Method Article

Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

DOI:

10.3791/67881

⸱

March 28th, 2025

 , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, Drosophila melanogaster'deki X veya Y kromozomu ribozomal DNA lokusundan türetilen ribozomal RNA transkriptlerini ayırt etmek için tek nükleotid polimorfizmlerine duyarlı floresan in situ hibridizasyon (SNP-FISH) yöntemini tanımlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ribozom fonksiyonu için yeterli ribozomal RNA'nın (rRNA) kopyalanmasını sağlamak için, genomlar, ribozomal DNA (rDNA) lokusları adı verilen bölgeleri oluşturan rRNA'ları kodlayan dizilerin yüzlerce tandem kopyasını içerir. Birçok organizmanın genomu, farklı kromozomlara dağılmış birden fazla rDNA lokusu içerir ve rRNA, birden fazla rDNA lokusundan veya yalnızca tek bir lokustan kopyalanabilir. rRNA transkripsiyon kaynaklarındaki değişiklikler genellikle ribozomal sıkıntıyı gösterir. Bununla birlikte, rRNA'nın homojenliği, rRNA'nın birden fazla veya tek bir rDNA lokusundan kopyalanıp kopyalanmadığını ayırt etmeyi engeller. Burada, X ve Y kromozomları üzerindeki Drosophila melanogaster rDNA lokusları arasındaki rRNA transkripsiyonunu ayırt etmek için tek nükleotid polimorfizmine duyarlı floresan in situ hibridizasyon (SNP-FISH) kullanan bir yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntem, tek hücreli çözünürlükle rRNA transkripsiyon kaynağının kolay tespit edilmesini sağlamak için lokusa özgü rRNA varyantlarından yararlanır. Bu test herhangi bir Drosophila hücre tipine uygulanabilir ve diğer sistemlerde kullanım için uyarlanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ribozom fonksiyonu için gerekli olan 18S, 5.8S ve 28S ribozomal RNA'lar (rRNA'lar), 45S pre-rRNA adı verilen tek bir sistron içinde birlikte kopyalanır. Üç rRNA, 45S pre-rRNA içinde iki dahili transkripsiyonlu aralayıcı dizisi (ITS) ile ayrılır ve 5' ve 3' ucunda harici kopyalanmış aralayıcı dizileri (ETS) ile çevrilidir. Bu aralayıcı dizilerin tümü, olgun rRNA'ların ribozomlara dahil edilmesi için 45S pre-rRNA'dan çıkarılır (bkz.1). Ribozom aktivitesini desteklemek için gereken rRNA üretimine yönelik yüksek talebi karşılamak için, tüm Ökaryotik genomlar 45S dizisinin yüzlerce kopyasını içerir. Bu kopyalar, ribozomal DNA (rDNA) lokusları adı verilen genomik bölgeler oluşturan ardışık tekrarlar halinde bir araya getirilir. Çoğu Ökaryotik genom, ayrı kromozomlara yayılmış çoklu rDNA lokusu içerir (bkz.2). 45S kopyaların yüksek yedekliliği, tipik olarak transkripsiyon için gerekenden çok daha fazla 45S kopyası olduğu anlamına gelir ve 45S kopyalarının çoğu transkripsiyonel olarak sessizdir ve heterokromatin3'e gömülüdür. Transkripsiyonel aktivite, rDNA lokusları arasında tek tip değildir ve rDNA lokus transkripsiyonundaki varyasyon, organizmalar 4,5,6 arasında yaygın olarak gözlenir, bu da 45S transkripsiyonunun bireysel rDNA lokuslarında diferansiyel olarak düzenlendiğini gösterir. Bitkilerde, omurgasızlarda ve omurgalılarda lokus çapında rDNA susturmagözlemlenmiştir 7,8,9,10, bu da lokus çapında rDNA susturmanın rRNA dozajını 11 düzenlemek için önemli bir mekanizma olduğunu düşündürmektedir. rRNA transkripsiyonu, ribozom üretiminde önemli bir düzenleyici adımdır ve translasyonel aktiviteyi modüle eden rRNA transkripsiyonundaki değişiklikler, hem normal farklılaşmanın hem de hastalık koşullarının önemli bir özelliğidir12. rDNA lokus transkripsiyonundaki değişiklikler, toplam rDNA kopya numarası13'teki azalmalarla da ilişkilidir. Bu nedenle, değiştirilmiş lokusa özgü rDNA transkripsiyonu, bozulmuş hücresel fizyolojinin önemli bir göstergesi olabilir.

Lokusa özgü susturma, rRNA transkripsiyonel düzenlemesinin önemli bir kaynağı gibi görünse de, bu susturmayı sağlayan ve hangi rDNA lokuslarının transkripsiyonel olarak aktif olduğunu yönlendiren mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. rDNA dizilerinin homojenliği, bireysel rDNA lokus transkripsiyonunun değerlendirilmesini zorlaştırarak, lokusa özgü rDNA transkripsiyonel aktivitesinin yaygın analizini önler. Bu zorluğun, aynı genom 4,5,6,13 içindeki rDNA kopyaları arasındaki yapısal ve tek nükleotid dizi varyasyonundan yararlanarak üstesinden gelmek mümkün olabilir. Bu varyantlardan bazıları, tek bir lokustaki kopyaların çoğu veya tümü arasında paylaşılabilir ve bir rDNA lokusunu ayırt eden birden fazla varyanttan oluşan benzersiz rDNA lokus haplotipleri oluşturabilir. Gerçekten de, telomer-telomer konsorsiyumu tarafından rDNA varyantlarının belirli lokuslara yakın zamanda haritalanması, insan genomunda lokusa özgü paylaşılan rDNA varyantlarını ortaya çıkardı14. Bu tür rDNA lokus haritaları, dizileme veri kümelerinden lokusa özgü transkripsiyonun tanımlanmasını sağlayabilir; Ancak, bu haritaların mevcudiyeti şu anda sınırlı kalmaktadır ve üretilmesi kolay değildir. rDNA lokusları sadece Drosophila melanogaster'deki cinsiyet kromozomlarında bulunduğundan (her X ve Y kromozomunda bir lokus)15, Y kromozomu rDNA lokusu XX dişide yoktur. Y kromozom lokusundan bu doğal izolasyon, X ve Y rDNA lokusları arasındaki tek nükleotid polimorfizmi (SNP) varyantlarının, erkeklerde (XY) bulunan ancak dişilerde bulunmayan (XX) herhangi bir varyant olarak kısa okuma dizilemesinde kolayca tanımlanabileceği anlamına gelir. Daha önce tanımlanmış SNP'ler, erkeklerden ve dişilerden alınan DNA'nın basit PCR ve Sanger dizilimi yoluyla genotiplenmemiş Drosophila suşlarında hızlı bir şekilde test edilebilir. Ayrıca, rDNA lokusu16 olmayan bir X kromozomuna sahip Drosophila suşlarının mevcudiyeti, bireysel X ve Y rDNA lokuslarının daha da kesin rDNA SNP karakterizasyonu için ayrı ayrı izole edilebileceği anlamına gelir. Drosophila rDNA lokusları arasındaki SNP varyantlarının bu kolay tanımlanması, benzersiz X ve Y rDNA lokusları SNP haplotiplerinin13 belirlenmesini mümkün kılar. X kromozomu rDNA lokusları da Drosophila erkeklerinde tipik olarak tamamen sessizdir, ancak her iki X kromozomu lokusu dişilerde10,17 kopyalanır, bu da Drosophila'yı lokus çapında rDNA susturmayı incelemek için yararlı bir sistem haline getirir.

Floresan in situ hibridizasyon (FISH), bir dokunun tek tek hücreleri içinde spesifik RNA veya DNA dizilerinin varlığını görselleştirmek için güçlü bir araçtır. FISH etiketleri, floroforlara konjuge edilmiş antisens oligonükleotid probları aracılığıyla RNA veya DNA dizilerini hedefler. FISH problarının, görselleştirilebilecek kadar kararlı hedef bağlanma sağlamak için tipik olarak ~ 20 nükleotid uzunluğunda olması gerekir, ancak bu kadar uzun problar, yalnızca tek bir nükleotid ile farklılık gösteren hedef olmayan dizilere de kolayca bağlanabilir (Şekil 1A). Tersine, tek nükleotid özgüllüğü sağlayacak kadar kısa problar, görselleştirme için yeterince kararlı bir şekilde bağlanmaz. Özgüllüğü ve kararlılığı dengelemek için, SNP'ye duyarlı FISH (SNP-FISH), ~26 nükleotid uzunluğunda bir antisens floresan probu ile probun 5' ucu hariç tümüne bağlanan floresan olmayan bir sensör maskesi oligonükleotidi18 birleştirir. Bu maske, probun yalnızca en fazla 5' nükleotidini tek sarmallı ve hedef bağlama için kullanılabilir durumda bırakır (Şekil 1B). Probun bu kısa tek sarmallı kısmı, hedefe özgüllük kazandırır, ancak bu 10 nükleotid ile tek bir uyumsuzluğa sahip RNA'larla çapraz reaktiviteyi önler (Şekil 1B). Probun 5' ucu hedefini bağladığında, pasif iplik yer değiştirmesi maskeyi probdan sıyırarak 3' bölgesinin hedefi bağlamasına ve kararlı hedef etiketlemesi oluşturmasına izin verir (Şekil 1B)18. Bu nedenle, SNP-FISH, her biri farklı bir SNP'yi tamamlayan ancak ortak bir maskeyi paylaşan farklı floroforlara sahip bir çift prob kullanarak, tek bir SNP ile farklılık gösteren RNA'ları farklı şekilde görselleştirebilir (Şekil 1C). Bu yöntem, hedef SNP'ye yalnızca tek bir florofor konjuge prob alsa da, birden fazla prob maskesi setini paylaşılan bir rDNA haplotip içinde birkaç SNP'ye havuzlamak, tek bir rRNA'nın SNP'ye duyarlı tespitini amplifiye etmek için kullanılabilir (Şekil 1D). Ayrıca, rRNA çok bol miktarda kopyalandığından, rRNA transkriptleri, RNA başına az sayıda floresan etiketi kullanılarak FISH deneylerinde kolayca görselleştirilebilir. RNA başına florofor için bu düşük gereksinim, SNP-FISH'in rRNA'ları yalnızca birkaç benzersiz SNP ile belirli bir lokustan görselleştirebileceği anlamına gelir. Bu yöntem, çeşitli Drosophila dokularında ve gelişim aşamalarında lokusa özgü rRNA transkripsiyonunu kolayca tespit edebilir17. Özellikle,13 yaşında özel Y-rDNA transkripsiyonu ile X ve Y-kromozomu rDNA lokuslarının birlikte ekspresyonu arasında değişen Drosophila erkek germ hattı kök hücrelerinde etkilidir. Burada, lokusa özgü rRNA susturmayı değerlendirmenin genel hedefine ulaşmak için Drosophila testisindeki farklı X ve Y rRNA transkriptlerini görselleştirmek için bir SNP-FISH protokolü sunuyoruz. Bu yöntem, daha önce yaygın y1w1 laboratuvar Drosophila suşunun X ve Y kromozomları üzerindeki rDNA lokusları arasında karakterize edilen dört SNP kullanır (Şekil 1D).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

NOT: RNaz içermeyen teknik, 1, 3 ve 4. adımlar boyunca kullanılacaktır ve sertifikalı RNaz içermeyen reaktifler kullanılmalıdır.

  1. Kimyasal bir başlıkta, 10 mL %16 formaldehit ve 4 mL RNaz içermeyen 10x PBS'ye 26 mL RNaz içermeyen su ekleyerek 1x PBS fiksasyon solüsyonunda 40 mL %4 formaldehit hazırlayın. 1 mL alikotlara dağıtın ve hazırladıktan sonraki 30 dakika içinde -20 ° C'de saklayın. Fiksasyon solüsyonu -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
    DİKKAT: Çözelti formaldehit içerir. Eldiven ve uygun KKD ile tutun ve güvenli bir şekilde atın.
  2. 1 mL 20x RNaz içermeyen salin-sodyum sitrat (SSC), 1 g dekstran sülfat, 100 μL 100 mg / mL Saccharomyces cerevisiae tRNA, 100 μL 200 mM Vanadil ribonükleosit kompleksi, 1 mL %5 RNaz içermeyen BSA, 1 mL deiyonize formamid ile birlikte 6 mL RNaz içermeyen su karıştırarak 10 mL hibridizasyon tamponu hazırlayın. 1.5 mL'lik mikrofüj tüplerinde 1 mL'lik alikotlara dağıtın ve -20 ° C'de 1 aya kadar saklayın.
  3. 5 mL 20x RNaz içermeyen SSC, 5 mL deiyonize formamid, 50 μL Triton-X ila 40 mL RNaz içermeyen su ekleyerek 50 mL yıkama tamponu hazırlayın. Oda sıcaklığında karanlıkta 1 aya kadar saklayın.
  4. 9.8 mL suya 100 μL 1M Tris-HCl pH 7.5-8.0, 20 μL 0.5M EDTA ve 50 μL 5M NaCl ekleyerek 10 mL DNA izolasyon tamponu hazırlayın.

2. X ve Y'ye özgü rRNA SNP'ler için örnek genotipleme

  1. Aynı X kromozomunu barındıran çiftleşmemiş homozigot X dişi ve erkeği 0.2 mL'lik tüplerde toplayın ve buz üzerinde soğutun.
  2. 50 μL DNA izolasyon tamponunu numune başına 0.5 μL 20 mg / mL Proteinaz K ile birleştirin.
  3. Drosophila örneğine 50 μL DNA izolasyon tamponu / Proteinaz K ekleyin ve bir pipet ucu kullanarak örneği homojenize edin.
  4. Numuneleri 37 ° C'de 30 dakika, ardından 95 ° C'de 2 dakika inkübe edin. 40 mL numuneyi (hayvan kalıntılarından kaçının) temiz bir 1,5 mL tüpe aktarın.
  5. Aşağıdaki primer çiftlerinin 10 μM konsantrasyonunu kullanarak her bir DNA örneğinden her bir SNP hedef bölgesini PCR ile ayrı ayrı amplifiye edin: 18S SNP İleri + Geri; ITS1 SNP İleri + Geri; 28S SNP İleri + Geri. Primer dizisi ve beklenen PCR amplikon boyutu Tablo 1'de bulunur.
  6. Beklenen PCR ürününü doğrulamak için tüm PCR örneğini %1 agaroz 1x TAE jeli üzerinde ayırmak için jel elektroforezi kullanın. Beklenen ürün boyutları Tablo 1'de listelenmiştir.
  7. Piyasada bulunan herhangi bir jel ekstraksiyon kitini kullanarak PCR ürününü jelden izole edin.
  8. Sanger dizilemesi ile PCR ürünlerini sıralayın. Her hedef için F ve R primeri için ayrı ayrı reaksiyonlar kullanarak numuneleri her iki yönde sıralayın.
  9. Eşleşmemiş bir dişi DNA örneğinde Tablo 2'deki pozisyonlarda X kromozomu SNP varyantını belirleyin. Beklenen X haplotip Tablo 2'de açıklanmıştır.
  10. Erkek DNA örnek dizileme kromatogramında SNP pozisyonlarını gözlemleyin. Her SNP pozisyonunda önceden belirlenmiş X SNP varyantına dayalı olarak Y kromozomu SNP varyantını çıkarın. Beklenen Y haplotip Tablo 2'de açıklanmıştır.
Astar adıSıraBeklenen Amplikon Boyutu
18S SNP FGACTACCATGGTTGCAACGG652 beygir
18S SNP RTTCACCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP FCTTGCGTGTTACGGTTTTTTC955 bp
ITS1 SNP RACAGCATGGACTGCGATATG
28S SNP FATGCGTAGAAGTTTGGCG598 bp
28S SNP RGCCGACTTCCCTTACCTACA

Tablo 1: rDNA SNP'lerin dizilenmesi için primer dizileri. 18S, ITS1 ve 28S rDNA bölgelerinde daha önce karakterize edilmiş SNP'leri içeren rDNA bölgelerini amplifiye etmek için primer çiftleri. Primer oligonükleotid sekansı ve beklenen PCR amplikon boyutu listelenmiştir.

HaplotipSNP PozisyonuSıra
X rDNA18'LI YILLAR1603-ATACTTGTATTTTTTCATATG-1625
ONUN 1-12873-CGTTAATAAATATTTGTAATT-2895
ONUN 1-23115-GAAAATCGAAGAAACAAAATT-3137
28'LI YILLAR5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
Y rDNA18'LI YILLAR1603-ATACTTGTATCTTTTCATATG-1624
ONUN 1-12873-CGTTAATAAACATTTGTAATT-2895
ONUN 1-23115-GAAAATCGAAAAAACAAAATT-3137
28'LI YILLAR5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

Tablo 2: Beklenen rDNA haplotipleri. Y1w1 Drosophila suşunda X ve Y kromozomu rDNA lokuslarında beklenen SNP'ler. SNP kalın ve altı çizili olarak belirtilmiştir. Konsensüs 45S rRNA dizisine göre listelenen konum (Ek dosya 1).

3. Testis diseksiyonu, fiksasyonu ve permeabilizasyonu

  1. Stereomikroskop, iş istasyonu, diseksiyon kabı ve diseksiyon forsepslerini %70 etanol (veya başka bir RNase tedavisi) ile temizleyin.
  2. Stereomikroskop altında, testisleri 1x RNAse-free PBS'de izole etmek için Drosophila'yı inceleyin. Hayvanın karnının ortasını bir çift forseps ile kavrayın ve hayvanı nazikçe ayırmak için karnın ucunu başka bir çift forseps ile kavrayın. Testisler hayvandan ayrılır ve forseps kullanılarak daha da ayrılabilir. Örnek başına 30 - 40 testis toplayın.
  3. Forseps kullanarak, testisleri alın ve bunları diseksiyon kabından 0.5 mL 1x RNaz içermeyen PBS içeren 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın.
  4. PBS'yi aspire edin ve 1 mL fiksasyon solüsyonu ekleyin. Oda sıcaklığında bir nutating çalkalayıcı üzerinde 30 dakika inkübe edin. Aspire sabitleyici.
  5. 2x'i 1 mL 1x RNaz içermeyen PBS ile 5 dakika boyunca bir somun çalkalayıcıda yıkayın. 1x PBS'yi aspire edin ve 1 mL RNaz içermeyen% 70 etanol (EtOH) ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de bir somun çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

4. SNP'ye duyarlı ribozomal RNA BALIĞI

  1. Etanolü aspire edin ve 1 mL yıkama tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında bir somun çalkalayıcı üzerinde 3 dakika inkübe edin, ardından 2 dakika tüp dik olarak dinlendirin.
  2. Probları ve maskeleri hibridizasyon tamponu ile karıştırın ve numune başına 100 μL toplam hacim elde edin. Prob, maske dizileri ve florofor etiketleri Tablo 3'te listelenmiştir. 4 SNP'nin tümünü kullanırken, 80 μL hibridizasyon tamponu, 10 μM Y-SNP probunun her biri 1 μL (toplam 4 μL), 10 μM X-SNP probunun her biri 1 μL (toplam 4 μL) ve 10 μM ortak maskenin her biri 3 μL (toplam 12 μL) hazırlayın
  3. Yıkama tamponunu aspire edin, ardından 100 μL hibridizasyon çözeltisi ekleyin. Tüpün kenarlarına şeffaf film uygulayın, ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın ve en az 24 saat boyunca 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin.
  4. Hibridizasyon çözeltisini aspire etmeden numuneye 1 mL yıkama tamponu ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin.
  5. Yıkama tamponunu aspire edin, ardından numuneye 1 mL yıkama tamponu ekleyin. Karanlıkta 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin.
  6. Yıkama tamponunu aspire edin ve 50 μL montaj ortamı ekleyin. Numuneler hemen slaytlara monte edilebilir veya montajdan önce 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
SNP PozisyonuOligonükleotidSıra3' konjuge Florofor
18'LI YILLARX SNP probuAAAAAATACAAGTATTTAATCACATAİsmail 488
Y SNP probuAAAAGATACAAGTATTTAATCACATAİskender'ın fotoğrafı. 647
MaskeTATGTGATTAAATACT
ONUN 1-1X SNP probuAAATATTATTAACGGTAAGGATATTİsmail 488
Y SNP probuAAATGTTTATTAACGGTAAGGATATTİskender'ın fotoğrafı. 647
MaskeAATATCCTTACCGTTA
ONUN 1-2X SNP probuGTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAACİsmail 488
Y SNP probuGTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAACİskender'ın fotoğrafı. 647
MaskeGTTTCGAACATGAAAA
28'LI YILLARX SNP probuTTAGGCATTTTTTTTTTTTTTTGAAAAİsmail 488
Y SNP probuTTAGCCATTTTTTTTTTTTTTTGAAAAİskender'ın fotoğrafı. 647
MaskeTTTTCAAGTAAAACAA

Tablo 3: rDNA SNP-FISH için prob ve maske dizileri. SNP pozisyonları kalın harflerle vurgulanmıştır. Maske oligonükleotidine bağlanan prob kısmının altı çizilidir. Uygun 3' konjuge florofor örnekleri listelenmiştir, ancak herhangi bir uyumlu florofor kullanılabilir.

5. Görüntüleme için numunelerin hazırlanması

  1. Diseksiyon stereomikroskobu altında çalışarak, numuneyi bir mikroskop lamına aktarmak için geniş delikli bir pipet kullanın.
  2. Forseps kullanarak, görüntüleme sırasında örnekleri bulmayı kolaylaştırmak için testisleri bir satırda düzenleyin (belirli bir yönlendirme gerekmez). Numuneyi bir lamel ile örtün. Fazla montaj ortamını çıkarmak için lamel kenarlarını bir mendille kurulayın.
  3. Lamelin kenarlarını oje ile kapatın. Oje'nin kuruması için slaytı oda sıcaklığında 10 dakika karanlıkta bırakın. Slaytlar konfokal görüntüleme için hemen kullanılabilir veya görüntülemeden önce 4 ° C'de bir aya kadar saklanabilir.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SNP genotiplemesinden elde edilen dizileme sonuçlarının, X ve Y rDNA lokusları arasındaki SNP farklılıklarını tespit etmesi beklenmektedir. Bu SNP'ler, sıralama kromatogramlarındaki SNP pozisyonlarının doğrudan değerlendirilmesiyle tespit edilir (Şekil 2). Dişi örneklerin diziliminin, SNP pozisyonunda, iki X kromozomu arasındaki SNP homozigotluğunu gösteren tek bir dizileme sinyaline sahip olması beklenir (Şekil 2A). Erkek numune dizileme sonuçlarının SNP pozisyonunda çift tepe noktasına sahip olması beklenmektedir (Şekil 2B). Dişi numune diziliminden belirlenen X kromozomu genotipine dayanarak, X olmayan varyantın bir Y kromozomu rDNA SNP olduğu sonucuna varılır (yani, Şekil 2'deki 18S SNP dizilimi için X = T, Y = C). Alternatif olarak, erkek numunede bir SNP pozisyonunda tek bir dizileme zirvesi, o SNP pozisyonunda erkek ve dişi rDNA lokusları arasındaki homozigotluğu gösterir ve bu pozisyon rRNA SNP-FISH için kullanılamaz.

SNP FISH protokolünü takiben, numuneler slaytlara monte edilerek görselleştirilebilir ve kapalı bir örtü kızağı altına yerleştirilebilir, ardından konfokal mikroskopi uygulanabilir. Tablo 3'te listelenen problar kullanılarak, Y'den türetilen rRNA sinyali Alexa Fluor 647 emisyonu ile tespit edilir ve X'ten türetilen rRNA sinyali Alexa Fluor 488 emisyonu ile tespit edilir. rRNA sinyallerinin çekirdekte gözlenmesi beklenir, bu da çekirdekteki DAPI açısından fakir delik olarak tanımlanabilir (Şekil 3A). Nükleolus, büyük çekirdekleri ve çekirdekçikleri nedeniyle germ hücrelerinde tanımlanması özellikle kolaydır (Şekil 3A). Zayıf sinyal tipik olarak sitoplazmada da bulunabilir (Şekil 3), ancak bu, tamamlayıcı bir SNP içeren rRNA'sı olmayan örneklerde de tespit edilebilen spesifik olmayan bir sinyaldir (yani, Y rDNA'sı olmayan hücrelerde Y sinyali veya X rDNA'sı olmayan hücrelerde X sinyali; Şekil 3B-C). Ayrıca, X ve Y rRNA'nın yapay olarak birlikte etiketlenmesi, X veya Y rDNA lokusları olmayan örneklerde bile bazen somatik merkezde tespit edilebilir (Şekil 3B-C, sarı oklar). Bu nedenle, lokusa özgü transkripsiyonu değerlendirmek için yalnızca nükleer sinyaller kullanılmalıdır. Çoğu hücrenin, özellikle somatik hücrelerin, yalnızca bir Y rRNA sinyaline sahip olması beklenir, bu da rRNA'nın yalnızca Y rDNA lokusundan kopyalandığını gösterir (Şekil 3A, sarı noktalı daire ve kırmızı ok)10,17. Bununla birlikte, X ve Y rRNA'nın birlikte ekspresyonu sıklıkla germ hücrelerinde, özellikle germ hattı kök hücrelerinde13 tespit edilir (Şekil 3A, beyaz noktalı daireler). Birlikte eksprese eden hücrelerdeki X ve Y rRNA sinyalleri bitişik olabilir ve tek bir nükleol oluşturabilir (Şekil 3A üst hücre) veya iki nükleol oluşturarak ayrı olabilir (Şekil 3A alt hücre). Şekil 3'teki örnekler, yalnızca iki SNP'yi (iki ITS1 SNP) hedefleyen prob setleri kullanılarak rDNA SNP-FISH'ten sağlanmıştır ve rDNA SNP-FISH için yalnızca iki SNP'nin gerekli olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, dört SNP'nin tümünü hedefleyen problar kullanılırken daha sağlam sinyaller gözlenir13.

Negatif kontroller, özellikle yöntemde ilk sorun giderme sırasında, probların yanlış SNP hedefiyle çapraz reaksiyona girmediğini doğrulamak için bu test için önemli bir katılımdır. X kromozomu negatif kontrolleri, rDNA delesyonu olan bir X kromozomu barındıran erkekler gibi, X kromozomu rDNA'sı olmayan herhangi bir durumu içerir. X kromozomu negatif kontrollerinin sadece Y rRNA sinyalini algılaması ve X rRNA'yı algılamaması beklenir (Şekil 3B). Y kromozomu negatif kontrolleri, Y kromozomu rDNA'sı olmayan herhangi bir durumu içerir. Bu koşulların bazı örnekleri, herhangi bir XX dişi dokusu, Y kromozomu olmayan erkeklerden alınan doku veya rDNA delesyonu15 olan bir Y kromozomu barındıran erkeklerdir. Y kromozomu negatif kontrollerinin yalnızca X rRNA sinyalini algılaması ve saptanabilir bir Y rRNA sinyaline sahip olmaması beklenir (Şekil 3C). Bu kontrollerin yalnızca prob özgüllüğünü belirlemek için değil, aynı zamanda herhangi bir sinyal arka planını veya artefaktını belirlemek için de önemli olduğunu unutmayın. Bu tür kontrollerde özgüllük sağlayan herhangi bir yeni prob veya tahlil koşulu, lokusa özgü rDNA transkripsiyonunu tespit etmek için doğru bir şekilde kullanılabilir.

Farklı genetik, gelişimsel veya çevresel koşullar, rDNA'nın yalnızca Y kromozomu rDNA lokusundan13,17 kopyalanma olasılığını değiştirebilir. Tek bir lokustan veya birden fazla lokustan rDNA transkripsiyonunun sıklığı ölçülebilir ve numuneler arasında doğrudan karşılaştırılabilir. rDNA lokus transkripsiyonundaki farklılıkları kantitatif olarak karşılaştırmak için, her hücre ayrı ayrı Y-baskın, Ko-baskın veya X-baskın olarak kategorize edilmelidir. Hücreler, yalnızca ilgili sinyal algılanırsa Y ve X baskın olarak kategorize edilir. Hem Y hem de X rRNA sinyallerine sahip herhangi bir hücre, bir sinyal diğerinden çok daha zayıf olsa bile, eş baskın olarak kabul edilir. Bu nedenle, çok güçlü X ve Y sinyalleri içeren hücreler, niteliksel olarak güçlü Y ve zayıf X veya güçlü X ve zayıf Y sinyallerine sahip hücrelerle aynı kabul edilir. Her kategorideki tüm örneklerdeki tüm hücrelerin toplam yüzdesi, ki-kare testi ile örnekler arasında karşılaştırılabilir. Bu tahlil, belirli bir rDNA lokusunun kopyalanıp kopyalanmadığını kalitatif olarak belirlemek için iyi çalışsa da, bireysel SNP-FISH sinyallerinin floresan yoğunluğunu doğrudan ölçerken numuneler arasında tutarlı değerlendirmeler gözlemlemedik. Bu nedenle, numuneler arasındaki FISH sinyal yoğunluğunun veya tek bir hücre içindeki X ve Y rDNA sinyallerinin nispi yoğunluğunun kantitatif değerlendirmelerinin yapılmasını önermiyoruz. Floresan yoğunluğundaki bu tutarsızlığın kaynağı belirsizdir, ancak bu, hedef rRNA'ların tümüne bağlanmayan maskelenmiş probların verimsiz bağlanmasından kaynaklanıyor olabilir.

figure-results-1
Şekil 1: SNP-FISH yönteminin diyagramı. (A) Geleneksel FISH antisens oligonükleotid probları, yalnızca bir nükleotid ile farklılık gösteren hedef olmayan RNA'larla çapraz reaksiyona girer. (B) SNP-FISH yöntemi, oligonükleotid probunun 3' bölgesine bağlı tamamlayıcı maske oligonükleotidi kullanır. Maske, hedef diziye bağlanmak için sadece 10 nükleotidi serbest bırakır. Maskelenmemiş bir prob bölgesi, bir veya daha fazla nükleotid tarafından farklılık gösteren hedef olmayan dizilere kararlı bir şekilde bağlanmaz. Maske, prob hedefe bağlandıktan sonra probdan ayrışır ve prob ile hedef arasında kararlı bir bağlanmaya izin verir. (C) Ortak bir maske ile birleştirilen farklı etiketlenmiş eşleştirilmiş SNP probları, çapraz reaksiyona girmeden tek bir nükleotid ile farklılık gösteren hedefleri özel olarak bağlar. (D) Farklı rRNA haplotiplerini spesifik olarak etiketlemek için birden fazla prob bir araya getirilebilir. Y1w1 Drosophila melanogaster suşunda X ve Y rDNA lokusları arasında dört SNP farkı karakterize edilmiştir. 18S rRNA'da bir SNP, 28S rRNA'da bir ve pre-rRNA'nın ITS1 kısmında iki SNP. SNP-FISH için kullanılan X ve Y'ye özgü rRNA haplotipleri görüntülenir. Dört rRNA SNP'de X rDNA varyantını hedefleyen problar, ortak bir florofora (yeşil) konjuge edilir ve Y rDNA varyantlarını hedefleyen problar, farklı bir florofora (macenta) konjuge edilir. Her SNP için ortak bir maske kullanılır (toplam dört). rRNA üzerindeki her SNP pozisyonunda SNP'ye özgü prob bağlanması, dört adede kadar FISH oligonükleotid probu ile X ve Y rDNA lokuslarından rRNA'yı spesifik olarak etiketleyebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Homozigot ve heterozigot rDNA SNP dizileme sonuçlarına örnekler. Örnek dizileme kromatogramları: (A) dişi ve (B) erkek örneklerden alınan DNA'nın 18S SNP dizilimi. 18S SNP konumu yıldız (*) ile gösterilir. Dişi numunedeki SNP pozisyonu için tek timin (T) sinyali, X kromozomu rDNA lokusundaki SNP pozisyonunda bir timin olduğunu gösterir. Erkek numunede timin ve sitozin (C) arasında bölünen SNP pozisyonundaki çift sinyal, Y kromozomu rDNA lokusunda SNP pozisyonunda bir sitozini gösterir (timinin X kromozom lokusunda olduğunu bilerek çıkarım). Sıralama sonuçları, bir plazmid düzenleyici yazılımı olan ApE kullanılarak görüntülendi19. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: SNP-FISH örnekleri, sadece iki SNP-FISH prob seti kullanılarak Drosophila testisinde sonuçlanır. (A) hem X hem de Y rDNA'sı, (B) sadece Y rDNA'sı veya (C) sadece X rDNA'sı olan hayvanların testislerinde SNP FISH örnekleri. Bu örneklerde yalnızca iki ITS1 rRNA SNP'yi etiketleyen prob setleri kullanıldı ve bu da rRNA SNP FISH'in en az iki hedef SNP ile çalıştığını gösterdi. Germ hücreleri büyük yuvarlak çekirdekleri ile ve somatik hücreler daha küçük ve daha az yuvarlak çekirdekleri ile tanımlanır. Germ hattı kök hücreleri, bir yıldız işareti (*) ile işaretlenmiş somatik merkezin hemen yanındaki konumlarıyla tanımlanır. Hem X hem de Y rDNA lokuslarından rDNA'yı kopyalayan germ hücreleri, hem X hem de Y nükleer FISH sinyalleri (Beyaz noktalı daireler, A-A'') ile tanımlanır. DNA'yı yalnızca Y rDNA lokusundan kopyalayan germ hücreleri yalnızca bir Y nükleer FISH sinyaline (Sarı noktalı daire) sahiptir. Yalnızca Y ifade eden somatik hücreler kırmızı bir okla işaretlenmiştir. X ve Y rDNA lokuslarının yapay olarak birlikte etiketlenmesi somatik merkezde (sarı ok) gözlemlenebilir. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: X kromozom lokusunun rRNA dizisi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Drosophila melanogaster dokularındaki X ve Y kromozomu rDNA lokuslarından türetilen 45S rRNA transkriptlerini ayırt etmek için SNP-FISH'i kullanmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokoldeki en kritik adım, SNP-FISH hedefleri olarak kullanılacak 45S SNP'lerin doğru genotiplendirilmesidir. Bilinen dört Drosophila 45S SNP'yi genotiplemek için primerler ve protokol sağlıyoruz, ancak diğer dizileme yöntemleri, alternatif olarak test için kullanılabilecek yeni SNP'leri ortaya çıkarabilir. X ve Y kromozomu rDNA lokusları arasında aynı olduğu tespit edilen herhangi bir SNP pozisyonu (yani, erkek DNA örneklerinde tek bir dizileme zirvesi vardır) SNP FISH için kullanılamaz. Bazı SNP pozisyonlarının tek bir rDNA lokusu içinde heterojen olduğu bulunabilir (yani, dizileme sonuçları XX numuneleri için tek bir SNP varyantı vermez veya XY numunelerinde sadece çok küçük bir ikinci dizileme zirvesi verir). Tek bir rDNA lokusu içinde heterojen olan SNP'ler de bu test için uygun değildir, çünkü varyantlardan biri iki rDNA lokusu arasında paylaşılacak ve tek bir lokustan veya çoklu lokustan transkripsiyonu ayırt edilemez hale getirecektir. Ayrıca, dişi sperm depolanması20 nedeniyle, çiftleşmiş dişilerden izole edilen DNA, Y kromozomu rDNA'sı içerebilir. Bu nedenle, XX dizileme analizi için çiftleşmemiş dişilerin kullanılması kritik öneme sahiptir. Daha da önemlisi, bu yöntem, en az iki lokusa özgü probun tespit için her bir rRNA molekülünü bağlamasını sağlamak için en az iki kromozoma özgü SNP gerektirir ve uygulamasını, aralarında en az iki ayırt edici SNP bulunan rDNA lokuslarına sınırlar. Daha fazla SNP'nin mevcudiyeti, her bir rRNA'yı bağlamak için daha fazla proba izin verir ve daha fazla sinyal etkinliği sağlayabilir. İlginç bir şekilde, sitoplazmaya aktarılan 18S ve 28S rRNA'lardaki SNP'leri hedefleyen iki prob çiftine rağmen, bu yöntem yalnızca nükleoldeki rRNA'yı etiketler (iki ITS1 hedef bölgesini içeren rRNA yalnızca nükleolde bulunur). Sitoplazmik FISH sinyalinin olmaması, münhasır olmayan iki olasılığı akla getirir: 1) 18S ve 28S probları tek başına sitoplazmik rRNA'yı tespit etmek için yetersizdir, çünkü belki de rRNA sitoplazma boyunca nükleolden daha fazla dağılmıştır veya 2) olgun ribozomal alt birimlere entegre edilmiş rRNA'lara, işlenmemiş 45S rRNA'ya göre daha düşük prob bağlama verimliliği vardır. 18S ve 28S rRNA'lar içindeki ek SNP'ler, sitoplazmik rRNA'ların SNP'ye duyarlı FISH tespitini sağlayabilir.

Lokusa özgü rRNA transkripsiyonunu değerlendirmek için diğer yöntemler, spesifik lokus6'ya atanan rRNA varyantlarının ekspresyonunu farklılaştıran rRNA dizileme yaklaşımlarını içerir. Benzer şekilde, qPCR, benzersiz tespiti mümkün kılacak kadar farklı olan rRNA varyantlarının ekspresyonunu farklı bir şekilde değerlendirebilir 5,21, ancak bu varyantların susturulmasının tüm bir rDNA lokusunun susturulmasını temsil edip etmediği belirsizdir. Bu yöntemler, belirli rRNA varyantlarının ekspresyonunu ölçmede etkili olabilirken, tek hücreli çözünürlükle yapılamazlar. Drosophila dokularında X kromozomu rDNA susturmasının heterojenliği, rDNA lokus transkripsiyonunda17 hücreden hücreye güçlü varyasyon olduğunu düşündürür ve bu değişkenliği açıklayabilecek tekniklere olan ihtiyacı vurgular. H3.3 histon varyantı10 veya Pol I transkripsiyon faktörü UBF22 gibi rDNA lokuslarında aktif transkripsiyon ile ilişkili görüntüleme özellikleri, tek hücreli çözünürlükle lokusa özgü rRNA transkripsiyonunu tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin her ikisi de, herhangi bir belirli rDNA lokusunda meydana gelen transkripsiyonu ayırt etmek için mitotik hücrelerin yoğunlaştırılmış kromozomlarını gerektirir. Drosophila hücrelerinde, X ve Y kromozomlarındaki rDNA lokusları, kromozom şekli10 ile tanımlanabilir, ancak insan hücrelerinde transkripsiyonel olarak aktif rDNA lokuslarının tanımlanması ayrıca kromozoma özgü etiketlerle birlikte boyamayı gerektirir22. SNP-FISH yöntemi, kromozoma özgü ortak etiketleme veya transkripsiyonel belirteçlerin etiketlenmesini gerektirmez ve herhangi bir hücre döngüsü aşamasında veya mitotik sonrası hücrelerde değerlendirilebilir, bu da çeşitli dokularda ve deneysel koşullarda kullanım için esneklik sağlar.

Bu rRNA SNP-FISH yöntemi, Drosophila rRNA'ları arasında ayrım yapan diğer SNP'lerle kullanım için modifiye edilebilir veya potansiyel olarak diğer organizmalardaki rDNA lokusları arasında ayrım yapan SNP'lere uygulanabilir. Bu yöntemin ikiden fazla rDNA lokusuna sahip organizmalara uygulanması, bir lokusun, başka herhangi bir rDNA lokusunda bulunmayan ve o lokustaki tüm 45S kopyaları arasında paylaşılan en az iki SNP içeren benzersiz bir rDNA varyant haplotipine sahip olmasını gerektirecektir. Bu gereklilik, yöntemin diğerlerine kıyasla yalnızca belirli bir lokustan transkripsiyonu belirleyebileceği anlamına gelir (yani, lokus 1'den rRNA SNP'leri, lokus 2 ve 3 tarafından paylaşılan SNP'lere kıyasla). Bununla birlikte, her bir rDNA lokusu uyumlu bir haplotipe sahipse, her bir lokusun transkripsiyonunu birer birer değerlendirmek için birden fazla deney birleştirilebilir. Bu protokolde kullanılan hibridizasyon sıcaklığının (37 °C) nispeten düşük sıkılığı, özellikle probun kısa, maskelenmemiş kısmı göz önüne alındığında güçlü prob bağlanmasına izin verir, ancak daha yüksek sıcaklıklarda (50-75 °C) hibridizasyonun bazı FISH problarının23 sinyalini arttırdığı gösterilmiştir. Daha yüksek hibridizasyon sıcaklıkları, maske ipliğinin yer değiştirmesini artırabilir ve prob bağlanmasını artırabilir, ancak çok yüksek sıcaklıklar prob-maske bağlanmasını kararsızlaştırabilir ve SNP özgüllüğünü kaybedebilir. Bu nedenle, SNP-FISH'in DNA'yı spesifik olarak etiketlemesini beklemiyoruz, çünkü prob bağlamayı sağlamak için çift sarmallı DNA hedeflerini eritmek için gereken sıcaklıklar aynı zamanda prob-maske bağlanmasını kararsızlaştıracak ve SNP'ye duyarlı hedef özgüllüğünü ortadan kaldıracaktır. Yine de, yeni rRNA SNP probları için hibridizasyon sıcaklığının optimizasyonu, özellikle yalnızca iki SNP bölgesi mevcut olduğunda sinyali artırabilir. X kromozomu rDNA susturma kaybı, Drosophila13'te rDNA kopya sayısının azalması ile ilişkilidir, bu nedenle diğer sistemlerde lokusa özgü rRNA transkripsiyonunu karakterize etmek için SNP-FISH tahlillerinin geliştirilmesi, rDNA ve ribozom fonksiyonunun bütünlüğünü değerlendirmek için yararlı bir araç olarak hizmet edebilir. Ayrıca, bu yöntem Drosophila'da bir delesyon varyantı ile kullanım için modifiye edilmiştir ve bu tek yapısal rRNA varyantı tespit için uygundur (belki de bir prob maskesi olmadan daha büyük hedef bağlanma afinitesi nedeniyle)17. Potansiyel olarak SNP varyantları ile birleştirilen yapısal rRNA varyantlarının kullanılması, diğer sistemlerde uygulama potansiyelini genişletir. rDNA lokus transkripsiyonunu düzenleyen mekanizmalar büyük ölçüde belirsizliğini koruduğundan, rRNA SNP-FISH'in esnekliği ve diğer sistemlere potansiyel uyarlanabilirliği, onu rRNA transkripsiyonunu araştırmak için gelecekteki çalışmalar için güçlü bir araç haline getirmektedir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynakları için Bloomington Drosophila Stok Merkezi, Kyoto Drosophila Stok Merkezi ve FlyBase'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Stony Brook Üniversitesi Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Bölümü ve Rönesans Tıp Okulu (JON) tarafından sağlanan başlangıç fonları ile desteklenmiştir.

Materials

Drosophila melanogaster

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PTC Tempo 96 Termal DöngüleyiciBio Rad 12015382Herhangi bir termal döngüleyici
0,2 mL 8 şerit düz kapaklı PCR tüpleriVWR89133-912Herhangi bir uyumlu tüp kullanılabilir
1 kb DNA merdiveniNEBN3232SSekanslamayı kontrol ederken kullanmak için Jel elektroforezi ile PCR amplikon boyutu
1,5 mL dereceli mikrosantrifüj tüpleriUSA Scientific1615-5510Herhangi bir sertifikalı RNase içermeyen tüp,
2 mM dNTP KarışımıThermoFisher ScientificR0241
50x TAE TamponBio Rad1610743Jel elektroforezi için kullanılır. Herhangi bir TAE tamponu kullanılabilir.
5M NaClHerhangi bir NaCl
AgaroseVWR97064-250Herhangi bir Agaroz kullanılabilir
ApE - Bir plazmid Düzenleyici yazılımN/AN/A
https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ Şeffaf ojeHerhangi bir perakendeciden alınan herhangi bir oje kullanılabilir
Kapak camı, No. 1 KalınlıkThomas Scientific6672A38
Deiyonize FormamidFisher ScientificNC9569627
Dekstran Sülfat SodyumSigma AldrichD8906-10G
DreamTaq Yeşil PCR Master MixThermoFisher ScientificK1081
Dumont #5 forsepsGüzel Bilim Araçları11252-20Numuneleri incelemek için kullanılır
EDTA (0.5M), Ph 8.0ThermoFisher ScientificR1021Karşılaştırılabilir herhangi bir ürün kullanılabilir
EtanolVWR89125-172Herhangi bir 200 geçirmez Etanol kullanılabilir. Rnaz içermeyen koşullar için geçirgenleştirme ve temizleme için% 70 etanole seyreltme için kullanılır
Etidyum BromürThermoFisher Scientific15585011
Yatay Mini Jel Elektroforez SistemiFisher Scientific14-955-170Herhangi bir jel elektroforez sistemi kullanılabilir
KimwipesFisher Scientific06-666
Mikro Test Boyama Kabı Elektronu Mikroskopi Bilimleri71564Numuneleri incelemek için kullanılır
Nutating çalkalayıcıSigma AldrichBMSB3D1020Herhangi bir somunlama çalkalayıcı kullanılabilir
ParafilmUSA Scientific3023-4526
Fosfat Tamponlu Salin (10X) pH 7.4, RNaz İçermeyenYaşam TeknolojileriAM9624
Pierce %16 Formaldehit (a/h), Metanol İçermeyenYaşam Teknolojileri28908
Hassas Genel Amaçlı Su BanyosuYaşam TeknolojileriTSGP02Herhangi bir su banyosu kullanılabilir
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen28704Herhangi bir jel ekstraksiyon kiti kullanılabilir
Rekombinant Proteinaz K Çözeltisi (20 mg/mL)InvitrogenAM2546Karşılaştırılabilir herhangi bir ürün kullanılabilir
Rnaz içermeyen UltraPure BSAThermoFisher ScientificAM2618
S. cerevisiae tRNASigma AldrichR8759
SSC (20X), RNaz içermeyenFisher ScientificAM9763
Triton-X 100Yaşam TeknolojileriA16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl Tampon, pH 7.5ThermoFisher Scientific15567027Karşılaştırılabilir herhangi bir ürün kullanılabilir
Vanadil ribonükleozit
Bloomington Drosophila Stok Merkezi1495
Zeiss LSM 980 konfokal mikroskopZeiss mikroskobuUyumlu emisyon ve algılamaya sahip herhangi bir konfokal mikroskop kullanılabilir
Zeiss Stemi 2000-C Stereo Mikroskop ve ışık kaynaklıMikroskop Merkezi455053Herhangi bir steromikroskop kullanılabilir
kullanılabilir kullanılabilir veya herhangi bir kaynaktan hazırlanabilir kompleksi NEB S1402S VECTASHIELD montaj ortamı 10977023 UltraPure DNase/RNase İçermeyen Damıtılmış Su Ömrü Teknolojileri DAPI Vector Laboratories H-1200-10 VWR Superfrost Mikroskop Slaytı VWR 48311-601 y[1]w[1] hattı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baßler, J., Hurt, E. Eurokaryotic ribosome assembly. Ann Rev Biochem. 88 (1), 1-26 (2018).
  2. Hall, A. N., Morton, E., Queitsch, C. First discovered, long out of sight, finally visible: ribosomal DNA. Trend Genet. 38 (6), 587-597 (2022).
  3. Srivastava, R., Srivastava, R., Ahn, S. H. The epigenetic pathways to ribosomal DNA silencing. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 545-563 (2016).
  4. Kuo, B. A., Gonzalez, I. L., Gillespie, D. A., Sylvester, J. E. Human ribosomal RNA variants from a single individual and their expression in different tissues. Nucl Acid Res. 24 (23), 4817-4824 (1996).
  5. Tseng, H., et al. Mouse ribosomal RNA genes contain multiple differentially regulated variants. PLoS ONE. 3 (3), e1843(2008).
  6. Locati, M. D., et al. Expression of distinct maternal and somatic 5.8S, 18S, and 28S rRNA types during zebrafish development. RNA. 23 (8), 1188-1199 (2017).
  7. Roussel, P., André, C., Comai, L., Hernandez-Verdun, D. The rDNA transcription machinery is assembled during mitosis in active NORs and absent in inactive NORs. J Cell Biol. 133 (2), 235-246 (1996).
  8. Pontes, O., et al. Postembryonic establishment of megabase-scale gene silencing in nucleolar dominance. PLoS ONE. 2 (11), e1157(2007).
  9. Earley, K. W., et al. Mechanisms of HDA6-mediated rRNA gene silencing: suppression of intergenic Pol II transcription and differential effects on maintenance versus siRNA-directed cytosine methylation. Gene Dev. 24 (11), 1119-1132 (2010).
  10. Greil, F., Ahmad, K. Nucleolar dominance of the Y chromosome in Drosophila melanogaster. Genetics. 191 (4), 1119-1128 (2012).
  11. Preuss, S., Pikaard, C. S. rRNA gene silencing and nucleolar dominance: Insights into a chromosome-scale epigenetic on/off switch. Biochim Biophys Acta. 1769 (5-6), 383-392 (2007).
  12. Sharifi, S., Bierhoff, H. Regulation of RNA pPolymerase I transcription in development, disease, and aging. Ann Rev Biochem. 87 (1), 1-23 (2018).
  13. Lu, K. L., Nelson, J. O., Watase, G. J., Warsinger-Pepe, N., Yamashita, Y. M. Transgenerational dynamics of rDNA copy number in Drosophila male germline stem cells. eLife. 7, e32421(2018).
  14. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  15. Ritossa, F. M. Unstable redundancy of genes for ribosomal RNA. Proc Natl Acad Sci. 60 (2), 509-516 (1968).
  16. Nelson, J. O., Slicko, A., Yamashita, Y. M. The retrotransposon R2 maintains Drosophila ribosomal DNA repeats. Proc Natl Acad Sci. 120 (23), e2221613120(2023).
  17. Warsinger-Pepe, N., Li, D., Yamashita, Y. M. Regulation of nucleolar dominance in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (4), (2020).
  18. Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells. Nat Meth. 10 (9), 865-867 (2013).
  19. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, a plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Front Bioinfo. 2, 818619(2022).
  20. Qazi, M. C. B., Heifetz, Y., Wolfner, M. F. The developments between gametogenesis and fertilization: ovulation and female sperm storage in Drosophila melanogaster. Dev Biol. 256 (2), 195-211 (2003).
  21. Rogers, M. J., et al. Structural features of the large subunit rRNA expressed in Plasmodium falciparum sporozoites that distinguish it from the asexually expressed subunit rRNA. RNA. 2 (2), 134-145 (1996).
  22. Potapova, T., et al. Epigenetic control and inheritance of rDNA arrays. bioRxiv. , (2024).
  23. Tang, Y. Z., Gin, K. Y. H., Lim, T. H. High-temperature fluorescent in situ hybridization for detecting Escherichia coli in seawater samples, using rRNA-targeted oligonucleotide probes and flow cytometry. Appl Environ Microbiol. 71 (12), 8157-8164 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SNP FISH DetectionRibosomal RNA TranscriptionDrosophila MelanogasterrDNA LociSingle Nucleotide PolymorphismLocus Specific rRNAFluorescence In Situ HybridizationGerm Cell NucleolusChromosome Specific TranscriptionTestes Dissection

Related Articles