Yöntem makalesi

Trombosit Alt Popülasyonlarının Çok Renkli Akış Sitometrisi ile Analiz Edilmesi

DOI:

10.3791/67878

⸱

10 Haziran 2025

 ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology, University Hospital Tübingen, University of Tübingen

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombositler için çok renkli akış sitometrisi, klasik trombosit alt popülasyonları içinde istirahat, agregatör, prokoagülan ve apoptotik trombositler gibi yeni trombosit alt tiplerini tanımlayabilir. Bu, çeşitli trombosit agonistleri tarafından indüklenen farklı alt popülasyon modellerinin karşılaştırılmasına izin verir. Burada, çok renkli bir akış sitometrisi paneli oluşturmak için bir prosedür ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombositler veya trombositler, hemostaz ve trombozda çok önemli bir rol oynayan küçük anükleasyonlu kan hücreleridir. Trombosit fonksiyonlarındaki bozukluklar, kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda kanama veya trombotik olaylara neden olabilir. Bu nedenle, trombosit fonksiyonuna trombosit alt popülasyonları atayabilmek için trombositleri fenotipik olarak karakterize etmek önemlidir. İnsan trombositlerinin trombosit agonistleri ve aktivatörleri ile uyarılması, yüzey reseptörü popülasyonundaki değişikliklerle birlikte trombositlerde morfolojik ve fizyolojik değişikliklere neden olur. Bu, fonksiyonel olarak farklı trombosit alt popülasyonlarına yol açar. Klasik olarak tanımlanan trombosit alt popülasyonları istirahat, agregatör, prokoagülan ve apoptotik trombositlerdir. Agonistlerin trombosit alt tipleri üzerindeki etkisini karakterize etmek için, 10 farklı antikor ve boyadan (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-IntegrinαIIbβ3 (klon: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Annexin V, Zombie NIR) oluşan çok renkli akış sitometrisi kullanan bir test oluşturduk. İzole edilmiş insan trombositleri, trombosit agonistleri ile inkübe edildi ve spesifik florofor konjuge antikorlar ve boyalarla boyandı. Daha sonra akım sitometrisi ile ölçüldüler. Bu, klasik dört alt popülasyon içinde agonistlere özgü alt tipleri tanımlamamıza izin verir. Sonuç olarak, bu yazıda açıklanan 10 renkli akış sitometrisi panelini oluşturan aktivasyon belirteçleri (anti-CD62P, anti-CD63, anti-IntegrinαIIbβ3 (klon: PAC-1)), inflamatuar belirteçler (anti-CXCR4, anti-ACKR3) ve apoptotik belirteçlerin (Annexin V, Zombie NIR) kombinasyonu, spesifik trombosit fonksiyonuna bağlanabilecek başka trombosit alt tiplerini tanımlama olasılığını açar. Bu yöntem, trombosit fonksiyonu ve fizyolojisi ile ilgili temel araştırmalarda uygulanabildiği gibi, hastalık modellerinde ve hasta çalışmalarında yeni trombosit alt tiplerinin tanımlanmasında da uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombosit olarak da adlandırılan trombositler, hemostaz ve tromboz gelişimi için gerekli olan küçük, çekirdeksiz kan hücreleridir 1,2. Çeşitli trombosit agonistleri tarafından aktive edilebilirler. Klasik, fizyolojik trombosit agonistleri, P2Y12 ve P2Y1 reseptörlerine bağlanan adenozin difosfat (ADP), PAR1 ve PAR4 reseptörleri yoluyla trombositleri aktive eden trombin ve glikoprotein VI ile etkileşime giren kollajendir. Kollajen, in vitro deneylerde kollajenle ilişkili peptit (CRP-XL) ile ikame edilebilir3,4. Son zamanlarda, heminin C-tipi lektin benzeri reseptör (CLEC-2) ve glikoprotein VI'nın (GPVI) etkileşimi ile trombosit aktivasyonunu indüklediği gösterilmiştirve hemin'i yeni bir endojen trombosit aktivatörü/agonisti olarak belirlemiştir 5,6. Çeşitli patolojik durumlar hemolize yol açabilir ve bu da serbest ferrik demir içeren heminin serbest kalmasına neden olabilir. Tüm bu trombosit agonistleri, trombositler üzerindeki yüzey reseptör ekspresyonunu değiştirir. Yüzey reseptörlerinin ve plazma zarının değişmesi, trombosit agonistinin 7,8,9 kuvvetine ve konsantrasyonuna bağlıdır. Bu nedenle, trombosit fonksiyonuna trombosit alt popülasyonları atayabilmek için trombositleri fenotipik olarak karakterize etmek önemlidir.

Akış sitometrisi gibi yüksek boyutlu yöntemler, trombositlerin farklı işlevlere sahip alt popülasyonlar oluşturduğunu ortaya koymuştur. Alt popülasyonlar farklı yüzey işaretleyicileri ile sınıflandırılabilir. Literatürde, iki farklı trombosit alt popülasyonunun mevcut olduğu iyi bilinmektedir: fosfatidilserin dışsallaştırması ile karakterize edilen prokoagülan ve integrin αIIIbβ3'ü aktive eden agregatör fenotip.Klasik aktivasyon belirteçlerine ek olarak, mitokondriyal fonksiyonu ve oksidatif stresi tespit eden Glutatyon-S-Ariloksit (GSAO) gibi floresan boyalar, örneğin metabolik durumlarına göre prokoagülan trombositler gibi daha fazla kategorizasyon için kullanılabilir10. Bu, balonlaşma ve mitokondriyal geçirgenlik geçişi gözenek oluşumu (MPTP) prokoagülan trombosit fenotipi11 arasında bir ayrım yapılmasına izin verir.

Heemskerk ve ark. fosfatidilserin (PS) maruziyetini ve integrin αIIbβ3 aktivitesini analiz ederek, farklı trombosit popülasyonlarının farklı pıhtılaşma adımlarını kontrol edebildiğini ve fosfatidilserin maruziyeti için trombin ve kollajen gibi güçlü aktivatörlerin gerekli olduğunu göstermiştir12. Ayrıca, trombositlerin GPVI ile kollajen veya spesifik GPVI agonisti konvülksin ile aktive edilmesi, yapışık prokoagülan trombositlerin oluşumundan birincil olarak sorumludur. Benzer şekilde, siklooksijenaz tarafından tromboksan A2 üreterek trombosit aktivasyonuna yol açan araşidonik asit, PS maruziyetini indükler13. Bununla birlikte, araşidonik asit, trombin veya kollajen ile karşılaştırıldığında, zayıf bir trombosit aktivatörüdür14. Van Velzen ve ark. ayrıca trombosit yüzey antijenlerini (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) ve aktivasyon belirteçlerini (PAC-1, CD63, CD62P) iki ayrı ölçümde değerlendirmiştir15. Ek olarak, van Velzen ve ark. trombasteni hastalarından alınan kanı analiz edebildi ve sağlıklı ve hastalıklı hastalar arasındaki alt popülasyonları karşılaştırdı. Hindle ve ark. trombin ve CRP-XL tedavisinden sonra prostasiklinin trombosit alt popülasyonları üzerindeki etkisini, her biri dört belirteçten oluşan iki ayrı panel ile ölçtü (PAC-1, Annexin V, CD62P, CD42b veya CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)16. Son zamanlarda, çok renkli akım sitometrisi istirahat (CD42b+, PAC1-, CD62P-, Annexin V-), agregatör (CD42b+, PAC1+, CD62P+, Annexin V-) prokoagülan (CD42b+, PAC1-, CD62P+, Annexin V+) ve apoptotik (Cd42b-, PAC1-, CD62P-, Annexin V+) trombosit alt popülasyonlarını tanımlamak için kullanılmaktadır 7,17. Laspa ve ark. kemokin reseptörleri CXCR4 ve ACKR318'e karşı antikorların eklenmesiyle çok renkli akış sitometrisi yaklaşımını genişletti/rafine etti. Mevcut literatüre dayanarak, bu, tek bir tüpte izole edilmiş insan trombositleri popülasyonu içinde tek bir trombosit (tek hücre seviyesi) üzerinde 10 farklı antijenin saptanmasına izin veren, izole edilmiş insan trombositleri için ilk 10 renkli akış sitometresi panelidir. Bu nedenle, mevcut alt popülasyonu daha da ayırt etmek için tek bir hücrenin aktivasyon, adezyon ve agregasyon potansiyelini, kemokin reseptörlerini ve apoptotik potansiyelini aynı anda ölçmek mümkündür. Böylece, dört ana alt popülasyonu dört belirteçle (dinlenme, prokoagülan, agregatör, apoptotik) tanımlayan Johnson ve ark.17'yi tamamlar. Bu nedenle, çok renkli bir akış sitometrisi testinin oluşturulması, farklı trombosit agonistlerinin aktivasyon paternleri ve klasik trombosit alt popülasyonları içinde trombosit alt tiplerinin oluşumu açısından karşılaştırılmasını sağlar.

Yöntem, trombosit fonksiyonu ve fizyolojisinin analizi ile ilgili temel araştırmalar için kullanılabilir. Ayrıca, insan trombositleri için kurulan çok renkli akış sitometrisi testi, örneğin kardiyovasküler hastalıklar ve trombotik olayların araştırılması, bu hastalıkların neden olduğu trombosit alt popülasyonlarının kodunu ve tedavilerin bu indüklenen fenotipler üzerindeki etkilerini çözmek için hasta çalışmalarında elde edilen trombositlerle gerçekleştirilebilir. Örneğin, Mueller ve ark. aort darlığı hastalarında trombosit alt popülasyonlarının farklılık gösterebileceğini göstermiştir19. Kazanılan bilgi, farmasötik müdahaleler için yeni açılımlar sunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırma amaçlı kan alma ve işleme, Eberhard Karls Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Tübingen Üniversite Hastanesi Etik Kurul tarafından onaylanmıştır (etik oy 238/2018B02) ve çalışma metodolojileri Helsinki Bildirgesi tarafından belirlenen standartlara uygundur. Sağlıklı bağışçılar kan alımı için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Sağlıklı donörler için temel özellikler Tablo 1'de listelenmiştir. Şekil 1 , akış sitometrisi protokolüne genel bir bakış sunar.

1. İnsan trombositlerinin tam kandan izolasyonu

NOT: Trombositleri izole etmek için standart bir yol sağlamak için numune toplama, turnike ve antikoagülan seçimi açısından ISTH yönergeleri izlenmiştir20.

  1. Tampon hazırlama
    1. Asit-sitrat-dekstroz (ACD) antikoagülan tampon: 12.50 g Na 3-Sitrat (85 mM C6H5Na3O7 x 2 H2O), 6.82 g sitrat asidi (71 mM) ve 10.00 g glikozu (111 mM) 475 mL aqua destillata içinde çözün. PH'ı 1 M NaOH ile 4.69'a ayarlayın. Aqua destillata ile 500 mL'ye kadar doldurun. Daha sonra tamponu filtreyle sterilize edin ve kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Tüm çözeltiler, 0,22 μm gözenek boyutunda hızlı akışlı polieter sülfon membran kullanan vakumla çalışan bir filtre sistemi ile filtre ile sterilize edilir.
    2. Tiroz tamponu (10x): 80.00 g NaCl, 10.15 gNaHCO3 ve 1.95 g KCl ağırlığında ve 1 L'ye aqua destillata ekleyin. Filtre tamponu sterilize edin ve kullanana kadar 4 ° C'de saklayın.
    3. Tyrode's-HEPES tamponu (1x; 137 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 5 mM glikoz, 10 mM HEPES): 10 mL 10x Tyrode tamponu ve 90 mL aqua destillata'yı karıştırın. 0.1 g glikoz ve 0.1 g sığır serum albüminini (BSA) çözün. PH'ı 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ile 7.4'e ayarlayın. 10 mL Tyrode tamponunu pH 7.4'e ayarlayın ve kalan 90 mL Tyrode'un pH'ını 1 N HCl'den pH 6.5'e kadar 7.4'e ayarlayın.
      NOT: BSA, hemin gibi bazı kimyasalları temizleyebilir. Bu durumda, 1x Tyrode'un tamponunu BSA olmadan hazırlamak önemlidir. Kullanmadan önce tüm tamponların oda sıcaklığına veya 37 °C'ye kadar ısınmasına izin verilmelidir.
  2. Kan örneği alınması
    1. Her donör için 2 mL ACD antikoagülan içeren 10 mL'lik bir şırınga hazırlayın ve bir inkübatör kullanarak oda sıcaklığına veya 37 °C'ye ayarlanmasına izin verin. Seyreltme faktörünü 1:5 (ACD: kan) olarak tutun.
      NOT: Kan örnekleri almak için daha küçük veya daha büyük şırıngalar kullanın. Soğuk ACD tamponu trombositleri önceden aktive edebilir ve sonuçlarınızı bozabilir.
    2. Donör kanını önceden ısıtılmış ACD şırıngalarında yavaşça toplamak için bir kelebek iğnesi (21G) kullanın. Ön aktivasyonu önlemek için şırıngayı doldurmadan önce turnike hortumunu açın.
      NOT: Daha büyük bir ölçü iğnesine sahip şırıngalar, trombositlerin kesme kaynaklı aktivasyonunu en aza indirebilir.
    3. ACD kanını yavaşça 15 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Trombositlerin ön aktivasyonunu önlemek için hemen kanı kullanın.
  3. Trombosit izolasyonu
    1. ACD kanını frensiz olarak 209 x g'da (oda sıcaklığı, RT) 20 dakika santrifüj edin. 50 mL'lik bir reaksiyon tüpünde 25 mL Tyrode's-HEPES tamponu pH 6.5 hazırlayın.
    2. Elde edilen trombositten zengin plazmayı (PRP, üst tabaka) Tyrode's-HEPES tamponu, pH 6.5 içeren 50 mL'lik reaksiyon tüpüne nazikçe aktarın.
    3. Diğer kan hücreleri ile kontaminasyonu önlemek için buffy coat ve eritrositlerin üzerinde yaklaşık 1 mL PRP bırakın.
    4. Trombositleri peletlemek için süspansiyonu RT'de 10 dakika boyunca 430 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen peleti 200-300 μL Tyrode tamponunda, pH 7.4'te dikkatlice yeniden süspanse edin.
    5. Trombosit sayısını belirlemek için bir hücre sayacı kullanın. Tyrode's-HEPES-tampon pH 7.4 ila 200 x 103 trombosit/μL ile trombosit sayısını ayarlayın. Trombosit boyamanın daha fazla işlenmesi için 3. adıma bakın.

2. Akış sitometrisi için antikorların seçimi ve titrasyonu

  1. Antikor ve boya seçimi
    1. Akış sitometresi21 için uygun floroforlu antikorları ve boyaları seçin. Akış sitometresi üreticisi tarafından önerilen filtre yapılandırmasına dikkat edin. Aşağıdaki sitometre için Tablo 2 ve Şekil 2'de trombosit belirteçleri ve florofor konfigürasyonuna bir örnek verilmiştir: Lazer konfigürasyonlu BD LSR Fortessa: menekşe (402 nm), mavi (488 nm), sarı/yeşil (561 nm), kırmızı (640 nm).
      NOT: Düşük eksprese edilen antijenler için daha parlak florokromlar kullanın. Örneğin, zayıf eksprese edilen kemokin reseptörleri (ACKR3 ve CXCR4) için parlak florokromlar BV412 ve BV650 kullanıldı22,23,24.
  2. Antikorların ve boyaların titrasyonu
    1. Doğru çalışma konsantrasyonunu bulmak için antikorları titre edin. Titrasyon için, adım 1'den izole edilmiş insan trombositlerini ve antikorun bir konsantrasyon serisini kullanın.
      NOT: Üretici tarafından verilen çalışma konsantrasyonları genellikle konsantrasyon serileri için iyi bir başlangıç noktasıdır.
      1. Sadece tedavi altında eksprese edilen antijenlerle çalışıyorsanız, negatif ve pozitif hücrelerin de tespit edilebildiğinden emin olmak için boyamadan önce trombositleri aktive edin. Örneğin, PAC-1 yalnızca aktive edilmiş integrin αIIbβ3'e bağlanır. Bu nedenle, parlak, pozitif bir sinyal elde etmek için trombositleri güçlü bir şekilde aktive edin, ör. 10 μg / mL kollajen ile ilişkili peptit (CRP; bkz. Şekil 3).
  3. Numunelerin titrasyonu
    1. İnsan trombositlerini adım 1'deki gibi izole edin ve trombosit sayısını numune başına 1 x 106 trombosit olarak ayarlayın.
      1. Boyamadan önce aktivasyona ihtiyaç duymayan reseptörler için: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4 antikor başına bir boyanmamış ve bir lekeli numune kullanın. Örneğin boyamadan önce 10 μg/mL CRP-XL ile aktive edilmesi gereken reseptörler/markörler için: PAC1, CD63, CD62P, Annexin V, Zombie NIR, bir aktif ve bir aktive edilmemiş numunekullanın 15,25,26.
    2. Gerekirse trombositleri (numune başına 1 x 10,6 trombosit) 10 μg/mL CRP-XL ile 30 dakika boyunca aktive edin. Daha sonra, izole edilmiş trombositleri (numune başına 1 x 106 trombosit) farklı konsantrasyonlarda florokrom konjuge antikor veya boya ile 30 dakika inkübe edin ve numuneyi seyreltmek için 300 μL 1x Annexin Bağlayıcı Tampon ekleyin (konsantrasyonlar için örnekler Tablo 3'te verilmiştir).
    3. Her numune için 10.000 olayı ölçün.
    4. Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, her antikor için pozitif ve negatif popülasyonların optimal ayrımını gösteren leke indeksini hesaplayın.
    5. Optimal konsantrasyonu bulmak için her bir antikor konsantrasyonu için leke indeksini çizin.

3. Akış sitometrisi için boyama

NOT: Dört farklı trombosit aktivatörü (CRP-XL, ADP, trombin, hemin) ile boyama örneği için Tablo 4'e bakınız.

  1. Hemin'in taze olarak hazırlanması gerekiyor. Tozu 1.4 M NaOH içinde 3 M'lik bir çözeltiye çözün ve 450 rpm'de 5 dakika boyunca 96 ° C'ye ısıtın. Daha sonra, damıtılmış H2O ile 3 mM'lik bir stok çözeltisine seyreltin.
  2. Trombosit sayısının ayarlanmasından sonra (numune başına: 1 x 106 trombosit), trombositleri Tablo 4'te verildiği gibi RT'de 30 dakika boyunca trombosit aktivatörleri ile bir tüpte aktive edin.
  3. Örneklere 43.3 μL antikor kokteyli ekleyin ve trombositleri karanlıkta RT'de 30 dakika inkübe edin.
  4. İnkübasyondan sonra, numuneleri 300 μL 1x Annexin Bağlayıcı Tampon (10 mM HEPES / NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2) ile seyreltin, böylece Annexin V proteini hücre zarının dış tarafındaki fosfatidilserine bağlanabilir. Numuneleri hemen ölçün.
    NOT: Numuneleri hazırlandıktan hemen sonra ölçün. Numuneler sabit olmadığından, numune hazırlama ve ölçümün geciktirilmesi sonuçların değişkenliğini artırabilir. Fiksasyon, Annexin V bağlanmasını bozar.

4. Kompanzasyon kurulumu ve floresan eksi bir kontrol (FMO) ölçümü

NOT: Verileri kaydetmeden önce bir kompanzasyon kurulumu çalıştırın. Bir akış sitometresi, kompanzasyon ayarlarını otomatik olarak hesaplar; Özel kompanzasyon prosedürü için akış sitometresinin olağan kılavuzlarına bakın. Bununla birlikte, telafi kontrollerini hücrelerle veya boncuklarla kullanın.

  1. Ücretlendirme kurulumu
    1. Boncuklarla kompanzasyon için, her florofor için bir damla boncuk ve 1 μL floresan konjuge antikor ile 150 μL fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.
    2. Boncukların türün reaktivitesini izleyin. Anti-fare IgGκ ve polistiren mikropartiküllerin negatif kontrolünü kullanın. Annexin V'yi telafi etmek için, PE / Cy7 boncuklarını, Annexin V ile aynı floroforu konjuge eden antikor PE / Cy7 anti-insan CD62L ile etiketleyin.
    3. Amin-reaktif boya için amin-reaktif kompanzasyon boncukları kullanın. 1 μL boya ile 150 μL PBS'de iki damla pozitif ve bir damla negatif boncuk kullanın. Amin reaktif kompanzasyon boncuklarının boya ile reaksiyona girdiğini ve pozitif bir sinyal gösterdiğini kontrol edin. Negatif boncukların amin reaktif boya ile reaksiyona girmediğini ve negatif bir sinyal sunduğunu kontrol edin.
      NOT: Zombie NIR APC-Cy7 için negatif ve pozitif amin reaktif boncuklar kullanın.
    4. Kompanzasyon numunelerini karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    5. Her kompanzasyon tüpünü ayrı ayrı çalıştırın ve FSC ve SSC'ye dayalı olarak tekli boncuk popülasyonunu açın. Boncuk popülasyonu, küçük bir konsantre popülasyon olarak görünür. Bu nüfusun etrafına bir kapı çizin.
    6. Her kompanzasyon tüpü için histogramları görüntüleyin ve farklı antikorların ve boyaların pozitif tepe noktaları örtüşmeyene kadar kompanzasyon değerlerini ayarlayın. Ardından, her bir kompanzasyon tüpünü ölçün ve floroforların yayılmasının üreticinin SOP'sine göre hesaplanmasına izin verin.
    7. İzole edilmiş insan trombositleri ile gerçek boyama deneyini elde etmeye devam edin (bkz. adım 3 ve Tablo 4). Trombosit popülasyonunu bulmak için ölçümden önce SSC/FSC voltajını ayarlayın. CD61 trombositler üzerinde her yerde eksprese edildiğinden, trombositin her boyutunun tespit edilip edilemeyeceğini bu floresan eşiği ile kontrol edin.
    8. Ardından, örnek başına 20.000 olayı ölçün.
  2. FMO ölçümü
    1. Her işaretleyici için Tablo 5'e göre bir FMO kontrolü hazırlayın. Tüm belirteçlerin örtüşmelerini belirleyebilmek için, hem uyarılmamış hem de uyarılmış numuneler hazırlayın.

5. Veri analizi

  1. Akış sitometrisi veri analiz yazılımı ile analiz (Şekil 4)
    1. FSC dosyalarını yazılıma sürükleyip bırakın. FMO kontrolü ile her bir belirteç için pozitif popülasyonu tanımlayın.
      1. Her bir FMO kontrolünü bir nokta grafiğindeki her işaretçiye karşı çizerek FMO'ları belirleyin. Bu, diğer kanallara dökülmeyi görünür hale getirir. İşlem görmüş 10 renkli numuneler için pozitif popülasyonun sınırı olarak en yüksek floresan yayılmasına sahip FMO kapısını kullanın.
  2. Bulut tabanlı akış sitometrisi analizi ile analiz (Şekil 5)
    1. Yazılımı açın ve yeni bir veri kümesi oluşturun. Akış sitometresi ile alınan FCS dosyalarını sürükleyip bırakın.
    2. Bir iş akışı oluşturarak analizi başlatın. Kompanzasyon matrisi, ham veri dosyalarından otomatik olarak oluşturulur.
    3. Aşağıdaki ayarlarla bir UMAP analizi çalıştırın: Komşular: 15, Minimum Mesafe: 0.4; Bileşenler: 2; Metrik: Öklidyen; Öğrenme Oranı: 1; Çağlar: 200; Gömme Başlatma: spektral. Tüm dosyaları ve 10 işaretçinin (özellikleri) tümünü seçin.
    4. Phenopraph analizini yeni bir görev olarak ekleyin ve analizi aşağıdaki ayarlarla çalıştırın: K En Yakın Komşular: 20; Mesafe Metriği: Öklidyen; Louvain koşuları: 1; Sonuç Sayısı: 1.
    5. Oluşturulan kümeleri belirtmek için bir geçit görevi ekleyin. Analizi çalıştırdıktan sonra, verileri dışa aktarılabilen farklı lekelerde sunmak mümkündür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok renkli bir akış sitometrisi paneli tarafından toplanan ham verileri analiz etmek için iki seçenek vardır. Bir seçenek, analiz yazılımı ile manuel olarak analiz etmektir (Şekil 3 ve Şekil 4). Bu nedenle, ham verilerin yazılım penceresine sürüklenip bırakılması gerekir. İlk olarak, trombosit popülasyonunu ayrı bir nokta bulutu olarak göstermek için saçılma grafiği görüntüleme modunda SSC/FSC ölçeği ayarlanarak hücrelerin bulunması gerekir. Daha sonra, her bir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok renkli akış sitometrisi, ayrık fonksiyonlarla ilişkili farklı trombosit kümelerini/alt popülasyonlarını tanımlamaya izin verir 12,17,18. Alt popülasyonların sonuçları ve reseptör yüzey ekspresyonu için belirleyici olan, izole edilmiş insan trombositlerinin kalitesidir. Bu nedenle, sunulan protokoldeki önemli bir adım, trombositlerin hazırlanmasıdır. Farklı agonistlerle numune muamelesinden ö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proje, Alman Araştırma Vakfı (DFG) - Proje numarası 335549539 - GRK 2381 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x Bağlama Tamponu   Invitrogen,
Carlsbad, California, ABD		88-8103-74Tampon 
Adenozin difosfat (ADP)Probe & go Labordiagnostica GmbH
Lemgo, Almanya   		70212Trombosit agonisti ve nbsp;
Annexin V PE-Cyanine7Invitrogen,
Carlsbad, California, ABD		88-8103-74boya 
anti-CD41 AF 700BioLegend,
San Diego, CA, ABD		303728antikoru 
anti-CD41 Alexa Fluor 700BioLegend,
San Diego, CA, ABD		303727antikoru 
anti-CD42b PerCP / Siyanin5.5 BioLegend,
San Diego, CA, ABD		303918antikoru 
anti-CD61 BV605BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, ABD 		744382antikoru 
anti-CD62P PEBeckman Coulter,
Brea, California, ABD		IM1759Uantikoru 
anti-CD63 PE / Cy5 Abcam,
Cambrigde, İngiltere		ab 234251antikoru 
anti-CXCR4 BV650BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, ABD		740599antikoru 
anti-CXCR7 BV421 ve nbsp;BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, ABD 		566234antikoru 
anti-PAC-1 FITCBD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, ABD		340507antikoru 
Sığır serum albümini (BSA)Applichem,
Darmstadt, Almanya		A1391-Citrit
asidi & nbsp;Carl Roth,
Karlsruhe, Almanya		6490.1-CRP-XL
CambCol Laboratuvarları,
Ely, İngiltere		CRP-XLtrombosit agonisti ve nbsp;
D-(+)-GlikozSigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, ABD		G7528-Dubecco
' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Sigma Aldrich Co,
St. Louis, Missouri, ABD		D8537-Hemin
ve nbsp;Sigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, ABD		H9039-10Gtrombosit agonisti ve nbsp;
HEPESCarl Roth,
Karlsruhe, Almanya		9105.3-Potasyum
klorür ve nbsp;Carl Roth,
Karlsruhe, Almanya		6781.3-Sodyum
klorür Carl Roth, < / > Karlsruhe, Almanya3957.1-Sodyum
hidrojenkarbonat  Sigma Aldrich Co,
St. Louis, Missouri, ABD
401676-Trombin &Roche 10602400001trombosit agonisti ve nbsp;
tri-Sodyum sitrat-dihidrat Applichem,
Darmstadt, Almanya		1416551211-Zombie
NIRBioLegend,
San Diego, CA, ABD		423105amin reaktif boya 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freedman, J. E. Molecular regulation of platelet-dependent thrombosis. Circulation. 112 (17), 2725-2734 (2005).
  2. Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: an update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2016).
  3. van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives. Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).
  4. Li, Z., Delaney, M. K., O'Brien, K. A., Du, X. Signaling During Platelet Adhesion and Activation. Arterioscl Thrombosis Vas Biol. 30 (12), 2341-2349 (2010).
  5. Oishi, S., et al. Heme activates platelets and exacerbates rhabdomyolysis-induced acute kidney injury via CLEC-2 and GPVI/FcRgamma. Blood Adv. 5 (7), 2017-2026 (2021).
  6. Bourne, J. H., et al. Heme induces human and mouse platelet activation through C-type-lectin-like receptor-2. Haematologica. 106 (2), 626-629 (2021).
  7. Rohlfing, A. K., et al. cGMP modulates hemin-mediated platelet death. Thromb Res. 234, 63-74 (2024).
  8. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  9. Sodergren, A. L., Ramstrom, S. Platelet subpopulations remain despite strong dual agonist stimulation and can be characterised using a novel six-colour flow cytometry protocol. Sci Rep. 8 (1), 1441(2018).
  10. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  11. Agbani, E. O., et al. Coordinated Membrane Ballooning and Procoagulant Spreading in Human Platelets. Circulation. 132 (15), 1414-1424 (2015).
  12. Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. Platelet-based coagulation: different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
  13. Rukoyatkina, N., et al. Multifaceted effects of arachidonic acid and interaction with cyclic nucleotides in human platelets. Thromb Res. 171, 22-30 (2018).
  14. Taylor, M. L., Misso, N. L. A., Stewart, G. A., Thompson, P. J. Differential Expression of Platelet Activation Markers CD62P and CD63 Following Stimulation with PAF, Arachidonic Acid and Collagen. Platelets. 6 (6), 394-401 (1995).
  15. van Velzen, J. F., Laros-van Gorkom, B. A., Pop, G. A., van Heerde, W. L. Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers. Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).
  16. Hindle, M. S., Spurgeon, B. E. J., Cheah, L. T., Webb, B. A., Naseem, K. M. Multidimensional flow cytometry reveals novel platelet subpopulations in response to prostacyclin. J Thromb Haemost. 19 (7), 1800-1812 (2021).
  17. Johnson, L., Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  18. Laspa, Z., et al. Hemin-induced platelet activation is regulated by the ACKR3 chemokine surface receptor and has implications for passivation of vulnerable atherosclerotic plaques. FEBS J. 291 (24), 5420-5434 (2024).
  19. Mueller, K. A. L., et al. Macrophage Migration Inhibitory Factor Promotes Thromboinflammation and Predicts Fast Progression of Aortic Stenosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (9), 2118-2135 (2024).
  20. Jourdi, G., et al. Consensus report on flow cytometry for platelet function testing in thrombocytopenic patients: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (10), 2941-2952 (2023).
  21. Flores-Montero, J., et al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Meth. 475, 112618(2019).
  22. Clemetson, K. J., et al. Functional expression of CCR1, CCR3, CCR4, and CXCR4 chemokine receptors on human platelets. Blood. 96 (13), 4046-4054 (2000).
  23. Rohlfing, A. K., et al. ACKR3 regulates platelet activation and ischemia-reperfusion tissue injury. Nat Commun. 13 (1), 1823(2022).
  24. Rath, D., et al. Expression of stromal cell-derived factor-1 receptors CXCR4 and CXCR7 on circulating platelets of patients with acute coronary syndrome and association with left ventricular functional recovery. Eur Heart J. 35 (6), 386-394 (2014).
  25. Hashemzadeh, M., et al. A comprehensive review of the ten main platelet receptors involved in platelet activity and cardiovascular disease. Am J Blood Res. 13 (6), 168-188 (2023).
  26. Moroi, M., Farndale, R. W., Jung, S. M. Activation-induced changes in platelet surface receptor expression and the contribution of the large-platelet subpopulation to activation. Res Pract Thromb Haemost. 4 (2), 285-297 (2020).
  27. Busuttil-Crellin, X., et al. Guidelines for panel design, optimization, and performance of whole blood multi-color flow cytometry of platelet surface markers. Platelets. 31 (7), 845-852 (2020).
  28. Fink, A., et al. The Subtilisin-Like Protease Furin Regulates Hemin-Dependent Ectodomain Shedding of Glycoprotein VI. Thromb Haemost. 123 (7), 679-691 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Trombosit AktivasyonuTrombosit AgonistleriTrombosit FonksiyonuTrombosit Y zey Belirte leriTrombosit zolasyonuApoptotik TrombositlerTrombosit AgregasyonuUMAP Analizi

İlgili makaleler