Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tek Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Sinir Tüpü Organoidi Üretimi İçin Sağlam ve Tekrarlanabilir Bir Protokol

463 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67883

⸱

19 Aralık 2025

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

Bu makalede

Özet

Fare embriyonik kök hücrelerinden türetilen üç boyutlu sinir tüpü organoidleri (NTO'lar), erken gelişim sürecinde merkezi sinir sistemini incelemek için değerli araçlardır. Burada, NTO'ların in vitro yetiştirilmesine yönelik optimize edilmiş bir protokolün adım adım gösterimi sunuluyor; bu protokol güvenilir ve tekrarlanabilir NTO üretimi için istikrarlı kültür koşulları ve sorun giderme stratejileri sunuyor.

Özet

Memelilerin gelişimi, doğru desen oluşumu ve morfogenez için hassas konsantrasyon ve zamana bağlı sinyal gerekliliğiyle karakterize edilen son derece karmaşık bir süreçtir. Önemli teknolojik gelişmeler ve toplanan bilgilere rağmen, memeli gelişiminin birçok yönü hâlâ anlaşılmazdır. Tüm organizma incelenirken, bireysel yolların etkilerini veya dış uyaranların çevredeki dokuların ve faktörlerin girişimini nasıl yönlendirdiğini ayırmak zorlaşır. Bu karmaşıklığı ele almakta, organoidler gibi üç boyutlu (3D) in vitro modeller değerli araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Embriyonik kök hücrelerden (ESC) veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) türeyen organoidler, ifadeyi ve işlevselliği açısından in vivo muadillerine çok benzeyen doku benzeri özellikler sergiler. Önemli olarak, kontrollü deneysel ortamda manipülasyon ve kapsamlı biyolojik çalışmalar için erişilebilirlik sunarlar. Pluripotent kültürlerden kaynaklanmalarına rağmen, organoid sistemler genellikle heterojenlik ve önemli değişkenlik sergiler; bu da karmaşık ve karmaşık biyolojik soruları incelerken faydalarını sınırlar. Bu nedenle, yüksek kaliteli tekrarlanabilir veriler, kullanılan malzemelerin azalması ve karmaşık olguların incelenmesine olanak tanıyan prosedürleri uyumlu hale getirmeye yönelik ayrıntılı protokollere acil ihtiyaç vardır. Bu bağlamda, sinir tüpü organoidlerinin (NTO'lar) in vitro yetiştirilmesi için optimize edilmiş bir protokol burada sunulmaktadır. Kararlı kültür koşulları üreterek ve kapsamlı sorun giderme stratejileri sunarak bu protokol, sinirsel indüksiyon, desenleme ve erken merkezi sinir sistemi gelişimi gibi ilgili bilimsel soruları incelemek için yeterli bir model olan güvenilir ve tekrarlanabilir NTO'ların oluşturulmasını sağlar.

Giriş

Memeli gelişimi, tek bir totipotent kök hücreden başlayarak, desen oluşumu ve morfogenez 1,2'nin indüklenmesini içeren karmaşık bir süreçtir. Bu gelişme, hücreler ile çevreleri arasındaki dinamik etkileşimleri yönetmek için sıkı şekilde düzenlenmiş hücresel programlar gerektirir. Kök hücreler, morfogengradyanları 3, mekaniksınırlar 4, hücresel çoğalma ve çevresel yeniden şekillendirme gibi sistemik ve yerel sinyalleri algılama, entegre etme ve yanıt verme gibi içselyeteneklere sahiptir. Dış mekansal zamansal ipuçları, ilk başta homojen dokularda çok hücreli yanıtlar ile karmaşık yapıların kesin oluşumunu sağlar. Kök hücreler, kendini yenileme 6,7 ve farklılaşma yetenekleriyle ayırt edilir ve embriyonik gelişim ve yetişkin doku onarımında kritik bir rol oynar; ana tipler arasında embriyonik kök hücreler (ESC'ler), yetişkin kök hücreler (ASC) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) bulunur.

ESC'ler, blastosistin iç hücre kütlesinden (ICM) çıkarılır ve genellikle iki boyutlu (2D) bir ortamda, besleyici hücrelerde veya ekstraslülerici matrikslerde özel kültür ortamları kullanılarak ekstrahücre ortamında kültürlenir8. Son yıllarda, daha gerçekçi hücre kültürü koşulları ve teknolojilerine olan ihtiyaç büyük ölçüde arttı, böylece temel biyomedikal süreçleri incelemek için üç boyutlu (3D) hücre ve doku modellerioluşturuldu9. Özellikle gelişimsel biyolojide, organoidler gibi bu 3B modeller, doku morfogenezi ve organogenezin ex vivo9 modellenmesi için sağlam bir yöntem sunar. Organoidler, simetri bozma ve desen oluşumu yoluyla kendiliğinden karmaşık 3D yapılara dönüşen çoğalan kök hücrelerin kendi kendini organize etmesi yoluyla oluşur. Bu süreç benzerdir, ancak in vivo gözlemlenenle aynı değildir ve çoğunlukla dış rehberlik olmadan, iç dinamikler ve etkileşimlerle yönlendirilir10. Organoidler, gerçek organların yapısını ve işlevini yakından taklit ettiklerinden, memeli biyolojisinin geleneksel 2B hücre kültürlerine kıyasla daha doğru bir temsilinisağlayabilirler. Ayrıca, temel faydalardan biri etik avantajdır; organoidler hayvan modellerine olan ihtiyacı azaltır ve hayvan testleriyle ilgili endişelerigiderir 12,13. Ayrıca, organoidler yüksek verimli ilaç taraması için bir platform sunarak ilaç etkinliği ve toksisitesinin tahminini artırır. Ancak, organoidlerin kullanımıyla ilgili birkaç zorluk da vardır. 2D kültürlerden daha gerçekçi olsalar da, canlı bir organizma içindeki tüm organların karmaşıklığını ve etkileşimlerini tam olarakyansıtamazlar. Ayrıca, aynı tür hücrelerden türetilse bile organoitler arasında önemli değişkenlik gözlemlenebilir ve bu da deneysel sonuçlarda tutarsızlıklara yolaçabilir 15. Bu nedenle, organoidlerin sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde kültürlenmesi gereklidir ve ileri teknik beceriler, özel ekipman ve ayrıntılı protokoller gerektirir.

Sinir sistemi, vücuda sinyal gönderip alarak eylemleri koordine etmek ve duyusal bilgileri işlemek, böylece hareket, duyu, düşünme ve kalp atışı ile sindirim gibi otonom işlevler dahil olmak üzere tüm gerekli işlevleri kontrol edip koordine eden karmaşık bir ağdır. Beyin ve omurilikten oluşan merkezi sinir sisteminin öncüsü sinir tüpüdür. Erken sinir tüpü gelişiminde sinir yapılarının nasıl oluştuğunu ve işlevini anlamak, çeşitli nörolojik bozukluklar ve gelişimsel anormallikler hakkında içgörüler elde etmek için çok önemlidir. Nörogelişimsel bozuklukları, özellikle etik nedenlerle insan deneklerden kaynaklandıklarında in vivo olarak incelenmesi zordur. Beyinorganoidleri gibi sinir organoidleri 16,17, insan beyin dokusunu yakından taklit eden çok yönlü ve erişilebilir modeller sunarak sinir sistemi gelişimi ve hastalıkların anlaşılmasını önemli ölçüde geliştirmiştir. Bu üç boyutlu yapılar, pluripotent kök hücrelerden (PSC) türetilir ve beyin gelişiminin farklı yönlerini, farklı beyin bölgelerinin oluşumu, hücresel çeşitlilik ve karmaşık sinir ağlarınıçoğaltır 16,18,19. Araştırmacıların gelişim evrelerini gerçek zamanlı gözlemlemesine ve temel düzenleyici mekanizmaları incelemesine olanak tanıyarak, bu organoidler normal beyin gelişimi hakkında derin içgörüler sunar. Beyin organoidleri ayrıcamikrosefali 16,21, Zika virüsüenfeksiyonu 22, otizm spektrumbozuklukları 23 gibi nörogelişimsel19 ve nörodejeneratifhastalıkların (20) modellenmesini sağlar; hastalık mekanizmalarını aydınlatır ve potansiyel terapötik hedefleri belirler. Ayrıca, beyin organoidleri, ilaç testi ve geliştirme için değerli platformlar olarak hizmet veriyor; insan beyni benzeri bir ortamda ilaç etkinliği ve toksisitesinin değerlendirilmesini kolaylaştırıyor ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımlarını hızlandırıyor. Ayrıca, gen-çevre etkileşimlerini incelemek için kontrollü bir ortam sağlar ve genetik ve çevresel faktörlerin etkileşiminden kaynaklanan karmaşık hastalıkların anlaşılmasını artırır. Ancak, beyin organoidleri gibi sinirsel organoidler genellikle hücre topluluklarından oluştuğundan, genellikle önemli hücresel heterojenlik ve deneysel sonuçlarda değişkenlik gösterirler; bu da üretilen verilerin yorumlanabilirliğini etkiler ve araştırmacılar için önemli bir zorlukoluşturur 17. Bu nedenle, protokol optimizasyonu ve hassas kalite kontrol kriterleri, in vivo durumu yeterince temsil eden değerli verilerin zayıflatılması için kritiktir.

Meinhardt vemeslektaşları 24, ilk olarak tek embriyonik kök hücrelerden (ESC) oluşan ve organoid heterojenliği büyük ölçüde en aza indiren erken sinir tüpü gelişimini taklit eden bir klonal nöral organoid protokolünü raporlayarak kritik bir etki yarattı. Bu yenilik, araştırmacıların gelişim süreçlerini ve mekanizmalarını, ayrıca sinir desenlerini hassas ve tanımlanmış bir ortamda, olağanüstü çözünürlükle incelemelerine olanak tanır. Şimdiye kadar, birçok laboratuvar, çoğunlukla fare veya insan kökenli olan, sinir tüpünün farklı bölümlerini ve gelişimini taklit eden sinir organoidleri geliştirmiştir; bu bölüm25'te özetlenmiştir. Ancak, mevcut bilgilere dayanarak, Meinhardt ve ark.24 tarafından oluşturulan protokol, NTO'ların tek bir hücreden güvenilir şekilde oluştuğu, kendi kendini organize ettiği ve tek, küresel retinoik asit (RA) darbesini takip ederek dorsoventral kaderlere verimli şekilde düzülüşünü oluşturduğu tek yöntemdir; bunlar, örneğin Sonic Hedgehog Agonist (SAG)26 gibi diğer ventralizasyon faktörleri eklenmemiştir, ya da gradyan oluşumu nedeniyle mekânsal bilgi sağlayan mikrofluidik odaların kullanımı. Burada sunulan protokol, Krammer ve ark.26'da sağlanan Meinhardt ve ark.24'ten uyarlanmıştır. Bu protokolde, tek fare ESC'leri hücre kültür matriksine yerleştirilir ve tanımlanmış nörodifferensiyon koşullarına maruz bırakılır. İki gün içinde bu hücreler klonal olarak genişler ve epitelize olur; böylece tek bir lümen ve apikal bazal tabakalı hücrelerle 3D yuvarlak-ellipsoid bir yapı oluşturur. 2. günde, sinyal molekülü RA'nın küresel olarak uygulanan 18 saatlik darbesi sinirsel farklılaşmayı artırır, NTO'ları orta beyinden arka beyin/servikal omurilik seviyelerine posterionize eder ve 6. güne kadar tek bir fonksiyonel zemin plakasının oluşumunu tetikler; bu da NTO'yu ventraldan dorsala doğru şekillendirir.

Optimize edilmiş protokol birkaç temel avantaj sunar. İlk üç gün içinde sağlam epitelizasyonu sağlar ve yaklaşık 200 μm çapında nispeten küçük, küresel dokular oluşturur; her biri tek bir lümen içerir. Organoidler tek hücrelerden klonal olarak ortaya çıkar ve serumsuz, kimyasal olarak tanımlanmış bir kültür ortamında korunur. Altı gün içinde, pluripotent kültürlerden kademeli olarak sinirsel farklılaşma sağlanır ve 6. güne kadar organoidlerin ön orta beyin kimliği göstermesi ve küresel RAdarbesi 26 sonrası dorsoventral desenli arka beyin veya servikal omurilik benzeri yapılar ortaya çıkar.

Tekrarlanabilirlik ve verimliliği artırmak için orijinalprotokol 22,25'ten farklı birkaç unsur uyarlanmış ve farklıdır. Bunlar arasında değiştirilmiş ESC kültür koşulları, azalmış giriş hücresi, geliştirilmiş bir farklılaşma ortamı ve 0-2. günlerde Noggin takviyesini (zaten 26 yılda kullanılmış) çıkaran ayarlanmış bir farklılaşma protokolü yer almaktadır. Ayrıca, tohumlama yoğunluğu 96 kuyu plakalarında kullanılmak üzere optimize edilmiş ve yüksek verimlilikli analizlere olanak sağlamaktadır. Bu iyileştirmeler birlikte, NTO oluşumu ve desen verimliliğinde %40 artışa yol açmıştır; bu verimlilik başta ~%4024 olan iken, güncellenmiş versiyonda şimdi ~%80%26'ya ulaşmıştır.

Burada (Şekil 1), hücre kültür matrisinde sağlam ve tekrarlanabilir bir NTO'nun oluşturulmasına olanak tanıyan optimize edilmiş bir protokolün ayrıntılı tanımı sunulmaktadır. Protokol, ESC'lerin ilk tohumlanmasından farklılaşma testleri için başlamasından sonraki bakım, fiksasyon ve analizlere kadar NTO işlemesinin tüm aşamalarını kapsar. Ayrıca, NTO morfolojisinin günlük görsel değerlendirmesi yoluyla kalite kontrolü için rehberler ve doğru desen ve sinirsel farklılaşmanın doğrulanması için antikor boyama kullanılarak organoid kimliğinin kritik karakterizasyonunu içerir. Ayrıca, protokolün her adımında kritik bir değerlendirme yapılmasına olanak tanıyan kapsamlı sorun giderme yaklaşımları sunulur ve bu da deneysel protokollerin tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini sağlamak için gereklidir. Bu ayrıntılı talimatlar, potansiyel sorunları tespit edip çözmeye, hataları en aza indirmeye ve sonuçları optimize etmeye yardımcı olur. Bu, bilimsel deneylerin bütünlüğünü korumak ve diğer bilim insanlarının çalışmayı başarıyla tekrarlayıp elde edilen verilerden kapsamlı sonuçlar çıkarmasını sağlamak için hayati öneme sahiptir.

figure-introduction-1
Şekil 1: Protokolün genel özeti. (A) Geçiş ESC'leri (bkz. adım 1.1). (B) Hücre kültürü matrisini alıp tek ESC'lerin tohumlanarak NTO'lara ayrılması (bkz. adım 1.2). (C) Aliquoteing RA ve RA tedavisi (bkz. adım 2). (D) RA çıkarımı ve günlük medyum değişimi rutini (bkz. adım 3). Bu figür BioRender.com ile oluşturuldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Herhangi bir sonraki işlem (medium değişimi, tedavi, fiksasyon vb.) öncesinde hücreleri ve NTO'ları günlük olarak kalite değerlendirmesi için kontrol edin. Hücrelerin doğrudan havaya maruz kalmasını gerektiren tüm prosedürler, sterilliği sağlamak ve kültürün kontaminasyonunu önlemek için bir biyogüvenlik dolabında yapılmalıdır.

1. NTO farklılaşması için fare ESC'lerinin bakımı, aktarılması ve tohumlanması

  1. Geçiş
    1. ESC'leri, %0,15 jelatinle önceden kaplanmış hücre kültürü tabaklarında veya %0,15 jelatinle kaplanmış 6 kuyunun kuyularında 37 °C'de 30 dakika boyunca kalın.
    2. Her 2-3 günde bir geçiş ESC'leri yapılır, 2. günden itibaren günlük orta seviye değişimi yapılır.
    3. Tüm reaktifleri (Ortam, PBS, enzim çözeltisi) en az 21 °C ve en fazla 37 °C ile önceden ısıtın.
    4. Hücreleri faz kontrast mikroskobu altında kontrol edin (bkz. temsil görüntüler, Şekil 2). Kolonilerin uygun boyut ve uygun morfolojiye sahip olduğundan emin olun (Şekil 2A), aynı zamanda yemeğin tabanına yapıştıklarını da doğrulayın.
      NOT: Fare ESC'lerinin %10'undan fazlası farklılaşmışsa kültürü atın (Şekil 2B) ve ESC'leri tohumlandırmadan önce en az iki kez geçmeli olan yeni çözülmüş bir kültür hazırlayın. Deneyimli araştırmacılar, görsel değerlendirmeyle (bkz. Mulas ve ark.28) veya belirteç ekspresyonu için antikor boyama yoluyla (örneğin, OCT4, ayrıca bkz. Ying ve ark.29) karar verebilirler.
    5. Kültür tabağının/tabakının kapağını açın, hafifçe eğin ve dikkatlice ortamı aspire edin. Hücreleri mümkün olduğunca kısa süre kuluçka makinesinden uzak tutun. Kültürün kurumasını önlemek için ortamsız hücreleri mümkün olduğunca kısa tutun.
    6. Kolonileri 500 μL önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın (6 kuyruklu plakanın tek bir kuyusunda hücrelere ekleyin) ve hemen tekrar aspirasyon yapın.
      NOT: Bu adım çok önemlidir çünkü: i) ESC ortamının (2iLIF) taşıması farklılaşma testinden önce kaçınılmalıdır (yoksa NTO oluşumu engellenecektir), ii) kültür ortamında FBS veya BSA ayrışmayı durdurabilir. Bu, farklı bir ESC ortamında kültürlenmiş, FBS veya BSA içeren ESC'ler için geçerlidir.
    7. 500 μL önceden ısıtılmış enzim çözeltisi ekleyin ve hücreleri tekrar kuluçka içine aktarın.
    8. Hücreleri 37 °C'de 3 dakika boyunca zamanlayıcı kullanarak kuluçka yapın.
    9. İnkubasyon süresinden sonra plakayı çıkarın ve hücreleri faz kontrast mikroskobu altında kontrol edin.
      NOT: ESC'ler kültür plakasından ayrılmış olmalıydı; Eğer olmazsa, tabağa sert ama dikkatlice dokunun (Şekil 2C).
    10. 1 mL N2B27 ortamı (Tablo 1) doğrudan hücrelere pipet yaparak ekleyin.
      NOT: Ortam (N2B27) hazırlanırken, glutamin 37 °C'de maksimum 5-10 dakika ve tercihen oda sıcaklığında tutulur. ESC'ler tabaktan yıkanmalı, kültür kabında 'boş' alanlar bırakılmalıdır.
    11. P1000 pipeti kullanın ve tabağı hafifçe eğin ki kültür kabına yapışan tüm koloniler yıkansın.
    12. Hücre kümelerini ayırmak için plakayı hafifçe eğin, pipet ucunu (P1000) kabın ortasına yerleştirin, ucunu tabağın altına bastırın ama dik eksenden biraz dışarı basın ve hücreleri dışarı çıkarın. Hücre kümelerini kırmak için beş-on kez tekrarlayın.
    13. Hücrelerin faz kontrast mikroskobu altında (Şekil 2D) doğru şekilde tek hücrelere ayrıldığından emin olun ve hala kümeler varsa tekrar yapın.
    14. Tam ayrışmadan sonra, hücre süspansiyonu temiz, steril 15 mL'lik konik santrifüj tüpüne aktarılır, hücrelerin kültürlendiği boş kuyu 1 mL N2B27 ortamı ile yıkar ve hücre süspansiyonu ile aynı konik santrifüj tüpüne aktarılır.
    15. Hücreleri 5 dakika boyunca 453 x g ile ultrasantrifüjde spin yapın.
    16. Süpernatantı dikkatlice aspire edin.
    17. Hücreleri uygun miktarda N2B27 ortamında (örneğin, 1 mL) yeniden süzülün ve hücreleri sayın (NTO'lara farklılaşma testi için önerilen hücre sayıları için Tablo 2'ye bakınız).
  2. ESC'lerin sinir tüpü organoidlerine (NTO) ayırılması
    1. Aliquoteing hücre kültürü matrisi
      1. Hücre kültürü matrisi şişesini 4 °C'de buz üzerinde gece boyunca eritin (asla oda sıcaklığında veya elle çözmeyle). Hücre kültür matrisini 4 °C'de gereğinden fazla süre beklemeyin; Aliquot ve işlevselliğini korumak için mümkün olan en kısa sürede dondurma.
      2. Biyogüvenlik dolabında, hücre kültürü matris şişesini taze buz üzerinde tutarken buzun üzerine 1.5-2 mL mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin.
      3. Erimiş hücre kültürü matrisini dikkatlice karıştırın, böylece baloncuklar jelifikasyondan sonra kuyuyu/kabadan ayrılmaya neden olabilir.
      4. Aliquot hücre kültür matrisini istenen hacimde (0.5-1 mL önerilir) ve -20 °C'de dondurularak daha fazla kullanıma kadar alınır. Oda sıcaklığında uç ucu alikotlar arasında değiştirmekten kaçının, çünkü oda sıcaklığında uçlar hücre kültür matrisinin içinde katılaşmasına ve önemli bir kayba yol açmasına neden olabilir. Bunun yerine, pipet uçlarını kullanmadan önce buzdolabında saklayarak 4 °C'ye kadar soğutun.
    2. Tek hücrelerin bir hücre kültür matrisine tohumlanması
      1. Gerekli hücre sayısını (100 hücre/μL hücre kültür matrisleri, bkz. Tablo 2) nicelikle hesaplayın.
      2. Uygun hücre numarasını (hücre süspansiyonu) temiz 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın ve üzerine 1 mL N2B27 ekleyin.
      3. Santrifüjde 453 x g ile hücreleri 5 dakika boyunca döndürün.
      4. Süpernatantı aspire edin ve konik santrifüj borusunu buzun üzerine yerleştirin.
      5. Hücre pelletini uygun miktarda çözülmüş ve sıvı hücre kültürü matrisinde dikkatlice buz üzerinde askıya alın, böylece kabarcık oluşumunu önleyin.
      6. Uygun miktarda hücre kültürü-matris hücre süspansiyonunu, görüntüleme için en uygun olan cam tabanlı veya plastik tabanlı bir çanakta ince bir tabaka halinde yayın (bkz. Tablo 2, Şekil 3A-C), çok kuyu plakalarının duvarlarına dokunmadan. Yüksek yüzey gerilimi nedeniyle, hücre kültürü matris damlası, daha önce dokunulmuş durumda kuyunun merkezinden duvarlara hareket edebilir ve bu da hücrelerin/NTO'ların yetersiz dağılımına yol açar.
        NOT: Çok kuyruklu plakalar kullanıyorsanız, önce P20 (96 delikli plaka) veya P200 pipet ucu kullanarak hücre kültürü matrisi dairesi çizin ve ardından hücre kültürü matris-hücre süspansiyonu ile 'doldurun' (Şekil 3B).
      7. Çok kuyu tabağı/kabı hücre kültürü matrisinin katılaşması için 37 °C sıcaklıkta kuluçka makinesine yerleştirin. Daha küçük miktarlarda μL hücre kültürü matrisi başına 1 dakika, 40 μL veya daha fazla için maksimum 15 dakika tahmin edin.
      8. İnkubasyon süresinden sonra tabağı çıkarın ve uygun miktarda ortam ekleyin ( bkz. Tablo 2). Hücre kültür matrisindeki ESC'ler, tohumlama sırasında NTO'lara farklılaşma testi sırasında veya ortamın yerine geçerken kurumamamalıdır. Jelifikasyondan sonra, ortam mümkün olan en kısa sürede uygulanmalıdır. Jelifikasyon genellikle 1 μL hücre kültürü matrisi başına 37 °C'de 1 dakikada, ince bir tabaka olarak yayıldığında ise 40-100 μL hücre kültürü matrisi için maksimum 15 dakika içinde tamamlanır.
        NOT: Hücre kültür matriksinde ESC'lerin kurumasını önlemek için, çok kanallı pipetli 96 kuyu plakasından maksimum 8 kuyunu veya diğer herhangi bir çok kuyu plakasından bir 35 mm cam tabanlı çanak/kuyuyu işleyin. Hücreleri mümkün olduğunca kısa süre kuluçka makinesinden uzak tutun.
      9. Hücre kültür matrisi içindeki tohumlama yoğunluğunu ve hücre dağılımını faz kontrast mikroskobu altında kontrol edin (Şekil 3C,D). Optimal tohumlama yoğunluğu önerilir (Tablo 2 ve Şekil 3). Ancak, erken analiz gibi bazı uygulamalarda, tohumlama yoğunluğunun 10 katına kadar olması avantajlı olabilir.
        NOT: Hücre kültürü-hücre süspansiyonunu, tohumlamadan önce P300 veya P1000 pipet ucu ile dikkatlice karıştırın; böylece kuyular / tabak arasındaki hücre sayısı değişkenliğini dengelemek için farklılaşma testi yapılacaktır. Bu adım, hücre kültürü matris kaybına karşı korumak için her kuyu tohumlanmadan önce önerilmez çünkü bu madde sertleşip pipet ucuna yapışabilir.

Tablo 1: Orta bileşenler (N2B27 taban, 2iLIF, N2B27diff). Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Tabak başına hücre sayısı, hücre kültür matrisi miktarı, ortamın hacmi ve jelifikasyon süresi hakkında bilgiler. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

2. NTO'ların sinirsel farklılaşmayı artırmak ve posteriorizasyon ile ventralizasyonu indüklemek için RA tedavisi

  1. Retinoik asit (RA) aliquoteing
    1. Tüm trans RA tozunu oda sıcaklığına getirin (-20 °C'de saklanıyor).
    2. Tozu uygun bir DMSO hacminde yeniden yapılandırarak nihai konsantrasyon 100 mM'ye ulaşın.
    3. Aliquot 1 μL 100 mM RA her biri bir 1.5 mL vidalı kaplı şişeye koyar.
    4. Tüp 'dolana' kadar Argon gazı ekleyin.
      NOT: Argon gazı oksijenden daha ağır olduğundan, tüpün altına inerek havadan RA'yı kaplar ve korur. Tüp dolduğunda sızıntı ellerde hissedilebiliyor.
    5. Şişeni sıkıca kapat. RA ışığa ve havaya karşı son derece hassastır.
    6. Aliquotları karanlıkta -80 °C'de daha fazla kullanıma kadar sakla. Alternatif olarak, yeniden oluşturulmuş RA sıvı N2 içinde 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde depolanabilir.
      NOT: Yeniden oluşturulmuş ve seyreltilmiş RA, folyo ile kaplandığında en fazla 2 gün buzdolabında saklanabilir.
  2. 18 saat boyunca NTO'ların RA tedavisi (Şekil 4A)
    1. 100 mM konsantrasyonda -80 °C'den 1 μL aliquot alın ve oda sıcaklığında çözülene kadar karanlıkta kalın; (örneğin, avuç içinde veya ışıklar açık olmayan bir biyogüvenlik dolabındaki tüp rafında).
      NOT: RA aliquotları sıvı N2 içinde saklanıyorsa, mikrosantrifüj tüpünün kapağını hemen açın, tüpün patlamasını önlemek için, sonra tekrar kapatın ve 2.2.2. adıma geçin.
    2. Çözüldükten sonra, P1000 pipeti kullanılarak 250 μM konsantrasyon için 400 μL önceden ısıtılmış N2B27diff ortamı ekleyin. Homojenlik elde etmek için iyice karıştırın.
      NOT: Alternatif olarak, RA N2B27diff ortamı yerine saf DMSO'da yeniden oluşturulup seyreltilebilir, ancak bu kültürdeki DMSO konsantrasyonunu artırır. Malzeme hazırlanırken (N2B27diff), glutamin en fazla 5-10 dakika boyunca 37 °C'de ve tercihen oda sıcaklığında tutulur.
    3. Kuluçka makinesinden NTO'lar yetiştiren tabakları/tabakları çıkarın ve steril bir biyogüvenlik dolabına yerleştirin.
    4. Büyüyen NTO'ları faz kontrast mikroskobu altında inceleyin. NTO'ların morfolojisi, kültürün uygulanabilirliği ve deneyin etkinliği hakkında bilgi sağlamada kritik öneme sahiptir (Şekil 4B-D).
    5. Tabak/tabağın kapağını çıkarın ve tabağı hafifçe yana doğru eğin. Ortamı dikkatlice aspirasyon yapın; ya P200 pipeti veya aspiratör kullanarak, hücre kültür matrisini rahatsız etmeden. Kültür ve/veya hücre kültürü karışımının kurumasını önlemek için ortamsız NTO'ları mümkün olduğunca kısa süreliğine tutun.
    6. Uygun bir hacim N2B27diff ekleyin ve 250 nM RA çözeltisi ile desteklenin ( bkz. Tablo 2), kapağı kapatın ve NTO'ları tekrar kuluçka makinesine aktarın.
      NOT: Bazen, özellikle RA tamamen karıştırılmamışsa, normal N2B27diff'te çözülmesi daha zor olan çökeltmeler oluşabilir. Bu durumda, aliquotu atıp yeni RA aliquotları yapın çünkü bu çökelticilerin bilinen ve kontrolsüz bir RA konsantrasyonu vardır.

3. RA çıkarılması ve NTO'ların günlük orta seviye değişim rutini

  1. Kültür plakasını kuluçka makinesinden steril biyogüvenlik dolabına aktarın.
  2. Kapağı çıkarın ve tabağı hafifçe yana eğin.
  3. RA içeren N2B27diff'i, hücre kültür matrisine dokunmadan P200 pipeti veya aspiratör kullanarak dikkatlice aspire edin.
  4. Önceden ısıtılmış PBS ekleyin (hücre kültürü matris damlasını kaplayacak kadar hacim kullanın veya Tablo 2'de belirtildiği gibi), sonra plakayı tekrar eğip dikkatlice çıkararak kalan RA'yı yıkamak için kullanın.
  5. Hücre kültürü matris damlasına zarar vermemek için ortamı kuyunun duvarı boyunca pipet ederek uygun miktarda N2B27diff ekleyin ( Tablo 2'de belirtildiği gibi).
  6. Orta günlük maddeyi 3.1-3.3 adımlarını takip ederek değiştirin, ardından taze önceden ısıtılmış N2B27diff'i nazikçe ekleyin; ortamı kuyunun duvarına pipetle uygulayarak NTO'ları tekrar kuluçka kutusuna geri döndürün. Hücre kültürü matris damlasına doğrudan ve güçlü pipetleme veya soğuk ortam/PBS eklenmesi, damlanın kırılmasına ve tabaktan ayrılmasına neden olabilir.
    NOT: Küçük moleküller veya rekombinant proteinler kullanılarak yolları bozurken, ortamın günlük olarak değiştirilmesi önemlidir. İlaçlar bir günden uzun süre uygulanacaksa, protein/ilaç stabilitesi ve doğru konsantrasyonların devam etmesini sağlamak için ilaç çözeltilerinin her gün veya en az iki günde bir taze olarak hazırlanması gerekir.

4. NTO'ların Takıntısı

NOT: NTO'lar Krammer ve ark.26 tarafından tanımlandığı gibi sabittir. Daha sonra kullanılacak antikora bağlı olarak, farklı kaynaklardan (mağazadan alınan, kendi içinde vb.) PFA gerekebilir.

  1. PFA aliquotunu gece boyunca 4 °C'de erit.
  2. Kullanmadan önce PFA'yı oda sıcaklığına getirin.
  3. Daha yüksek stok PFA konsantrasyonu kullanıyorsanız, PFA'yı N2B27diff ortamında %4'e kadar seyreltin veya kimyasal bir kapustonda PBS'yi kullanın.
  4. NTO'ları kuluçka makinesinden çıkarıp kimyasal bir kapüşe aktar.
  5. Kapağı açın ve %4 PFA ile doğrudan NTO'lara 1:1 oranında ekleyin; böylece nihai konsantrasyon %2 elde edilir (örneğin, 96 kuyu plakasında 100 μL N2B27diff'e %4 PFA eklenir).
  6. Kapağı tekrar koyup oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kübe koyun. Bir zamanlayıcı ayarlayın, çünkü daha uzun fiksasyon bazı antikor tedavilerinin performansını olumsuz etkileyebilir.
    NOT: PFA toksiktir ve solulmamalıdır. Kimyasal kapağın altında dikkatli ve dikkatli çalışın. Bazı antikorlar belirli bir PFA veya daha kısa/optimize fiksasyon süresi gerektirir.
  7. 30 dakika sonra kapağı çıkarın ve plakayı hafifçe yana eğin, ardından 3.3-3.4 numaralı adımları takip edin.
  8. Önceden ısıtılmış PBS dikkatlice ekleyin (hücre kültürü matrisi damlasını kaplayacak kadar hacim kullanın veya Tablo 2'de belirtildiği gibi) ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın. Bu adımı 3 kez tekrarlayarak kalan tüm PFA'yı çıkarabilirsiniz.
  9. Son yıkamadan sonra, uygun miktarda PBS ekleyin (bkz. Tablo 2), plakayı parafilm ile mühürleyin ve daha fazla kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.

5. NTO'ların antikor boyama

  1. Antikor boyama, NTO'ların doğru kimliğini ve test/deneyin başarısını değerlendirmede değerli bir araçtır. Antikor boyama, Meinhardt ve ark.24 ve Krammer ve ark.26'da belirtildiği gibi yapılabilir.
    NOT: Eğer NTO'lar optimal değilse (Şekil 4E-G) veya doğru uzaylı-zamansal işaretleyici ifadesi göstermiyorsa (Şekil 5'ten Şekil 7'ye), materyal kalite standartlarına uymadığı için atılmalıdır.
  2. Blok/geçirimlilik çözeltisini (1x PBS, %1 BSA ve %0,5 Triton-X ile) 4 °C'de tutun ve kullanmadan önce oda sıcaklığına uyarlayın.
  3. Tam 3D yeniden yapı ve analiz için, antikorları (1. ve 2. yıl) en az 1, tercihen 2-3 gece boyunca 4 °C'de tutun; böylece iyi antikor nüfuzu sağlanır.
    NOT: Alexa Fluor anti-561 2. antikor, farklılaşma testinin ilk üç gününde hücre kültür matrisinde daha güçlü bir arka plan sinyali verebilir.

6. NTO'ların Temizlenmesi

  1. 26 temizlemeye hazırlanın
    1. Temizleme işlemine başlamadan önce antikor boyama işlemini tamamlayın (hem 1. hem de 2. antikorların kuluçka edilip iyice yıkandığından emin olun).
    2. NTO'ların fotobeyazlanmasını en aza indirmek için temizleme çözeltisine propilgallat ekleyin (mL için 2 mg propilgallat).
      NOT: Görüntülemeden 1-2 saat önce temizleme işlemi yapılarak oksidasyonu (sıvının açık sarı/kremden koyu parlak sarıya veya hatta kahverengiye dönüşmesi) veya temizleme çözeltisinin kristalleşmesini önleyin. Kristalleşme gerçekleşirse, kuyuya PBS ekleyerek çözünür.
  2. Çözelti pH ve karıştırma önlemleri
    1. Hızlı oksidasyonu veya hücre kültür matrisinin çözünmesini önlemek için temizleme çözeltisinin doğru pH'ını koruyun.
    2. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için çözeltiyi sert sarsıntıdan veya sert karıştırmaktan kaçının.

7. NTO'ların Analizi

  1. Mikroskopi hazırlığı
    1. Antikor boyama ve tüm doku temizlemesi tamamlandıktan sonra, görüntüleme için 10-40x hedefli konfokal mikroskop kullanın.
  2. Görsel değerlendirme
    1. NTO'ların uygun sinirsel belirteç ifadesi ve dorsoventral organizasyonu gösterip göstermediğini etkili şekilde belirlemek için görsel değerlendirme ve manuel niceleme kullanın.
  3. 3D analiz yazılımı
    1. 3D analiz için, mekânsal işaretleyicileri ve yapısal detayları değerlendirmek için CellProfiler28,29, Imaris (Dosya Dönüştürücü ve Görüntüleyici) gibi yazılımlar veya benzeri bir araç kullanın.
  4. NTO kimliğinin doğrulanması
    1. NTO'ların doğru kimliğini, sinir belirteçlerinin zamansal ifadesini ve belirli dorsoventral desen belirteçlerinin uzaylı-zamansal ifadesini değerlendirerek doğrulayın. Bu adım, daha fazla araştırmadan önce farklılaştırma testinin başarılı olmasını sağlamak için gereklidir.
  5. Karakterizasyon yönleri: Kültür başarısının aşağıdaki kritik yönlerini doğrulamak için Şekil 4, ayrıca Şekil 6 ve Şekil 7'ye bakınız:
    1. Başarılı epitelizasyon ve lümen oluşumunu doğrulamak için Meinhardt ve ark.24'te gösterilen Şekil 4 ve ZO-1 boyamalarına bakınız.
    2. Başarılı sinirsel farklılaşma, OCT4'ün aşağı regulasyonu ve SOX1'in yukarı regülasyonu ile karakterize edilir; ardından β3TUBULIN ekspresyonu gelir (24'te detaylandırılmıştır). Başarılı sinirsel farklılaşmayı doğrulamak için Şekil 6 ve Şekil 7'ye bakınız.
    3. Dorsoventral desenlenme, karşı dorsal kutupta ventral FOXA2+/SHH+ zemin plakası ve PAX3+ ekspresyonu ile doğrulanır (26'da ayrıntılı ventral desenleme). Başarılı dorsoventral desenleme doğrulamak için Şekil 6 ve Şekil 7'ye bakınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu el yazmasında sunulan şekillerdeki tüm temsilci örnekler için R1 fare ESC'leri kullanılmıştır. Bahsedilen diğer fare ESC'leri, NTO'lar için tohumlandığında epitelizasyon zamanlaması, sinir farklılaşması veya desen verimliliğinde hafif farklılıklar gösterebilir, ancak sonuçlar burada gösterilen verilerden anlamlı şekilde farklı olmamalıdır.

Uygun hücre yoğunluğunda tohumlanmış kaliteli ESC'ler (Şekil 2A) (Şe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, laboratuvarlar arasında standartlaştırmayı kolaylaştırmak için yüksek kaliteli NTO'lar üretmek için orijinal protokole optimize edilen birkaç uyarlama ve iyileştirme sunulmaktadır. Önemli değişiklikler arasında farklı ESC kültür koşulları, azaltılmış giriş hücresi sayıları, geliştirilmiş farklılaşma ortamı, değiştirilmiş farklılaşma protokolü ve çoklu kuyu plakaları kullanılarak yüksek verimli analiz için tohumlama yoğunluğu ayarlamaları yer alır. Protokolün birkaç yönü, güvenili...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Tanaka laboratuvarının mevcut ve eski üyelerine, bu protokolün geliştirilmesindeki destek ve tartışmaları için teşekkür etmek istiyoruz. Özellikle, el yazmasını eleştirel bir şekilde okuduğu ve katkı sağladığı ve şemalara yardımcı olduğu için A. Pelzl'e, ayrıca E. Chatzidaki'ye eleştirel bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz; E. Chatzidaki'ye el yazmasını eleştirel bir şekilde okuyordu, düzenledi, şemalara destek verdi ve Juergen A. Knoblich ile birlikte PUD 25 finansmanını sağladı. Bu yayın, Avusturya Bilim Fonu (FWF) tarafından finanse edilmiştir: "Bağımsız Yayın Projesi PUD 25". Ayrıca, bu proje Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı kapsamında (hibe anlaşması ERC AdG 742046) ve Avusturya Bilim Fonu (FWF) [10.55776/ F7803-B] (Kök Hücre Modülasyonu) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC) fon almıştır. Açık Erişim amacıyla, yazarlar bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Kabul Etmiş Makale (AAM) versiyonuna CC BY kamu telif hakkı lisansı uygulamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
35 mm Çanak | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Cam Çapı | KaplamasızMatTek ŞirketiCat# P35G-1.5-14-C
AccutaseInvitrogenCat# 00-4555-56
Albümin (BSA) Fraksiyonu V (pH 7.0)Panreac AppliChemCat# A1391
All-Trans Retinoik AcidMerckCat# R2625
B-27 Takviyesi (50X), serumsuzGibcoCat# 17504044
Bazal Zar Matrisi (Matrigel)CorningCat# BDL354234Protein konsantrasyonu 10 mg/ml 
CellCarrier-96 Ultra MikroplakalarPerkinElmerCat# 6055302
CellProfiler 4Stirling ve ark. 2021https://cellprofiler.org
CHIR 99021TocrisCat# 4423
CUBIC-R+(N)Matsumoto ve ark., 2019Yok
DimetilsülfüfoksitSigma AldrichCat# D2650
DMEM/F-12, glutamin yokGibcoCat# 21331020
Dulbecco' s Fosfatla tamponlanmış tuzlu (DPBS, 1X)GibcoCat# 14190144
Eppendorf Santrifüj 5810 REppendorfCat# 5811000015
Eppendorf Mikrotüp 3810XMerckCat# EP0030125150
Falcon Konik Santrifüj TüpleriCorningCat# 352095
JelatinMerckCat# G2500
L-Glutamin (200 mM)GibcoCat# A2916801
HeracellVIOS 160i CO2 kuluçka makinesi, 165 LThermoFisher ScientificCat# 51033557
ImarisOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com
Ters LED faz kontrast mikroskobu (CKX53)Olympus
2-Merkaptoetanol (50 mM)GibcoCat# 31350010
Monoklonal fare anti-OCT-3/4Santa Cruz BiyoteknolojisiCat# sc-5279; RRID:AB_6280511:200 kullanın
Monoklonal fare anti-PAX3DSHBCat# PAX3-C; RRID:AB_5284261:100 kullanın
Monoklonal tavşan anti-SHHHücre Sinyal TeknolojileriCat# 2207; RRID:AB_21881911:300 kullanın
Monoklonal tavşan anti-β 3-TubulinHücre Sinyal TeknolojileriCat# 5568; RRID:AB_106945051:500 kullanın
Monoklonal fare anti-ZO-1InvitrogenCat# 33-9100; RRID:AB_25331471:200 kullanın
Fare LIFQkineCat# Qk018-1000
N-2 Takviyesi (100X)GibcoCat# 17502048
Nörobazal OrtamGibcoCat# 21103049
Paraformaldehit, reaktif derecesi, kristalMerckCat# P6148
PD 0325901TocrisCat# 4192
Penisillin-Streptomisin ÇözeltisiGibcoCat# 15140130
Faz kontrast mikroskobu
Poliklonal keçi anti-FOXA2R& DCat# AF2400; RRID:AB_22941041:400 kullanın
Poliklonal keçi anti-SOX1R& D SistemleriCat# AF3369; RRID:AB_22398791:200 kullanın
Şekil 6 ile ilgili RNA-Dizisi verileriIshihara ve ark., 2022GEO: GSE214368
SafeFAST Premium Mikrobiyolojik Güvenlik KabiniDasit grubu DAHA HIZLIDIRCat# F00025200000
Sodyum Piruvat (100 mM)GibcoCat# 11360070
Dönen disk konfokal ters mikroskop (IX3)Olympus
Triton X-100Sigma AldrichCat# 9036-19-5

Kaynaklar

  1. Hiiragi, T., Solter, D. First cleavage plane of the mouse egg is not predetermined but defined by the topology of the two apposing pronuclei. Nature. 430 (6997), 360-364 (2004).
  2. Louvet-Vallée, S., Vinot, S., Maro, B. Mitotic spindles and cleavage planes are oriented randomly in the two-cell mouse embryo. Curr Biol. 15 (5), 464-469 (2005).
  3. Sagner, A., Briscoe, J. Morphogen interpretation: concentration, time, competence, and signaling dynamics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 6 (4), e271(2017).
  4. Anlaş, A. A., Nelson, C. M. Tissue mechanics regulates form, function, and dysfunction. Curr Opin Cell Biol. 54, 98-105 (2018).
  5. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape: mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. J Cell Sci. 131 (6), jcs214015(2018).
  6. Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation. 14 (1-3), 23-33 (1979).
  7. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  8. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  9. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: modeling development and the stem cell niche in a dish. Dev Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  10. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  11. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Park, G., Rim, Y. A., Sohn, Y., Nam, Y., Ju, J. H. Replacing animal testing with stem cell-organoids: advantages and limitations. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1375-1386 (2024).
  14. Xu, Z., et al. Merits and challenges of iPSC-derived organoids for clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1188905(2023).
  15. Phipson, B., et al. Evaluation of variability in human kidney organoids. Nat Methods. 16 (1), 79-87 (2019).
  16. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  17. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  18. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. 35 (7), 659-666 (2017).
  19. Eichmüller, O. L., et al. Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects. Science. 375 (6579), eabf5546(2022).
  20. Reumann, D., et al. In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids. Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).
  21. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  22. Krenn, V., et al. Organoid modeling of Zika and herpes simplex virus 1 infections reveals virus-specific responses leading to microcephaly. Cell Stem Cell. 28 (8), 1362-1379.e7 (2021).
  23. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  24. Meinhardt, A., et al. 3D reconstitution of the patterned neural tube from embryonic stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 987-999 (2014).
  25. Wu, Y., Peng, S., Finnell, R. H., Zheng, Y. Organoids as a new model system to study neural tube defects. FASEB J. 35 (4), e21545(2021).
  26. Krammer, T., et al. Mouse neural tube organoids self-organize floorplate through BMP-mediated cluster competition. Dev Cell. 59 (15), 1940-1953.e10 (2024).
  27. Ishihara, K., Ranga, A., Lutolf, M. P., Tanaka, E. M., Meinhardt, A. Reconstitution of a patterned neural tube from single mouse embryonic stem cells. Organ Regen. 1597, 43-55 (2017).
  28. Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), dev173146(2019).
  29. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  30. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  31. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  32. Ishihara, K., et al. Topological morphogenesis of neuroepithelial organoids. Nat Phys. 19, 177-183 (2023).
  33. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
  34. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  35. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
  36. Robanus-Maandag, E., et al. p107 is a suppressor of retinoblastoma development in pRb-deficient mice. Genes Dev. 12 (11), 1599-1609 (1998).
  37. Smith, A. G., Hooper, M. L. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol. 121 (1), 1-9 (1987).
  38. Kuehn, M. R., Bradley, A., Robertson, E. J., Evans, M. J. A potential animal model for Lesch-Nyhan syndrome through introduction of HPRT mutations into mice. Nature. 326 (6110), 295-298 (1987).
  39. Doetschman, T., et al. Targeted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature. 330 (6148), 576-578 (1987).
  40. Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
  41. Ranga, A., et al. Neural tube morphogenesis in synthetic 3D microenvironments. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

N ral T p Organoidlerin Vitro ModellerPluripotent K k H crelerN ral nd ksiyonPatern Olu umuMerkezi Sinir SistemiOrganoid ProtokolDoku Morfogenezi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.