Bu makale, Proteus mirabilis biyofilmleri için özel olarak tasarlanmış bir Genleşme Mikroskobu tekniği olan PmbExM için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. PmbExM, izotropik, 4,3 kat genişleme elde etmek için biyofilm numunelerinin aşamalı olarak enzimatik bir şekilde işlenmesini kullanır ve bu sapsız mikrobiyal topluluklar içindeki hücresel ve hücre altı yapıların uzamsal organizasyonunun süper çözünürlüklü analizini sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Proteus mirabilis Biyofilminin Genleşme Mikroskobu ile Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Konvansiyonel optik mikroskopi kullanılarak mikrobiyolojik örneklerden ayrıntılı görsel bilgilere ve nicel verilere erişim, kırınım bariyeri ile sınırlıdır. Çözünürlüğü artırmak için bir çözüm, numuneleri orijinal boyutlarının yaklaşık dört katı kadar fiziksel olarak büyüten yenilikçi ve uygun maliyetli bir süper çözünürlük tekniği olan Genleşme Mikroskobudur (ExM). Başarılı bir genleşme için, biyolojik materyalin mekanik özelliklerini homojenize etmek esastır. Biyofilmler, bir yüzeye yapışan ve ürettikleri hücre dışı bir matrise gömülü bakteri topluluklarıdır; ExM protokollerinin benzersiz yapısal bileşenlerini barındıracak şekilde uyarlanmasını gerektirirler. Bu makale, 48 saat boyunca büyütülen P. mirabilis biyofilmlerinin süper çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlayan özel bir ExM varyantı olan Proteus mirabilis biyofilm ExM'yi (PmbExM) sunmaktadır. Protokol, numunelerin temel yapısal bileşenlerinin, teorik koşullarına yakın optimize edilmiş seri enzimatik çürütmeler yoluyla hedeflenen bozunmasına odaklanır. PmbExM, polisakkarit hidrolizi için α-amilaz, selülaz ve litikaz glikozit-hidrolazlar dahil olmak üzere bir enzim kombinasyonu kullanır; peptidoglikan hidrolizi için mutanolizin; ve protein hidrolizi için proteinaz K. Bu sindirim prosedürleri, jelleşme işleminden bağımsızdır ve farklı biyofilm modellerinde spesifik homojenizasyon gereksinimlerini karşılamak için modifikasyonlara izin verir. Bu uyarlanabilirlik, çeşitli bakteri türleri ve büyüme koşullarında uygulama için büyük bir potansiyel sunar. ExM, genel olarak optimal olmayan genleşme faktörlerine sahip farklı biyofilm türlerine uygulanmıştır. Buna karşılık, PmbExM, morfoloji veya topolojide önemli bir bozulma olmaksızın standart akrilamid-akrilat ExM hidrojelin teorik maksimum genleşme faktörüne ulaşır. Bu çalışmanın amacı, P. mirabilis biyofilmlerinin mimarisini, montajını ve hücresel ve hücre içi özelliklerini görselleştirmek için erişilebilir bir süper çözünürlük protokolü sağlamaktır.
Giriş
Floresan mikroskobu, biyofilm mimarisini, bileşimini ve işlevini incelemek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır1. Bununla birlikte, optik mikroskopinin biyofilmlerin yapısal, hücresel ve hücre altı özelliklerini çözme yeteneği, kırınım bariyeri ile sınırlıdır. Genleşme Mikroskobu (ExM), kırınım sınırı 2,3'ün ötesinde biyofilm yapısını ortaya çıkarmak için büyük potansiyele sahip yenilikçi, erişilebilir ve kullanımı kolay bir süper çözünürlük tekniğidir. ExM, biyolojik numuneleri orijinal boyutlarının yaklaşık dört katı izotropik olarak genişleterek çözünürlüğü artırır. Yöntem, numune boyunca şişirilebilir bir iyonik hidrojelin yerinde polimerizasyonunu ve dikkatle uygulandığında moleküler hedeflerin nispi uzamsal düzenlemesinin korunmasını içerir 4,5.
ExM'nin düzgün çalışması için biyolojik materyalin mekanik özelliklerinin homojenleştirilmesi çok önemli bir adımdır6. Memeli hücre kültürleri ve dokuları üzerinde standart ExM varyantları geliştirildi, burada sadece proteinaz K proteolitik sindirimi 4,5 veya deterjanlar ve otoklavlama7 ile yumuşak protein denatürasyonu yoluyla homojenizasyonu verimli bir şekilde elde ettiler ve izotropik 4 kat genleşme sağladılar. Bununla birlikte, bakteriler ve bakteriyel biyofilmler söz konusu olduğunda, peptidoglikan hücre duvarı ve yapısal polisakkaritler gibi EPS matris elemanları, genleşme 2,3,8,9'a karşı engellerdir.
Bu makale, yüksek antibiyotik direnci ve kateterle ilişkili idrar yolu enfeksiyonları ile ilişkili klinik olarak anlamlı gram negatif bir basil olan P. mirabilis'in biyofilmlerini genişletmek için tasarlanmış özel bir ExM varyantı olan Proteus mirabilis biyofilm Genişletme Mikroskobu (PmbExM) prosedürlerini açıklamaktadır10. PmbExM, peptidoglikan hücre duvarını, polisakkaritleri ve proteinleri hidrolize etmek için sırasıyla mutanolizin, α-amilaz, selülaz, litikat ve proteinaz K enzimatik tedavilerinin bir kombinasyonunu kullanır. Sonuçlar, bu yöntemin 48 saatlik P. mirabilis biyofilmlerinin 4,3 kat izotropik genişlemesini sağladığını göstermektedir. Teknik, P. mirabilis biyofilm mimarisinin, montajının ve hücre içi özelliklerinin çift boyama yoluyla süper çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlar3. Ayrıca, PmbExM, enzim işlemlerini türe özgü biyofilm bileşenlerini hedef alacak şekilde ayarlayarak diğer biyofilm modellerine uyarlanabilir.
Bu makalenin amacı, PmbExM için biyofilm numunelerinin jelleşmesi, sindirimi, genleşmesi ve montajı ile ilgili prosedürlerin ayrıntılı bir açıklamasını sağlamaktır. Ek olarak, bu çalışma, yazarlar tarafından kullanılan bakteri üreme koşullarını, numune formatlarını ve floresan boyama tekniklerini, görüntü işleme konusunda sınırlı deneyime sahip araştırmacılar tarafından kolayca uygulanabilecek bir veri işleme ve analiz rutinini özetlemektedir. Görüntü işleme ve analizi hakkında daha kapsamlı ve derinlemesine bir kılavuz için lütfen Castagnini, D. et al.3'e bakın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
PmbExM'nin genel süreci Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm adlandırılmış çözeltilerin (yani monomer çözeltisi, proteinaz K sindirim çözeltisi, vb.) bileşimini bulmak için lütfen Ek Dosya 1'e bakın. Benzer şekilde, görüntü işleme konusunda geniş deneyime sahip olmayan araştırmacılar tarafından kullanılabilecek basitleştirilmiş bir veri işleme ve analiz rutini için Ek Dosya 2, Ek Dosya 3 ve Ek Dosya 4'e bakın. Protokol 2,5-3 haftalık bir süre boyunca rahatça gerçekleştirilebilir: lamel temizleme ve sterilizasyon, biyofilm büyümesi ve numune fiksasyonuna ayrılan ilk hafta; ikinci hafta numune boyama ve PmbExM protokolünün kendisi için ve üçüncü hafta numune montajı ve görüntü elde etmek için. Ek olarak, gerekli malzemeler ve çözeltiler için 1 haftalık ön hazırlıkları göz önünde bulundurun. Bu çalışmada kullanılan reaktifler, malzemeler, ekipman ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
Şekil 1: P. mirabilis biyofilminin başarılı bir şekilde genişletilmesi, gözlemlenmesi ve analizi için PmbExM protokolünün ankrajı, polimerizasyonu, sindirimi ve diyalizi. Sol sütun, genişletme protokolü sırasında seçilen adımlarda örneğin altı durumunu tanımlar. Sabit, geçirgen ve lekeli biyofilm numunesinden başlar, dört ara durumu takip ederek son jelleşmiş ve genişletilmiş duruma kadar, süper çözünürlükte mikroskopi ve görüntü analizi için hazırdır. Biyofilmin EPS matrisi yeşil renkle gösterilir, bakteri hücre duvarı mor çizgilerle gösterilir, genel protein hücre yapısı gri renkle gösterilir ve akrilamid-akrilat ExM polimeri dalgalı mavi çizgiler olarak gösterilir. İşlemde yer alan tüm enzimler Pac-Man sembolleri ile temsil edilir: ekzopolisakkarit hidrolizi için 3 glikozit-hidrolaz (yeşil): α-amilaz, selülaz ve litikaz; peptidoglikan hücre duvarının bozunması için mutanolizin (mor); ve genel protein sindirimi için proteinaz K (gri). Pac-Man sembollerinin renkleri, ilgili hedef yapılarla eşleşir. Düşük opaklık veya kesikli kenarlıklarla gösterilen tüm nesneler, enzimatik bir bozulma durumunu temsil eder. Bu şekil Castagnini, D. et al.3'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. Biyofilm oluşumu için cam lamellerin temizlenmesi ve sterilizasyonu
- 12 mm cam lamelleri 1 M sodyum hidroksit içinde oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ultrasonikat yapın ve ardından bol miktarda deiyonize su ile durulayın.
- Lamelleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 70 (v / v) etanol içinde ultrasonikat edin ve% 95 (h / h) etanol ile durulayın.
- Lamellerin oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
- Otoklavlama ile sterilize edin.
2. Proteus mirabilis biyofilm büyümesi
- P. mirabilis'i 10 mL Luria Bertani (LB) suyunda 37 ° C'de 24 saat çalkalamadan büyütün.
NOT: Ticari olarak temin edilebilen bir P. mirabilis tipi suşu (Malzeme Tablosuna bakınız) elde edilmiş ve bu çalışmada kullanılmıştır, ancak kolayca bulunabilen herhangi bir P. mirabilis suşunun kullanılması teşvik edilmektedir. - Kültürden 1 mL alın ve 1:10 seyreltme bakteriyel süspansiyonu oluşturmak için 9 mL taze ve steril LB suyuna ekleyin.
- 1:10 bakteriyel süspansiyonun 600 nm'deki Optik Yoğunluğunu (OD) 0,1 olarak kontrol edin. OD600 = 0.1'e ulaşana kadar küçük hacimlerde taze LB veya P. mirabilis kültürü ekleyerek gerekirse ayarlayın.
- 12 mm'lik cam lameller (önceden temizlenmiş ve sterilize edilmiş) steril bir polistiren 24 kuyulu plakada (kuyucuk başına bir lamel için) yerleştirin.
NOT: Tüm lamel yüzeyinin kuyunun dibine temas ettiğinden emin olun. Biyofilm, lamel yukarı bakan tarafında oluşacaktır. - Plakanın kuyucuklarını 350 μL OD600 = 0.1 bakteri süspansiyonu ile tohumlayın.
NOT: Dış kuyucukları (yani A ve D sıralarındaki ve sütun 1 ve 6'daki kuyular) steril su veya LB suyu ile doldururken plakanın sadece iç kuyularının tohumlanması önerilir. Bunun nedeni, dış kuyuların iç kuyulara göre daha yüksek sıvı buharlaşma oranlarına eğilimli olmasıdır ve bu da biyofilm büyümesini etkiler. - Tohumlanmış plakayı bir inkübatörün içine yerleştirin ve 45 derecelik bir eğimle konumlandırın.
NOT: 50 mL santrifüj tüpleri veya mikropipet ucu kutuları gibi yaygın laboratuvar malzemeleri kullanın. Eğik pozisyon, P. mirabilis biyofilminin en kalın bölgesini oluşturacağı lamellerin yüzeyinde bir hava-sıvı arayüzünün oluşmasına izin verecektir. - Biyofilmlerin 37 °C'de 48 saat boyunca çalkalamadan oluşmasına izin verin.
NOT: Bu biyofilm büyüme kurulumu, ortamın buharlaşması nedeniyle biyofilm kuruması nedeniyle 48 saatten daha uzun inkübasyon süreleri için uygun değildir.
3. Biyofilm numunesi fiksasyonu ve saklanması
- Kültür ortamını kuyucuklardan dikkatlice çıkarın ve biyofilm içeren lamelleri 300 μL steril Fosfat Tampon Salin (PBS) ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca çok hafif çalkalama ile iki kez nazikçe yıkayın.
NOT: İnkübasyon veya yıkama için küçük hacimler kullanarak tekrarlayan sıvı değişimi ile biyofilmlerin tahrip olmasını önleyin. Biyofilmleri 24 oyuklu bir plakaya daldırmak için 300-400 μL sıvı yeterlidir. Yavaş ve metodik pipetlemenin yanı sıra, değiştirilen çözeltilerle biyofilmlere doğrudan çarpmaktan kaçınılması şiddetle tavsiye edilir. - PBS'yi dikkatlice çıkarın ve biyofilm fiksasyonu için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS'de 400 μL %4 (a/h) paraformaldehit (PFA) ile değiştirin.
- PFA'yı çıkarın ve hücre geçirgenliği için 300 μL %1 PBST (PBS'de %1 v/v Triton X-100) ile değiştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
- % 1 PBST çözeltisini 300 μL% 0.3 PBST (PBS'de% 3 v / v Triton X-100) ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- %0,3 PBST'yi çıkarın ve numune dehidrasyonu için 300 μL 50:50 metanol ve %0,3 PBST karışımı ile değiştirin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve ardından karışımı 1 mL mutlak metanol ile değiştirin.
NOT: 1 mL metanolü yavaşça ekleyin ve kuyu duvarlarına doğru yönlendirin. Bu daha yüksek hacimdeki metanol, numune saklama sırasında tamamen buharlaşmasını önlemek için kullanılır. - Numuneleri -20 °C'de en az 1 gün ve bir aya kadar saklayın.
NOT: Metanolün buharlaşmasını ve numunelerin kurumasını geciktirmek için plakaların esnek bir mum filmi kullanılarak kapatılması önerilir. - Kullanımdan sonra, metanolü 300 μL 50:50 metanol ve %0.3 PBST karışımı ile ve ardından oda sıcaklığında 300 μL %0.3 PBST ile değiştirerek numuneleri sırayla rehidre edin.
4. Biyofilm floresan boyama
- Rehidre edilmiş biyofilm örneklerini 300 μL 50 μg/mL Buğday tohumu aglütininin floresan lektin konjugatı (bundan böyle sadece WGA konjugatı olarak anılacaktır; Malzeme Tablosuna bakınız) ile hücre duvarı / kapsül / ekzopolisakkarit boyama için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS'de inkübe edin.
NOT: Lütfen Tartışma bölümündeki floresan boyama ile ilgili konulara bakın. Şu andan itibaren numuneleri ışıktan koruyun. - WGA konjuge solüsyonunu çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 μL PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.
5. PmbExM adımları
- MA-NHS ankrajı ve akrilamid-akrilat polimerizasyonu
- Lekeli biyofilm örneklerini 400 μL 1 mM metakrilik asit N-hidroksisüksinimidil ester (MA-NHS) ile PBS'de oda sıcaklığında hafif çalkalama ile 1 saat inkübe edin.
NOT: MA-NHS, sulu bir ortamda hidrolize eğilimli aktif bir esterdir, bu nedenle numuneleri PBS çözeltisinde 1 mM'yi hazırladıktan hemen sonra işlemden geçirin. - Oda sıcaklığında 300 μL PBS ile 10 dakikalık üç nazik yıkama gerçekleştirin.
- PBS'yi çıkarın ve 300 μL monomer çözeltisi ile değiştirin. Gece boyunca (O.N.) 4 °C'de inkübe edin.
- Jelleşme ön odalarını oluşturun. Taban olarak bir cam sürgü kullanın ve üzerine 400 μm ara parça görevi görecek şekilde iki parça katlanmış çift taraflı bant yerleştirin. Ara parçaları birbirinden 8-10 mm olacak şekilde yerleştirin.
NOT: Jelleşme ön odasının nasıl oluşturulacağı hakkında daha fazla netlik için Şekil 2A'ya bakın. Burada kullanılan çift taraflı bant yaklaşık 100 μm kalınlığındaydı, bu nedenle 3 mm x 5 mm x 0,4 mm ara parçalar oluşturmak için kendi üzerine kırpıldı ve katlandı. Mevcut çift taraflı bandın kalınlığını ölçün ve buna göre düzenleyin. Jelleşme çözeltisinin bant ara parçaları tarafından emilmesi ihmal edilebilir düzeydedir. Çift taraflı banda alternatif olarak, 12 mm'lik yuvarlak cam lameller su damlaları ile birbirine yapıştırılabilir ve istenen yüksekliğe kadar yığılabilir. - Polimerizasyon sırasında numuneleri kurumaya karşı korumak için ıslak odalar düzenleyin.
NOT: Yaygın bir mikropipet ucu kutusu, uçların plastik iskelesini çıkararak ve ıslak kağıt havlularla değiştirerek kolayca ıslak bir odaya dönüştürülebilir. - Monomer çözeltisi, (a/h) N, N, N', N'-tetrametiletilendiamin (TEMED), %0,5 (a/h) 4-hidroksi-TEMPO (4-HT) ve (a/h) amonyum persülfat (APS) hacimlerini sırasıyla 47:1:1:1 oranında iyice karıştırarak taze bir jelleşme çözeltisi stok hacmi hazırlayın. APS'yi jelleştirici çözelti reaktiflerinin geri kalanıyla yalnızca 5.1.5'e kadar olan adımlar tamamlandığında karıştırın.
NOT: Hazırlanacak stok jelleşme çözeltisinin toplam hacmi, işlenmekte olan biyofilm numunelerinin miktarına bağlı olacaktır. Örneğin, üç biyofilm örneğini işlemek için, 846 μL monomer çözeltisini 18 μL (a/a) TEMED, 18 μL %0,5 (a/a) 4-HT ve 18 μL (a/a) APS ile karıştırarak 900 μL jelleşme çözeltisi hazırlayın. Erken polimerizasyonu önlemek için, APS karışıma en son ve yalnızca numuneler, jelleşme ön odaları ve ıslak odalar kullanıma hazır olduğunda eklenmelidir. Bu adım sırasında bahsedilen tüm reaktifleri ve yakın zamanda hazırlanan jelleşme solüsyonunu soğutulmuş halde tutun. - Jelleşme solüsyonunu hazırladıktan hemen sonra, monomer solüsyonunu nazikçe çıkarın ve 300 μL eski ile değiştirin. 4 °C'de 5 dakika inkübe edin.
- Adım 5.1.7 devam ederken, cam slaytlar üzerine yerleştirilmiş çift taraflı bant şeritlerinin kalan koruyucu kapağını çıkarın ve aralarındaki boşluğa 40 μL jelleşme solüsyonu yerleştirin.
- Adım 5.1.7 bittikten sonra, her bir biyofilm içeren lamel kuyusundan çıkarın ve daha önce bir cam slayt üzerine serilmiş 40 μL damla jelleşme solüsyonunun üzerine yerleştirin. Lameli yüzeyindeki biyofilm jelleşme çözeltisine temas edecek şekilde yönlendirin.
- Çift taraflı bant ara parçalarına yapışmasını sağlamak için biyofilm içeren lamel üzerine cımbız kullanarak hafifçe bastırarak jelleşme odasının yapımını bitirin.
NOT: Bu sandviç benzeri kurulum, jelleşme odası olarak adlandırılan şeyden oluşur (Şekil 2B). - Numunelerin ıslak bir oda içinde polimerize olmasına izin verin ve çalkalama olmadan 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
- Genleşme öncesi görüntü yakalama için jelleşme odalarını sökmeden numuneleri floresan mikroskobu altında görselleştirin (bkz. adım 6.2.1).
NOT: Önceden genleşmiş jeller kurumaya eğilimli olduğundan, jelleşmiş numuneleri bir saatten fazla ıslak haznenin dışında bırakmayın ve bu da numuneyi kullanılamaz hale getirir. İlgili genişletme öncesi edinme prosedürleri için lütfen adım SF2.3'e (Ek Dosya 2) bakın. - Jelleşme odalarını sökün ve cerrahi bir bıçak kullanarak biyofilm numunesindeki ilgili bölgenin etrafındaki fazla jeli kesin.
NOT: Genleşmiş numunelerin işlenmesini ve montajını kolaylaştırmak için jellerin kırpılması şiddetle tavsiye edilir. Ek olarak, numuneler içindeki ilgilenilen bölgenin uzamsal yönelimini takip etmek için, jelleri asimetrik bir şekle kesin veya doğru yönlendirmenin kolay tanınması için jelde karakteristik bir kesik bırakın. - Kesilmiş jelleri taşıyan lamelleri, jel yukarı bakacak şekilde 24 oyuklu yeni bir plakanın içine yerleştirin.
NOT: Bu aşamada, jelleşmiş numuneler orijinal cam lamellere yapışık kalmalıdır.
- Lekeli biyofilm örneklerini 400 μL 1 mM metakrilik asit N-hidroksisüksinimidil ester (MA-NHS) ile PBS'de oda sıcaklığında hafif çalkalama ile 1 saat inkübe edin.
- Enzimatik sindirim I-III ve DNA boyama
NOT: P. mirabilis biyofilm örneklerinin mekanik özelliklerinin homojenizasyonu, yazarların bozunma için hedeflenen biyolojik yapıya dayalı olarak 3 adımda kategorize ettiği bir dizi enzimatik çürütmeyi takip eder: polisakkarit hidrolizi (Sindirim I), peptidoglikan hidrolizi (Sindirim II) ve protein hidrolizi (Sindirim III).- Sindirim I
- Numuneleri 1 mL α-amilaz sindirim çözeltisine daldırın. O.N.'yi 50 °C'de inkübe edin.
NOT: Yüksek inkübasyon sıcaklığı nedeniyle numunenin kurumasını önlemek için büyük hacimlerde (yani 0,5-1 mL) enzimatik çözelti kullanılır. - α-amilaz çözeltisini çıkarın ve jelleri oda sıcaklığında 300 μL selülaz sindirim tamponu ile 5 dakika yıkayın.
- Selülaz sindirim tamponunu çıkarın ve 500 μL selülaz sindirim solüsyonu ile değiştirin. 45 °C'de 2 saat inkübe edin.
- Selülaz sindirim solüsyonunu çıkarın ve jelleri oda sıcaklığında 300 μL litikaz sindirim tamponu ile 5 dakika yıkayın.
- Litikat sindirim tamponunu çıkarın ve 500 μL litikaz sindirim çözeltisi ile değiştirin. 30 °C'de 2 saat inkübe edin.
- Numuneleri 1 mL α-amilaz sindirim çözeltisine daldırın. O.N.'yi 50 °C'de inkübe edin.
- Sindirim II
- Litikat sindirim solüsyonunu çıkarın ve jelleri oda sıcaklığında 300 μL mutanolizin sindirim tamponu ile 5 dakika yıkayın.
- Mutanolizin sindirim tamponunu çıkarın ve 1 mL mutanolizin sindirim solüsyonu ile değiştirin. O.N.'yi 55 °C'de inkübe edin.
- Sindirim III
- Mutanolizin sindirim solüsyonunu çıkarın ve jelleri oda sıcaklığında 300 μL proteinaz K sindirim tamponu ile 5 dakika yıkayın. Proteinaz K sindirim tamponunu çıkarın ve 500 μL proteinaz K sindirim solüsyonu ile değiştirin. 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
- (İSTEĞE BAĞLI) DNA boyama
- Proteinaz K çözeltisini çıkarın ve jelleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 μL 10x PBS ile yıkayın.
- 10x PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 10x PBS'de 300 μL 5 μM kırmızı floresan nükleik asit lekesi ile değiştirin.
NOT: ExM prosedürleri için DNA boyama hakkında yorumlar için Tartışma bölümüne bakın.
- Sindirim I
- Genleşme
- Proteinaz K çözeltisini (veya isteğe bağlı adım 5.2.4 gerçekleştirilmişse DNA boyama çözeltisini) çıkarın ve jelleri 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Petri kabı başına bir jel yerleştirin.
NOT: Jeli cam lamel üzerine itmek için küçük düz bir boya fırçası kullanın. Laboratuvar cımbızı ile cam lamel alın ve jel için bir platform olarak kullanın. Plakanın kuyusundan kaldırırken jelin lamelden düşmesini fırça yardımıyla önleyin. Jellerin kendi üzerlerine katlanmasını önleyin. - Petri kabını fazla deiyonize su ile doldurun, jeli tamamen daldırın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hafif çalkalama altında inkübe edin. Suyu 4-5 kez değiştirin.
NOT: Genişleyen jelin suya batırıldığında neredeyse görünmez hale geldiğini unutmayın. Su değişimleri sırasında Pasteur pipetinden veya mikropipetten gelen emişle zarar görmesini önlemek için jelin yerini belirlemeyi kolaylaştırmak için Petri kabını ışığa karşı konumlandırın.
- Proteinaz K çözeltisini (veya isteğe bağlı adım 5.2.4 gerçekleştirilmişse DNA boyama çözeltisini) çıkarın ve jelleri 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Petri kabı başına bir jel yerleştirin.
Şekil 2: Jelleşme odası ve numune montajı. (A) Ön jelleşme odası. Bir slaytta, 2 adet çift taraflı bant ara parçasını (sarı) yerleştirin. Bir Cam lamel (
= 12 mm) mesafe referansı olarak üstüne oturur. (B) Jelleşme odası. Bakteriyel biyofilm (yeşil) alt lamel yüzeyinde oluşur. 400 μm kalınlığındaki ara parçalar (turuncu), 100 μm kalınlığındaki çift taraflı bant kesiklerinden yapılmıştır. Ara parçalar, jelin tüm numuneyi gömmesine ve jelleşme solüsyonunun haznenin kenarlarından taşmasını önlemesine izin vererek, numunenin slayt ile lamel arasında ezilmesini önler. (C) 3D Baskılı görüntüleme odaları (.stl dosyalarına https://github.com/scianlab/ExM erişmek için aşağıdaki bağlantıyı ziyaret edin). Genişletilmiş bir jel numunesi (solda) ve deiyonize suya batırılmış genişletilmiş bir jel numunesi (sağda). Genleşmiş jeller daldırıldığında neredeyse görünmez hale gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
6. Gözlem ve analiz
- Genişletilmiş numunelerin montajı
- Görüntüleme sırasında numune immobilizasyonu için polilizin kaplamalı görüntüleme odalarını hazırlayın11: Görüntüleme odasının cam yüzeyini (Malzeme Tablosuna Bakın) oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %0,1 (a/h) poli-L-lizin ile ıslatın.
- Poli-L-lizin çözeltisini çıkarın ve fazla deiyonize su ile iki yıkama yapın. Kurutma işlemini hızlandırmak için 1 saat havada kurumaya bırakın veya 37 °C'de bir inkübatörün içine yerleştirin.
- Adım 5.3.2'den itibaren beşinci diyaliz döngüsünden sonra, jelleri kaplayan suyu çıkarın ve numuneyi 24 mm x 50 mm'lik bir cam lamel üzerine itmek için küçük düz bir fırça kullanın. Dikdörtgen lamel jel için bir platform olarak kullanın ve Petri kabından kaldırın.
- Suyun jelin yüzeyi ile görüntüleme odasının cam yüzeyindeki poli-lizin kaplama arasındaki doğrudan teması engellemesini önlemek için kağıt mendil kullanarak jeldeki fazla suyu çıkarın.
- Jel ile cam arasında hava kabarcıklarının kalmasını önleyerek jeli görüntüleme odasının cam yüzeyine dikkatlice yerleştirin.
NOT: Görüntüleme odasının cam yüzeyi tamamen kuru olmalıdır. Genişletme öncesi görüntüler alınmışsa, önceden genişletilmiş örnekte daha önce yakalanan görüş alanlarını bulmayı kolaylaştırmak için genişletilmiş jelin doğru yönünü düşünün. - Jel tamamen suya batırana kadar deiyonize su ekleyin (bkz. Şekil 2C).
NOT: Yakalama sırasında büzülmeyi önlemek için genleşmiş jeller, görüntüleme işleminin tamamı boyunca nemli kalmalıdır.
- Görüntü elde etme
- Mevcut bir kırınım sınırlı floresan mikroskobunda numunelerin görüntülerini görselleştirin ve yakalayın.
NOT: Yazarlar, 1.2 sayısal açıklık (NA) olan 63x suya daldırma objektifine sahip bir dönen disk konfokal mikroskop kullandılar. Florofor uyarımı için, 488 ve 647 nm'de bir katı hal lazer çizgisi kullanıldı. Yakalamalar, özel yazılım tarafından kontrol edilen 16 bitlik bir dijital CMOS kamera ile yapılmıştır (bkz. Voksel boyutu 64,4 mm x 64,4 mm x 200 nm (XYZ eksenleri) olarak ayarlandı.
- Mevcut bir kırınım sınırlı floresan mikroskobunda numunelerin görüntülerini görselleştirin ve yakalayın.
- Görüntü işleme
- Bakterilerin segmentasyonu (bölüm SF2.1), hücre genişliği ölçümü (bölüm SF2.2), EF belirleme (bölüm SF2.3) ve önceden genişletilmiş ve genişletilmiş koşullar için görüntü eşleştirme (bölüm SF2.4) için bir dijital görüntü işleme rutini bulmak için lütfen Ek Dosya 2'ye bakın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
PmbExM, P. mirabilis biyofilm 4.3 katını genişletti ve morfoloji ve topolojiyi korudu
Şekil 3A-D, P. mirabilis biyofilm hücrelerinin fiziksel büyütmesini ve tekniğin getirdiği artan çözünürlüğü göstermektedir. Dahası, bu sadece hücrelerin tek tabaka benzeri bir düzende organize olduğu ince biyofilm bölgelerinde değil, aynı zamanda 2 veya hatta 3 seviyeli bakteri katmanlarının yoğun nüfu...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
PmbExM'in kritik adımları
Herhangi bir ExM varyantında olduğu gibi, protokolün en kritik adımlarından biri numunenin mekanik özelliklerinin homojenleştirilmesidir. PmbExM söz konusu olduğunda, bu bir dizi enzimatik işlemle elde edilir. Yetersiz sindirim, düşük EF'lere ve biyofilm morfolojisi ve/veya topolojisinde potansiyel hasara neden olabilir, bu da optimal olmayan çözünürlüğe ve güvenilmez sonuçlara yol açabilir. Tersine, aşırı agresif çürütmeler, özellikle proteo...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bu çalışmayla ilgili herhangi bir finansal veya kişisel çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, Dr. Juan Eduardo Rodríguez ve Prof. Dr. Ulrich Kubitschek'e (U-Bonn) SCIAN-Lab'da genişletme tekniklerinin uygulanmasına katkılarından dolayı teşekkürlerini sunarlar. Bu çalışma ANID projeleri ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH) tarafından finanse edilmiştir; Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66,390, MINEDUC hibe RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH) ve Bölgesel İki Uluslu Proje Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Arthrobacter luteusbiyofilm büyüme ortamı
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| α-Bacillus sp. | Sigma-Aldrich | 10070 | Polisakkarit sindirimi |
| % 0.1 (a/h) poli-L-lizin su çözeltisi | Sigma-Aldrich | P8920 | Görüntüleme için numune immobilizasyonu |
| 12 mm cam lameller | Chemglass Yaşam Bilimleri | CLS-1760 | Jelleşme odası bileşeni |
| 16-bit C13440-20CU kamera | Hamamatsu Fotonik | Mevcut değil | Görüntü alımı için CMOS dijital kamera |
| 24 mm x 50 mm cam lameller | Chemglass Yaşam Bilimleri | CLS-1764 | Numune manipülasyonu/kullanımı |
| 3D baskılı görüntüleme odası | Şirket içi | tasarım-Görüntüleme | odası seçeneği |
| 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oksil (4-hidroksi-TEMPO) | Sigma-Aldrich | 176141 | Jelleşme çözeltisi bileşeni |
| Siyah duvarlı 6 kuyulu cam tabanlı plaka | CelVis | P06-1.5H-N | Görüntüleme odası seçeneği |
| Asetik asit | Sigma-Aldrich | 818755 | Enzim tampon bileşeni |
| Akrilamid | Sigma-Aldrich | A4058 | Monomer çözelti bileşeni |
| Amonyum persülfat | Sigma-Aldrich | A3678 | Jelleşme çözeltisi bileşeni |
| Axiovert 200 mikroskop | Zeiss | Mevcut değil | Konfokal mikroskop |
| Kalsiyum klorür | Sigma-Aldrich | C8106 | Enzim tampon bileşeni |
| C-Apochromat 63x 1.2 NA suya daldırma objektifi | Zeiss | Mevcut değil | Mikroskop objektifi |
| Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 | Polisakkarit sindirim |
| Chamlide CMB 35 mm çanak manyetik görüntüleme odası | Canlı Hücre Aleti | Mevcut değil | Görüntüleme odası seçeneği |
| Dimetil sülfoksit | Sigma-Aldrich | 472301 | MA-NHS ankraj reaktifi stok çözeltisi |
| Disodyum fosfat | Sigma-Aldrich | S3264 | Enzim tampon bileşeni |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Temizleme ve sterilizasyon |
| Etilendiamintetraasetik asit | Merck | 324503 | Enzim tampon bileşeni |
| Falcon polistiren 24 kuyu plakası | Corning | 351147 | Genel prosedürler platformu |
| FIJI Yazılımı | Ulusal Sağlık Enstitüleri-Görüntü | işleme yazılımı | |
| Gliserol | Sigma-Aldrich | G7893 | Enzim tampon bileşeni |
| Guanidin hidroklorür | Thermo Scientific | 24115 | Enzim tampon bileşeni |
| Huygens Yazılımı | Bilimsel Hacim | Görüntüleme-Görüntü | restorasyonu için evrişim çözme yazılımı |
| Hidroklorik asit | Supelco | 1.00317 | Tampon hazırlama |
| Kimwipes kağıt mendil | Fisher Scientiffic | 06-666 | Fazla su giderme |
| Laboratuvar cımbızları | Elektron Mikroskobu Bilimleri | M5E | Genel numune manipülasyonu/kullanımı |
| Luria Bertani suyu | Invitrogen | 12795-027 | |
| Lytikaz> | Sigma-Aldrich | L4025 | Polisakkarit sindirim |
| Magnezyum klorür | Sigma-Aldrich | D5652 | Enzim tampon bileşeni |
| Metakrilik asit N-hidroksisüksinimidil ester | Sigma-Aldrich | 730300 | Ankraj reaktifi |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Numune dehidrasyonu ve depolanması |
| MikropJ | - | Görüntü işleme yazılımı eklentisi | |
| Mikroskopi cam slaytları | Chemglass Yaşam Bilimleri | CG-8221 | Jelleşme odası bileşeni |
| Monosodyum fosfat | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Streptomyces globisporus | Sigma-Aldrich | M990 | Peptidoglikan sindirimi |
| N, N, N', N'-tetrametiletilendiamin | Sigma-Aldrich | T7024 | Jelleşme çözeltisi bileşeni |
| N, N ve asal; -metilenbisakrilamid | Sigma-Aldrich | M1533 | Monomer çözeltisi bileşeni |
| Nunc 40.4 mm cam tabanlı Petri kapları | Thermo Fisher | 12-567-400 | Görüntüleme odası seçeneği |
| Paraformaldehit | Sigma-Aldrich | 158127 | Numune fiksasyonu |
| Fosfat tampon salin | Sigma-Aldrich | 79383 | Monomer çözelti bileşeni, Yıkama, |
| Engyodontium albümünden Proteinaz K enzim tamponu | Invitrogen | 25530-031 | Protein sindirimi |
| Proteus mirabilis ATCC 12453 | Mikrobiyoloji | 0440P | Çalışma konusu |
| Küçük düz boya fırçası | Yerel hırdavatçı-Numune | manipülasyonu | /kullanımı |
| Sodyum asetat | Sigma-Aldrich | 241245 | Enzim tampon bileşeni |
| Sodyum akrilat | Sigma-Aldrich | 408220 | Monomer çözelti bileşeni |
| Sodyum bikarbonat | Sigma-Aldrich | S5761 | Enzim tampon bileşeni |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich | S9888 | Monomer çözelti bileşeni, Enzim tampon bileşeni |
| Sodyum hidroksit | Sigma-Aldrich | 221465 | Cam slaytların temizlenmesi |
| Katı hal lazer çizgisi | Omicron | Mevcut değil | 488, 568 ve 647 nm Uyarma lazer çizgisi |
| SYTO 61 nükleik asit boyama | Invitrogen | S11343 | Floresan boya |
| Tris(hidroksimetil)aminometan hidroklorür | SAFC | 108219 | Enzim tampon bileşeni |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Örnek geçirgenliği, Enzim tampon bileşeni |
| Volocity 7.0.0 yakalama yazılımı | Quorum | Technologies-Microscoy edinimi denetleyici yazılımı | |
| Volocity ViewVox eğirme diski sistemi | Perkin-Elmer | Mevcut değil | Konfokal için eğirme diski sistemi mikroskop |
| Buğday tohumu aglütininin – Alexa Fluor 488 floresan lektin konjugatı | Invitrogen | W11261 | Floresan boya |
Kaynaklar
- Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), 10(2015).
- Valdivieso González, D., Jara, J., Almendro-Vedia, V. G., Orgaz, B., López-Montero, I. Expansion microscopy applied to mono- and dual-species biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 9 (1), 92(2023).
- Castagnini, D., et al. Proteus mirabilis biofilm expansion microscopy yields over 4-fold magnification for super-resolution of biofilm structure and subcellular DNA organization. J Microbiol Methods. 220, 106927(2024).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging- Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Gao, R., Asano, S. M., Boyden, E. S. Q&A: Expansion microscopy. BMC biology. 15 (1), 50(2017).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLoS biology. 17 (10), e3000268(2019).
- Kunz, T. C., et al. The expandables: Cracking the staphylococcal cell wall for expansion microscopy. Front Cell Infect Microbiol. 11, 644750(2021).
- Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: Protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 80 (1), e56(2018).
- Yokogawa, K., Kawata, S., Nishimura, S., Ikeda, Y., Yoshimura, Y. Mutanolysin, bacteriolytic agent for cariogenic streptococci: partial purification and properties. Antimicrob Agents Chemother. 6 (2), 156-165 (1974).
- Hurst, P. L., Nielsen, J., Sullivan, P. A., Shepherd, M. G. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger. Biochem J. 165 (1), 33-41 (1977).
- Scott, J. H., Schekman, R. Lyticase: Endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis. J Bacteriol. 142 (2), 414-423 (1980).
- Bano, S., Qader, S. A. U., Aman, A., et al. Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS. AAPS PharmSciTech. 12, 255-261 (2011).
- Kaplan, J. B., et al. Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms. J Bacteriol. 186 (24), 8213-8220 (2004).
- Kaplan, J. B., et al. Recombinant human DNase I decreases biofilm and increases antimicrobial susceptibility in staphylococci. J Antibiot. 65 (2), 73-77 (2012).
- Schlapp, G., Scavone, P., Zunino, P., Härtel, S. Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture biofilms: A quantitative confocal microscopy approach. J Microbiol Methods. 87 (2), 234-240 (2011).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
