Yöntem makalesi

Karasal Amfibilerin Derisinden Bakteri Suşlarının İzolasyonu ve Tanımlanması

DOI:

10.3791/67862

⸱

17 Haziran 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu, Avrupa plethodontid semenderlerinin (Speleomantes cinsi) kutanöz mikrobiyotasından kültürlenebilir bakterilerin örneklenmesi ve izole edilmesi için bir yöntemdir. Burada, semender derisinden sürüntülerle numune almak ve bunları kültürlenebilir yaklaşımlar kullanarak işlemek için bir protokol sunuyoruz. Bakteri suş karakterizasyonu ile numune almayı, izolasyonu ve aksenik kültürün kurulmasını tarif ediyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiyota, yüksek organizmaların hayati bir unsurudur ve kutanöz mikrobiyota, organizmanın dış etkenlere karşı savunmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Mikrobiyal kültürleme yaklaşımı için Speleomantes (Amphibia: Plethodontidae) cilt mikrobiyal topluluklarını örneklemek için standart bir yöntem yoktur. Bunu ele almak için, bakterileri bireylerin derisinden izole etmek için pratik bir protokol ve numunelerin işlenmesi ve saklanması için en iyi uygulama geliştirdik. Adımlar basittir: swablar, numune alındıktan sonra gliserol ile takviye edilmiş fizyolojik bir tuzlu su çözeltisi içinde saklanır. Laboratuvara aktarıldıktan sonra, mikrobiyal topluluğun bütünlüğünü sağlamak için swablar +4 °C'de en fazla 10 gün saklanabilir. Bu çalışma, Speleomantes cinsine ait olanlar gibi karasal amfibi türlerinin kutanöz mikrobiyota araştırmasına ilişkin ilginç bilgiler sunmaktadır. Bu yaklaşım, nesli tükenmekte olan türler için önlemlerin uygulanmasına, izlenmesine ve korunmasına katkıda bulunur ve mikrobiyotanın amfibilerin sağlığı ve ekolojisindeki işlevi hakkındaki bilgileri geliştirebilir. Bu protokol aynı zamanda birçok yaban hayatı koruma senaryosunda mikrobiyom araştırmaları için daha geniş bir öneme sahip olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm organizmalar epitel yüzeylerinde, dokularında ve organlarında çeşitli mikrobiyal simbiyontlar barındırır1. Deri, konakçı ile çevresi arasındaki birincil arayüzdür ve çeşitli mikroorganizmalar için bir yaşam alanı sağlar2. Deri, omurgalıların en büyük organıdır ve mekanik, kimyasal ve mikrobiyal saldırılara karşı bir bariyer görevi görür3. Bununla birlikte, cildin çevresel koşullara bu kadar geniş bir şekilde maruz kalması, muhtemelen onu organizmanın dış biyotik ve abiyotik faktörlerle etkileşimine aracılık eden en kritik ekolojik sınır haline getirmektedir4.

Amfibilerin cilt mikrobiyotası son on yılda yoğun bir şekilde incelenmiş ve bu mikrobiyal topluluk ile konakçısı arasındaki ilişki derinlemesine araştırılmıştır 5,6,7,8,9,10. Deri mikrobiyotasının biyolojik çeşitliliği büyük ölçüde konakçının türü (yani türe özgü topluluk) tarafından belirlenir, ancak daha fazla çevresel faktör daha yüksek türler arası çeşitliliği teşvik edebilir11. Amfibilerin deri mikrobiyotası, diğer hayvanlardan farklı bir bileşime sahiptir. Amfibilerin deri mikropları ile karşılıklı bir ilişkiye sahip oldukları, antimikrobiyal bileşikleri biyosentezleyebildikleri veya konakçılarını ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklara karşı koruyabildikleri bilinmektedir12.

Bakterilerin deriden izolasyonuna genellikle farklı adımlar tamamlandıktan sonra ulaşılır. İlk adım, sürüntü alarak ve harici kontaminasyondan kaçınarak temsili bir numune toplamayı içerir. Mikrobiyal numuneler steril tuzlu su veya tampon içinde süspanse edilir. Süspansiyon sıvılarının koruyucularla (örn., gliserol) takviyesi, laboratuvar transferi sırasında bakteri topluluğu bütünlüğünü iyileştirebilir13,14. Laboratuvara aktarıldıktan sonra, mikrobiyal topluluk bütünlüğünü korumak için numuneler hemen veya kısa bir süre sonra işlenebilir. Klasik mikrobiyal yaklaşım, mikrobiyal yoğunluğu azaltmak ve Petri plakaları üzerinde daha iyi koloni ayrımı sağlamak için seri seyreltme yoluyla numune işlemeyi içerir. Numune ve seri seyreltmeler daha sonra agar Luria-Bertani (LBA)15, Triptik Soya (TSA)16, Tripon Maya özütü Agar (TYEA)17,18,19 veya Besin (NA)20 gibi spesifik olmayan, seçici olmayan ortamlara sürülür ve bu da çok çeşitli bakterilerin büyümesini destekler. Numune alma ve işleme sırasında seçici olmayan zenginleştirmeler kullanılır, çünkü çok çeşitli mikropların kültürlenmesi gerekir. Çizgi veya yayılmış plaka yöntemleri, mikrobiyal süspansiyonu agar yüzeyine eşit olarak dağıtır21. Eşit dağılım, numunede bulunan farklı mikrobiyal türlerin farklı koloniler oluşturmasına izin verir. 20-37 ° C'de 2-7 gün inkübe edildikten sonra, mikrobiyal koloniler morfolojiye göre sayılır ve ayırt edilir. Bakteri kolonisinin morfolojik karakterizasyonu pigmentasyon, form, yükseklik, kenar, opaklık ve yüzey temelinde gerçekleştirildi. En yüksek seyreltmelerde iyi izole edilmiş koloniler, mikrobiyal kültürleri saflaştırmak için taze agar plakalarına alt kültürlenir. Kolonilerin saflığı, hücre homojenliğine ve Gram boyama için afiniteye dayalı olarak sağlanır. Kolonilerin saflığını kontrol etmek için çeşitli biyokimyasal veya moleküler testler de yapılabilir22. İzole edilmiş suşların saf kültürleri, kısa süreli kullanım için 4 ° C'de agar eğimlerinde saklanabilir veya kriyoprotektanlarda -80 ° C'de uzun süreli olarak korunabilir (ör., 20:80 veya 50:50'lik bir gliserol-orta oranı)23.

Bu protokolde, hem yüzey hem de yeraltı ortamlarında yaşayabilen, kesinlikle karasal amfibiler olan Speleomantes mağara semenderlerinin deri mikrobiyotasından bakterileri izole etmek için en iyi uygulama yaklaşımını rapor ediyoruz24. Literatürde evrensel olarak uygulanan protokollerin eksikliği göz önüne alındığında, bu çalışma, bu karasal amfibilerden alınan kutanöz mikrobiyota örneklerini örneklemek ve korumak için en iyi uygulamayı geliştirmeyi amaçlamıştır. Bu protokolü test etmek için, İtalyan mağara semenderini (Speleomantes italicus) model olarak kullandık ve Abruzzo'da (İtalya) bulunan bir mağara popülasyonundan 12 bireyi örnekledik. Bireyler elle toplandı ve sırt, ventral tarafları ve yanlarından tekrar tekrar (en az 5 kez) sürüntü alındı. Kullanılan swablar steril damıtılmış suya batırıldı. Swablar daha sonra gliserol takviyesi olan ve olmayan fizyolojik% 0.9 salin çözeltisine daldırıldı. Laboratuvara aktarıldıktan sonra, numunenin korunması çeşitli koşullar altında test edildi: kontrolsüz oda sıcaklığı, 4 °C ve 10 gün boyunca -20 °C. Kültürlenebilir mikrobiyal topluluklar, jenerik ve yarı seçici ortamlar (LBA, TSYEA, TSA, NA) üzerinde kültür tabanlı yöntemler kullanılarak karşılaştırıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bakteri suşlarını izole etmek için mikrobiyolojik kültüre uygun bir yaklaşım için Speleomantes deri örneklerinin alınması ve işlenmesi için en iyi uygulamaları sunar. Aşağıdaki adımlarda yararlı olan malzeme, Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Protokol, İtalya Çevre Bakanlığı'nın (22/04/2024 tarihli PNM 74554) izni üzerine DPR 357/97'nin 11. maddesinde yer alan hayvan bakımı yönergelerini takip eder.

1. Medya hazırlığı

  1. Toz içerik miktarını hesaplayın ve tartın (LBA, TSYEA, TSA, NA veya diğer ortamlar için kullanılan toz miktarı için üreticinin talimatlarına bakın).
  2. Malzemeleri damıtılmış suda çözmek için üreticinin talimatlarını izleyin. Ortama ve satın alınan ürüne bağlı olarak kaynatma adımları gerekebilir.
  3. Malzemeler tamamen çözüldüğünde ortamı son hacme getirin ve pH'ı kontrol edin. Değer beklenenden daha yüksek veya daha düşükse, üreticinin talimatlarında önerilen çözümleri kullanarak ayarlayın. HCl ve NaOH çözeltileri, sırasıyla pH'ı azaltmak ve artırmak için yaygın olarak kullanılır.
  4. Agar ekleyin (a/h% 2), 95 ° C'ye kadar ısıtın ve otoklavasyondan önce agarı çözmek için yaklaşık 1 dakika kaynatın.
  5. Üreticinin talimatlarını izleyerek ortamı otoklavlayarak sterilize edin. Yaygın otoklavlama işlemleri, 15-30 dakikalık tedavi için 121-134 °C'yi içerir.
  6. Otoklavlamadan sonra, agar ortamını yaklaşık 45-50 ° C'ye soğutun ve önceden sterilize edilmiş bir laminer akış başlığı altında steril Petri kaplarına dökün
  7. Katılaşmadan sonra, plakaları ortam türüne ve hazırlama tarihine göre etiketleyin.

2. Örnek toplama

  1. Geçici mikrobiyal toplulukları uzaklaştırmak için semenderin derisini (Speleomantes cinsi) steril damıtılmış suda durulayın.
  2. Bir test tüpünde steril pamuklu uçlu bezler kullanarak amfibilerden deri çubukları toplayın. Kişiye zarar vermeden mikrobiyal örnekleri toplamak için swabları cilt yüzeyine nazikçe sürün.
    1. Bireyleri örneklemek için tüm ekstremiteler de dahil olmak üzere tüm vücudun her iki tarafında steril damıtılmış suya batırılmış bir çubukla beş kez (beş ileri geri vuruş) geçirin.
      NOT: Bireylere zarar verebileceği için katkı maddeleri takviyesi yapılması önerilmez.
    2. Swabları, gliserol (% 20) ile takviye edilmiş fizyolojik salin çözeltisi (% 0.9 NaCl) içeren tüplere yerleştirin.
  3. Numuneyi çözelti ile karıştırın, tüpü sıkarken swabı tüp duvarlarına doğru itin ve swabı iyice döndürün (saat yönünde 10 kez ve saat yönünün tersine 10 kez).
  4. Karıştırdıktan sonra, swabı tüpün içine kapatın ve mikrobiyolojik numuneleri laboratuvara aktarın, numuneyi mikrobiyal analize kadar 4 °C'de tutun.
    NOT: Kontaminasyonu ve operatörün biyolojik ve kimyasal kirleticilere maruz kalmasını önlemek için tüm adımlar her birey için yeni steril malzeme ve eldivenler kullanılarak gerçekleştirilir.

3. Aşılama ve Kuluçka

  1. İşlemeden önce mikrobiyolojik numuneyi iyice karıştırın.
  2. Kutanöz numunenin 10-1 ila 10-6 arasında değişen tuzlu su çözeltisi (% 0.9 NaCl) ile seri dilüsyonlarını hazırlayın.
  3. 100 μL olduğu gibi numune ve seri seyreltmeleri hazırlanan agar plakalarına aşılayın. Steril L şeklinde bir halka kullanarak, numuneyi agar ortamının yüzeyi boyunca çizgi halinde çekin ve agara zarar vermemek için aşırı basınç uygulamadan eşit şekilde dağıtın.
  4. Aşılanmış plakaları 3-5 gün boyunca 20-25 ° C'de bir inkübatörde ters çevirin. Bu sıcaklık aralığı, amfibi derisinde yaşayan birçok çevresel mezofilik ve psikotropik bakterinin yetiştirilmesi için uygundur.
    NOT: Tüm adımlar, önceden sterilize edilmiş bir laminer başlık altında steril malzeme kullanılarak gerçekleştirilir. Her deney ünitesi için beş bağımsız kopya hazırlanır. Başlangıç yoğunluğu bilinmediğinden ve tahmin edilemez olduğundan, geniş bir seyreltme yelpazesinin dahil edilmesi her zaman yardımcı olur.

4. Gerinim saflaştırma ve tanımlama

  1. İnkübasyondan sonra daha fazla analiz için farklı morfolojilere sahip bakteri kolonilerini seçin.
    1. İlk olarak, kontaminasyonu veya örtüşmeyi önlemek için iyi izole edilmiş kolonileri seçin ve kolonilerin birleşebileceği kalabalık alanlardan kaçının. Ayrıca, potansiyel olarak farklı türlerin veya suşların örneklenmesini sağlamak için farklı görünümlere (örn. renk, boyut, şekil, kenar, yüzey veya doku) sahip koloniler seçin.
      NOT: Bu adım, cilt mikrobiyotasının farklı yetiştirilebilir bakteri suşlarını seçmek için çok önemlidir.
  2. Seçilen kolonileri alt kültüre alın.
    1. Orijinal agar plakasının iyi izole edilmiş bir kolonisini aseptik olarak bir aşılama halkası kullanarak taze bir agar plakasına aktarın. Koloniyi izole etmek için çizgileyin ve ardından uygun şekilde kuluçkaya yatırın.
    2. İzole edilen koloniler benzer görünene kadar her bakteri izolatından saf kültürler elde etmek için bu adımı taze agar plakaları üzerinde birkaç kez tekrarlayın. Seçici ve genel ortam kullanarak alt kültürlemeyi tekrarlayın.
      NOT: Aseptik kullanım, görsel ve mikroskobik inceleme ve moleküler tanımlamanın birleştirilmesi, kontaminasyonsuz suş sağlar.
  3. Mikrobiyal kültürlerin saflığını mikroskobik gözlemler (5x ila 100x objektif), Gram boyama afinitesi (koloni sabitleme, renklendirme ve gözlem) ve biyokimyasal testler (örn. katalaz, oksidaz, üreaz ve şeker fermantasyon testi) ile kontrol edin21,25.
    NOT: Saf kültürler, tek tip koloni morfolojisi, tutarlı mikroskobik özellikler ve biyokimyasal özellikler göstermelidir.
  4. Moleküler tanımlama yapın.
    1. Saflaştırılmış bakteri kolonilerinden DNA'yı çıkarın ve bakteri türlerini tanımlamak için 16S rRNA gen dizilimi gerçekleştirin. Bakteriyel evrensel primerleri kullanarak 16S rRNA geninin PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin, ardından dizileme ve GenBank26 gibi veritabanlarındaki bilinen dizilerle karşılaştırın.
  5. Biyobanka kültürleri oluşturun.
    1. Aksenik (veya saf) kültürleri, seçici olmayan bir ortama aşılayarak ve kirleticilerin büyümesinin olup olmadığını kontrol ederek sterilite açısından test edin. Aksenik kültürleri orta ve uzun süreli kullanım için saklayın.
      NOT: Standart yöntemler, seçici ortam ve oda sıcaklığında depolamanın agar eğimleri üzerinde kolonilerin çizgilenmesini, kültürün seçici ortam ve gliserol (20:80 veya 50:50) karışımı ile hazırlanan stok çözeltilerinde askıya alınmasını veya et suyu kültürü liyofilizasyonunu (dondurarak kurutma) ve -80 °C'de dondurmayı içerir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel yaklaşımın iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Amfibi deri örneklerinin örneklenmesi, işlenmesi ve işlenmesinin iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen bu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amfibi deri mikrobiyotasından kültüre edilebilir bakteri topluluğu elde etmek için en iyi uygulama protokolünü geliştirdik ve bunu Speleomantes italicus üzerinde gösterdik. Yukarıdaki uygulamada gösterildiği gibi, amfibi derisinden başarılı bir mikrobiyal izolasyon sağlamak için birkaç adım atılmalıdır. Nazik bir sürüntü tekniği ve steril malzemeler kullanılarak yapılan toplama, yeterli mikrobiyal materyalin toplanması ve kontaminasyonun önlenmesi için çok önemlidir. 4 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avrupa Biyoçeşitlilik Ortaklığı Biodiversa+ tarafından "Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ: Nesli tükenmekte olan Avrupa mağara semenderlerinin ekotoksikolojisi" ve "Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35" projeleri kapsamında L'Aquila Üniversitesi'nden mali destek alıyoruz. 2022–2023 BiodivMon ortak çağrısı ve Ulusal Toparlanma ve Dayanıklılık Planı (NRRP), Misyon 4, Bileşen 2, Yatırım 1.1, İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı (MUR) tarafından 14.9.2022 tarihinde yayınlanan 1409 sayılı ihale çağrısı, Avrupa Birliği tarafından finanse edildi - NextGenerationEU- Proje Kodu: P2022CYF9L, Proje Adı Fakültatif mağara türleri metal kirleticilerin yeraltı ortamlarına itici güçleri midir? (METAL MAĞARASI) - FINCAN E53D23015380001.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lauria-Bertani agarMerk MilliporeL3027
Triptik Soya AgarMerk Millipore22091
Tripton Soya Mayası özü AgarMerk Millipore17221
Besin AgarMerk Millipore70148
Gliserol çözeltisiMerk Millipore49781

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Belkaid, Y., Tamoutounour, S. The influence of skin microorganisms on cutaneous immunity. Nat Rev Immunol. 16 (6), 353-366 (2016).
  3. Kligman, A. M. What is the 'true' function of skin. Exp Dermatol. 11 (2), 159-187 (2002).
  4. Ross, A. A., Rodrigues Hoffmann, A., Neufeld, J. D. The skin microbiome of vertebrates. Microbiome. 7 (1), 79(2019).
  5. Kueneman, J. G., et al. Community richness of amphibian skin bacteria correlates with bioclimate at the global scale. Nat Ecol Evol. 3 (3), 381-389 (2019).
  6. Rebollar, E. A., MartínezUgalde, E., Orta, A. H. The amphibian skin microbiome and its protective role against chytridiomycosis. Herpetologica. 76 (2), 167(2020).
  7. Wuerthner, V. P., HernándezGómez, O., Hua, J. Amphibian skin microbiota response to variable housing conditions and experimental treatment across space and time. J Herpetol. 53 (4), 324(2019).
  8. HernándezGómez, O., Wuerthner, V., Hua, J. Amphibian host and skin microbiota response to a common agricultural antimicrobial and internal parasite. Microb Ecol. 79 (1), 175-191 (2020).
  9. SotoCortés, E., et al. Host species and environment shape the skin microbiota of Mexican axolotls. Microb Ecol. 87 (1), 98(2024).
  10. Cramp, R. L., McPhee, R. K., Meyer, E. A., Ohmer, M. E., Franklin, C. E. First line of defence: the role of sloughing in the regulation of cutaneous microbes in frogs. Conserv Physiol. 2 (1), cou012-cou012 (2014).
  11. Colston, T. J., Jackson, C. R. Microbiome evolution along divergent branches of the vertebrate tree of life: what is known and unknown. Mol Ecol. 25 (16), 3776-3800 (2016).
  12. Rebollar, E. A., et al. The skin microbiome of the neotropical frog Craugastor fitzingeri: inferring potential bacterialhostpathogen interactions from metagenomic data. Front Microbiol. 9, 466(2018).
  13. Li, X., Ricke, S. C. Comparison of cryoprotectants for Escherichia coli lysine bioavailability assay culture. J Food Process Preserv. 28 (1), 39-50 (2004).
  14. Patra, J. K., Das, G., Das, S. K., Thatoi, H. Isolation, Culture, and Biochemical Characterization of Microbes. In A Practical Guide to Environmental Biotechnology. , Springer. Singapore. (2020).
  15. Bertani, G. Studies on lysogenesis i. J Bacteriol. 62 (3), 293-300 (1951).
  16. Forbes, B. A., Sahm, D. F., Weissfeld, A. S. Diagnostic Microbiology. , Mosby. St Louis. (2007).
  17. O'Reilly, T., Niven, D. F. Tryptoneyeast extract broth as a culture medium for Haemophilus pleuropneumoniae and Haemophilus parasuis to be used as challenge inocula. Can J Vet Res. 50 (3), 441(1986).
  18. O'Reilly, T., Rosendal, S., Niven, D. F. Porcine haemophili and actinobacilli: characterization by means of API test strips and possible taxonomic implications. Can J Microbiol. 30 (10), 1229-1238 (1984).
  19. Niven, D. F. The cytochrome complement of Haemophilus parasuis. Can J Microbiol. 30 (6), 763-773 (1984).
  20. Lapage, S., Shelton, J. E., Mitchell, T. Methods in Microbiology. , Academic Press. London. (1970).
  21. Smibert, R. M. General Characterization. Manual of Methods for General Bacteriology. , American Society for Microbiology. Washington, DC. (1981).
  22. Sharma, N., Sharma, N., Sharma, S., Sharma, P., Devi, B. Identification, Morphological, Biochemical, and Genetic Characterization of Microorganisms. Basic Biotechniques for Bioprocess and Bioentrepreneurship. , Elsevier, Academic Press. (2023).
  23. Hubálek, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology. 46 (3), 205-229 (2003).
  24. Lanza, B., Pastorelli, C., Laghi, P., Cimmaruta, R. A review of systematics, taxonomy, genetics, biogeography and natural history of the genus Speleomantes Dubois, 1984 (amphibia caudata plethodontidae). Atti Museo Civ St Natl, Trieste. 52, 5-135 (1984).
  25. Cappuccino, J. G., Welsh, C. T. Microbiology: A Laboratory Manual, Global Edition. , Pearson Education Limited: Pearson. Essex, England. (2017).
  26. Farda, B., et al. The "Infernaccio" gorges: microbial diversity of black deposits and isolation of manganesesolubilizing bacteria. Biology (Basel). 11 (8), 1204(2022).
  27. Lunghi, E., et al. Thermal equilibrium and temperature differences among body regions in European plethodontid salamanders. J Therm Biol. 60, 79-85 (2016).
  28. Woodhams, D. C., et al. Hostassociated microbiomes are predicted by immune system complexity and climate. Genome Biol. 21 (1), 23(2020).
  29. Stolp, H., Starr, M. P. Principles of Isolation, Cultivation, and Conservation of Bacteria. The Prokaryotes. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1981).
  30. El Baz, S., et al. Resistance to and accumulation of heavy metals by actinobacteria isolated from abandoned mining areas. Sci World J. 2015 (1), 761834(2015).
  31. Le Pioufle, O., Declerck, S. Reducing water availability impacts the development of the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis MUCL 41833 and its ability to take up and transport phosphorus under in vitro conditions. Front Microbiol. 9, 1254(2018).
  32. Freitas, F., Alves, V. D., Reis, M. A. M. Advances in bacterial exopolysaccharides: from production to biotechnological applications. Trends Biotechnol. 29 (8), 388-398 (2011).
  33. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  34. De Paoli, P. Biobanking in microbiology: from sample collection to epidemiology, diagnosis and research. FEMS Microbiol Rev. 29 (5), 897-910 (2005).
  35. Dal Pizzol, M., et al. Antifungal efficacy and safety of cycloheximide as a supplement in OptisolGS. Drug Des Devel Ther. 15, 2091-2098 (2021).
  36. Overmann, J. Principles of Enrichment, Isolation, Cultivation, and Preservation of Prokaryotes. The Prokaryotes. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).
  37. Madhuri, R. J., et al. Recent Approaches in the Production of Novel Enzymes from Environmental Samples by Enrichment Culture and Metagenomic Approach. Recent Developments in Applied Microbiology and Biochemistry. , Elsevier, Academic Press. (2019).
  38. BaichmanKass, A., Song, T., Friedman, J. Competitive interactions between culturable bacteria are highly nonadditive. Elife. 12, e83398(2023).
  39. Cevallos, M. A., et al. Genomic characterization of antifungal Acinetobacter bacteria isolated from the skin of the frogs Agalychnis callidryas and Craugastor fitzingeri. FEMS Microbiol Ecol. 98 (12), fiac126(2022).
  40. Lauer, A., Simon, M. A., Banning, J. L., Lam, B. A., Harris, R. N. Diversity of cutaneous bacteria with antifungal activity isolated from female fourtoed salamanders. ISME J. 2 (2), 145-157 (2008).
  41. Niederle, M. V., et al. Skinassociated lactic acid bacteria from North American bullfrogs as potential control agents of Batrachochytrium dendrobatidis. PLoS One. 14 (9), e0223020(2019).
  42. MuletzWolz, C. R., et al. Antifungal bacteria on woodland salamander skin exhibit high taxonomic diversity and geographic variability. Appl Environ Microbiol. 83 (9), e00186-e00217 (2017).
  43. Woodhams, D. C., et al. Antifungal isolates database of amphibian skin-associated bacteria and function against emerging fungal pathogens. Ecology. 96 (2), 595-595 (2015).
  44. Woodhams, D. C., et al. Interacting symbionts and immunity in the amphibian skin mucosome predict disease risk and probiotic effectiveness. PLoS One. 9 (4), e96375(2014).
  45. Pessier, A. P. An overview of amphibian skin disease. Sem Avian Exot Pet Med. 11 (3), 162-174 (2002).
  46. HernándezGómez, O., Hua, J. From the organismal to biosphere levels: environmental impacts on the amphibian microbiota. FEMS Microbiol Rev. 47 (1), fuad002(2023).
  47. Stevens, E. J., Bates, K. A., King, K. C. Host microbiota can facilitate pathogen infection. PLoS Pathog. 17 (5), e1009514(2021).
  48. Kostanjšek, R., Prodan, Y., Stres, B., Trontelj, P. Composition of the cutaneous bacterial community of a cave amphibian, Proteus anguinus. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz007(2019).
  49. Indriani, S., Karnjanapratum, S., Nirmal, N. P., Nalinanon, S. Amphibian skin and skin secretion: an exotic source of bioactive peptides and its application. Foods. 12 (6), 1282(2023).
  50. Gao, Y., et al. Targeted modification of a novel amphibian antimicrobial peptide from Phyllomedusa tarsius to enhance its activity against MRSA and microbial biofilm. Front Microbiol. 8, 628(2017).
  51. Wang, Y., Zhang, Y., Lee, W., Yang, X., Zhang, Y. Novel peptides from skins of amphibians showed broad-spectrum antimicrobial activities. Chem Biol Drug Des. 87 (3), 419-424 (2016).
  52. Barra, D., Simmaco, M. Amphibian skin: a promising resource for antimicrobial peptides. Trends Biotechnol. 13 (6), 205-209 (1995).
  53. RollinsSmith, L. A. The importance of antimicrobial peptides (AMPs) in amphibian skin defense. Dev Comp Immunol. 142, 104657(2023).
  54. RomeroContreras, Y. J., et al. Bacteria from the skin of amphibians promote growth of Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum by modifying hormonerelated transcriptome response. Plant Mol Biol. 114 (3), 39(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Amfibi Deri MikrobiyotasBakteri zolasyonuMikrobiyal Kom niteSeri Dil syonPetri KaplarSalin Gliserol SaklamaKoloni MorfolojisiMezofilik BakterilerMikrobiyal Canl l kYaban Hayat Mikrobiyomu

İlgili makaleler