods Mol Biol. 1345, 115-132 (2016).
  12. Sabaté, R., Gallardo, M., Estelrich, J. Temperature dependence of the nucleation constant rate in β amyloid fibrillogenesis. Int J Biol Macromol. 35 (1-2), 9-13 (2005).
  13. Niraula, T. N., et al. Pressure-dissociable reversible assembly of intrinsically denatured lysozyme is a precursor for amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (12), 4089-4093 (2004).
  14. Miller, A. E., et al. Behavior of β-Amyloid 1-16 at the air-water interface at varying pH by nonlinear spectroscopy and molecular dynamics simulations. J Phys Chem A. 115 (23), 5873-5880 (2011).
  15. Majzika, A., et al. Functionalization of gold nanoparticles with amino acid, -amyloid peptides and fragment. Colloids Surf B Biointerfaces. 81 (1), 235-241 (2010).
  16. Liu, L., et al. Electrochemical detectionof β-amyloid peptides on electrode covered with N-terminus-specific antibody based on electrocatalytic O2 reduction by Aβ(1-16)-heme-modified gold nanoparticles. Biosens Bioelectron. 49, 231-235 (2013).
  17. Elbassal, E. A., et al. Gold Nanoparticles as a Probe for Amyloid-β Oligomer and Amyloid Formation. J Phys Chem C Nanomater Interfaces. 121 (36), 20007-20015 (2017).
  18. Olmedo, I., et al. How changes in the sequence of the peptide CLPFFD-NH2 can modify the conjugation and stability of gold nanoparticles and their affinity for beta-amyloid fibrils. Bioconjug Chem. 19 (16), 1154-1163 (2008).
  19. Xu, Y., et al. Attenuation of the aggregation and neurotoxicity of amyloid peptides with neurotransmitter-functionalized ultra-small-sized gold nanoparticles. Eng Sci. 6, 53-63 (2019).
  20. John, T., Gladytz, A. K., Martin Clemens, L. L., Risselada, H. J., Abel, B. Impact of nanoparticles on amyloid peptide and protein aggregation: A review with a focus on gold nanoparticles. Nanoscale. 45, 20894-20913 (2018).
  21. Li, J., et al. Reduced aggregation and cytotoxicity of amyloid peptides by graphene oxide/gold nanocomposites prepared by pulsed laser ablation in water. Small. 10 (21), 4386-4394 (2014).
  22. Araya, E., et al. Gold nanoparticles and microwave irradiation Inhibit beta-amyloid amyloidogenesis. Nanoscale Res Lett. 3, 435(2008).
  23. Barrow, C. J., Yasuda, A., Kenny, P. T., Zagorski, M. G. Solution conformations and aggregational properties of synthetic amyloid beta-peptides of Alzheimer's disease. Analysis of circular dichroism spectra. J Mol Biol. 225 (4), 1075-1093 (1992).
  24. Wood, S. J., MacKenzie, L., Maleeff, B., Hurle, M. R., Wetzel, R. Selective inhibition of Ab fibril formation. J Biolog Chem. 271 (8), 4086-4092 (1996).
  25. Yokoyama, K. Nanoscale Surface Size Dependence in Protein Conjugation. Advances in Nanotechnology. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2010).
  26. Yokoyama, K. Nanoscale Protein Conjugation. Advances in Nanotechnology. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2010).
  27. Yokoyama, K. Modeling of Reversible Protein Conjugation on Nanoscale Surface in Computational Nanotechnology: Modeling and Applications with MATLAB. , CRC Press. Boca Raton. (2011).
  28. Yokoyama, K. Nano Size Dependent Properties of Colloidal Surfaces. Colloids: Classification, Properties and Applications. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2012).
  29. Yokoyama, K. Controlling Reversible Self-Assembly Path of Amyloid Beta Peptide over Gold Colloidal Nanoparticle's Surface. Nanoscale Spectroscopy with Applications. , CRC Press, Taylor and Francis Group, LLC. (2013).
  30. Yokoyama, K., et al. Nanoscale size dependence in the conjugation of amyloid beta and ovalbumin proteins on the surface of gold colloidal particles. Nanotechnology. 19, 375101(2008).
  31. Yokoyama, K., Welchons, D. R. The conjugation of amyloid beta protein on the gold colloidal nanoparticles' surfaces. Nanotechnology. 18, 105101(2007).
  32. Edelhoch, H. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry. 6 (7), 1948-1954 (1967).
  33. Yokoyama, K., et al. Examination of adsorption orientation of amyloidogenic peptides over nano-gold colloidal particles surfaces. Int J Mol Sci. 20 (21), 5354-5380 (2019).
  34. Yokoyama, K., Ichiki, A. Oligomerization and Adsorption Orientation of Amyloidogenic Peptides over Nano-Gold Colloidal Particle Surfaces. Advances in Chemistry Research. , NOVA Science Publishers. New York, NY. (2020).
  35. Fan, X., Zheng, W., Singh, D. J. Light scattering and surface plasmons on small spherical particles. Light Sci Appl. 3, e179(2014).
  36. Yokoyama, K., et al. Microscopic investigation of reversible nanoscale surface size dependent protein conjugation. Int J Mol Sci. 10 (5), 2348-2366 (2009).
  37. Vishwanathan, K. Symmetry of gold neutral clusters Au3-20 and normal modes of vibrations by using the numerical finite difference method with density-functional tight-binding (DFTB) approach. Arch Chem Res. 2 (1), 4(2017).
  38. Gao, P., Weaver, M. J. Metal-adsorbate vibrational frequencies as a probe of surface bonding: halides and pseudohalides at gold electrodes. J Phys Chem. 90, 4057-4063 (1986).
  39. Stewart, S., Fredericks, P. M. Surface-enhanced raman spectroscopy of peptides and proteins adsorbed on an electrochemically prepared silver surface. Spectrochim Acta AMol Biomol Spectrosc. 55 (7-8), 1615-1640 (1999).
  40. Palings, I., et al. Assignment of fingerprint vibrations in the resonance Raman spectra of rhodopsin, isorhodopsin, and bathorhodopsin: Implications for chromophore structure and environment. Biochem. 26 (9), 2544-2556 (1987).
  41. Szekeres, G. P., Kneipp, J. SERS probing of proteins in gold nanoparticle agglomerates. Front Chem. 7, 30(2019).
  42. Lin, V. J. C., Koenig, J. L. Raman studies of bovine serum albumin. Biopolymers. 15 (1), 203-218 (1976).
  43. Hornemann, A., Drescher, D., Flemig, S., Kneipp, J. Intracellular SERS hybrid probes using BSA-reporter conjugates. Anal Bioanal Chem. 405 (19), 6209-6222 (2013).
  44. Dong, J., et al. Metal binding and oxidation of amyloid-beta within isolated senile plaque cores: Raman microscopic evidence. Biochemistry. 42 (10), 2768-2773 (2003).
  45. Carey, P. R. Biochemical Applications of Raman and Resonance Raman Spectroscopies. , Academic Press. New York, NY. (1982).
  46. Harada, I., Takeuchi, H. Raman and Ultraviolet Resonance Raman Spectra of Proteins and Related Compounds. Spectroscopy of Biological Systems : Advances in Infrared and Raman Spectroscopy. , Wiley. Chichester, UK. (1986).
  47. Overman, S. A., Thomas, G. J. Jr Raman markers of nonaromatic side chains in an α-helix assembly: Ala, Asp, GGly, Ile, Leu, Lys, Ser, and Val residues of phage fd subunits. Biochemistry. 38 (13), 4018-4027 (1999).
  48. Talaga, D., et al. Total internal reflection tip-enhanced Raman spectroscopy of tau fibrils. J Phys Chem B. 126 (27), 5024-5032 (2022).
  49. Grys, D. -B., et al. Citrate coordination and bridging of gold nanoparticles: The role of gold adatoms in AuNP aging. ACS Nano. 14 (7), 8689-8696 (2020).
  50. Guo, T., et al. Full-scale label-free surface-enhanced Raman scattering analysis of mouse brain using a black phosphorus-based two-dimensional nanoprobe. Appl Sci. 9 (3), 398-408 (2019).
  51. Walther, M., Plochocka, P., Fischer, B., Helm, H., Uhd Jepsen, P. Collective vibrational modes in biological molecules investigated by Terahertz time-domain spectroscopy. Biopolymers. 67 (4-5), 310-313 (2002).
  52. Lochocki, B., et al. label-free fluorescence and Raman imaging of amyloid deposits in snap-frozen Alzheimer's disease human brain tissue. Commun Biol. 4 (1), 474-486 (2021).
  53. Palombo, F., et al. Detection of Aβ plaque-associated astrogliosis in Alzheimer's disease brain by spectroscopic imaging and immunohistochemistry. Analyst. 143 (4), 850-857 (2018).
  54. Khoury, Y. E., et al. Raman imaging reveals accumulation of hemoproteins in plaques from Alzheimer's diseased tissues. ACS Chem Neurosci. 12 (15), 2940-2945 (2021).
  55. Schmidbaur, H., Raubenheimer, H. G., Dobrzańska, L. The gold-hydrogen bond, Au-H, and the hydrogen bond to gold Au∙∙∙H-X. Chem Soc Rev. 43 (1), 345-380 (2014).
  56. Yokoyama, K., et al. Protein corona formation and aggregation process of amyloid beta 1-40 coated gold nano-colloids. Langmuir. 40 (3), 1728-1746 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Amyloid Beta 1 40Gold ColloidsReversible AggregationPH Dependent Self AssemblySurface Plasmon ResonanceTransmission Electron MicroscopySurface Enhanced Raman SpectroscopyProtein FoldingColloidal AggregationPeptide Conformation

İlgili makaleler