Yöntem makalesi

Prion Güvenlik Laboratuvarı Kaydırma Testi

DOI:

10.3791/67889

⸱

14 Şubat 2025

 ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, School of Medicine, Creighton University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prion kontaminasyonu ve etkili dekontaminasyon için laboratuvar ortamlarında yaygın olarak kullanılan alanları değerlendirmek için bir yöntem eksiktir. Burada açıklanan protokol, belirli laboratuvarların bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için kolayca değiştirilebilen bir laboratuvar prion güvenlik kaydırma testinin uygulanması için temel temelleri sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İyatrojenik prion hastalığının bulaşması, kontamine beyin cerrahisi aletleri, nakil materyalleri ve prion ile kontamine laboratuvar aletlerine mesleki maruziyet yoluyla meydana gelmiştir. Prionlar, prion proteininin normal hücresel formu olan PrPC'nin, yanlış katlanmış ve patojenik form PrPSc'ye şablonlu olarak yanlış katlanmasıyla hastalığa neden olur ve her zaman ölümcüldür. İyatrojenik ve mesleki prion geçişini azaltmak zordur. İlk olarak, prionlar yüzeylere bağlanabilir ve uzun süre yüzeylerde kalabilir. İkincisi, prionlar inaktivasyona karşı oldukça dirençlidir. Bu göz önüne alındığında, yüzeyler etkisiz dekontaminasyonu takiben uzun süre bulaşıcılığı koruyabilir. Bu sadece prion laboratuvar çalışanları için potansiyel bir mesleki risk oluşturmakla kalmaz, aynı zamanda hassas prion amplifikasyon tekniklerini kullanan laboratuvar deneylerini potansiyel olarak çapraz kontamine edebilir. Bir prion güvenlik laboratuvarı kaydırma testi için burada açıklanan protokol, yüksek trafikli laboratuvar alanlarının tanımlanması ve belgelenmesi için adımları, sonuçların geçerliliğini sağlamak için önerilen sürüntü kontrollerini, pozitif yüzey sürüntü bölgelerine uygun yanıtları belirleme adımlarını, prion kaydırma testinden elde edilen temsili sonuçları ve potansiyel artefakt sonuçları içerir. Genel olarak, prion güvenlik laboratuvarı kaydırma testi, yüzeylerin dekontaminasyonunu değerlendirmek, prion kontaminasyonu için ortak alanları izlemek ve prion dekontaminasyon durumunun dokümantasyonunu uygulamak için daha geniş bir prion güvenlik programının bir parçası olarak uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prion hastalıkları, bilinen bir tedavisi veya tedavisi olmayan, her zaman ölümcül nörodejeneratif hastalıklardır. Prion hastalıklarına, prion proteini 1,2,3,4,5'in normal hücresel formunun yanlış katlanmış ve patojenik formu olan PrP Sc, PrPC neden olur. Prion hastalıklarının insanları ve diğer bazı hayvan türlerini etkilediği bilinmektedir. Bir insan prion hastalığı olan Creutzfeldt-Jakob Hastalığı, CJD'nin bilinen üç etiyolojisi vardır: sporadik, kalıtsal ve edinsel. Edinilmiş CJD, kazara bulaşma (iyatrojenik ve mesleki) sonucu ortaya çıkabilir ve Papua Yeni Gine'nin Ön Halkında Kuru'nun nedeni olduğu düşünülmektedir6.

Prion iletimi, prion ile kontamine olmuş tıbbi cihazlar ve nakil materyalleriile ilişkilendirilmiştir 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. CJD'nin iyatrojenik iletimi kan, doku veya prion ile kontamine yüzeylerden meydana gelebilir 18,19,20. Örneğin, iyatrojenik CJD, daha önce CJD'nin klinik öncesi aşamasında bir bireyde kullanılan ve daha sonra CJD21'e yenik düşen elektrotlarla bir elektroensefalogramı takip eden hastalarda gelişebilir. Daha yakın zamanda, bir laboratuvar çalışanının, koyunlara uyarlanmış BSE22,23 ile enfekte olmuş bir hayvandan beyin dilimlerini işlemek için kullanılan forseps ile bir deri delinmesi yoluyla prion hastalığına yakalandığı laboratuvar tabanlı mesleki bulaşma da meydana gelmiştir. Bu tür iletim senaryoları, prion örneklerinin işlendiği klinik, laboratuvar ve tanısal laboratuvar ortamlarında ortaya çıkabilir.

Prionlar yaygın dezenfeksiyon tekniklerine direnir ve yüzeylerde uzun süre kalabilir ve bulaşıcı kalabilir 24,25,26,27,28,29. Etanol, fenolik temizleyiciler, hidrojen peroksit, çeşitli radyasyon biçimleri ve formaldehit kullanımı gibi yaygın dezenfeksiyon teknikleri, prionların inaktivasyonu için yetersizdir ve yüzeylerin enfektivitesi korumasına izin verir 30,31,32,33,34,35,36,37. Bu özellikler, iyatrojenik ve mesleki maruziyet sırasında prionların bulaşmasına katkıda bulunur.

Çevresel prionların tespiti için yöntemler ancak son zamanlarda geliştirilmiştir. Gerçek zamanlı sarsıntı kaynaklı dönüşüm (RT-QuIC) ile birleştirilmiş bir çevresel sürüntü yöntemi, etkisiz dezenfeksiyonu takiben çevresel yüzeylerden ve ortak laboratuvar yüzeylerindenkalıntı prion enfektivitesini değerlendirebilir 38,39,40,41,42. Burada, bu tekniğin daha geniş bir prion güvenlik programına nasıl dahil edilebileceğini açıklıyoruz. Genel olarak, bu yöntem laboratuvara bağlı dezenfeksiyon protokollerinin izlenmesine, kontaminasyon durumunun araştırılmasına ve uygun şekilde belgelenmesine izin verebilir, bu da çapraz kontaminasyonu en aza indirerek deneylerin geçerliliğini sağlamaya yardımcı olabilir, prion kontaminasyonu için ortak kullanım alanlarının değerlendirilmesi ve personelin yaygın olarak kontamine olmuş alanlara dayalı olarak yönlendirilerek yeniden eğitilmesine izin verir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Creighton Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak onaylandı.

NOT: Prion güvenlik laboratuvarı kaydırma testinin şematik bir genel bakışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Sürüntü yerlerinin seçimi ve yüzey temizleme için hazırlık

  1. Sürüntü almak için uygun gözetim alanlarını belirleyin ve etiketleyin. Dokümantasyon ve referans için sağlanan şablona bakın (Şekil 2 ve Ek Şekil 1).
  2. Tanımlanan alanların her biri için iki adet 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. Adım 3.2'de kullanılmak üzere ilk mikrosantrifüj tüp setine 250 μL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini ekleyin. İkinci mikrosantrifüj tüpü setinin adım 4.3'te kullanılmak üzere boş kalmasına izin verin.
  3. Köpük uçlu swabları prion kontaminasyonu olmayan bir alanda depodan alın.
  4. Adım 2.1'de kullanmak için Milli-Q su (MQ H2O) içeren bir sıkma şişesi hazırlayın.

2. Pozitif ve negatif kontrol çubuğu hazırlama

  1. İlgili kontrol tiplerini kullanarak pozitif ve negatif sürüntü kontrolleri için seyreltmeler hazırlayın. Örnek: Pozitif kontrol için, Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) prion ile enfekte beyin homojenatının% 1'lik bir seyreltmesini hazırlayın. Negatif kontrol için, DPBS'deki pozitif kontrol ile aynı türden enfekte olmamış (UN) beyin homojenatının (BH) %0.1'lik bir seyreltmesini hazırlayın.
  2. Temiz eldivenler kullanarak, temiz ambalajdan uygun sayıda swab alın ve sap tarafı aşağı bakacak şekilde bir tüp rafına yerleştirin, uçların diğer swablara veya yüzeylere temas etmemesi için köpük swabları aralıklı hale getirmeye dikkat edin. Her kontrol numunesi için üç bez hazırlayın. Her numune arasında eldivenleri değiştirin.
  3. Temiz bir köpük çubuğu sapından tutarak, köpük çubuk uçlarına 50 μL ilgili pozitif ve negatif kontrol numunesi uygulayın. Tam emilimi sağlamak için çubuk ucunun her iki tarafına da uyguladığınızdan emin olun.
    NOT: Tüp rafından temiz bir bezi çıkarmadan önce daima eldivenleri değiştirin.
  4. Makas kullanarak, swabın fazla sapını kesin (uzunluğun yaklaşık 1 / 2'si) ve swabı, köpük uç kısmı aşağı bakacak şekilde önceden yüklenmiş mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Köpük ucun DPBS'ye daldırıldığından ve mikrosantrifüj tüpünün kapağını tamamen kapatmak için sapın yeterince kesildiğinden emin olun.
  5. Eldivenleri değiştirdikten sonra tüm numuneler uygulanana kadar kontrol numunelerini uygulamaya devam edin.

3. Yüzey temizleme

  1. Temiz bir köpük uçlu çubuğu sapından tutarak, köpük ucunu MQ H2O ile önceden ıslatın ve fazlalığı silkeleyin. Swabın nemli köpük ucunu gözetim için seçilen alana yerleştirin ve swabın ucunu yüzeyde aynı anda döndürürken alanı yaklaşık on kez ileri geri sürün.
  2. Makas kullanarak, swabın fazla sapını kesin (uzunluğun yaklaşık 1 / 2'si) ve swabı, köpük uç kısmı aşağı bakacak şekilde önceden yüklenmiş mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Köpük ucun DPBS'ye daldırıldığından ve mikrosantrifüj tüpünün kapağını tamamen kapatmak için sapın yeterince kesildiğinden emin olun.
  3. Çapraz kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için eldivenleri atın ve her ilgili temizleme alanından önce yeni eldivenler yerleştirin.
  4. Gözetim için seçilen tüm alanlar temizlenene kadar prosedürü tekrarlayın.

4. Swab ekstraksiyonu ve vakum konsantrasyonu

NOT: Cihazın ısınmasını sağlamak için kullanmadan 30 dakika önce vakum yoğunlaştırıcıyı açın.

  1. Mikrosantrifüj tüplerini dairesel bir tüp rafına yerleştirin. Mikrofüj tüpü rafını fincan boynuz sonikatörü su banyosuna yerleştirin. Mikrosantrifüj tüpleri içindeki DPBS'deki köpük bezlerin, kap boynuzundaki su yüzeyinin altında olduğundan emin olun (sap kısmının suya batırılması gerekmez). Aşağıdaki ayarları uygulayın: 15 sn toplam çalışma süresi (5 sn açık, 5 sn kapalı) ~75-85 watt'ta.
  2. Sonikasyonun ardından, transferden önce tüpün dibinde DPBS'yi toplamak için tüpleri yaklaşık 15 saniye santrifüjleyin.
  3. 250 μL'ye ayarlanmış bir P1000 pipeti kullanarak, mikrosantrifüj tüpünün altındaki tüm sıvıyı (swab özütü) dikkatlice toplayın ve önceden etiketlenmiş ikinci boş setten ilgili mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Köpük ucundaki fazla sıvıyı sıkmak için pipet ucunu kullanın. Sürüntü içeren boş tüpleri atın.
  4. Vakum yoğunlaştırıcıda aşağıdaki ayarları yapın: Sıcaklık: 45 °C, Isı süresi: 15 dakika, Çalışma süresi: 2 saat, Vakum: 5.1.
  5. Swab ekstraktları içeren mikrosantrifüj tüplerini vakum yoğunlaştırıcıya yerleştirin, tüplerin dengeli olduğundan ve tüm tüp kapaklarının açık olduğundan emin olun.
  6. Döngü tamamlandıktan sonra, numunelerin tamamen konsantre olduğundan emin olun (sadece pelet kalır). Peletleri RT-QuIC için kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Bazı durumlarda, tam konsantrasyonu sağlamak için ek vakum konsantrasyon süresi gerekebilir. Tüm konsantre numuneleri çıkarın, sadece hala sıvı içeren tüpleri bırakın. Yoğunlaştırıcı içinde kalan tüpleri yeniden dengeleyin ve numuneler tamamen konsantre olana kadar 1 saatlik ek artışlarla çalıştırın.

5. RT-QuIC'de kullanım için sürüntü kontrollerinin hazırlanması

NOT: RT-QuIC kontrolleri, sürüntü alma, ekstraksiyon veya konsantrasyon prosedürleri sırasında kontaminasyonun ortaya çıkmadığından emin olmak için çevresel sürüntü ekstraktlarının tahlilinden önce yapılmalıdır. Örnek düzenler için, Şekil 3 ve Şekil 4'e bakın.

  1. Doku seyreltme çözeltisinde (N2-0.1% SDS / PBS) uygun konsantrasyona seyrelterek uygun bir negatif RT-QuIC plaka kontrolü (örneğin, enfekte olmamış beyin homojenatı [UN BH]) hazırlayın. Prion ile enfekte beyin homojenatı doku seyreltme çözeltisinde 10-3'lük bir seyreltmeye seyrelterek pozitif bir plaka kontrol seyreltmesi hazırlayın.
  2. Önceden depolanmış kontrol çubuğu ekstrakt peletlerini -80 °C'den çıkarın ve her birini 50 μL MQ H2O ile yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek ve ardından kısa bir süre vorteksleyerek yeniden süspanse edin. Kalan adımları gerçekleştirirken numunelerin oda sıcaklığında (RT) oturmasına izin verin.
  3. Negatif plaka kontrolleri (tek başına doku seyreltme solüsyonu ve enfekte olmamış beyin homojenatı) ve pozitif plaka kontrolü (enfekte beyin homojenatı) dahil olmak üzere 2 μL belirtilen plaka kontrollerini yükleyin.
  4. Her bir pozitif ve negatif swab ekstraktı teknik replikatından 2 μL'yi en az dört replikasyon RT-QuIC plaka kuyusuna yükleyin.
    NOT: Negatif sürüntü kontrolleri, pozitif bir belirleme için bir laboratuvar standardının üzerinde RT-QuIC tohumlaması sergiliyorsa, bu, sürüntü alma, ekstraksiyon ve konsantrasyon işlemi sırasında kontaminasyonun ortaya çıktığını ve sürüntü deneyinin tekrar yapılması gerektiğini gösterir

6. RT-QuIC'de kullanılmak üzere numunelerin hazırlanması

  1. Doku seyreltme solüsyonunda (N2-0.1% SDS / PBS) uygun konsantrasyona seyrelterek uygun bir negatif plaka kontrolü (ör. enfekte olmamış beyin homojenatı, enfekte olmamış lenf nodu, vb.) hazırlayın. Enfekte beyin homojenatını doku seyreltme çözeltisinde 10-3'lük bir seyreltmeye seyrelterek pozitif plaka kontrolleri hazırlayın.
  2. Önceden depolanmış swab ekstrakt peletlerini -80 °C'den çıkarın ve 20-50 μL doku seyreltme solüsyonu (şüpheli kontaminasyon miktarına bağlı olarak) ile yaklaşık on kez yukarı ve aşağı pipetleyerek ve ardından kısaca girdaplama yaparak yeniden süspanse edin. Kalan adımları gerçekleştirirken örneklerin RT'de oturmasına izin verin.
  3. Negatif plaka kontrolleri (tek başına doku seyreltme solüsyonu ve enfekte olmamış beyin homojenatı) ve pozitif plaka kontrolü (enfekte beyin homojenatı) dahil olmak üzere 2 μL'lik belirtilen plaka kontrollerini RT-QuIC plaka kuyucuklarına yükleyin.
  4. Her bir swab ekstraktından 2 μL'yi dört çoğaltma kuyucuğuna yükleyin.

7. RT-QuIC analizi ve sonuçları

  1. RT-QuIC'yi bireysel laboratuvar protokollerine göre gerçekleştirin (isteğe bağlı protokoller38,40).
  2. Bir numunenin pozitifliğini belirlemek için gerekli parametreleri tanımlayın (bkz. temsili sonuçlar, Şekil 5).
    Not: Bu parametreler her laboratuvar tarafından tanımlanır.
  3. Sonuçları sağlanan tabloya kaydedin ve en iyi laboratuvar uygulamalarına dayalı olarak uygun önlemleri alın (Tablo 1 ve Ek Şekil 2).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozitif ve negatif sonuçların yazılı açıklaması (pozitif/negatif plaka ve sürüntü kontrolleri dahil)

Negatif kontrol swabları, swabbing, ekstraksiyon ve konsantrasyon işlemi sırasında ortaya çıkabilecek potansiyel prion kontaminasyonunu izlemek için gözetim swabbingine dahil edilir. Belirli bir aylık sürveyans için gerçekleştirilen ilk RT-QuIC plakası, pozitif ve negatif sürüntü kontrollerini içermelidir. Başarılı negatif kontroller, pozitif floresan eşiğini geçemez (Şekil 6A). Bu sonuç, deneysel prosedürler sırasında kontaminasyonun ortaya çıkmadığını gösterecektir. Başarılı pozitif kontrol sürüntü ekstraktları, belirli bir numune için tüm replike kuyucuklarda pozitif tohumlama sergileyecektir (pozitif kontrol swabları, hamstera uyarlanmış bulaşıcı vizon ensefalopati suşu Hyper (HY TME) beyin homojenatı ile kontamine olmuştur. Pozitif bir kontrol seyreltme serisinin dahil edilmesi, belirli bir deney için prion tespitinin duyarlılığının belirlenmesine izin verir (Şekil 6A).

Yüzey sürüntü ekstraktı numuneleri incelenirken, önceden belirlenmiş pozitif floresan eşiğinin üzerinde tohumlama göstermeyen yüzeyler prion negatif olarak kabul edilebilir (Şekil 6B). Tersine, prion ile kontamine olmuş yüzey sürüntü ekstraktları, pozitif floresan eşiğinin üzerinde tohumlama yetenekleri gösterecektir, ancak maksimum nokta oranı (MPR) ve floresan süresi, dahil edilen pozitif plaka kontrolüne kıyasla değişebilir (Şekil 6B). Yöntemin yeterli dezenfeksiyonu değerlendirme yeteneği, artık RT-QuIC'yi tohumlamada başarısız olan ağartıcı ile muamele edilmiş prion ile kontamine yüzeyler tarafından vurgulanmaktadır (Şekil 6B).

Daha da önemlisi, laboratuvarımız pozitif bir numuneyi, replike kuyucukların en az yarısında belirlenen pozitif floresan eşiğini geçen bir numune olarak tanımlarken, her laboratuvarın kendi standartlarını belirlemesi gerekmektedir. Amiloid oluşum hızı (RAF) ve floresan süresi de pozitiflik için laboratuvara özgü eşiklerin oluşturulmasına yardımcı olmak için kullanılabilir.

Pozitif floresan eşiğini geçen, ancak değişmiş kinetik eğrilerle ve pozitif kontrol numunelerine kıyasla anormal derecede uzun bir floresan süresinden sonra yüzey artefaktı sonuçlarını gözlemledik (Şekil 6C). Bu sonuçlar, bir yüzeyde bulunan toz veya artık kimyasalların varlığından kaynaklanabileceğinden dikkatli bir şekilde yorumlanmalıdır. Bu bulgular, genel laboratuvar temizliğinin gerekliliğinin yanı sıra gerçek pozitif ve yanlış pozitif tohumlama arasında ayrım yapma kriterlerini vurgulamaktadır.

Katı ve sıvı biyolojik tehlike atıklarının bertarafı, belirli bir kurumun mevcut biyolojik tehlike imha yönergelerine göre yapılmalıdır. Yaygın prion dezenfeksiyon teknikleri, sodyum hidroksit, sodyum hipoklorit (ağartıcı) ile muamele veya 134 ° C'de 18 dakikaboyunca otoklavlama 43,44,45,46 içerir.

figure-results-1
Şekil 1: Prion güvenlik laboratuvarı kaydırma testine şematik genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Örnek sürüntü sitesi düzeni. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Sürüntü kontrolleri için örnek deney tasarımı, prion güvenlik laboratuvarı kaydırma testini içeriyordu. (A) Negatif ve pozitif sürüntü özü kontrolleri için örnek düzeni. (B) Negatif ve pozitif swab ekstrakt kontrolleri 50 μL H2O ile yeniden askıya alınmalıdır. Yeniden süspanse edilmiş swab ekstraktının 10 kat seyreltilmesi, bir doku seyreltme çözeltisine seyreltilerek oluşturulmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Prion güvenlik laboratuvarı kaydırma testinden yüzey sürüntü ekstraktları için örnek deney tasarımı. (A) Yüzey swab ekstraktları için numune düzeni. (B) Yüzey sürüntü ekstraktı numuneleri 20 μL doku seyreltme solüsyonu ile yeniden süspanse edilmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Aylık prion güvenlik laboratuvarı kaydırma testi. Sonuçları yorumlamak ve uygun yanıtı belirlemek için kullanılan akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Temsili yüzey sürüntü deneyi. (A) Üçlü (DPBS, enfekte olmamış hamster beyin homojenatı 10-4 ve 10-10) negatif sürüntü özü kontrolleri ve üçlü (HY beyin homojenatı 10-3) pozitif sürüntü özü kontrolleri içeren yüzey sürüntü özü kontrol plakası. (B) Kontaminasyondan önce, HY 10-3 ile kontaminasyondan sonra ve kontamine yüzeylerin ağartıcı işleminden sonra swabı alınmış tezgah üstü, cam ve paslanmaz çelik (SS) yüzeyler için temsili swab ekstraktları. (C) Enfekte olmamış beyin homojenatı 10-4, HY beyin homojenatı 10-3 ve ince bir toz tabakası ile kaplanmış tezgah üstünden alınan sürüntü ekstraktının floresan izleme karşılaştırması. Paneller A ve B için negatif plaka kontrolleri, bir boşluk (doku seyreltme solüsyonu) ve enfekte olmamış hamster beyin homojenatı 10-4 içerir. Panel B, enfekte olmamış beyin homojenatı 10-4'ün eklenmesini ve HY beyin homojenatı 10-3'ün pozitif plaka kontrolünü içerir. Pozitif bir floresan eşiği (kırmızı kesikli bir çizgi ile gösterilmiştir) 2 olarak belirlenmiştir. Rapor edilen maksimum nokta oranı (MPR), plaka okuyucu tarafından elde edilen ilk floresan okumasına bölünen maksimum floresandır. Her nokta, belirli bir numune türü için bir teknik kuyu kopyasını temsil eder. Ortalama ve standart sapma sunulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Örnek sürüntü sitesi aylık dokümantasyon formu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Temizleme sitesi düzeni şablonu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Sürüntü alanı aylık dokümantasyon formu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan prion güvenlik sürüntüsü yöntemi, mevcut prion güvenlik önlemlerini geliştirmek için kullanılabilir. Bu yöntem, potansiyel prion kontaminasyonu için prion laboratuvar alanlarını ve ekipmanlarını ve ayrıca paylaşılan laboratuvar alanlarını izleyebilir. Daha da önemlisi, bu yöntem, prion ile kontamine olmuş yüzeylerin dekontaminasyonunu doğrulamak için laboratuvara özel dezenfeksiyon tekniklerini test etmek için uyarlanabilir. Çeşitli prion suşları dezenfeksiyon tekniklerine karşı farklı hassasiyetler gösterdiğinden, bu yöntem bu tekniklerin sodyum hidroksit veya sodyum hipoklorit (ağartıcı) ile muamele gibi mevcut laboratuvar deneyleri için etkili olduğunu doğrulayabilir43,44.

Bu metodoloji için temel adımlar, hem yüksek trafikli alanların hem de deneylerin aşağı akış çapraz kontaminasyonu ile ilgili olabilecek izlenecek alanların bir örneğini sağlayacak uygun sürüntü alanlarının belirlenmesini içerir. Ek olarak, laboratuvarlar, belirli bir laboratuvar veya klinikte yaygın olarak kullanılanları yakından yansıtan pozitif ve negatif kontroller kullanmalıdır. Örneğin, kemirgen prionlarla çalışılıyorsa, pozitif ve negatif kontroller o türle eşleşmelidir. Son olarak, sürveyans verileri güncel tutulmalı ve pozitiflik eğilimlerinin kolayca belirlenebilmesi için düzenlenmeli, böylece belirli bir alan için tutarlı pozitif sonuçlar elde edilmesi durumunda laboratuvar personelinin azaltılmasına ve yeniden eğitilmesine olanak sağlanmalıdır.

Bu protokolün bir sınırlaması, hatalı RT-QuIC sonuçlarının potansiyel olarak üretilmesidir. RT-QuIC'in hassas doğası göz önüne alındığında, laboratuvar yüzeylerinde artık deterjanların, tuzun ve diğer maddelerin varlığı reaksiyonunsonucunu etkileyebilir 39. Genel olarak, bu gözlem göz önüne alındığında, yüzeylerin artık tuz, deterjanlar ve toz gibi RT-QuIC ile etkileşime girebilecek maddelerden arınmış olması avantajlıdır. RT-QuIC metodolojisinde iyileştirmeler mevcut hale geldikçe, RT-QuIC'nin mevcut sınırlamalarının çoğunun çözüleceğini tahmin ediyoruz. Bu nedenle, son kullanıcıyı RT-QuIC'deki en son gelişmelerden yararlanmak için literatürü takip etmeye teşvik ediyoruz.

Prionları araştıran laboratuvarlar için bu yöntemin önemli bir yararı, hassas amplifikasyon testlerinin sonuçlarını etkileyebilecek kontaminasyonu en aza indirme yeteneğidir. Nekropsi aletleri, gelecekteki nekropsiler için yeniden kullanılmadan önce genellikle dezenfekte edilir. Açıklanan sürüntü yöntemi, aşağı akış sonuçlarını etkileyebilecek rezidüel prion enfektivitesi için nekropsi araçlarını değerlendirmek için bir yöntem sağlar. Bu, dokularda prion tespitinin nekropsi araçlarından kaynaklanan kontaminasyona bağlı olmadığı olasılığını dışlamak için deneylere ek bir titizlik düzeyi sağlayabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.B. ve Q.Y., prion yüzey temizleme teknolojisi ile ilgili bir patent başvurusunun mucitleridir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Creutzfeldt Jacob Hastalığı Vakfı'ndan bir hibe ile desteklendi. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama veya çalışmayı yayınlanmak üzere sunma kararında hiçbir rolü yoktu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Balıkçı markası  PurSwab Köpük ÇubuklarFisher markaKatalog #14-960-3E
Milli-Q IQ 7005 Ultra Saf Su SistemiMilliporeSigmaQ7005T0C
Mini-santrifüj, 6000 rpmGüney LabwareMLX-306
Omega plaka okuyucuBMG LabtechFLUOstar Omega plaka okuyucu
Q700 sonikatörQSonicaQ700-110
Rekombinant hamster prion proteiniMNPROMNPROtein-HamsterSuriye hamsterı, amino asitler 90-231
Savant speedvac Thermo ScientificSPD1030-230
Silika nanoküreler (50 nm)nano Composix SISN50-25M

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
  3. Oesch, B., et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40 (4), 735-746 (1985).
  4. Caughey, B., Raymond, G. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J Biol Chem. 266 (27), 18217-18223 (1991).
  5. Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (23), 9741-9746 (2007).
  6. Gajdusek, D. C., Zigas, V. Degenerative disease of the central nervous system in New Guinea: the endemic occurrence of "kuru" in the native population. N Engl J Med. 257, 974-978 (1957).
  7. Centers for Disease Control. Fatal degenerative neurologic disease in patients who received pituitary-derived human growth hormone. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 34, 359-361 (1985).
  8. Duffy, P., Wolf, J., Collins, G., DeVoe, A. G., Streeten, B., Cowen, D. Letter: possible person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. N Engl J Med. 290 (12), 692-693 (1974).
  9. Brown, P., et al. Iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease at the millennium. Neurology. 55 (8), 1075-1081 (2000).
  10. Huillard d'Aignaux, J., et al. Incubation period of Creutzfeldt-Jakob disease in human growth hormone recipients in France. Neurology. 53 (6), 1197-1201 (1999).
  11. Marzewski, D. J., Towfighi, J., Harrington, M. G., Merril, C. R., Brown, P. Creutzfeldt-Jakob disease following pituitary-derived human growth hormone therapy: a new American case. Neurology. 38, 1131-1133 (1988).
  12. Hannah, E. L., et al. Creutzfeldt-Jakob disease after receipt of a previously unimplicated brand of dura mater graft. Neurology. 56 (8), 1080-1083 (2001).
  13. Shimizu, S., et al. Creutzfeldt-Jakob disease with florid-type plaques after cadaveric dura mater grafting. Arch Neurol. 56 (3), 357-362 (1999).
  14. Antoine, J. C., et al. Creutzfeldt-Jakob disease after extracranial dura mater embolization for a nasopharyngeal angiofibroma. Neurology. 48 (5), 1451-1453 (1997).
  15. Esmonde, T., Lueck, C. J., Symon, L., Duchen, L. W., Will, R. G. Creutzfeldt-Jakob disease and lyophilised dura mater grafts: report of two cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 56, 999-1000 (1993).
  16. Willison, H. J., Gale, A. N., McLaughlin, J. E. Creutzfeldt-Jakob disease following cadaveric dura mater graft. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 54, 940(1991).
  17. Diringer, H., Braig, H. R. Infectivity of unconventional viruses in dura mater. Lancet. 334, 439-440 (1989).
  18. Peden, A. H., Head, M. W., Ritchie, D. L., Bell, J. E., Ironside, J. W. Preclinical vCJD after blood transfusion in a PRNP codon 129 heterozygous patient. Lancet. 364 (9433), 527-529 (2004).
  19. Will, R. G., Matthews, W. B. Evidence for case-to-case transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 45, 235-238 (1982).
  20. el Hachimi, K. H., Chaunu, M. P., Cervenakova, L., Brown, P., Foncin, J. F. Putative neurosurgical transmission of Creutzfeldt-Jakob disease with analysis of donor and recipient: agent strains. C R Acad Sci III. 320 (4), 319-328 (1997).
  21. Alper, T., et al. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid. Nature. 214, 764-766 (1967).
  22. Casassus, B. France halts prion research amid safety concerns. Science. 373 (6554), 475-476 (2021).
  23. Brandel, J. P., et al. Variant Creutzfeldt-Jakob disease diagnosed 7.5 years after occupational exposure. N Engl J Med. 383 (1), 83-85 (2020).
  24. Flechsig, E., Hegyi, I., Enari, M., Schwarz, P., Collinge, J., Weissmann, C. Transmission of scrapie by steel-surface-bound prions. Mol Med. 7 (10), 679-684 (2001).
  25. Zobeley, E., Flechsig, E., Cozzio, A., Enari, M., Weissmann, C. Infectivity of scrapie prions bound to a stainless steel surface. Mol Med. 5 (4), 240-243 (1999).
  26. Brown, P., Gajdusek, D. C. Survival of scrapie virus after 3 years' interment. Lancet. 337 (8736), 269-270 (1991).
  27. Seidel, B., et al. Scrapie agent (strain 263K) can transmit disease via the oral route after persistence in soil over years. PLoS One. 2 (5), e435(2007).
  28. Maddison, B. C., et al. Environmental sources of scrapie prions. J Virol. 84 (21), 11560-11562 (2010).
  29. Pritzkow, S., Morales, R., Lyon, A., Concha-Marambio, L., Urayama, A., Soto, C. Efficient prion disease transmission through common environmental materials. J Biol Chem. 293 (9), 3363-3373 (2018).
  30. Alper, T., Cramp, W., Haig, D., Clarke, M. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid. Nature. 214 (90), 764-766 (1967).
  31. Bernoulli, C., et al. Danger of accidental person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease by surgery. Lancet. 309 (8009), 478-479 (1977).
  32. Brown, P., Rohwer, R. G., Green, E. M., Gajdusek, D. C. Effect of chemicals, heat, and histopathologic processing on high- infectivity hamster-adapted scrapie virus. J Infect Dis. 145 (5), 683-687 (1982).
  33. Brown, P., et al. Chemical disinfection of Creutzfeldt-Jakob disease virus. N Engl J Med. 306, 1279-1282 (1982).
  34. Dickinson, A. G., Taylor, D. M. Resistance of scrapie agent to decontamination. N Engl J Med. 299, 1413-1414 (1978).
  35. Hunter, G. D., Millson, G. C. Studies on the heat stability and chromatographic behavior of the scrapie agent. J Gen Microbiol. 37, 251-258 (1964).
  36. Pattison, I. H. Resistance of the scrapie agent to formalin. J Comp Pathol. 75, 159-164 (1965).
  37. Fraser, H., Farquhar, C., McConnell, I., Davies, D. The scrapie disease process is unaffected by ionising radiation. Prog Clin Biol Res. 317, 653-658 (1989).
  38. Yuan, Q., et al. Sensitive detection of chronic wasting disease prions recovered from environmentally relevant surfaces. Environ Int. 166, 107347(2022).
  39. Simmons, S. M., et al. Rapid and sensitive determination of residual prion infectivity from prion-decontaminated surfaces. mSphere. 9, e00504-e00524 (2024).
  40. Orru, C. D., et al. Sensitive detection of pathological seeds of alpha-synuclein, tau and prion protein on solid surfaces. PLoS Pathog. 20 (4), e1012175(2024).
  41. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217(2010).
  42. Srivastava, A., et al. Enhanced quantitation of pathological alpha-synuclein in patient biospecimens by RT-QuIC seed amplification assays. PLoS Pathog. 20 (9), e1012554(2024).
  43. Hughson, A. G., et al. Inactivation of prions and amyloid seeds with hypochlorous acid. PLoS Pathog. 12 (9), e1005914(2016).
  44. Williams, K., Hughson, A. G., Chesebro, B., Race, B. Inactivation of chronic wasting disease prions using sodium hypochlorite. PLoS One. 14 (10), e0223659(2019).
  45. Taylor, D. M. Autoclaving standards for Creutzfeldt-Jakob disease agent [letter]. Ann Neurol. 22 (4), 557-558 (1987).
  46. Brown, P., Rohwer, R. G., Gajdusek, D. C. Newer data on the inactivation of scrapie virus or Creutzfeldt-Jakob disease virus in brain tissue. J Infect Dis. 153 (6), 1145-1148 (1986).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Prion KontaminasyonuY zey S rmeRT QuIC AnaliziPrion naktivasyonuPrion DekontaminasyonuMesleki Prion RiskiY zey DezenfeksiyonuPrion Tespiti

İlgili makaleler