Burada, hücre dışı bir matris (3D-HRTEC) üzerinde tek tabakalar ve üç boyutlu kültürler geliştirmek için böbrek korteksinden insan renal tübüler epitel hücrelerinin (HRTEC) birincil kültürlerini elde etmek için protokolleri açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Renal Tübüler Epitel Hücre Primer Kültürlerinin Tek Tabakalı ve Üç Boyutlu Koşullarda Geliştirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan renal tübüler epitel hücresi (HRTEC) primer kültürleri, Buenos Aires, Arjantin'deki General de Pediatría Pedro de Elizalde Hastanesi Pediatrik Nefroloji Ünitesi tarafından nefrektomi geçiren pediatrik hastalardan alınan böbreklerden izole edilir. Makroskopik olarak, normal böbrek korteksi renal medulladan diseke edilir ve parçalara ayrılır. Kortikal fragmanlar daha sonra Hank'in solüsyonunda sindirilir, %0.1 kollajenaz tip 1 ile desteklenir ve böbrek tübüllerini glomerüllerden ayırmak için 70 μm'lik gözenek boyutunda bir ağdan süzülür. Renal tübüller, epitel hücrelerini izole etmek için kollajenaz ile ikinci bir sindirime uğrar. Son olarak, enzim sindirimi durdurulur ve epitel hücreleri, birleşene kadar 37 ° C'de% 5 CO2altında takviyelerle RPMI 1640 içeren şişelerde büyütülür. HRTEC hücreleri, 96 oyuklu plakalar üzerinde tek tabakalar, 24 oyuklu plakalara cam lameller veya kollajen ile kaplanmış hücre kültürü tutucular olarak büyütülebilir. Ayrıca, üç boyutlu insan renal tübüler epitel hücresi (3D-HRTEC) kültürleri, bir bazal membran (BM) matrisi üzerine ekilen HRTEC hücrelerinden elde edilir. Hücre agregasyonu ve boru şeklindeki yapıların oluşumu izlenir. Pediatrik böbrekte Shiga toksininin neden olduğu sitotoksik etkiyi incelemek için uzun yıllardır HRTEC primer kültürlerini kullanıyoruz, bu da hemolitik üremik sendrom (HÜS) ile sonuçlanan patofizyolojik değişikliklere yol açıyor. Hem HRTEC hem de 3D-HRTEC kültürleri, farklı toksinlerin, sentetik ilaçların, biyolojik faktörlerin, hormonların vb. özellikle insan renal proksimal tübül epiteli üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.
Giriş
Grubumuzda, Shiga toksini üreten Escherichia coli (STEC) ile gastrointestinal enfeksiyon sonrası oluşan Shiga toksini tip 2'nin (Stx2) sitotoksik etkisini pediatrik böbrekte incelemek için tek tabakalı ve üç boyutlu (3D-HRTEC) koşullarda geliştirilen insan renal tübüler epitel hücrelerinin (HRTEC) primer kültürleri kullanıldı.
Stx1 ve Stx2 (Stxs), ishal sonrası hemolitik üremik sendroma (HUS) neden olabilen STEC'in ana virülans faktörleridir1. HÜS, STEC ile enfekte çocukların yaklaşık %5-10'unu etkileyen ve hemolitik anemi, trombositopeni ve pediatrik akut böbrek hasarından (ABH) oluşan, destekleyici tedavi gerektiren sistemik bir komplikasyondur2. Arjantin'de STEC-HUS, akut böbrek hasarının önde gelen nedenlerinden birini temsil eden, 5 yaşın altındaki 100.000 çocuk başına yıllık 6,52 vaka insidansı olan endemik bir hastalıktır(dünya çapında en yüksek). Mortalitesi %4'ten3 daha az olmakla birlikte, hastaların yaklaşık %50'sinde renal sekel gelişmektedir ve bu durum ülkemizde böbrek naklinin en sık ikinci nedenini oluşturmaktadır 4,5.
İçselleştirmeden ve sitotoksik etkisini uygulamadan önce, Stx2 spesifik olarak hedef organların6 hücre yüzeyinde eksprese edilen glikolipid globotriaosilseramid (Gb3) reseptörüne bağlanır. Böbrek, renal epitel ve endotel hücrelerinde yüksek miktarda biyolojik olarak aktif Gb3 reseptörlerini eksprese eden Stx'e duyarlı hücrelerin varlığı nedeniyle Stxs tarafından hasar gören ana organdır 7,8.
Tek tabakalar olarak kültürlenen HRTEC'te yapılan önceki çalışmalar, Stx2'nin protein sentezini inhibe ettiğini, hücre canlılığını ve hücre proliferasyonunu azalttığını ve apoptoz ve nekrozu indüklediğini gösterdi 9,10,11,12. Ayrıca, 3D-HRTEC'in Stx2'ye maruz kalması, hücre göçünü ve renal proksimal tübüllerin özelliklerine sahip tübüler yapıların gelişimini inhibe etti12,13.
HRTEC ve 3D-HRTEC kültürlerinin birincil kültürleri, 5-bromo-2-deoksiüridin (BrdU) hücre döngüsünün14 S fazındaki hücrelerin DNA'sına dahil edilmesini ölçerek estradiolün hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için de kullanıldı.
Epitel hücrelerini izole etmek için, ürolojik durumların düzeltilmesi için belirtilen pediatrik nefrektomilerden elde edilen böbrek parçalarından başlıyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hospital General de Niños Pedro de Elizalde Etik Komitesi, araştırma amaçlı birincil hücre kültürlerinin geliştirilmesi için insan böbrek dokularının kullanımını onayladı. Böbrek örneklerinin araştırma amaçlı kullanımı için çocuklar adına yakın akraba veya velilerden yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.
NOT: İnsan renal tübüler epitel hücrelerinin (HRTEC) birincil kültürleri, Arjantin, Buenos Aires'teki Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde'de ürolojik durumların düzeltilmesi veya tümör rezeksiyonları için endike nefrektomi geçiren pediatrik hastalardan türetilmiştir.
1. İnsan renal tübüler epitel hücrelerinin (HRTEC) primer kültürlerinin geliştirilmesi
NOT: Hastanede nefrektomi geçiren pediatrik hastalardan alınan böbreklerden kortikal böbrek parçaları diseke edilir. HRTEC'in birincil kültürü, daha önce açıklanan yönteme göre gerçekleştirilir11.
Protokol aşağıdaki adımlarda açıklanmıştır:
- Böbrek parçasını laboratuvarda işlenene kadar steril fosfat tamponlu salin (PBS) veya Hanks'in Dengeli Tuz çözeltisinde (Hanks) buzdolabında saklayın.
- Böbrek kapsülünü forseps ile inceleyin. Renal korteksi medulladan ayırın ve yaklaşık 1 mm'lik küçük parçalar halinde kesin.
- Sindirimi gerçekleştirmek için, böbrek parçalarını% 0.1 kollajenaz tip I ile desteklenmiş Ca2 + ve Mg2 + içermeyen steril Hanks çözeltisine yerleştirin.
- Böbrek parçalarını 37 ° C'de 30 dakika çalkalayarak inkübe edin.
- Sindirimi durdurmak için,% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren bir hacim PBS ekleyin ve numuneyi 4 ° C'de soğutulmuş bir santrifüjde her biri 10 dakika boyunca 160 × g'da santrifüjleme ile üç kez yıkayın. Her santrifüjlemede, süpernatanı atın ve peleti aynı çözelti içinde yeniden süspanse edin.
- Tübülleri filtrelemek ve filtrede kalan glomerülleri atmak için sindirim ürününü 70 μm'lik bir gözenek ağından geçirin.
- Filtrelenmiş tübülleri 160 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti% 0.2 kollajenaz tip I ile desteklenmiş Ca2 + ve Mg2 + içermeyen steril Hanks çözeltisinde yeniden süspanse edin.
- Numuneyi çalkalayarak 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Sindirimi durdurmak için,% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren bir hacim PBS ekleyin.
- Numuneyi, her biri 10 dakika olacak şekilde 160 × g'da santrifüj ederek 4 °C'de soğutulmuş bir santrifüjde üç kez yıkayın. Her santrifüjlemede, süpernatanı atın ve peleti aynı çözelti içinde yeniden süspanse edin.
- Son santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 5 mL tam kültür ortamında (% 5 FBS, L-glutamin [2 mmol / L], penisilin [100 U / mL], streptomisin [100 μg / mL] ile desteklenmiş RPMI 1640 yeniden süspanse edin ve endotel hücre büyüme takviyesi [EKGS,% 1]).
- Hücre süspansiyonunu, havalandırmalı bir kapağı olan 25cm2'lik bir kültür şişesine tohumlayın.
- Hücreleri nemli bir atmosferde 37 °C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Ertesi gün, hücre kültürünü 3 kez yıkayın, sıvıyı şişeden atın, her birine 5 mL PBS ekleyin ve şişeye 5 mL tam kültür ortamı ekleyin. Bu yıkamalar, tam olarak sindirilmemiş ve kültür şişesine bağlanmamış kırmızı kan hücrelerini ve tübüler parçaları ortadan kaldırır.
- Epitel hücrelerini hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin ve tek tabaka halinde birleşmelerine izin verin.
- Ortamı her 3 günde bir yeni bir tam kültür ortamı ile değiştirin ve hücre kültürünü günlük olarak ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin.
2. Üç boyutlu HRTEC kültürlerinin geliştirilmesi (3D-HRTEC)
NOT: Bu bölüm, üç boyutlu kültürler (3D-HRTEC) geliştirme adımlarını sağlar. 3D-HRTEC kültürleri, daha önce açıklanan yönteme göre gerçekleştirilir12.
- Engelbreth-Holm-Swarm murin sarkomundan bir BM matrisi kullanın. Bu BM matrisi donmuş olarak teslim edilir ve bu durumda katı kalır. BM matris çözeltisini, üretici tarafından belirtildiği gibi buzdolabında 4 ° C'de bir buz banyosunda gece boyunca çözdürün.
- BM matrisini yerleştirmeden önce uçları dondurucuda soğutun ve işlem sırasında matrisin katılaşmasını önlemek için çok kuyulu plakayı buz üzerinde bırakın.
- Sıvı BM matrisinden (150 mL /cm2) bir alikot alın ve kuyunun tabanını kaplayacak şekilde plakanın her bir oyuğuna yerleştirin. BM matrisini jel haline getirmek için plakayı hücre inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Bu arada, birleşen HRTEC birincil kültürlerini ayırmak için, kültür ortamını şişeden atın ve 1 mL %0.25 tripsin ve %0.02 EDTA çözeltisi ekleyin.
- Sıvıyı şişenin tüm yüzeyine yayın ve hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Ters çevrilmiş bir mikroskop altında tüm hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını gözlemleyin.
- Hücreleri 10 mL kültür ortamında veya PBS'de yeniden süspanse edin, 15 mL'lik bir tüpe geçirin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 160 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücre peletini, HRTEC birincil kültürleri için kullanılan aynı takviyeleri içeren tam bir kültür ortamında yeniden süspanse edin.
- Bir Neubauer odasındaki hücre sayısını sayın.
- BM matrisi üzerine kuyu başına 4 × 104 hücre / 150 μL tohumlayın. Hücre kültürünü 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe, nemli bir atmosferde ve% 5 CO2 'de birkaç gün inkübe edin.
- Ortamı her 2 günde bir taze ortamla değiştirin.
- Ters çevrilmiş bir optik mikroskop altında hücre toplanmasını ve boru şeklindeki şekil yapılarının oluşumunu izleyin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Birleştirilmiş HRTEC primer kültürleri, ışık mikroskobu altında gözlenen benzer bir morfoloji göstermiştir (Şekil 1). Hücreler, aquaporin 1 (AQP1) ve PECAM CD31 9,12,13'e karşı antikorlar kullanılarak önceki yayınlarımızda tarif edildiği gibi immünofloresan ile karakterize edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Primer kültürler nefrektominin yapıldığı gün yapılmalıdır. HRTEC birincil kültürleri, hücrelerin morfogenetik stabilitesini garanti etmek için 1-5 geçiş arasında kullanılabilir. Beşinci geçişten sonra, hücreler morfolojilerini değiştirmeye başlar, fibroblast benzeri bir görünüm veya vakuollerde artış gösterir ve hareketsiz hale gelebilir.
Daha büyük bir böbrek parçası kullanılırsa, sindirimden sonra hücre parçalanması ile salınan DNA, yıkama işlemine müdahale ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Arjantin, Buenos Aires'teki "Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde"deki Pediatrik Üroloji ekibine böbrek örnekleri sağladıkları için minnettarız. Bu çalışma, Buenos Aires Üniversitesi'nden (UBACYT20020190100072BA) C. Silberstein'a ve Ulusal Bilimsel ve Teknik Araştırma Konseyi'nden C Ibarra ve C Silberstein'a (CONICET: PUE 0041) verilen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) tarafından desteklenmiştir (Red STEC/SUH Nº 224RT0152 aracılığıyla).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kollajenaz tip I | Sigma Merck, St Louis, MO, ABD | 637958 | |
| Endotel hücre büyüme takviyesi | Sigma Merck, St Louis, MO, ABD | E2759 (İngilizce) | |
| Matrigel bazal membran matrisi | BD Biyolojik Bilimler, ABD; Sigma Merck, St Louis, MO, ABD | 356234 | |
| 70 μ M gözenekli ağ filtre | BD Biyobilim, MA, ABD | css010070 | |
| RPMI 1640 orta L-glutamin | Sigma Merck, St Louis, MO, ABD | R8758-500ml | |
| Hanks'in Dengeli tuz Çözeltisi Ca2+ ve Mg2+ içermez | Gibco Invitrogen, NY, ABD | 14175046 | |
| Tripsin-EDTA çözeltisi | Sigma Merck, St Louis, MO, ABD | T4049 Serisi |
Kaynaklar
- Rivas, M., Chinen, I., Miliwebsky, E., Masana, M. Risk factors for Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated human diseases. Microbiol Spectr. 2 (5), (2014).
- Gianantonio, C. A., Vitacco, M., Mendilaharzu, F., Gallo, G. E., Sojo, E. T. The hemolytic-uremic syndrome. Nephron. 11 (2), 174-192 (1973).
- Alconcher, L. F., et al. Hemolytic uremic syndrome associated with Shiga toxin-producing Escherichia coli infection in Argentina: update of serotypes and genotypes and their relationship with severity of the disease. Pediatr Nephrol. 36 (9), 2811-2817 (2021).
- Alconcher, L. F., Lucarelli, L. I., Bronfen, S., Meni Battaglia, L., Balestracci, A. Dynamic evolution of kidney function in patients with STEC-hemolytic uremic syndrome followed for more than 15 years: unexpected changes. Pediatr Nephrol. 40 (1), 143-150 (2025).
- Monteverde, M. L., et al. A decrease in the incidence of Shiga toxin-related hemolytic uremic syndrome as a cause of kidney transplantation at an Argentine Referral Center. Pediatr Transplant. 27 (4), e14489(2023).
- Sandvig, K., van Deurs, B. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. EMBO J. 19 (22), 5943-5950 (2000).
- Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga toxin mechanisms of action in renal disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
- Karpman, D., et al. Apoptosis of renal cortical cells in the hemolytic-uremic syndrome: in vivo and in vitro studies. Infect Immun. 66 (2), 636-644 (1998).
- Pistone Creydt, v, Silberstein, C., Zotta, E., Ibarra, C. Cytotoxic effect of Shiga toxin-2 holotoxin and its B subunit on human renal tubular epithelial cells. Microbes Infect. 8, 410-419 (2006).
- Silberstein, C., Pistone Creydt, V., Gerhardt, E., Nuñez, P., Ibarra, C. Inhibition of water absorption in human proximal tubular epithelial cells in response to Shiga toxin-2. Pediatr Nephrol. 23, 1981-1990 (2008).
- Márquez, L. B., et al. Effects of Escherichia coli subtilase cytotoxin and Shiga toxin 2 on primary cultures of human renal tubular epithelial cells. PLoS One. 9, e87022(2014).
- Márquez, L. B., Araoz, A., Repetto, H. A., Ibarra, F. R., Silberstein, C. Effects of Shiga toxin 2 on cellular regeneration mechanisms in primary and three-dimensional cultures of human renal tubular epithelial cells. Microb Pathog. 99, 87-94 (2016).
- Sánchez, D. S., et al. Eliglustat prevents Shiga toxin 2 cytotoxic effects in human renal tubular epithelial cells. Pediatr Res. 91 (5), 1121-1129 (2022).
- Sánchez, D. S., et al. Estradiol stimulates cell proliferation through classic estrogen receptors and GPER-1 in human renal tubular epithelial cell primary cultures. Biochem Biophys Res Commun. 512, 170-175 (2019).
- Fernandez Miyakawa, M., Zabal, O., Silberstein, C. Clostridium perfringens epsilon toxin is cytotoxic for human renal tubular epithelial cells. Hum Exp Toxicol. 30, 275-282 (2011).
- Chen, J., et al. Cooperative application of transcriptomics and ceRNA hypothesis: ln cRNA-00742/miR-116 targets CD74 to mediate vanadium-induced mitochondrial apoptosis in duck liver. J Hazard Mater. 480, 135904(2024).
- Chen, J., et al. Copper toxicity in the liver of broiler chicken: insights from metabolomics and AMPK-mTOR mediated autophagy perspective. Poult Sci. 103 (9), 104011(2024).
- Zhang, T., et al. Role of Caveolin-1 on the molybdenum and cadmium exposure induces pulmonary ferroptosis and fibrosis in the sheep. Environ Pollut. 334, 122207(2023).
- Fujiki, K., et al. Blockage of Akt activation suppresses cadmium-induced renal tubular cellular damages through aggrephagy in HK-2 cells. Sci Rep. 14, 14552(2024).
- Joun, J. I. H., et al. Antioxidative effects of molybdenum and its association with reduced prevalence of hyperuricemia in the adult population. PLoS One. 19 (8), e0306025(2024).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
