Yöntem makalesi

Mitokondri ile ilişkili endoplazmik retikülüm zar sıkılığının indüklenebilir FRET biyosensörleri kullanılarak tespiti

DOI:

10.3791/67914

⸱

7 Ağustos 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ER (CFP etiketli) veya mitokondri (YFP etiketli) bölgelerini hedef alan indüklenebilir FRET biyosensörlerinin FRET değerlerini in vitro ölçerek mitokondri ile ilişkili ER membranlarının (MAM) sıkılığını değerlendirmek için bir yöntem tanımlıyoruz; bu yöntem Aβ oluşumunu etkileyen ve bu yöntem, potansiyel AD tedavileri olarak sentetik veya doğal MAM modüle edici ajanların ilk taramasında kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok çalışma, ER-mitokondri temaslarının veya mitokondri ilişkili zarların (MAM) sayısı, uzunluğu ve boşluk genişliğinin (kalınlığının) biyolojik rollerini etkilediğini göstermiştir. Önceki çalışmamız, yaklaşık 7 nm genişliğindeki boşluk ile karakterize edilen sıkı MAM'lerin stabilizasyonunun amiloid β (Aβ) seviyelerinde artışa yol açtığını, oysa yaklaşık 40 nm genişliğindeki gevşek MAM'lerin bulunmasının, Alzheimer hastalığının (AD) üç boyutlu (3D) sinir modelinde Aβ üretimini azalttığını göstermiştir. Farklı boşluk genişliklerine sahip MAM'lerin etkilerini araştırmak için, ER ve mitokondri hedefli FRET (Förster Rezonans Enerjisi Transferi) biyosensörleri-ER-CFP (cyan floresan protein) ve Mito-YFP (sarı floresan protein) sırasıyla sıkı MAM'leri (<10 nm boşluk genişliği) gevşek veya MAM'sız MAM'lere kıyasla nicelendirmek için geliştirildi. FRET, donör florofor (CFP) ve akseptör florofor (YFP) birbirine 10 nm içinde olduğunda oluşur; bu da bu sistemi MAM yakınlığının değerlendirilmesi için uygun kılar. Bu protokol, sıkı MAM oluşumunun boyutunu ölçmek için spektral oranmetrik FRET kullanımını özetlemektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri ile ilişkili endoplazmik retikülüm temasları (MERC'ler), biyokimyasal olarak mitokondri ilişkili ER zarları (MAM'ler) olarak izole edilen, Alzheimer hastalığı (AD)1 dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif bozukluklarda rol oynamaktadır. Yakın zamanda önerilen "MAM hipotezi", MAM'lerin amiloid β (Aβ) oluşumunda merkezi bir rol oynadığını ve böylece AD'nin patojenik zincirini başlattığını öne sürer. Bu zincirleme nörofibriller düğümlerin (NFT), kalsiyum dishomeostazının venöroinflamasyonun oluşumunu içerir. MAM'lar, endoplazmik retikülüm ve dış mitokondriyal zarda (OMM) kolesterol açısından zengin, lipid raft benzeri mikrodomainlerden oluşur ve bu mikrodomainler, hem yapısal hem de fonksiyonel çeşitliliklerine katkıda bulunan spesifik bağlama proteinleriyle birbirine bağlıdır. ER-mitokondri temaslarının stabilizasyonu, ER kalsiyum sinyalizasyonu ve apoptoz 4,5 dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçleri etkiler. Mitokondrilerin %5-%20'sinin acil servis ile fiziksel temas kurarakMAM'ları kurduğu tahmin edilmektedir 6. Birçok çalışma, MAM bölgelerindeki ER ile mitokondri arasındaki sayı, uzunluk ve boşluk genişliğinin (kalınlığının) işlevsel rollerinin önemli belirleyicileri olduğunu göstermiştir. Fare karaciğerinin kriyo-elektron mikroskobu ve in vivo analizleri, hepatositlerin metabolik durumunun hem MAM'lerin kalınlığını (14 nm ile 20 nm arasında) hem de uzunluğunu (145 nm ile 270 nm arasında) modüle ettiğinigöstermiştir 7.

MAM'ler ayrıca kanser ve metabolik bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için potansiyel terapötik hedefler olarak ortaya çıkmaktadır. MAM kalınlığı veya boşluk genişliği hücre hayatta kalmasını düzenler. Sıkı (6 nm ± 1 nm boşluk genişliği) ve gevşek MAM'leri (24 nm ± 3 nm boşluk genişliği) stabilizasyonu için tasarlanan yapısal MAM stabilizatörleri MAM 1X ve MAM 9X, sıkı MAM'lerin stabilizasyonunun AD'nin yeni bir 3D sinir kültürü modelinde Aβ üretimini dramatik şekilde artırdığını göstermiştir. Buna karşılık, gevşek MAM'lerin stabilizasyonu hiçbir etkiyaratmadı 8. Bu nedenle, sıkı MAM'ların stabilizasyonunu gevşek MAM'lara dönüştürmek, amiloid patolojisini düşürmek için faydalı olabilir. Yapısal ve fonksiyonel karmaşıklıklar ile MAM stabilizasyonu derecesinin kesin nicel analizinin olmaması, ilaç keşfi için MAM'leri hedeflemeyi zorlaştırır. ER'ye bağlı mitokondrilerin aksonal hızının yeni bir canlı hücre görüntülemesi ve kimografi temelli analizi, mitokondrilerin aksonal hızının, ER ile daha sıkı temasın mitokondriyal aksonal hızı serbest mitokondrilere kıyasla önemli ölçüde azalttığı için MAM stabilizasyonunu nicel olarak ölçmek için bir metrik olarakkullanılabileceğini göstermiştir; 8,9. hAPP eksprese eden Nöro 2A (N2AAPP) hücrelerinde MAM'ların indüklenebilir bir stabilizatörükullanılarak 8, MAM boşluklarının sıkılaştırılmasının Aβ oluşumunu doza bağlı olarakartırdığını gördük 8. İndüklenebilir MAM stabilizatörleri, CFP (cyan floresan proteini)-epitop etiketli ER-hedefleme ve YFP (sarı floresan proteini)-epitop etiketli mitokondri hedefleyen biyosensörleri kodlayan ifade plazmidleridir; bunlar rapamisin indüklenebilir FK506 rapamisin bağlanması (FRB) veya 12-kDa FK506-bağlayıcı protein (FKBP) domainlerine entegre edilmiştir. Biyosensörler sırasıyla ER-CFP ve Mito-YFP olarak gösterildi. CFP, >10 nm uzaklıkta olduğunuzda alıcı florofor YFP'ye enerji aktaran donör bir florofordur. İndüklenebilir biyosensörleri ifade eden hücreler (N2AAPP), rapamisin tedavisi 8 sırasında Aβ üretimini artırdıve bu da sıkı MAM'ların Aβ üretimini artırdığını gösterdi. Bu yöntemler, MAM'lerin küçük molekül modülatörlerinin taraması ve onların etkili konsantrasyonunu, patojenik ("Aβ artış") MAM'ları tedavi amaçlı ("Aβ düşüren") olarak tamamen destabilizasyon yapmadan ER ve mitokondri temaslarını tamamen destabilize etmeden dönüştürecek olan sıkı MAM'ların optimal seviyesinin stabilizasyonunu sağlamak için faydalı olacaktır.

Deneysel model
Bu çalışma, APP751 (N2AAPP) bileşen olarak ifade eden Neuro2A(N2A) hücrelerini kullandı. Bu hücreler, naif N2A hücrelerine kıyasla koşullu ortama (CM) tespit edilebilir Aβ seviyeleri salgılar. N2A APP hücreleri, daha önce tanımlandığı gibi %10 FBS, 100 U/mL penisilin (100 μg/mL penisin), 100 μg/mL streptomisin ve 2 mM L-glutamat takviyesi ile desteklenmiş DMEM'detutuldu.

İfade plazmidi
Memeli A-kinaz anchor proteini 1 [AKAP1(34-63)] ve CFP (cyan floresan protein) etiketli ER hedefleme dizisi fosfatidilinositol-3-fosfataz Sac1 fosfatazının [Sac1(521-587)] kendi kendine bölünen Tav2A dizisi ile birleşerek bir ekspresyon plazmidi üretildi; bu dizide pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP olarak belirtilir. Tav2A ile birleşen ekspresyon plazmidi ayrıca FK506 rapamisin bağlanma (FRB) alanını kodlayan nükleotit dizileriyle çevrilidir [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] veya 12-kDa FK506 bağlayıcı protein (FKBP) alanını (MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVHCTGFGDD GDLSQFWSTKDEGQPSFQGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDDDDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP füzyon plazmidi, burada MAM-Tav2A olarak belirtilmiştir ve oranlı FRET analizi için FRB-YFP-AKAP1(34-63) ve Sac1(521-587)-CFP-FKBP ekvimolyar ekspresyon seviyelerini elde etmek amacıyla oluşturulmuştur. Sac1(521-587)-CFP-FKBP, ER-CFP olarak belirtilir, donör florofordur, Mito-YFP-FRB ise, Mito-YFP olarak gösterilir ve ~10 nm8 ile ayrıldığında FRET üreten alıcı florofordur. Bu nedenle, FRET tabanlı biyosensörler sıkı MAM'leri (6-10 nm, boşluk genişliği) tespit eder. FRB ve FKBP, rapamisin eklendiğinde MAM boşluk genişliklerinin doz bağımlı bir şekilde daralmasını sağlamak için tanıtıldı; bu durum artan FRETsinyalinin 8. ölçülmesiyle ölçülebilirdi.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Transfeksiyon

  1. N2AAPP hücrelerini MAM-Tav2A ekspresyon plazmidi ile transfekte edin (14-18 saat).
    1. Başlamadan önce, 1. plaka cam kapak kapakları içeren 6 kuyu başına10adet 6 N2A APP hücresi × ve hücreleri büyüme ortamında 12-16 saat boyunca tuttur.
    2. Üretici protokolüne uygun olarak Lipofektamin transfeksiyon reaktifiyle 1-3 μg MAM-Tav2A plazmidini (Ek Dosya 1) transfekte et.
    3. 12-16 saat transfeksiyondan sonra ilaç tedavisi yapın.
      NOT: FRET arka planı olarak kullanılacak olarak yalnızca donörü (ER-CFP) veya akseptörü (Mito-YFP) kodlayan bir ekspresyon plazmid ile transfekte edilen hücreler her zaman alınmalıdır.

2. Uyuşturucu tedavisi

  1. MAM-Tav2A eksprese edenN2A APP hücrelerini Rapamisin (Rapa) veya Rapalog (Log) (3-6 saat) ile tedavi edin.
    1. Tedaviden önce, stok çözeltileri (10 mM) Rapa ve Log hazırlayın.
    2. Medyayı 0 nM, 100 nM veya 250 nM Rapa veya Log içeren yeni medya ile değiştirin.
    3. 3 saatlik tedaviden sonra, hücreleri sabitlemek için %3,3 paraformaldehit (PFA) ekleyin.
    4. Slaytları floresans konfokal mikroskopisi için bir damla antiifade reaktifi yerleştirerek hazırlayın.
    5. Kapak kaymalarını damlanın üzerine monte edin ve forsepsle nazikçe basın.
      NOT: Cam kapak kapakları kırılgandır ve dikkatli olunmalıdır. Cam kapak örtülerine alternatif olarak, cam alt plakalar kullanın. Cam taban plakalarının kullanılmasının en büyük eksikliği, antiifade reaktifinin kullanılamamasıdır; bu da floroforların ağartılması nedeniyle görüntülemeyi zorlaştırır. DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) içeren antiifade reaktifini KULLANMAYIN çünkü mavi floresansı CFP ile YFP arasındaki FRET'i etkileyecektir.

3. Flüoresans Rezonans Enerjisi Transferi (FRET) için Konfokal Mikroskopi

  1. Slaytları ters bir mikroskobin altına yerleştirin ve hücreler görünür hale gelene kadar mikroskobun odaklığını ayarlayın.
  2. 440 nm lazer kullanarak floroforu uyarın ve donör CFP (FKBP-CFP-ER) için 468-503 nm emisyon veya alıcı YFP (FRB-YFP-Mito) için 525-565 nm emisyon ile görüntü alın.
  3. Sinyal yoğunluğunu dahili floresan filtre kullanarak arka plan sinyali dağınık olana kadar ayarlayın (neredeyse tamamen siyah olmalı).
    NOT: NIS Element AR yazılımı kullanılarak floresan görüntüler yakalamak için konfokal mikroskop kullanılmıştır. 60x büyütme ve 512 piksel çözünürlükte kullanıldı.
  4. Görselleri .nds dosyası olarak kaydet.
  5. Spektral oranlı metrik FRET analizi yapın.

4. Ratiometrik FRET analizi (6 - 12 saat)

NOT: Donör ER-CFP (468-503 nm) ve akseptör Mito-YFP (525-565 nm) tarafından floresan emisyonu konfokal mikroskop kullanılarak tespit edildi. ImageJ yazılımı, arka plan çıkarma sonrası ortalama piksel floresans yoğunluğunu niceltmek için kullanıldı. YFP ile CFP emisyon yoğunluğu oranı hesaplandı ve spektral FRET analizi için okuma olarak kullanıldı.

  1. Açık Görüntü J (Fiji).
  2. .nds dosyasını Image J'ye sürükle ya da File -> Open tuşuna basıp Image'i seçin.
  3. Aşağıdaki ekranda Split Channels kutusunu seçin.
  4. C = 0 paneline tıklayın.
  5. Analyze -> Measure seçeneğine tıklayın.
    NOT: Daha sonra hesaplama için Ortalama Değeri yazın.
  6. Process -> Math -> çıkarma seçeneğine tıklayın.
  7. Ortalama değeri girin.
  8. C = 1 paneli için 4. adımı tekrarlayın.
  9. Freehand seçim aracına tıklayın.
  10. İlgilendiği bir hücreyi daireye alıp Ctrl+T tuşlarına basarak bunu ROI'ya kaydet.
  11. Seçim getirdiğiniz şeyi göstermek için ROI'nin altındaki Show All seçeneğine tıklayın.
  12. Tüm seçilmiş hücreleri seçin ve Ölçüt, Bu değerleri Excel'e kaydet seçeneğine tıklayın.
  13. C = 1 paneline tıklayın ve Show All seçeneğine tıklayın.
  14. Tüm hücreleri seçin ve tekrar Ölçüt'e tıklayın, bu değerleri Excel'te ayrı bir sütuna kaydedin.
  15. Excel'de, alıcının (C0/C1) üzerine donör sinyalinin değerlerini koymak için bir fonksiyon oluşturun. Bu FRET oranıdır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAM-Tav2A'yı ifade eden FACS ile zenginleştirilmişN2A APP hücrelerinin ratiometrik FRET analizi, rapamisin tedavisi sonrası Aβ40 seviyelerinde doza bağlı bir artışgöstermiştir 8. Rapamisin, memelilerin hedef rapamisin (mTOR) sinyal yolunu inhibe ederek etki eder; bu da mikrogliyada TREM2 (Myeloid Hücrelerde İfade Edilen Tetikleyici Reseptör 2) ifadesini aşağı regule eder ve Alzheimer hastalığı 5XFAD fare modellerinde Aβ plak temizliğinin azalmasına yolaçar. Rapamisin analogu AP21967, genellikle rapalog (Log) olarak adlandırılır, mTOR'a düşük eğilim gösterir ve bu nedenle hücreler için nispeten toksik değildir. Ancak, FRB alanı12'ye eklenen telafi edici bir boşluk oluşturan mutasyon (K2095P) nedeniyle, FRB alanını rapamisin ile aynı afiniteyle bağlama yeteneğini korur.

Rapa ve Log tedavisi FRET oranını artırdı (Şekil 1). Tedavi, APP veya IP3R3 veya VDAC1 gibi diğer MAM proteinleri üzerinde çok az veya hiç etki göstermedi. Böylece, sıkı (<10 nm) MAM'lerin artması, in vitro8 Aβ üretimini artırdı. Özellikle, naif N2A hücrelerinde yapılan FRET testleri de benzer sonuçlar verdi.

figure-results-1
Şekil 1: MAM boşluk genişliklerinin sıkılaştırılması, in vitro Aβ üretimini artırdı. (A) İndüklenebilir MAM stabilizatörü CFP-FRB-ER-Tav2A-Mito-FKBP-YFP (MAM-Tav2A) şeması kendiliğinden bölünür ve donörün (CFP-FRB-ER veya ER-CFP) ve alıcının (Mito-FKBP-YFP veya Mito-YFP) ekvimolyar seviyelerini oluşturur ve endogen sıkı MAM'lere bağlı olduğunda veya FRB ve FKBP etkileşimini Rapamisin (Rapa) veya analogu Rapalog (Log) ile indükleyerek sıkı MAM oluşumunu artırdığında FRET/FLIM'i destekler. (B) MAM-Tav2A (Tav2A) ile Tav2A'nın kendi kendine bölünmesinden sonra CFP-ER (mavi kutu) ve Mito-YFP (sarı kutu) ekvimoler ekspresyonunu gösteren hücrelerin IB'si. (C) DMSO (Veh) veya Rapa (250 nM) ile işlenmiş MAM-Tav2A'yı aşırı eksprese eden hücrelerin konfokal görüntüleri. (D,E). (Veh) veya 100 nM rapamisin (Rapa) (D) veya rapalog (Log) (E) ile işlenmiş hücrelerin orantimetrik FRET analizi. FRET değerleri, kanal 2 (465-500 nm) ile kanal 1 (525-555 nm) arasındaki yoğunluk oranları olarak sunulur. Her FRET analizi için, 40-50 hücre rastgele seçilerek hücre bazında yatırım getirisi elde edildi. Tek yönlü ANOVA. p < 0.0001. (F) 24 saat Rivastigmine ile yapılan işlemden sonra MAM-Tav2A ekspresyon edenN2A APP hücrelerinin temsil Western blot görüntüsü (Riv: 0 veya 50 μM). MAM-Tav2A, donör (CFP-ER) ve akseptör (Mito-YFP) seviyeleri oluşturdu. (G) Araçla işlenmiş (0 μM) veya Riv ile işlenmiş (50 μM) alıcı ile alıcı arasındaki FRET oranının nicelendirilmesi. (H) Araçla işlenmiş (0 μM) veya Riv ile işlenmiş (50 μM) hücrelerin koşullu ortamında (CM) Aβ ELISA (Wako) 50 μM Riv-işlemden sonra Aβ40 (pM) seviyelerinde anlamlı bir azalma göstermiştir. n = 6, p < 0.001. (I) FRET (oran) ve Aβ (pM) değerleri tablolanır. Bu figür, Zellmer ve ark. 8'den değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: MAM-Tav2A plazmid dizisi dosyası. ER-hedefli Sac1 dizisini kodlayan ekspresyon plazmidinin DNA dizisi (521FLALPIIMVVAFSMCIICLLMA GDTWTETLAYVLFWGVASIGTFFIILYNGKDFVDAPRLVQKEKID 587) FKBP ve CFP dizisine ve mitokondri hedefleyen AKAP1 dizisi (34SSHDEQQVEAGAVQLRADPAIKEPLPVEDV63) FRB ve YFP dizisine bağlı olarak kendi kendine ayrılan Tav2A dizisi (EGRGSLLTCGD VEENPGP) ile bağlantılıdır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAM'lerin modülasyonu, kanser, metabolik bozukluklar ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli bozukluklar için potansiyel sonuçları olan gelişmekte olan bir araştırmaalanıdır 13. Dynein-antagonist LDC-3/Dynarrestin, antidiyabetik ilaç metformin ve kanser anti-kanser ajanı sulforafan dahil olmak üzere birçok farmakolojik ajan, MAM'ları bozmakta olup, şu anda kanser ve metabolik bozukluklar için pre-klinik ve klinik denemeler aşamasındadır. Bu farmakolojik ajanlar, PTPIP51, VAPB, VDAC1, PACS2, MFN2, VDAC1 ve IP3R3 gibi MAM tethering proteinleri arasındaki etkileşimleri düzenleyerek ER-mitokondri temas temalarını veya MAM temas genişliklerini modüle eder; örneğin , VAPB, VDAC1, PACS2, MFN2, VDAC1 ve IP3R3 14,15,16,17,18,19,20. Sigma-1 reseptörü (S1R) antagonisti (NE-100), AD21'in 3D bir nöronal modelinde MAM'leri aşağı regule etti ve aksonal Aβ seviyelerini dramatik şekilde azalttı. Yakın tarihli bir rapor, S1R kaybının gevşek MAM'leri artırdığını ve sıkı MAM'ları azalttığını göstererek, S1R'nin MAM sıkılığını 8,9 modüle etmek için terapötik bir hedef olduğunu öne sürdü.

Alzheimer hastalığı (AD) transgenik sıçanlarından türetilen nöronların canlı FRET (floresans rezonans enerji transferi) görüntülemesi, vahşi tip kontrollerle karşılaştırıldığında sıkı MAM'lerde (<10 nm) belirgin bir bozulma (~20 nm) gösterdi. N2A APP hücrelerinde ifade edilen rapamisin (Rapa)/rapalog (Log)-indüklenebilir FRB ve FKBP dimerizasyon alanlarını içeren indüklenebilir FRET/FLIM tabanlı MAM stabilizatörleri, Rapa/Log tedavisinin MAM sıkılığını artırdığını ve Aβ40 üretimini doza bağlıolarak artırdığını göstermiştir 8,9. Bu, MAM boşluğunun genişliğini daraltmanın amiloidejenik işlemini teşvik ettiğine dair ilk kavram kanıtını sağladı. FDA onaylı anti-amnestik ilaç rivastigmine, şu anda hafif ve orta dereceli AD22,23 için preklinik inceleme aşamasında olup, VDAC1 veya BACE1 ifadesini değiştirmeden veya CFP-ER ile Mito-YFP 8,9 arasındaki kolokalizasyon sıklığını etkilemeden Aβ40 seviyelerini (p < 0.001) anlamlı şekilde azaltmıştır. Rivastigmine, MAM stabilizasyonunu MAM-sabitleyici protein mitofusin-2 (MFN2)24 seviyelerini modüle ederek etkilemektedir. Bu bulgu, rivastigmine'in kültürlenmiş nöronlar ve AD fare modellerinde Aβ seviyelerini azalttığını bildiren diğer çalışmalarla örtüşmektedir (3xTg)25,26. MAM boşluk genişliği, hücre hayatta kalma için gerekli olan çeşitli hücreselsüreçleri düzenlediğinden, MAM stabilitesinin hedefli modülasyonu, MAM'ların tamamen destabilizasyonundan daha etkili bir terapötik strateji sunabilir; bu da istenmeyen yan etkilere yol açabilir.

Yöntemin büyük sınırlamalarından biri, orantımetrik FRET tekniğinin donör ve alıcının ekvimolyar ifadesine dayanmasıdır. Donörü veya alıcıyı kodlayan ekspresyon plazmidlerinin birlikte ifade edilmesi tutarsız sonuçlar verir. Donör ile akseptör biyosensörleri birbirine bağlayan kendiliğinden ayrılan bir Tav2A kullanmak, biyosensörlerin ekimolar ekspresyonunu sağlar. Ancak, biyosensörlerin ifade seviyeleri, FRET analizinden önce Western blot analiziyle kontrol edildi.

Rapamisin (Rapa), MAM sıkılaştırmasının Aβ üretimi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ideal olmayabilir; çünkü memelilerde hedef olan rapamisin (mTOR) sinyal yolunu inhibe eder; bu da mikrogliyada TREM2'nin (Myeloid Hücrelerde İfade Edilen Tetikleyici Reseptör 2) aşağı regulasyonuna ve bunun sonucunda Alzheimer hastalığı (AD) fare modellerinde Aβ plak temizliğini azaltır (5XFAD)11. Alternatif olarak, genellikle rapalog (Log) olarak adlandırılan rapamisin analogu AP21967 kullanılabilir. Log, mTOR'a düşük bağlanma eğilimi gösterir, bu da hücreler için nispeten toksik değildir. Ancak, FRB domeni12'de telafi edici bir boşluk oluşturan mutasyonun (K2095P) girmesi nedeniyle, rapamisin ile benzer bir afiniteyle FRB alanına bağlanma yeteneğini korur.

Tarif edilen yöntem yüksek öneme sahiptir. Kanser ve metabolik bozukluklarda MAM'lerin sentetik veya doğal küçük moleküllü modülatörlerinin umut vaat eden terapötik etkilerini gösteren birkaç preklinik çalışmanın kanıtlarına rağmen, henüz herhangi bir klinik deneme yapılmamıştır. Bunun başlıca nedenlerinden biri, etkili tedaviler geliştirmek için ön koşul olan MAM stabilitesini nicel olarak ölçebilen güvenilir bir yöntemin olmamasıdır. MAM'ın yapı-fonksiyon ilişkisinin nicelendirilmesi, olgun nöronlar için geleneksel TEM veya diğer yüksek çözünürlüklü mikroskopiler tarafından sağlanamaz, ancak düşük büyütme ile elde edilebilir olan tam bir hücregörüşünü gerektirir (28). Bu nedenle, TEM, kriyo-TEM veya Taramalı Elektron Mikroskopi (SEM) gibi geleneksel teknikler hücresel yapıları nanoölçek seviyesinde tespit edebilir, ancak mitokondri29 ve ER 30,31'in son derece dinamik doğası nedeniyle MAM yapılarını geçici hale getirdiği için MAM stabilizasyon derecesini ölçmedesınırlamalar vardır 32,33,34 . MAM'ın yapı fonksiyonu ilişkisini araştırmak için, canlı hücre görüntüleme ve kimografi analizi kullanılarak ER'ye bağlı mitokondrilerin aksonal hızını sıkı veya gevşek MAM'ler aracılığıyla ölçmekönerilmiştir 8,9. Bu, ADbeyinlerinden (AD beyinlerinden 35) ve farklılaşmış AD sibridhücrelerinden (36) kortikal nöronların mitochondri aksonal taşınımında azaldığını gösteren raporlarla uyumludur. Yüksek nicel doğruluğa rağmen, canlı hücre görüntüleme tekniği yüksek verimli ilaç taraması için faydalı olmayabilir. Buna karşılık, FRET/FLIM analizi, gelecekte mevcut canlı hücre veya yüksek çözünürlüklü mikroskopiden daha hızlı bir nicel teknik olarak uygulanarak AD için küçük moleküllü tedavileri tespit edebilir.

Burada tanımlanan FRET protokolünün, özellikle ER ile mitokondri arasındaki yapay olarak indüklenen bağlantı bağlamında uygulanabilir olduğu gösterilmiştir. Basitliği, ER-mitokondri temas kararlılığının verimli değerlendirilmesini ve bunun sonucunda ortaya çıkan etkilerin amiloid patolojisi üzerindeki incelenmesini sağlar; bu yaklaşımın temel amacı bu yaklaşımın temel amacıdır. Bu yöntemi, yakın zamanda geliştirilen üç boyutlu (3D) AD ilaç taramaplatformu 37 içinde potansiyel MAM modüle eden küçük moleküller kütüphanesini taramak için daha fazla kullanmayı hedefliyoruz. Sonuçlar, gelecekte in vivo veya klinik çalışmalara genişletilebilecek potansiyel anti-Aβ küçük moleküllü MAMmodülatörleri 13in vitro seçiminde son derece faydalı olacaktır. 

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massachusetts Genel Hastanesi (MGH) Profesörü Dr. Rudolph E. Tanzi'ye el yazması hakkında verdiği içgörülü yorumlar için içtenlikle teşekkür ederiz. MGH Yardımcı Doçenti Dr. Masato Maesako'ya FLIM testleri konusundaki uzmanlığını paylaştığı için teşekkür ediyoruz. Philadelphia, Thomas Jefferson Üniversitesi Profesörü Dr. Gyorgy Hajnoczky'ye ER-CFP veya Mito-YFP kodlayan ifade plazmidlerini cömertçe sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cure Alzheimer's Fund to RB tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BSAFisher Scientific501781532
Konfokal mikroskopOlympus FV3000RS (Tokyo, Japonya)N/A
GlutaMAX takviyesi ile DMEMGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTALife Technologies41116134
Falcon 6 Kuyu PlakaVWR International41122107
GAPDH Poliklonal AntikorThermo Fisher ScientificPA1-988
JelatinVWR International9000-70-8
Genetikin (G418 Sülfat)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
GFP monoklonal AntikorInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, sürüm 9.5.0N/A
HeparinSigma-AldrichH0200000
ImageJ YazılımImageJ 1.53aN/A
Ters konfokal mikroskopNikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS ExcelMicrosoft Excel, sürüm 2302N/A
NaClFisher Scientific7647145
NuPAGE 4-12% Bis-Tris jelInvitrogenNP0321BOX
Penisilin/Streptomisin/Amfoterik BLonza17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10N/A
Tris-HCL, pH 7.6Boston BioProducts42000000
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tripsin-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martino Adami, P. V., et al. Perturbed mitochondria-ER contacts in live neurons that model the amyloid pathology of Alzheimer's disease. J Cell Sci. 132 (20), 229906(2019).
  2. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  3. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  4. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  5. Carpio, M. A., et al. controls apoptosis by Ca2+ through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  6. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647-e658 (2022).
  7. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: Structure and signaling functions. Trends Cell Biol. 28 (7), 523-540 (2018).
  8. Zellmer, J. C., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Aβ generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 21 (2), e14417(2024).
  9. Zellmer, J. C., Lomoio, S., Tanzi, R. E., Bhattacharyya, R. Quantitative analysis of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) stabilization in a neural model of Alzheimer's disease (AD). J Vis Exp. (215), e66129(2025).
  10. Bhattacharyya, R., et al. The neuronal-specific isoform of BIN1 regulates beta-secretase cleavage of APP and Abeta generation in a RIN3-dependent manner. Sci Rep. 12 (1), 3486-3500 (2022).
  11. Shi, Q., et al. Microglial mTOR activation upregulates Trem2 and enhances β-amyloid plaque clearance in the 5XFAD Alzheimer's disease model. J Neurosci. 42 (27), 5294-5313 (2022).
  12. Wilmington, S. R., Matouschek, A. An inducible system for rapid degradation of specific cellular proteins using proteasome adaptors. PLoS One. 11 (4), e0152679(2016).
  13. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637-1655 (2020).
  14. De Vos, K. J., et al. VAPB interacts with the mitochondrial protein PTPIP51 to regulate calcium homeostasis. Hum Mol Genet. 21 (6), 1299-1311 (2012).
  15. Yang, M., et al. Mitochondria-associated ER membranes: The origin site of autophagy. Front Cell Dev Biol. 8, 595(2020).
  16. Filadi, R., et al. Mitofusin 2 ablation increases endoplasmic reticulum-mitochondria coupling. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (17), E2174-E2181 (2015).
  17. Filadi, R., et al. On the role of Mitofusin 2 in endoplasmic reticulum-mitochondria tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2266-E2267 (2017).
  18. Xie, Q., et al. ABT737 reverses cisplatin resistance by regulating ER-mitochondria Ca2+ transduction in human ovarian cancer cells. Int J Oncol. 49 (6), 2507-2519 (2016).
  19. Tsunoda, T., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene. 24 (8), 1396-1402 (2005).
  20. Tubbs, E., et al. Sulforaphane improves disrupted ER-mitochondria interactions and suppresses exaggerated hepatic glucose production. Mol Cell Endocrinol. 461, 205-214 (2018).
  21. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  22. Alhazmi, H. A., Albratty, M. An update on the novel and approved drugs for Alzheimer disease. Saudi Pharm J. 30 (12), 1755-1764 (2022).
  23. Rountree, S. D., et al. Effectiveness of antidementia drugs in delaying Alzheimer's disease progression. Alzheimers Dement. 9 (3), 338-345 (2013).
  24. Hadwen, J., et al. Transcriptomic RNAseq drug screen in cerebrocortical cultures: Toward novel neurogenetic disease therapies. Hum Mol Genet. 27 (18), 3206-3217 (2018).
  25. Ray, B., et al. Rivastigmine modifies the α-secretase pathway and potentially early Alzheimer's disease. Transl Psychiatry. 10 (1), 47(2020).
  26. Bailey, J. A., Ray, B., Greig, N. H., Lahiri, D. K. Rivastigmine lowers Aβ and increases sAPPα levels, which parallel elevated synaptic markers and metabolic activity in degenerating primary rat neurons. PLoS One. 6 (7), e21954(2011).
  27. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  28. Neikirk, K., et al. Call to action to properly utilize electron microscopy to measure organelles to monitor disease. Eur J Cell Biol. 102 (4), 151365(2023).
  29. Liu, X., et al. Mitochondrial 'kiss-and-run': Interplay between mitochondrial motility and fusion-fission dynamics. EMBO J. 28 (20), 3074-3089 (2009).
  30. Szymanski, J., et al. Interaction of mitochondria with the endoplasmic reticulum and plasma membrane in calcium homeostasis, lipid trafficking and mitochondrial structure. Int J Mol Sci. 18 (7), ijms18071576(2017).
  31. Tikhomirova, M. S., et al. A role for endoplasmic reticulum dynamics in the cellular distribution of microtubules. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2104309119(2022).
  32. Stacchiotti, A., et al. Perspective: Mitochondria-ER contacts in metabolic cellular stress assessed by microscopy. Cells. 8 (1), 8010005(2018).
  33. Cieri, D., et al. SPLICS: A split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  34. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: A matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  35. Dai, J., et al. Impaired axonal transport of cortical neurons in Alzheimer's disease is associated with neuropathological changes. Brain Res. 948 (1), 138-144 (2002).
  36. Trimmer, P. A., Borland, M. K. Differentiated Alzheimer's disease transmitochondrial cybrid cell lines exhibit reduced organelle movement. Antioxid Redox Signal. 7 (9-10), 1101-1109 (2005).
  37. Quinti, L., et al. Neurotherapeutics in the Era of Translational. Smith, R. A., Kaspar, B. K., Svendsen, C. N. , Academic Press. 311-331 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

BiyolojiSay 234Say 234Bu Ay JoVE deSay
Video yakında

İlgili makaleler