Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İlaç Keşfi Uygulamaları ile Clostridioides difficile için Biyofilm Testi

981 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67913

⸱

8 Temmuz 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bakteriyel patojen Clostridioides difficile'nin biyofilmleri ve hastalıktaki önemi iyi anlaşılamamıştır. Son bulgular, nükste bir rol olduğunu öne sürmüş ve bunların önemini vurgulamıştır. Burada, biyofilmlere karşı ilaç keşfi uygulamaları ile metabolik bir okumaya bağlı bir biyofilm testinin adaptasyonunu açıklıyoruz.

Özet

Clostridioides difficile , çoğalmak, toksinler salgılamak ve bağırsak epiteline zarar vermek için disbiyotik bir mikrobiyota ortamından yararlanabilen bir gastrointestinal bakteriyel patojendir. C. difficile enfeksiyonu (CDI) hastalarının bir alt kümesi antibiyotik (%15-%30) veya dışkı mikrobiyota nakli (FMT) (%<10) tedavi başarısızlığı yaşayacaktır. Bu nedenle, ek terapötik müdahalelerin geliştirilmesi kritik öneme sahiptir. C. difficile biyofilmlerinin nüksteki rolü belirsizdir. Bununla birlikte, diğer organizmalardaki biyofilmler kronik ve tekrarlayan hastalıklardan sorumludur, bu da bunun tekrarlayan CDI'da da olabileceğini düşündürmektedir. C. difficile'nin biyofilmlerinin değerli bir terapötik hedef sunduğunu varsayıyoruz. Burada sunulan protokolün amacı, yerleşik C. difficile biyofilmlerine karşı aktiviteye sahip yeniden konumlandırılabilir bileşiklerin tanımlanması için bir biyofilm oluşum testini uyarlamaktır. Protokol, biyofilm oluşturmak için sağlam ve tekrarlanabilir bir testi rafine eder, onu metabolik bir testle birleştirir ve ilaç keşfine uygular. Bu protokol, biyofilm oluşum testini, biyokütle ve metabolik aktivite okumalarını, ilaç duyarlılık testini, yeniden konumlandırma kütüphanesinin ilaç taramasını ve temsili sonuçları ana hatlarıyla belirtir.

Giriş

Clostridioides difficile, toksinler üreterek insan gastrointestinal (GI) sistemine ciddi hasar verebilen, spor oluşturan, anaerobik bir bakteriyel patojendir. C. difficile, ~30.000 ölümle yılda yaklaşık yarım milyon vakadan sorumludur (CDC, 2015). C. difficile enfeksiyonu (CDI) tedavisi, zaten gergin olan sağlık sistemine önemli bir maliyet getirmektedir (~ 4,8 milyar dolar)1,2,3. En fazla risk altındaki bireyler, immünosupresyon, antibiyotik maruziyeti ve / veya yaşlılar, hem ABD'de hem de dünya çapında önemli ölçüde genişlemeye devam eden tüm popülasyonlardır 4,5,6,7.

C. difficile, konak GI mikrobiyotasının durumuna büyük ölçüde bağlıdır ve bu nedenle, antibiyotik tedavisi CDI için önemli bir predispozan faktördür. Antibiyotiğe dirençli klinik izolatların tanımlanması C. difficile, tedaviyi daha da karmaşık hale getirir 8,9,10. Ayrıca, CDI için antibiyotiklerle tedavi edilen hastaların% 15 ila% 30'u ilk tedavide başarısız olacaktır 5,11,12,13,14,15,16. Bir hasta bir nüks atağı yaşadığında, nüks atakları olasılığı %45-64'e yükselir (nüks yürüyen merdiven) ve buna daha fazla tedavi başarısızlığı riski eşlik eder16,17. Daha da önemlisi, CDI'nin nüks vakalarının çoğu, konakçıda18,19 ilk enfeksiyon atağını oluşturan orijinal suştan kaynaklanır ve bu da başarılı tedaviden sonra bile C. difficile tarafından kolonizasyonun devam ettiğini düşündürür. Sporların GI kanalında devam ettiği ve ex vivo ve murin modellerinde nüksetmeye yol açtığı gösterilmiş olsa da20, C. difficile biyofilmleri ve bunların hastalık ve nüksetmedeki rolü yeterince araştırılmamıştır. Biyofilmler, kendi kendine üretilen hücre dışı bir matris tarafından korunan mikrobiyal topluluklardır, bu da onları antibiyotik tedavisi ve bağışıklık tepkileri gibi çevresel hakaretlere karşı oldukça inatçı kılan bir özelliktir21. Ayrıca, biyofilm oluşumu önemli bir virülans faktörüdür 22,23,24,25 ve Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa'nın neden olduğu bakteriyel enfeksiyonlarda biyofilmler nüks ve kronik belirtilerdeanahtardır 26,27. Son zamanlarda, C. difficile biyofilmleri tekrarlayan enfeksiyonlar için bir rezervuar olarak önerilmiştir 28,29,30 ve bu nedenle CDI nüksünün tedavisi ve/veya önlenmesi için yüksek değerli bir hedefi temsil etmektedir.

C. difficile biyofilmlerini incelemek için mevcut modeller arasında koloni biyofilm modelleri31,32, mikrofermentörler33, kemostat bağırsak modelleri 34,35 ve şişeler veya kuyu plakaları36,37 kullanan sıvı kültür sistemleri bulunur. Tüm bu modeller, gelişimin farklı aşamalarında ve farklı ortamlarda C. difficile biyofilmleri hakkında önemli bilgiler vermiştir. Bununla birlikte, bu modellerden bazıları (yani mikrofermentörler, kemostat bağırsak modelleri, koloni biyofilmleri) ilaç keşif çabaları için uygun değildir. Bugüne kadar, ilaç keşif çabalarını içeren çalışmaların çoğu, C. difficile 38,39,40,41'in planktonik yaşam tarzına odaklanmıştır. Bu nedenle, burada açıklanan protokol, mevcut (24 saat eski) C. difficile biyofilmlerini öldürme yeteneğine sahip yeniden konumlandırılabilir molekülleri tanımlamak için kütüphaneleri taramak için bir platform geliştirmek amacıyla mevcut 96 oyuklu plaka biyofilm modelini uyarlamayı, standartlaştırmayı ve doğrulamayı amaçlamaktadır. Protokolün doğrulanması, laboratuvara uyarlanmış bir suş (630 Δerm) ile bir salgın klinik izolat (Birleşik Krallık'taki Stoke-Mandeville Hastanesi'nde 2006 salgını sırasında izole edilen UK1 suşu) arasındaki biyofilm oluşturma yetenekleri karşılaştırılarak gerçekleştirildi42). Biyofilm oluşumu, biyokütleyi ölçmek için klasik Kristal viyole testi ve biyofilmlerin canlılığını ölçmek için bir metabolik test kullanılarak ölçüldü. Suşlar arasında biyofilm oluşturma yeteneklerinde önemli farklılıklar tespit edildi ve bu da potansiyel klinik etkileri düşündürdü. Ayrıca, test, yerleşik biyofilmlerin antibiyotik duyarlılık profillerini belirlemek için kullanıldı. Son olarak, kavramın kanıtı olarak, sıtma gibi ihmal edilen hastalıklara karşı yeni tedaviler keşfetmeye odaklanan kar amacı gütmeyen bir kuruluş olan Medicines for Malaria Venture'ın (MMV) Küresel Sağlık Önceliği kutusu, C. difficile'nin yerleşik biyofilmlerine karşı aktiviteye sahip bileşikleri belirlemek için tarandı. Burada açıklanan protokol, olgun biyofilmleri hedefleyen bir ilaç tarama platformu olarak kullanım için klasik bir biyofilm testini uyarlar ve doğrular.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Biyofilm tahlili için hücrelerin hazırlanması

DİKKAT: Clostridioides difficile bir insan patojenidir ve BSL-2 muhafazası gerektirir.

NOT: Bu çalışma için kullanılan sporlar, Tufts Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Dr. Carol Kumamoto'dan alınmıştır. C. difficile spor stokları daha önce tarif edildiği gibihazırlanmıştır 43,44,45. Sporlar daha sonra plakaları çıkarmak için PCR tüplerine 10 μL'lik hacimler halinde ayrılır. Deney için gerekli olan tüm ortam ve Fosfat Tampon Salin (PBS), kullanımdan 24 saat önce anaerobik odada önceden indirgenmelidir. Bu, haznenin içindeki ortamı veya PBS'yi içeren şişenin kapağını gevşeterek gerçekleştirilir.

  1. Anaerobik odada% 0.1 (a / h) taurokolat ve% 0.1 (a / h) L-sistein (BHIS) ile desteklenmiş bir Beyin Kalp İnfüzyonu agar plakasını önceden azaltın, tercihen gece boyunca veya tam indirgemeye izin vermek için en az 3 saat. Anaerobik odanın sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
  2. 10 μL spor içeren PCR tüpünü 70 °C'de 20 dakika ısıtın. Bu bir su banyosunda veya termocycler'da yapılabilir.
  3. Sporları anaerobik odaya getirin, 5x-6x hafifçe pipetleyerek karıştırın ve önceden indirgenmiş BHIS plakasına 10 μL pipetleyin. Daha önce tarif edildiği gibi dört kadranlı bir çizgi gerçekleştirin46 ve plakayı gece boyunca 37 ° C'de (anaerobik odanın sıcaklığı) inkübe edin.
  4. 24 saatlik büyümeden sonra, izole edilmiş koloniler görünür olmalıdır. Tek bir koloni seçin ve tek kullanımlık bir halka kullanarak 10 mL BHIS sıvısı içeren bir tüpe aktarın. Gece boyunca inkübe edin (14-18 saat).
  5. Odadaki gece kültürünü seri olarak seyrelterek hücre yoğunluğunu belirleyin.
    1. Gece boyunca kültürün 10 kat seyreltilmesini gerçekleştirin. 103 seyreltme, bu protokolde kullanılan suşların her biri için sayılabilir bir numune verir. Bununla birlikte, büyüme farklılıkları olan klinik izolatlar için bu adımın standardizasyonu gerekebilir.
    2. Tüpleri anaerobik odadan çıkarın, her numuneden 10 μL'yi bir hemositometreye yerleştirin ve hemositometre üreticisi tarafından tarif edildiği gibi bir parlak alan mikroskobu kullanarak sayın.
    3. Saymadan sonra hücre konsantrasyonunu belirlemek için üreticinin talimatlarını izleyin.

2. Biyofilm oluşumu

NOT: Bu protokol farklı kuyu boyutlarına uyarlanabilirken, 96 kuyulu platform için optimize edilmiştir. Kuyu boyutu değiştirilirse, hücre konsantrasyonunun kuyu yüzey alanına göre ayarlanması gerekecektir.

  1. Gece kültüründen hücre konsantrasyonunu belirledikten sonra, hücre konsantrasyonunu BHIS'de 1 x 107 hücre / mL'ye ayarlayın (% 10 (a / h) L-sistein ve 0.1M glikoz ile desteklenmiştir).
    NOT: 0.1M glikoz takviyesinin daha önce C. difficile 630 Δerm suşu47 tarafından biyofilm oluşumunu arttırdığı gösterilmiştir. Bu protokol için, farklı başlangıç konsantrasyonları test edildikten sonra 1 x 107 hücre / mL konsantrasyonu seçildi (Şekil 1). Glikoz takviyesi olmadan da sağlam biyofilm oluşumu elde edilebilir.
  2. 100 μL hücreyi 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının (düz tabanlı ve doku kültürü ile tedavi edilmiş) kuyucuklarına dağıtın, kontrol (yalnızca hücreler) ve boş (yalnızca ortam) sütunları bırakın. Anaerobik odada (37 ° C) 24 saat inkübe edin.
    1. Ortamın buharlaşması bir sorun haline gelirse, biyofilm plakalarını herhangi bir ısıtma ünitesinden uzağa yerleştirin. Alternatif olarak, biyofilmleri ek bir kabın içine yerleştirin veya geçirgen 96 oyuklu plaka membranlarla örtün.
  3. Medyayı boşluktan başlayarak tüm kuyucuklardan yavaşça çıkarın. Bu, yapışmayan hücreleri uzaklaştıracak ve geride bir biyofilm bırakacaktır. Bu adım çok önemlidir, çünkü sadece biyofilm içindeki hücreler ilgi çekicidir.
  4. Biyofilmleri 2 kez 200 μL önceden indirgenmiş PBS ile nazikçe yıkayın. Bu yıkamayı nazikçe yapmak için 96 oyuklu plakayı hafifçe eğin, pipet uçlarını kuyunun duvarına yerleştirin, uçları dibi kazımadan kuyunun dibine yakın kaydırın ve yavaşça aspire edin. PBS altta kalırsa, işlemi tekrarlayın. Bu aşamada, yapışık olmayan hücreler çıkarılabilir ve bu normaldir. Plakayı anaerobik odadan çıkarmadan önce PBS'yi çıkarın.
  5. Bu noktada, biyofilmleri aşağıdakiler için kullanın: Biyokütle ölçümleri (Bkz. Adım 3); metabolik aktivite ölçümleri (Bkz. Adım 4); ilaç duyarlılığı ve ilaç tarama testleri (Bkz. Adım 5).
    NOT: Bu protokol, laboratuvara uyarlanmış 630 Δerm suşu ve salgın UK1 suşu için doğrulanmıştır. Farklı klinik izolatlar ve suşlar zayıf biyofilm oluşturma yetenekleri gösterebilir. Biyofilm bozulmasını en aza indirmek için 2x yerine PBS 1x ile yıkayın ve yıkama hacmini 100 μL'ye düşürün.

3. Kristal viyole testi kullanılarak biyofilm biyokütlesinin ölçülmesi

NOT: Kristal viyole boyama, daha önce açıklanan bir protokol48'e dayanıyordu.

  1. Biyofilmleri anaerobik haznede yıkadıktan sonra (bkz. adım 2.4), plakayı çıkarın ve kimyasal bir çeker ocak içine aktarın.
  2. Biyofilmleri sabitlemek için, her bir oyuğa nazikçe 150 μL metanol ekleyin. Plakayı 10 dakika boyunca kapakla örtün.
  3. Metanolü çıkarın ve kapak çıkarılmış olarak kuyuların tamamen kurumasını bekleyin. Bu işlem 30 dakika ile 45 dakika arasında sürmelidir.
  4. Tüm kuyucuklara 100 μL %0,3 Kristal menekşe ekleyin ve 10 dakika boyayın. Kuyu kenarının ve duvarlarının lekelenmesini önlemek için Kristal menekşeyi dikkatlice çıkarın, çünkü bu okumayı etkileyebilir.
  5. Kapağı çıkarılmış halde plakanın kurumasını bekleyin. Bu işlem 30 dakika ile 45 dakika arasında sürmelidir.
  6. Kuyuları 3x 200 μL damıtılmış su ile yıkayın ve plakanın tamamen kurumasını bekleyin. Bu işlem 30 ila 45 dakika sürmelidir.
  7. Kuruduktan sonra, biyofilmleri görüntülemek için parlak alan mikroskobu kullanın (Şekil 2A). Bu adım isteğe bağlı olsa da, biyofilmdeki hücrelerin daha kapsamlı bir şekilde gözlemlenmesine olanak tanır.
    1. 96 oyuklu plakayı, bir plaka adaptörü ile ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobuna yerleştirin. Test edilen her suş için temsili kuyuları tanımlayın.
    2. İstenilen büyütmede her kuyucuk için görüntü alın. Bu protokolde sunulan görüntüler 40x büyütme ile çekilmiştir.
  8. İstenen görüntüler elde edildikten sonra, lekeyi gidermek için plakayı tekrar kimyasal bir çeker ocak içine aktarın.
  9. Biyofilmin lekesini çıkarmak için 150 μL %33 asetik asit ekleyin ve 10 dakika boyunca orta hızda bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
  10. Her kuyucuktan 90 μL çıkarın ve yeni bir 96 oyuklu düz tabanlı plakaya aktarın. Bir plaka okuyucu kullanarak 595 nm'de absorbansı okuyun (Şekil 2B).

4. Metabolik boya PrestoBlue kullanılarak biyofilm canlılığının ölçülmesi

  1. Metabolik aktivite ölçümünü, temel değişikliklerle test için üreticinin protokolünü takip ederek gerçekleştirin. Biyofilmleri test için hazırlamadan önce plaka okuyucuyu 37 °C'ye ısıtın. Floresan ölçümü yapabilen bir plaka okuyucu önerilir.
    NOT: Alternatif olarak, metabolik aktivite OD600'de okunabilir; Ancak, bu yaklaşımın bu tahliller için yeterince hassas olduğunu bulamadık. Kullanıcıların üreticinin protokolünü gözden geçirmeleri ve gerekirse standartlaştırmaları önerilir.
  2. Biyofilmleri yukarıda tarif edildiği gibi anaerobik odada PBS ile yıkadıktan sonra (bkz. adım 2.4), plakayı hazneden çıkarın.
  3. Plaka ile birlikte, 9 mL önceden indirgenmiş BHIS'i çıkarın (% 10 (a / h) L-sistein ve 0.1 M glikoz ile desteklenmiş).
  4. 9 mL önceden indirgenmiş BHIS ve vortekse hızlı bir şekilde 1 mL PrestoBlue reaktifi ekleyin. Reaktif renklenmesini etkileyebileceğinden reaktifi önceden küçültmeyin (Bkz. Tartışma).
  5. Her kuyucuğa 100 μL BHIS-PrestoBlue karışımı ekleyin. Plakayı aşağıdaki ayarlarla bir plaka okuyucuya yerleştirin: 37 °C'de sıcaklık, Kinetik olarak tahlil tipi; okuma süresi 30 dk olarak; her 2 dakikada bir okuma frekansı; mevcut plaka okuyucu tipine bağlı olarak floresan yoğunluğu. Bu protokolde açıklanan ölçümler, sırasıyla 560 nm / 590 nm uyarma/emisyon dalga boyları kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
  6. Okuduktan sonra plakaları atın.
  7. Plaka okumalarından floresan değerleri elde edildikten sonra, tüm numune kuyucuklarından gürültüyü çıkarmak için boş (yalnızca ortam) kuyucuklar kullanın. Bundan sonra, metabolik aktivite elde etmek için her bir bileşikle muamele edilmiş biyofilm kuyucuklarını, işlenmemiş (% 100) bir biyofilm içeren kontrol kuyusuna bölün.

5. Biyofilmlere ilaç ilavesi

NOT: Aşağıda açıklanan kurulum, ilaç duyarlılık testleri ve sabit konsantrasyonlu ilaç taraması için değiştirilebilir. Aşağıda açıklanan her iki yöntem için de PrestoBlue testi önerilir.

  1. Farklı antibiyotiklerin minimum inhibitör konsantrasyonlarının (MIC) belirlenmesi
    NOT: Biyofilmler 48 saatlik bir süre boyunca işlenir ve kontaminasyon olasılığını artırır. Önce boş kuyuların işlenmesi ve aseptik prosedürlerin takip edilmesi çok önemlidir. Diğer C. difficile suşları için literatürde bildirilen MIC değerleri ve test dozu yanıt testleri, bu protokolde sunulan MIC testleri için başlangıç antibiyotik konsantrasyonlarını bilgilendirmek için kullanılmıştır. Bu yaklaşım, klinik izolatlarla çalışırken başlangıç antibiyotik konsantrasyonlarını belirlemek için faydalı olacaktır.
    1. Olgun (24 saatlik) biyofilmleri yukarıda tarif edildiği gibi anaerobik odada PBS ile yıkayın (Bkz. adım 2.4).
    2. Test antibiyotiğinin iki kat dilüsyonlarını içeren 200 μL önceden indirgenmiş BHIS (% 10 (a / h) L-sistein ve 0.1M glikoz ile desteklenmiş) medyayı kontrol (yalnızca hücreler) ve boş (yalnızca ortam) hariç her bir oyuğa ekleyin plakadaki sütunlar.
    3. 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Bu çalışmada, testi doğrulamak için vankomisin (200 μg/mL başlangıç konsantrasyonu), metronidazol (16 μg/mL başlangıç konsantrasyonu) ve fidaksomisin (başlangıç konsantrasyonu 4 μg/mL) kullanılmıştır. MİK değerleri Tablo 1'de rapor edilmiştir.
    4. Plakaların kurumasını önlemek için, anerobik odadaki ısıtma ünitesinden uzak tutun veya gaz geçirgen bir membran kullanın.
      NOT: Alternatif olarak, plakanın dış kuyucuklarında önceden indirgenmiş bir PBS veya ortam hendeği (300 μL) kullanılabilir.
    5. İlaçlarla 24 saat inkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve biyofilmleri 1x PBS ile nazikçe yıkayın. Kristal viyole tahlili veya PrestoBlue tahlili kullanarak biyofilmleri işleyin.
  2. İlaç kütüphanelerinin taranması
    1. Olgun (24 saatlik) biyofilmleri yukarıda tarif edildiği gibi anaerobik odada PBS ile yıkayın (Bkz. adım 2.4).
    2. Plakadaki kontrol (antibiyotiksiz ortamdaki hücreler) ve boş (antibiyotiksiz ortam) sütunları dışında her bir oyuğa sabit konsantrasyonda ilaç kütüphanesi bileşikleri içeren 200 μL ortam ekleyin. 24 saat daha kuluçkaya yatırın. Plakaların kurumasını önlemek için, anerobik odadaki ısıtma ünitesinden uzak tutun.
    3. İlaçlarla 24 saat inkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve biyofilmleri 1x PBS ile nazikçe yıkayın. Kristal viyole tahlili veya metabolik tahlili kullanarak biyofilmleri işleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokolün amacı, 96 oyuklu plaka biyofilm oluşum modelini, C. difficile'nin yerleşik biyofilmlerine karşı aktiviteye sahip yeniden konumlandırılabilir bileşiklerin tanımlanması için bir ilaç tarama platformu olarak uyarlamak ve doğrulamaktır. Farklı hücre yoğunluklarının (104, 105, 106 ve 107 hücre / mL) biyofilm oluşumu üzerindeki etkisi belirlendi ve biyofilm oluşumu daha önce tarif edildiği gibi Kristal viyole boy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

C. difficile biyofilm oluşumu ve hastalıkta oynadığı rol tam olarak anlaşılamamıştır. Son bulgular hastalık nüksetmesinde biyofilmlerin rolü olduğunu göstermektedir28,34. Biyofilm oluşumu önemli bir virülans faktörüdür 22,23,24,25 ve Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çatışması yoktur.

Teşekkürler

J.A.R. çalışmayı ve protokolü tasarladı ve el yazmasını yazdı. A.S. ve P.Z. deneyleri yürüttüler ve protokolün iyileştirilmesine yardımcı oldular. Bu çalışma, San Antonio'daki Texas Üniversitesi'nden (UTSA) JAR'a kadar olan başlangıç fonları tarafından desteklendi ve A.S., UTSA MARC programı (T34GM145507) tarafından desteklendi. Yazarlar, Medicines for Malaria Venture'a (MMV, İsviçre) Küresel Sağlık Öncelikli Kutu kütüphanesini sağladığı için teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ASETİK ASİT SAF-CT ACS 500MLFisher ScientificA38S500
AGAR BAKTERİYOLOJİK GR 1KGFisher ScientificAC443570010
BioTek Synergy H1 plaka okuyucuFisher ScientificBTH1MG ŞİŞE
MAYA ÖZÜ 500GFisher ScientificDF0127179
BEYİN KALP İNFÜZYON SUYUFisher Scientific
Kristal Menekşe USP sınıfı 100GVWR97061-850Biyokütle tahlilleri için biyofilmlerin boyanması için
CytoOne 96 oyuklu TC plakası, düz dipli, şeffaf, iç sargılı, 50/kutuABD BilimselCC7682-7596
D-(+)-Glikoz, susuzFisher Scientific50712744
Moleküler Biyoloji için Dimetil Sülfoksit (DMSO)Millipore SigmaD8418-250ML
FIDAXOMICIN 250MGFisher ScientificAC468312500
L-SİSTEIN %98+1KGFisher ScientificAAA104350BC. difficile media
için METANOL 99.8 AKROSEAL 1LTFisher ScientificAC364390010
METRONIDAZOL, %99 5GRFisher ScientificAC210340050
Fosfat tampon tuzlu su (PBS) 10XFisher ScientificBP3991
PrestoBlue Hücre Canlılığı ReaktifiFisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAK YAPIŞKANLAR 100/CSFisher Scientific7000379Anne ve kız ilaç plakalarını depolamadan önce kapatmak için kullanılır
SODYUM TAUROKOLAT 100MG VWR100291-598
VANKOMİSİNFisher BilimselBP29581
CM1135R

Kaynaklar

  1. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  3. Sheitoyan-Pesant, C., et al. Clinical and healthcare burden of multiple recurrences of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 62 (5), 574-580 (2016).
  4. Abou Chakra, C. N., Pepin, J., Sirard, S., Valiquette, L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: A systematic review. PLoS One. 9 (6), e98400(2014).
  5. Aslam, S., Hamill, R. J., Musher, D. M. Treatment of Clostridium difficile-associated disease: Old therapies and new strategies. Lancet Infect Dis. 5 (9), 549-557 (2005).
  6. Brown, K. A., Khanafer, N., Daneman, N., Fisman, D. N. Meta-analysis of antibiotics and the risk of community-associated Clostridium difficile infection. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2326-2332 (2013).
  7. Dicks, L. M. T., Mikkelsen, L. S., Brandsborg, E., Marcotte, H. Clostridium difficile, the difficult "kloster" fuelled by antibiotics. Curr Microbiol. 76 (6), 774-782 (2019).
  8. Sholeh, M., et al. Antimicrobial resistance in Clostridioides (Clostridium) difficile derived from humans: A systematic review and meta-analysis. Antimicrob Resist Infect Control. 9 (1), 158(2020).
  9. Peng, Z., et al. Update on antimicrobial resistance in Clostridium difficile: Resistance mechanisms and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol. 55 (7), 1998-2008 (2017).
  10. Dilnessa, T., Getaneh, A., Hailu, W., Moges, F., Gelaw, B. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of Clostridium difficile among hospitalized diarrheal patients: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 17 (1), e0262597(2022).
  11. Hopkins, R. J., Wilson, R. B. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis: A narrative review. Gastroenterol Rep (Oxf). 6 (1), 21-28 (2018).
  12. Bartlett, J. G. Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis. Rev Infect Dis. 6 (Suppl 1), S235-S241 (1984).
  13. Merino, E., Salavert, M. Treatment of Clostridioides difficile infection: From guidelines to clinical practice. Rev Esp Quimioter. 35 (Suppl 3), 97-101 (2022).
  14. Pepin, J., et al. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 40 (11), 1591-1597 (2005).
  15. Cornely, O. A., Miller, M. A., Louie, T. J., Crook, D. W., Gorbach, S. L. Treatment of first recurrence of Clostridium difficile infection: Fidaxomicin versus vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S154-S161 (2012).
  16. Mcfarland, L. V., Elmer, G. W., Surawicz, C. M. Breaking the cycle: Treatment strategies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol. 97 (7), 1769-1775 (2002).
  17. Mcfarland, L. V., et al. A randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile disease. JAMA. 271 (24), 1913-1918 (1994).
  18. Kamboj, M., et al. Relapse versus reinfection: Surveillance of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 53 (10), 1003-1006 (2011).
  19. Figueroa, I., et al. Relapse versus reinfection: Recurrent Clostridium difficile infection following treatment with fidaxomicin or vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S104-S109 (2012).
  20. Castro-Cordova, P., et al. Entry of spores into intestinal epithelial cells contributes to recurrence of Clostridioides difficile infection (vol 12, 1140, 2021). Nat Commu. 13 (1), 2456(2021).
  21. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  22. Costerton, J. W., et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  23. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  24. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  25. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  26. Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M., Kielian, T. Hiding in plain sight: Interplay between Staphylococcal biofilms and host immunity. Front Immunol. 5, 37(2014).
  27. Thomsen, K., et al. Animal models of chronic and recurrent Pseudomonas aeruginosa lung infection: Significance of macrolide treatment. Apmis. 130 (7), 458-476 (2022).
  28. Normington, C., et al. Biofilms harbour Clostridioides difficile, serving as a reservoir for recurrent infection. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 16(2021).
  29. Frost, L. R., Cheng, J. K. J., Unnikrishnan, M. Clostridioides difficile biofilms: A mechanism of persistence in the gut. PLoS Pathog. 17 (3), e1009348(2021).
  30. Meza-Torres, J., Auria, E., Dupuy, B., Tremblay, Y. D. N. Wolf in sheep's clothing: Clostridioides difficile biofilm as a reservoir for recurrent infections. Microorganisms. 9 (9), 1922(2021).
  31. James, G. A., et al. Analysis of Clostridium difficile biofilms: Imaging and antimicrobial treatment. J Antimicrob Chemother. 73 (1), 102-108 (2018).
  32. Brauer, M., et al. What's a biofilm?-how the choice of the biofilm model impacts the protein inventory of Clostridioides difficile. Front Microbiol. 12, 682111(2021).
  33. Poquet, I., et al. Clostridium difficile biofilm: Remodeling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front Microbiol. 9, 2084(2018).
  34. Crowther, G. S., et al. Comparison of planktonic and biofilm-associated communities of Clostridium difficile and indigenous gut microbiota in a triple-stage chemostat gut model. J Antimicrob Chemother. 69 (8), 2137-2147 (2014).
  35. Crowther, G. S., et al. Development and validation of a chemostat gut model to study both planktonic and biofilm modes of growth of Clostridium difficile and human microbiota. PLoS One. 9 (2), e88396(2014).
  36. Dawson, L. F., Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, E. H., Wren, B. W. Characterisation of Clostridium difficile biofilm formation, a role for spo0a. PLoS One. 7 (12), e50527(2012).
  37. Dubois, T., et al. A microbiota-generated bile salt induces biofilm formation in Clostridium difficile. NPJ Biofilms Microbiomes. 5 (1), 14(2019).
  38. Abdelkhalek, A., Mohammad, H., Mayhoub, A. S., Seleem, M. N. Screening for potent and selective anticlostridial leads among fda-approved drugs. J Antibiot (Tokyo). 73 (6), 392-409 (2020).
  39. Chen, J., Lu, Y., Du, Y., Wang, H., Wu, Q. Recent development of small-molecular inhibitors against Clostridioides difficile infection. Bioorg Chem. 125, 105843(2022).
  40. Katzianer, D. S., Yano, T., Rubin, H., Zhu, J. A high-throughput small-molecule screen to identify a novel chemical inhibitor of Clostridium difficile. Int J Antimicrob Agents. 44 (1), 69-73 (2014).
  41. Pal, R., Dai, M., Seleem, M. N. High-throughput screening identifies a novel natural product-inspired scaffold capable of inhibiting Clostridioides difficile in vitro. Sci Rep. 11 (1), 10913(2021).
  42. Sun, X., et al. Mouse relapse model of Clostridium difficile infection. Infect Immun. 79 (7), 2856-2864 (2011).
  43. Edwards, A. N., Mcbride, S. M. Isolating and purifying Clostridium difficile spores. Methods Mol Biol. 1476, 117-128 (2016).
  44. Romo, J. A., Kumamoto, C. A. Characterization of the effects of Candida gastrointestinal colonization on Clostridioides difficile infection in a murine model. Methods Mol Biol. 2542, 271-285 (2022).
  45. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9 (Unit9A), 1(2009).
  46. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  47. Dapa, T., Unnikrishnan, M. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. 4 (5), 397-402 (2013).
  48. O'toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  49. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J Bacteriol. 195 (3), 545-555 (2013).
  50. Morais, M., et al. Comparative biofilm-forming ability between Clostridioides difficile strains isolated in Latin America and the epidemic nap1/027 strain. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1033698(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biyofilm OluşumuMetabolik Analizİlaç DuyarlılığıBiyokütle Okumasıİlaç TaramaTekrarlayan EnfeksiyonTerapötik Hedef

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.