Yöntem makalesi

İnsan Anne Sütünden Elde Edilen Hücre Dışı Veziküllerin Hızlı İzolasyonu

805 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67954

⸱

14 Kasım 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics/Division of Neonatology and Center of Glial Biology in Medicine, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, 2School of Health Professions/Department of Clinical and Diagnostic Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Biological Sciences, Alabama State University, 4Department of Pediatric Surgery, Washington University-St. Louis

Bu makalede

Özet

Bu protokol, hücre dışı veziküllerin insan anne sütünden yüksek saflıkta etkili bir şekilde izole edilmesini hızlandırmak ve buna izin vermek için tasarlanmıştır.

Özet

Yaklaşık 20-1000 nm boyutunda nano boyutlu parçacıklar olan hücre dışı veziküller (EV'ler), terapötik potansiyelleri nedeniyle hızla dikkat çekiyor. Spesifik olarak, insan anne sütünden elde edilen hücre dışı veziküllerin (HBMDEV'ler), öncelikle prematüre bebekleri etkileyen ve %50'ye varan ölüm oranlarıyla sonuçlanan bir bağırsak hastalığı olan nekrotizan enterokolitin deneysel modellerinde koruma sağladığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, diferansiyel ultrasantrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi vb. gibi geleneksel hücre dışı vezikül izolasyon teknikleri ya zaman alıcıdır ya da özel enstrümantasyon gerektirir ve bunların hiçbiri klinik ortamda pratik değildir. Bu nedenle, HBMDEV'lerin hastalara hızlı reaktif bir şekilde uygulanmasına izin verecek basit bir izolasyon yöntemine ihtiyaç vardır. Burada önerilen, yağ ve hücresel kalıntıları gidermek için anne sütünün santrifüjlenmesi ve yüksek verimli ve fonksiyonel hücre dışı veziküller üreten kalan yağsız sütün hızlı ultrafiltrasyonu ile birlikte bir kombinasyonudur. Bu tekniğin kullanılması, HBMDEV'lerin klinik ortamda pratik bir tedavi seçeneği olarak kullanılmasına izin verebilir.

Giriş

Hücre dışı veziküller (EV'ler), endozomal yollar (mikroveziküler cisimler plazma zarı ile birleştiğinde, hücresel yükün hücre dışı boşluğa salınmasını kolaylaştırdığında) veya plazma zarı yolları (yani tomurcuklanma) yoluyla yaklaşık 20-1000 nm boyutunda her yerde bulunan nanopartiküllerdir. EV'ler, kaynaklarına bağlı olarak lipitler, proteinler, nükleik asitler, çeşitli metabolitler ve diğer içerikler gibi konakçı hücresel kargoları içerir. Ayrıca, EV'ler hücreler arası iletişim, anjiyogenez, immün baskılanma, tümör mikroçevresinin yeniden şekillenmesi, kanserin ilerlemesi vb. konularda önemlidir.1,2,3,4. Özellikle, anne sütü (HBM) EV açısından zengindir ve emziren annelerden kolayca erişilebilir5. Son zamanlarda, insan anne sütünden elde edilen EV'ler (HBMDEV'ler),hastalık 1,2'yi tedavi etmek için terapötik vektörler olarak dikkat çekmektedir. Prematüre veya düşük doğum ağırlıklı yenidoğanlar, nekrotizan enterokolit de dahil olmak üzere çeşitli enfeksiyonlara karşı hassastır. İleal veya kolonik nekroz ile karakterize nekrotizan enterokolit, hafif bağırsak inflamasyonundan çoklu sistem organ yetmezliğine kadar değişir ve bebek ölüm oranı %50'ye kadar çıkar6. Anne sütünden elde edilen EV'lerle ön tedavi, NEC'nin in vitro ve in vivodeneysel modellerinde bağırsak iltihabından korunmak için yeterlidir 2,7. Bu nedenle, HBMDEV'lerin kullanımı, klinik ortamlarda NEC tedavisi için uygun bir seçenek olabilir.

HBMDEV'lerin terapötik vaatlerine rağmen, mevcut izolasyon tekniklerini kullanmanın, zaman alıcı olmaları veya özel ekipman gerektirmeleri nedeniyle bilinen sınırlamaları vardır ve bunların hiçbiri klinik ortam için evrensel olarak pratik değildir. EV izolasyonunun "altın standardı", tatmin edici bir EV verimi üretmesine rağmen, yapısal bütünlüklerini ve işlevselliklerini etkileyebilen birkaç tur diferansiyel ultrasantrifüjlemeyi içerir 8,9. Ek olarak, ultrasantrifüjleme süreleri en az 2 saat olabilir, bu da klinik ortamda maliyetli bir kaynaktır9. İzolasyon kitlerinin hem zaman kazandırdığı hem de biraz uygun maliyetli olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, bu tür yöntemler kullanılarak yapılan izolasyon aynı zamanda düşük verim ve dolayısıyla düşük ölçeklenebilirlik ile sonuçlanır. Bu nedenle, EV veriminden ödün vermeden hem zaman kazandıran hem de uygun maliyetli HBMDEV izolasyon tekniklerine ihtiyaç vardır.

Bu protokol, klinik olarak mevcut, FDA onaylı mevcut araçları kullanarak EV'leri HBM'den hızlı bir şekilde izole etmek için adım adım bir yöntemin ana hatlarını çizmeyi amaçlamaktadır. Bunu başarmak için, EV'leri HBM'den izole etmek için standart santrifüjleme ve klinik düzeyde bir filtre uzatma sistemi kullanıldı. Bu veziküller beklenen boyut aralığındadır, bilinen EV'lerle tutarlı morfoloji gösterir, EV belirteçleri için zenginleştirilmiştir ve geleneksel ultrasantrifüj izolasyon teknikleri kullanılarak izole edilen EV'lere işlevsel olarak benzerdir. Bu nedenle, bu HBM EV izolasyon protokolü, HBM'den izole edilen EV'lerin klinik ortamda pratik, hızlı izolasyonuna ve uygulanmasına izin verebilir.

Protokol

Anne sütü, Birmingham'daki Alabama Üniversitesi (UAB) Bölgesel Yoğun Bakım Ünitesinde toplandı. Anne sütü hasta kullanımı için çözüldükten sonra temizlenen örnekler toplandı ve hasta tüm beslenmeyi alamadı. Bu beslemeler normalde atılır, ancak araştırma amacıyla toplanmıştır. Kimliği belirsiz bireylerden numuneler toplandı ve deneyler yapılana kadar -80 °C'de saklandı. Koleksiyon, UAB Dahili İnceleme Kurulu Protokolü N160203002 tarafından onaylandı. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre Dışı Vezikül izolasyonu (diferansiyel ultrasantrifüjleme)

  1. Bir biyogüvenlik kabininde, anne sütünü 15 mL'lik konik bir tüpte steril PBS'de 1:10 oranında seyreltin.
  2. Anne sütünü 300 x g'da 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin. Santrifüjlemenin ardından 3 farklı katman olmalıdır: süt yağı (üst katman), peynir altı suyu veya yağsız süt (orta sulu katman) ve hücreler ve diğer kalıntılar (altta peletlenmiş). Bir biyogüvenlik kabininde, süt yağı ve peynir altı suyu katmanlarını 70 μm'lik bir filtreden geçirin (yağın daha kolay çıkarılmasını sağlar) ve peleti bozulmadan bırakın. Akışı yeni bir tüpe aktarın.
  3. Numuneyi 4 °C'de 10 dakika boyunca 2600 x g'da santrifüjleyin. Bu adımda artık süt yağı, hücreler ve kalıntılar giderilir. Bir biyogüvenlik kabininde, süpernatanı 70 μm'lik bir filtreden geçirin. Süpernatanı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Ultrasantrifüjlemeden önce tüpte en az 10 mL sıvı olduğunu doğrulayın.
  4. Numuneyi 4 °C'de 45 dakika boyunca 20.000 x g'da ultrasantrifüjleyin. Ultrasantrifüjlemenin ardından, adım 1.2'ye benzer üç katman olabilir: süt yağı, peynir altı suyu veya yağsız süt ve hücreler ve diğer kalıntılar. Bir biyogüvenlik kabininde, süt yağı ve peynir altı suyu katmanlarını peleti bozmadan 70 μm'lik bir filtreden geçirin. Süpernatanı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  5. Bir biyogüvenlik kabininde, şırınga anne sütünü 0,22 μm'lik bir filtre ile süzün. Süpernatanı yeni bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Ultrasantrifüjlemeden önce tüpte en az 10 mL sıvı olduğunu doğrulayın.
  6. Numuneyi 4 °C'de 70 dakika boyunca 110.000 x g'da ultrasantrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 10 mL steril PBS içinde yeniden süspanse edin.
  7. Numuneyi 110,00 x g'da 70 dakika boyunca 4 °C'de tekrar ultrasantrifüjleyin.
  8. Bir biyogüvenlik kabininde, peleti 150-200 μL steril PBS içinde yeniden süspanse edin.

2. Hücre dışı vezikül izolasyonu (hızlı filtrasyon yöntemi)

  1. Bir biyogüvenlik kabininde anne sütünü (1:10) steril PBS ile seyreltin.
  2. Anne sütünü 300 x g'da 10 dakika boyunca 4°C'de santrifüjleyin. Santrifüjlemenin ardından üç farklı katman olmalıdır: süt yağı (üst katman), peynir altı suyu veya yağsız süt (orta sulu katman) ve hücreler ve diğer kalıntılar (altta peletlenmiş). Bir biyogüvenlik kabininde, süt yağı ve peynir altı suyu katmanlarını 70 μm'lik bir filtreden geçirin (yağın daha kolay çıkarılmasını sağlar) ve peleti bozulmadan bırakın. Akışı yeni bir tüpe aktarın.
  3. Numuneyi 4°C'de 10 dakika boyunca 2600 x g'da santrifüjleyin. Bu adımda artık süt yağı, hücreler ve kalıntılar giderilir. Bir biyogüvenlik kabininde, süpernatanı 70 μm'lik bir filtreden geçirin. Süpernatanı 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  4. Bir biyogüvenlik kabininde, 5,4 mL PBS ile 0,22 μm, 16 inçlik bir filtre uzatma setini astarlayın.
    1. Ana sisteme, bir şırıngada 5.4 mL steril PBS alın ve PBS tüpün diğer ucundan bitene kadar sistemi yıkayın.
  5. Şırınga anne sütünü 0,22 μm, 16 inçlik bir filtre uzatma setinden süzün. Bu adımda artık süt yağı, hücreler ve kalıntılar giderilir.
    NOT: Numunede bulunan kalıntı miktarına bağlı olarak birden fazla filtre uzatma seti gerekebilir.
  6. Akışı 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.

3. Nanosight izleme analizi

  1. Numuneyi (1:1000) steril PBS içinde seyreltin. Hızlı filtrelenmiş numuneler seyreltilmeden kullanılabilir.
  2. Numuneyi kısaca vorteksleyin. 1 mL numuneyi bir tüberkülin şırıngasına yükleyin.
  3. Şırıngayı enjeksiyon aparatına takın ve şırıngayı sabitleyin.
  4. Enjeksiyon pompasını 50'ye ayarlayın. Görüntülenen parçacıkların çok fazla veya çok az olmadığından emin olmak için kamerayı açın. Numune akışında atlama veya ani sıçramalar olmadan partikül akışının sabit olduğundan emin olun.
  5. Enjeksiyon pompasını 100'e ayarlayın. Protokolü çalıştırın.
    NOT: Yazılım, toplam 5 okuma için dakikada bir okunacak şekilde ayarlanmıştır.
  6. Örneği okuyun.
  7. Nanosight'ı numuneler arasında PBS ile yıkayın.
    NOT: Mililitre başına partikül boyutunu ve partikül konsantrasyonunu belirlemek için bir nanopartikül izleme analiz sistemi kullanılmıştır. Ultrasantrifüjlenmiş numunenin ortalama konsantrasyonu 3.30 e+08 +/- 4.08 e+06 partikül/mL iken, hızlı filtrasyon yöntemi 5.50e+08 +/- 1.16e+08 partikül/mL idi.

4. Hücre dışı veziküllerin negatif boyanması ve transmisyon elektron mikroskobu

NOT: Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) için eksozom konsantrasyonu 108 aralığında olan numuneler kullanıldı.

  1. Deşarj aparatı kullanılarak 20 mA'da 25 saniye boyunca kızdırma deşarjlı formvar/karbon film kaplı örgü bakır EM ızgaralar.
  2. Şebekeye 7 μL EV süspansiyon solüsyonu yükleyin ve 1 dakika inkübe edin.
  3. Numuneyi ızgaradan uzağa değil ızgaraya doğru "çekmek" için ızgaranın altından fitil yaparak Whatman filtre kağıdıyla fazlalığı fitilleyin.
  4. Numuneyi hemen EM ızgarasının yüzeyinde pipetle 7 μL filtrelenmiş %1 uranil asetat (UA) çözeltisi ile boyayın.
  5. 15 saniye sonra, ızgara kenarına filtre kağıdı ile temas ettirilerek fazla UA çözeltisi ızgaradan çıkarıldı. Numuneyi hemen (24 saat içinde) TEM'de 80 kv'de görüntüleyin.

5. Protein konsantrasyonu

  1. Aseton, -20 °C'de 1 saat boyunca 250 μL saflaştırılmış EV'yi (1:4) çökeltir.
    NOT: Ultrasantrifüjleme yöntemi için 100 μL saflaştırılmış eksozom kullanın.
  2. Numuneyi 30 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
  3. Peletin havayla kurutulması, ardından 100 μL RIPA tamponunda yeniden süspansiyon yapılması.
  4. Protein konsantrasyonlarını belirlemek için BCA protein tahlil kiti protokolünü izleyin. Absorbans, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 562 nm'de ölçüldü.
    NOT: 1 mL anne sütü normalde ultrasantrifüjleme kullanılarak yaklaşık 1.3 μg/mL protein ve hızlı filtrasyon kullanılarak yaklaşık 0.2-1 μg/mL protein verir.

6. Batı lekesi

  1. 1 hacimli bir protein örneğini 4 hacimli bir şerit işaretleyici ile inkübe edin, numune tamponunu azaltın ve 90°C'de 7 dakika kaynatın.
  2. 10 μg proteini 10 dakika boyunca 70 V'ta bir SDS %15 jel üzerine yükleyin ve çalıştırın. Daha sonra voltajı 100 V'a yükseltin ve 90 dakika daha çalıştırın.
  3. Jeli, yarı kuru aparatı kullanarak 15 V'ta 30 dakika boyunca bir nitroselüloz membrana aktarın.
  4. Membranı her biri 10 dakika boyunca TBS-%0.1 Tween (TBS-T) ile 3 kez yıkayın.
  5. Hızlı Blokaj Tamponu çözeltisi (1x'e seyreltilmiş) kullanarak membranı 30 dakika bloke edin.
  6. Birincil antikoru inkübe edin (Hsp70-1:1000; CD63-1:1000 ve CD9-1:1000) 1x Tampon çözeltisi içinde, gece boyunca 4°C'de bir külbütör10,11,12 üzerinde.
  7. Membranı TBS-T ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  8. TBS-T'de %2 Süt içinde sorgulanan tüm proteinler (Hsp70, CD9 ve CD63) için 1:1000 seyreltmede (H+L) HRP-konjugat anti-fare ikincil antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  9. Membranı TBS-T ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  10. ECL (1:1) kullanarak geliştirin ve geliştiriciyle birlikte filme alın.

7. IEC-6 hücrelerinin in vitro kültürü

  1. 5 mL tam RPMI ortamında bir T-25 şişesinde 1.0 x10 6 hücre tohumlayın. Hücrelerin gece boyunca yapışmasına izin verin.
  2. Tüm ortamı çıkarın ve 1-2 mL PBS ile yıkayın.
  3. PBS'yi aspire edin ve 5 mL EV içermeyen tam RPMI ekleyin.
  4. Gece boyunca hücrelere kuyu başına 400 μMH2O2 ve aynı anda 10 μg / mL EV'lik bir son konsantrasyon ekleyin.
  5. Ortamı çıkarın ve hücreleri 1-2 mL PBS ile yıkayın.
  6. PBS'yi aspire edin ve 1 mL Tripsin ekleyin.
    1. Hücreleri inkübatöre 37°C'de 5 dakika yerleştirin.
  7. Tam RPMI'nin iki katı hacmini ekleyerek tripsini devre dışı bırakın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 125 x g'da santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
  9. Hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.

Sonuçlar

Ultrasantrifüjleme ve hızlı izolasyon kullanılarak EV'lerin izolasyonu
Dogmatik olarak, HBM'den EV izolasyonu, süt yağını ve diğer büyük parçacıkları uzaklaştırmak için santrifüjlemeyi, ardından filtrelemeyi, birkaç tur ultrasantrifüjlemeyi ve EV ile zenginleştirilmiş numunenin PBS'de yeniden süspansiyonunu içerir. Hızlı filtreleme yöntemi, süt yağını ve hücresel kalıntıları gidermek için santrifüjlemeyi kullanır, ardından 0.22 μm'lik bir filtre uzatma filtresi aracılığıyla filtrelemeyi kullanır ve artık kalıntıları daha da giderir, bu da geleneksel ultrasantrifüjlemeyle karşılaştırılabilir EV açısından zenginleştirilmiş bir numune verir (Şekil 1).

Filtre uzatmalı hızlı filtreleme sisteminden HBMDEV'lerin karakterizasyonu
Nanosight izleme analizi, ultrasantrifüjlenmiş (Şekil 2A) ve hızlı filtre izole edilmiş HBMDEV'ler (Şekil 2B) arasında karşılaştırılabilir partikül boyutunu ortaya çıkardı. Her iki yöntem de izole edilen EV'lerin ortalama boyutunun yaklaşık 100 nm olduğunu göstermektedir. EV'ler, konakçı hücrelerden çeşitli hedeflerine salgılanmak üzere çeşitli kargolar (yani proteinler, lipitler, miRNA'lar, vb.) taşır. Bu nedenle, incelenen ilk hedef protein, EV'ler 13 aracılığıyla taşındığı bilinen bir protein olan ısı şoku proteini70 (Hsp70) idi. Western blot analizi, hızlı filtrasyon kullanılarak izole edilen EV'lerin, ultrasantrifüjleme kullanılarak izole edilenlerle karşılaştırılabilir Hsp70 ekspresyonu gösterdiğini göstermektedir (Şekil 3A ve Ek Şekil 1A). Ek olarak, EV'ler, CD9 ve CD6314 gibi tetraspaninlerin yüzey ekspresyonu yoluyla tanımlanabilir. Western blot analizi, hızlı filtrasyon yoluyla izole edilen EV'lerin gerçekten de CD9 (Şekil 3B ve Ek Şekil 2B) ve CD63'ü (Şekil 3C ve Ek Şekil 3C) eksprese ettiğini ortaya koydu. Son olarak, HBMDEV'lerin transmisyon elektron mikroskobu ile morfolojik analizi, iki izolasyon tekniği arasında benzer vezikül morfolojisini ortaya çıkardı (Şekil 4A-D).

Birkaç laboratuvar, EV'lerin hücresel stres 2,3,7 sırasında hücrenin hayatta kalmasını destekleyen koruyucu özellikler sağladığını göstermiştir. Daha önce yayınlanmış raporlara benzer şekilde, hızlı filtrasyon yöntemi kullanılarak izole edilen EV'ler, bağırsak epitel hücrelerini (IEC-6) hidrojen peroksit kaynaklı hücre ölümünden2 koruyabilir (Şekil 5A,B). Bu veriler, hızlı filtrasyon yöntemi kullanılarak izole edilen HBMDEV'lerin, yalnızca diferansiyel ultrasantrifüjleme kullanılarak izole edilenlerle karşılaştırmalı niteliklere sahip olmadığını, aynı zamanda işlevsel olarak da benzer olduğunu göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: EV'lerin insan anne sütünden izolasyonunun ultrasantrifüjleme ve hızlı filtrasyon yöntemleri arasındaki farkları gösteren şematik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Ultrasantrifüjleme ve hızlı filtrasyon yöntemi kullanılarak insan anne sütünden izole edilen EV'lerin nanosight izleme analizi. (A) Ultrasantrifüjleme kullanılarak izole edilen insan anne sütü EV'lerinin NTA'sı (1x PBS'de 1:1000 seyreltilmiş). Gösterilen veriler, 3-4 bağımsız çalışmanın tek bir temsilidir. (B) Hızlı filtrasyon kullanılarak izole edilen anne sütü EV'lerinin NTA'sı. Gösterilen veriler, 3-4 bağımsız çalışmanın tek bir temsilidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Ultrasantrifüjleme ve hızlı filtrasyon kullanılarak izole edilen EV'lerin Western blot analizi. (A) 10 μg ısı şoku proteini 70'in (Hsp70) bir saniyelik maruziyeti. "L" merdiveni, "U" ultrasantrifüjlemeyi ve "R" hızlı filtrelemeyi ifade eder. Hızlı filtrasyon ile elde edilen numuneler, iki kez gerçekleştirilen 70 dakika boyunca 110.000 × g'da santrifüjleme ile daha da konsantre edildi. Gösterilen resim dört bağımsız denemeden birini temsil etmektedir. (B) 10 μg CD9'a yirmi saniye maruz kalma. "L" merdiveni, "U" ultrasantrifüjlemeyi ve "R" hızlı filtrelemeyi ifade eder. Hızlı filtrasyon numuneleri, iki kez gerçekleştirilen 70 dakika boyunca 110.000 × g'da santrifüjleme ile konsantre edildi. Gösterilen resim dört bağımsız denemeden birini temsil etmektedir. (C) 10 μg CD63'ün yirmi saniyelik maruziyeti. "L" merdiveni, "U" ultrasantrifüjlemeyi ve "R" hızlı filtrelemeyi ifade eder. Hızlı filtrasyon numuneleri, iki kez gerçekleştirilen 70 dakika boyunca 110.000 × g'da santrifüjleme ile konsantre edildi. Gösterilen resim dört bağımsız denemeden birini temsil etmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Ultrasantrifüjleme ve hızlı filtrasyon kullanılarak izole edilen EV'lerin transmisyon elektron mikroskobu analizi. (A) ×8.000 büyütmede ultrasantrifüjleme kullanılarak izole edilen EV'lerin elektron mikrografı. Ölçek çubuğu = 800 nm. Gösterilen resim, üç bağımsız denemeden birini temsil etmektedir. (B) 20.000× büyütmede ultrasantrifüjleme kullanılarak izole edilen EV'lerin elektron mikrografı. Ölçek çubuğu = 200 nm. Gösterilen resim, üç bağımsız denemeden birini temsil etmektedir. (C) ×8.000 büyütmede hızlı filtrasyon kullanılarak izole edilen EV'lerin elektron mikrografı. Ölçek çubuğu = 800 nm. EV'ler, iki kez gerçekleştirilen 70 dakika boyunca 110.000 × g'da santrifüjleme ile konsantre edildi. Gösterilen resim, üç bağımsız denemeden birini temsil etmektedir. (D) ×20.000 büyütmede hızlı filtrasyon kullanılarak izole edilen EV'lerin elektron mikrografı. Ölçek çubuğu = 200 nm. EV'ler, iki kez gerçekleştirilen 70 dakika boyunca 110.000 × g'da santrifüjleme ile konsantre edildi. Gösterilen resim, üç bağımsız denemeden birini temsil etmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Ultrasantrifüjleme ve hızlı filtreleme kullanılarak izole edilen EV'lerin fonksiyonel analizi. (A) EV içermeyen tam RPMI-1640 ortamında kültürlenen IEC-6 hücrelerinin hücre canlılığı. Hücreler gece boyunca aynı anda 400 μM H2O2 ve 10 μg / mL EV ile muamele edildi. Gösterilen veriler iki bağımsız çalışmadan birini temsil etmektedir. (B) EV içermeyen tam RPMI-1640 ortamında kültürlenen IEC-6 hücrelerinin hücre sayıları. Hücreler gece boyunca aynı anda 400 μM H2O2 ve 10 μg / mL EV ile muamele edildi. Gösterilen veriler iki bağımsız çalışmadan birini temsil etmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Ultrasantrifüjleme ve hızlı filtrasyon kullanılarak izole edilen EV'lerde Hsp70'in Western blot karakterizasyonu. 10 μg ısı şoku proteini 70'in (Hsp70) bir saniyelik maruziyeti. "L" merdiveni, "U" ultrasantrifüjlemeyi ve "R" hızlı filtrelemeyi ifade eder. Hızlı filtrasyon numuneleri, iki kez gerçekleştirilen 70 dakika boyunca 110.000 × g'da santrifüjleme ile konsantre edildi. Her numune tek bir biyolojik kopyayı temsil eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Ultrasantrifüjleme ve hızlı filtrasyon kullanılarak izole edilen EV'lerde CD9'un Western blot karakterizasyonu. 10 μg CD9'un beş dakikalık maruziyeti. "L" merdiveni, "U" ultrasantrifüjlemeyi ve "R" hızlı filtrelemeyi ifade eder. Hızlı filtrasyon numuneleri, iki kez gerçekleştirilen 70 dakika boyunca 110.000 × g'da santrifüjleme ile konsantre edildi. Her numune tek bir biyolojik kopyayı temsil eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Ultrasantrifüjleme ve hızlı filtrasyon kullanılarak izole edilen EV'lerde CD63'ün Western blot karakterizasyonu. 10 μg CD63'ün on dakikalık maruziyeti. "L" merdiveni, "U" ultrasantrifüjlemeyi ve "R" hızlı filtrelemeyi ifade eder. Hızlı filtrasyon numuneleri, iki kez gerçekleştirilen 70 dakika boyunca 110.000 × g'da santrifüjleme ile konsantre edildi. Her numune tek bir biyolojik kopyayı temsil eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

EV'ler, literatürün çeşitli enflamatuar mekanizmaları düzenleyebileceklerini ve koruyucu faydalar sağlayabileceklerini öne sürdüğü için dikkat çekmektedir 2,7. Bununla birlikte, EV'lerin klinik ortamlarda pratik kullanımının bir sınırlaması, EV'leri izole etmek ve yeterli bir verim elde etmek için gereken zamandır 8,15. Burada, FDA onaylı bir filtreleme sistemi kullanılarak EV'lerin HBM'den hızlı ve etkili bir şekilde izole edilmesi için adım adım bir protokol özetlenmiştir. Bu yöntemin faydası, verimden ödün vermeden geleneksel EV izolasyon yöntemlerini yarıya indirir. Bu nedenle, bu protokol, EV tedavisinin öngörülebilir gelecekte onaylanması durumunda, insan anne sütünden elde edilen EV'lerin klinik bir ortamda pratik terapötik uygulamasına izin verebilir.

Mevcut EV izolasyon protokolleri, EV'lerin kaynak sıvılarından tutarlı ve etkili verim elde edildiğini göstermiştir. Bununla birlikte, ister altın standart, ister diferansiyel ultrasantrifüjleme veya ticari kitlerin kullanımı olsun, geleneksel izolasyon yöntemlerinin sınırlamaları da vardır. EV'lerin diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla izolasyonu, etkili olmakla birlikte, minimum ~3 saat 2,8,15'lik birleşik dönüş sürelerini içeren protokollerle zaman alıcıdır. EV sayılarını uygun şekilde ölçmek için protokollerle birleştirilen izolasyon süresi, klinik bir ortamda zaman kısıtlamaları altında kullanımlarını zorlaştıracaktır. Üstelik ticari kitler etkili olmasına rağmen maliyetlidir. Ayrıca bu kitlerin yüksek maliyetleri göz önüne alındığında, kit başına işlenebilecek numune sayısıdüşüktür 8,15.

Bu protokol, EV veriminden veya saflığından ödün vermeden zamandan ve paradan tasarruf sağlayan bu sınırlamalara bir çözüm sunar. Bu protokolün etkili olabilmesi için, protokolü yürütürken izlenmesi gereken önemli adımlar vardır. Süt örneğinden hücre dışı kalıntıların ve süt yağının uzaklaştırılması için anne sütünün seyreltilmesi ve ilk santrifüjlenmesi gereklidir. Bu kalıntıların giderilmesi, filtre uzatma sisteminin tıkanmasını önlemek için kritik öneme sahiptir ve böylece bir numune için birden fazla filtre kullanmak zorunda kalmayı önler. Ek olarak, filtre uzatma sisteminin PBS ile yıkanması, filtreyi numuneye hazırlanırken hazırladığı için kritik öneme sahiptir. Astarlama, hazırlama işlemi sırasında numunenin kaybolmamasını sağlamaya yardımcı olur. Anne sütü numunesinin içeriğine bağlı olarak, filtrasyondan önce numunenin seyreltilmesi ve santrifüjlenmesinden bağımsız olarak birden fazla filtre uzatma setine ihtiyaç duyulabileceği unutulmamalıdır. Böyle bir durumda birden fazla filtre kullanılabilir; ancak, yeni filtre uzatma setinin numunenin filtrelenmesinden önce astarlanması gerekir.

Bu protokol, EV'leri anne sütünden izole etmede etkili ve tutarlıdır, ancak dikkate alınması gereken birkaç sınırlama vardır. Numunenin filtrelenmesinden önce santrifüj adımları (her iki dönüş arasında ~20 dakikalık toplam süre) gereklidir. Seyreltilmiş numuneyi santrifüjleme olmadan filtreleme girişimleri, filtre uzatma sisteminin tekrar tekrar tıkanmasına, numune kaybına yol açacak ve EV izolasyon protokolüne ek süre ekleyecektir. Ayrıca, NTA ve TEM analizinin kanıtladığı gibi, örneklem saf değildi. Filtrasyondan önce santrifüjlenmemiş numuneleri kullanma girişimleri, numuneye istenmeyen kirleticiler sokabilir ve bu da izole edilmiş EV'lerin gelecekteki aşağı akış uygulamasına bağlı olarak hedef dışı etkiler üretebilir. Ek olarak, bu protokol yalnızca EV'lerin anne sütünden izolasyonu ile ilgili olarak uygulanmıştır. Bu nedenle, bu protokolün EV'leri diğer sıvılardan izole etmedeki etkinliği araştırılmamıştır. Tüm vücut sıvılarının sulu doğası göz önüne alındığında, bu protokolün EV'leri diğer kaynaklardan izole etmek için kullanılması durumunda EV saflığı ve veriminde herhangi bir farklılık olması beklenmemektedir.

Bu protokolün küçük hücre dışı veziküllerin (sEV) izole edilmesinde etkili olduğu da belirtilmelidir. NTA'ya göre, HBM'den türetilen EV'lerin boyutu ~100 nm'ydi, bu da örnekte daha büyük EV'lerin bulunmadığını gösteriyor. Bunun nedeni, numunelerin, bu çalışma sırasında laboratuvarın birincil odak noktası olan eksozomların ve diğer küçük EV'lerin izolasyonu için kullanılan 0.22 μm'lik bir filtre kullanılarak filtrelenmiş olmasıdır. Teorik olarak, daha büyük gözenek boyutlarına sahip bir filtrenin kullanılması, daha büyük EV'lerin izolasyonuna izin verebilir. Ancak, bu sorular bu çalışmanın kapsamı dışındadır.

İnsan anne sütünden elde edilen EV'ler, klinik kullanım için kolayca erişilebilen doğal bir terapötik kaynağı temsil eder. EV çalışmasını klinik ortama getirmenin bir sınırlaması, EV'leri herhangi bir tesisin potansiyel olarak kullanabileceği pratik bir yöntemle izole etmektir. Bu protokol, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için tasarlanmıştır ve hastane ortamında kolayca uygulanabilir ve mevcut hastane sınıfı, FDA onaylı bir filtreleme sistemi kullanılarak uygulanabilir, ticari olarak temin edilebilir veya standart ultrasantrifüjden çok daha ucuza satın alınabilir. Bu yöntem uygun maliyetlidir ve klinik ortamda halihazırda kullanılan bir filtreleme sisteminden EV açısından zengin ve saf bir numune üretir.

Açıklamalar

Yazar(lar), bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayınlanması ile ilgili herhangi bir potansiyel çıkar çatışması beyan etmemiştir.

Teşekkürler

Görüntüler ve şekiller biorender.com kullanılarak oluşturuldu. Bu yayında bildirilen araştırma, UAB Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Tesisi tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma NIH/NICHD 5R21HD104481 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(H+L) HRP-konjugat anti-fareBio-Rad1721011
(H+L) HRP-konjugat anti-tavşanBio-Rad1706515
0.20 şırınga filtresiFisherbrand09-719C
0.70 um hücre süzcüCorning431751
1.5M Tris HCLKendi yapım
15 mL tüplerFalcon352096
16 inç filtre uzatma setiB-BRAUNFE2012F
1M Tris HCLTeknovaT1068
1x PBSGibco10010-031
50 mL tüplerFalcon353070
5x İngengeleme Örnek TamponuTermo Bilimsel39000
AsilamideFisher Scientifc BP1410-1
Amfoterisin BGibco15290-018
AMT NanoSprint43 Mark-II kameraAMT
Anti-AntiGibco15240-062
Anti-CD63NovusbioNBP2-32830
Anti-CD9Invitrogen10626D
APSTermo Bilimsel17874
BCA Protein Test KitiPierce23227
Beckman tüpleriBeckman Coulter 344059
BrightStar ECL KimamilüminesansAlkali ScientificXR92
Ekzozom Tükenmiş FBSFisher ScientificNC0464480
Hızlı Engelleme TamponuPierce37575
Fetal Sığır SerumuYaşam Teknolojileri10082147
HSP70InvitrogenMA3-006
İnsan insüliniSigma-AldrichI9278-5ML
Hidrojen PeroksitFisher ScientificH325-500
IEC-6 ATCCCRL-1592
JEOL 1400 FLASH TEMJEOL USA Inc
Şerit işaretçisi azaltıcı örnek tamponuTermo Bilimsel39000
Süt tozuBiyodünya30620074-1
Nanosight NS 300Malvern Instruments Ltd.
Nitroselüloz zarıYaşam teknolojileri88018
PELCO easiGlow deşarj cihazıTed Pella
Proteaz inhibitörü mini tabletlerPierceA32955
RIPA tamponuPierce89901
RPMI 1640Fisher Scientifc 11875119
SDSFisher Scientifc BP2436-200
T-25 matarasıTermo Bilimsel156367
TBSKendi yapım
TEMEDBio-Rad161-0801
Tripsin EDTAGibso25200-056
Tween 20Termo BilimselJ20605-AP

Kaynaklar

  1. Galley, J. D., Besner, G. E. The therapeutic potential of breast milk-derived extracellular vesicles. Nutrients. 12 (3), 745(2020).
  2. Martin, C., et al. Human breast milk-derived exosomes attenuate cell death in intestinal epithelial cells. Innate Immun. 24 (5), 278-284 (2018).
  3. Hock, A., et al. Breast milk-derived exosomes promote intestinal epithelial cell growth. J Pediatr Surg. 52 (5), 755-759 (2017).
  4. Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nat Commun. 6, 7321(2015).
  5. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma, and breast milk exosomes contain RNA: Uptake by macrophages. J Transl Med. 9, 9(2011).
  6. Chan, C. C., et al. Type I interferon sensing unlocks dormant adipocyte inflammatory potential. Nat Commun. 11 (1), 2745(2020).
  7. Miyake, H., et al. Human breast milk exosomes attenuate intestinal damage. Pediatr Surg Int. 36 (2), 155-163 (2020).
  8. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
  9. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
  10. Gandhi, J., Naik, M. N., Mishra, D. K., Joseph, J. Proteomic profiling of Aspergillus flavus endophthalmitis-derived extracellular vesicles in an in vivo murine model. Med Mycol. 60 (9), myac064(2022).
  11. Palinski, W., et al. Lysosome purinergic receptor p2x4 regulates neoangiogenesis induced by microvesicles from sarcoma patients. Cell Death Dis. 12 (9), 797(2021).
  12. Tantengco, O. aG., Radnaa, E., Shahin, H., Kechichian, T., Menon, R. Cross talk: Trafficking and functional impact of maternal exosomes at the feto-maternal interface under normal and pathologic statesdagger. Biol Reprod. 105 (6), 15621576(2021).
  13. Caruso Bavisotto, C., et al. Exosomal hsp60: A potentially useful biomarker for diagnosis, assessing prognosis, and monitoring response to treatment. Expert Rev Mol Diagn. 17 (9), 815-822 (2017).
  14. Feng, X., et al. Latest trend of milk-derived exosomes: Cargos, functions, and applications. Front Nutr. 8, 747294(2021).
  15. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Anne Sütü EV'leriHızlı FiltrasyonUltrasentrifügasyonEkzozom İzolasyonuWestern BlotTransmisyon Elektron MikroskobuNanoSight İzlemeCD63 Markeri
İnsan Anne Sütünden Elde Edilen Hücre Dışı Veziküllerin Hızlı İzolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.